Informasi

Pita yang diharapkan dalam gel poliakrilamida

Pita yang diharapkan dalam gel poliakrilamida


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya memiliki sesuatu dalam catatan saya yang tampaknya tidak benar.

Jika saya menggunakan enzim restriksi pada produk PCR, berapa banyak pita yang harus saya lihat asalkan saya tahu enzim restriksi akan memotong DNA? Jika saya menggunakan dua enzim restriksi, saya mengharapkan dua potongan maka gel akan menunjukkan tiga pita. Lalu, jika saya hanya menggunakan satu enzim dan saya tahu enzim itu akan dipotong sekali saja, apakah saya harus mengharapkan dua pita? Menurut catatan saya satu band diharapkan.


Jika enzim restriksi Anda hanya menargetkan satu situs pada urutan DNA maka ia akan membagi setiap untai DNA menjadi dua fragmen. Jika enzim restriksi memotong setiap untai maka Anda akan melihat dua fragmen itu. Perhatikan bahwa jika kedua fragmen memiliki panjang yang sama, mereka dapat muncul sebagai pita tunggal saat dipisahkan menggunakan elektroforesis gel.

Jika enzim tidak memotong semuanya, DNA yang belum dipotong juga akan ada. Inilah sebabnya mengapa Anda harus selalu memisahkan beberapa DNA yang belum dipotong dalam elektroforesis gel.


Teknologi untuk Mekanika Substrat Sel dalam Hidrogel

Makoto Funaki , Paul A. Janmey , dalam Biologi dan Rekayasa Relung Sel Punca , 2017

8.1 Gel Poliakrilamida

Gel poliakrilamida telah berfungsi sebagai alat penting untuk menyelidiki pengaruh kekakuan substrat pada fungsi seluler di berbagai jenis sel sejak Pelham et al. melaporkan bahwa motilitas sel dan adhesi fokal dalam fibroblas diatur oleh kekakuan gel poliakrilamida berlapis kolagen. 62 Salah satu keuntungan dari gel poliakrilamida adalah mereka inert secara biologis. Akibatnya, penyetelan kekakuan gel poliakrilamida dengan menyesuaikan konsentrasi akrilamida dan bisakrilamida, yang mempengaruhi kepadatan jaringan poliakrilamida, tidak mempengaruhi sifat biokimia gel. Dengan demikian, dimungkinkan untuk mengasumsikan bahwa setiap perbedaan dalam fungsi seluler yang diamati antara sel-sel yang diunggulkan pada gel poliakrilamida dengan kekakuan yang berbeda disebabkan oleh perbedaan kekakuan gel. Dengan memvariasikan konsentrasi akrilamida dan bisakrilamida, kisaran kekakuan dapat menutupi sebagian besar jaringan lunak (Gbr. 23.2). 63 Namun, kelembaman biologis poliakrilamida ini mencegah pengikatan reseptor permukaan sel dan molekul adhesi yang ada dalam medium. Dengan demikian, untuk terlibat dalam sel, molekul perekat perlu dihubungkan secara kovalen ke gel dengan menggunakan cross-linker, yang memiliki dua gugus fungsi yang satu mengikat poliakrilamida dan yang lain mengikat molekul kepatuhan, seperti kolagen dan fibronektin. 6,64 Salah satu kelemahan gel poliakrilamida adalah keterbatasannya pada kultur 2-D karena akrilamida sangat toksik sebelum polimerisasi.

Gambar 23.2 . Sifat mekanik substrat poliakrilamida.

Modulus geser gel poliakrilamida dengan kisaran akrilamida (ditunjukkan sebagai persen dekat jalur data) menjadi bis-akrilamida (ditunjukkan sebagai penghubung silang) proporsi diukur. Modulus geser (G), dinyatakan dalam Pascal, meningkat pada massa polimer konstan dengan meningkatnya cross-linker. Meningkatkan konsentrasi akrilamida dari 3% menjadi 12% juga menciptakan rentang kekakuan yang besar dari 10 hingga 50.000 Pa. garis utuh menunjukkan kekakuan teoritis dari jaringan seperti karet jika setiap ikatan silang efektif secara elastis.


PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), adalah metode analisis yang digunakan untuk memisahkan komponen campuran protein berdasarkan ukurannya. Teknik ini didasarkan pada prinsip bahwa molekul bermuatan akan bermigrasi dalam medan listrik menuju elektroda dengan tanda yang berlawanan. Teknik elektroforesis umum tidak dapat digunakan untuk menentukan berat molekul molekul biologis karena mobilitas suatu zat dalam gel tergantung pada baik muatan maupun ukurannya. Untuk mengatasi hal ini, sampel biologis perlu diperlakukan sehingga mereka memperoleh muatan yang seragam, maka mobilitas elektroforesis tergantung terutama pada ukuran. Untuk molekul protein yang berbeda dengan bentuk dan ukuran yang berbeda, perlu didenaturasi (dilakukan dengan bantuan SDS) sehingga protein kehilangan struktur sekunder, tersier atau kuaterner. Protein yang ditutupi oleh SDS bermuatan negatif dan ketika dimuat ke gel dan ditempatkan dalam medan listrik, maka akan bermigrasi menuju anoda (elektroda bermuatan positif) yang dipisahkan oleh efek pengayakan molekuler berdasarkan ukuran. Setelah visualisasi dengan teknik pewarnaan (khusus protein), ukuran protein dapat dihitung dengan membandingkan jarak migrasinya dengan tangga (marker) berat molekul yang diketahui.


Pewarnaan DNA pada gel agarosa dan poliakrilamida oleh methyl green

Metil hijau (MG) adalah pewarnaan histologis tradisional yang murah, nonproprietary untuk inti sel. Ketika terikat pada DNA dan pada eksitasi dengan cahaya oranye-merah, ia berpendar terang di daerah merah jauh. Kami membandingkan MG dengan etidium bromida (EtBr), pewarna konvensional untuk DNA dalam gel, dan pewarna Serva DNA G™ (SDsG), pewarna eksklusif yang dipasarkan sebagai alternatif yang lebih aman daripada EtBr untuk pewarnaan pita DNA elektroforesis dalam gel agarosa dan poliakrilamida. Fluoresensi DNA-MG direkam dan 2,4 g/ml MG menghasilkan gambar tajam dari DNA elektroforesis setelah inkubasi selama 10 menit. Solusi noda stabil dan batas deteksi untuk pita redup serta kuantisasi densitometrik relatif setara dengan EtBr. MG, EtBr dan SDsG masing-masing berharga 0,0192, 0,024 dan 157,5 sen AS/tes. MG adalah pewarna yang efektif untuk memvisualisasikan DNA dalam gel agarosa dan poliakrilamida. Keuntungan utamanya termasuk biaya rendah, kualitas pewarnaan yang sebanding, penyimpanan pada suhu kamar, foto-resistensi dan profil mutagenik rendah lebih besar daripada kerugiannya seperti pewarnaan pewarna pelacakan dan persyaratan untuk sistem dokumentasi gel dengan filter merah.

Kata kunci: DNA binding Serva DNA stain G™ ethidium bromide sistem dokumentasi gel fluoresensi merah jauh agen interkalasi biologi molekuler metil hijau.


Swiss, R.C. III, Merril, C.R. & Shifrin, S. Pewarna perak yang sangat sensitif untuk mendeteksi protein dan peptida dalam gel poliakrilamida. dubur. Biokimia. 98, 231–237 (1979).

Merril, C.R., Dunau, M.L. & Goldman, D. Pewarnaan perak sensitif yang cepat untuk polipeptida dalam gel poliakrilamida. dubur. Biokimia. 110, 201–207 (1981).

Heukeshoven, J. & Dernick, R. Metode sederhana untuk pewarnaan protein dalam gel poliakrilamida dan mekanisme pewarnaan perak. Elektroforesis 6, 103–112 (1985).

Somerville, L.L. & Wang, K. Pewarnaan 'protein' perak ultrasensitif juga mendeteksi nanogram asam nukleat. Biokimia. Biofis. Res. komuni. 102, 53–58 (1981).

Boulikas, T. & Hancock, R. Teknik yang sangat sensitif untuk pewarnaan DNA dan RNA dalam gel poliakrilamida menggunakan perak. J. Biokimia. Biofis. Metode 4, 219–228 (1981).

Tsai, C.M. & Frasch, C.E. Pewarnaan perak yang sensitif untuk mendeteksi lipopolisakarida dalam gel poliakrilamida. dubur. Biokimia. 119, 115–119 (1982).

Dubray, G. & Bezard, G. Pewarnaan asam-perak periodik yang sangat sensitif untuk kelompok 1,2-diol glikoprotein dan polisakarida dalam gel poliakrilamida. dubur. Biokimia. 119, 325–329 (1982).

Caetano-Anollés, G., Bassam, B.J. & amp Gresshoff, P.M. Sidik jari amplifikasi DNA menggunakan primer oligonukleotida arbitrer yang sangat pendek. BioTeknologi (NY) 9, 553–557 (1991).

Bassam, B.J., Caetano-Anollés, G. & Gresshoff, P.M. Pewarnaan perak yang cepat dan sensitif pada DNA dalam gel poliakrilamida. dubur. Biokimia. 196, 80–83 (1991).

Bassam, BJ & amp Bentley, S. Elektroforesis gel poliakrilamida yang didukung poliester. Bioteknik 19, 568–573 (1995).

Merril, C.R. Pewarnaan perak pada protein dan DNA. Alam 343, 779–780 (1990).

Rabilloud, T. Mekanisme pewarnaan perak protein dalam gel poliakrilamida: sintesis 10 tahun. Elektroforesis 10, 785–794 (1990).

Guillemette, J.G. & Lewis, P.N. Deteksi jumlah subnanogram DNA dan RNA pada gel poliakrilamida dan agarosa asli dan terdenaturasi dengan pewarnaan perak. Elektroforesis 4, 92–94 (1983).

Kolodny, G.M. Metode yang ditingkatkan untuk meningkatkan resolusi dan sensitivitas pewarnaan perak pada pita asam nukleat dalam gel poliakrilamida. dubur. Biokimia. 138, 66–67 (1984).

Beidler, J.L., Hilliard, P.R. & Rill, R.L. Pewarnaan asam nukleat ultrasensitif dengan perak. dubur. Biokimia. 126, 374–380 (1982).

Goldman, D. & Merril, C.R. Pewarnaan perak DNA dalam gel poliakrilamida: linearitas dan efek ukuran fragmen. Elektroforesis 3, 24–26 (1982).

Merril, C.R., Harrington, M. & Alley, V. Pewarnaan perak pengembangan foto untuk visualisasi cepat protein yang dipisahkan pada gel poliakrilamida. Elektroforesis 5, 289–297 (1984).

Blum, H., Beier, H. & Gross, H.J. Peningkatan pewarnaan perak protein tumbuhan, RNA dan DNA dalam gel poliakrilamida. Elektroforesis 8, 93–99 (1987).

Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A. & Ebert, M.H. Pewarnaan ultrasensitif untuk protein dalam gel poliakrilamida menunjukkan variasi regional dalam protein cairan serebrospinal. Sains 211, 1437–1438 (1981).

Kruchinina, N.G. & Gresshoff, P.M. Deterjen mempengaruhi urutan perak. Bioteknik 17, 280–282 (1994).


Metode elektroforesis gel untuk mengukur konsentrasi nanotube karbon berdinding tunggal yang diekstraksi dari jaringan biologis

Sebuah metode cepat dan sensitif untuk mendeteksi nanotube karbon berdinding tunggal (SWNTs) dalam sampel biologis disajikan. Metode yang digunakan adalah elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE) yang dilanjutkan dengan kuantifikasi pita SWNT. SWNT yang terdispersi dalam bovine serum albumin (BSA) digunakan untuk mengembangkan metode ini. Ketika dispersi BSA-SWNT dikenai sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE, BSA melewati stacking gel, masuk ke dalam resolve gel, dan bermigrasi menuju anoda seperti yang diharapkan. SWNT, bagaimanapun, terakumulasi dalam pita tajam pada antarmuka antara sumur pemuatan dan gel susun. Intensitas dari gambar digital dari pita ini sebanding dengan jumlah SWNT yang dimuat ke gel dengan batas deteksi 5 ng SWNT. Untuk menguji metode ini, sel-sel ginjal tikus normal (NRK) dalam kultur diizinkan untuk mengambil SWNTs pada paparan media yang mengandung berbagai konsentrasi BSA-SWNTs untuk waktu dan suhu yang berbeda. Analisis SDS-PAGE sampel lisat sel menunjukkan bahwa BSA-SWNTs memasuki sel NRK dengan endositosis fase cairan pada kecepatan 30 fg/hari/sel setelah terpapar media yang mengandung 98 mikrog/mL SWNT.


"Gelombang" dalam gel SDS-PAGE - (19 Juli/2013 )

Saya telah menjalankan gel SDS-PAGE musim panas ini untuk pertama kalinya mencoba memisahkan rantai berat miosin yang ada di otot rangka. Saya perhatikan bahwa terkadang saya mendapatkan pita yang tidak rata dan bergelombang. Terkadang ini adalah kelengkungan yang sebenarnya di band, terkadang hanya band yang miring di jalur. Saya bisa mendapatkan gel di mana saya tidak memiliki waviness sama sekali, tetapi saya belum menemukan apa yang saya lakukan secara berbeda. Apakah bergelombang hanya karena merobek sumur? Atau mungkin gelembung di bagian bawah gel pemisah/pemecahan?

Untuk gel saya, saya menjalankan dua gel secara bersamaan pada sistem Hoefer SE600. Karena saya memisahkan protein berat seperti itu, saya menjalankan gel pada suhu sekitar 7C selama sekitar 45 jam. Tegangan saya di gel susun adalah 70V dan kemudian saya meningkatkannya menjadi 200V di gel pemisah/penyelesaian.

Berikut adalah dua gel yang saya jalankan kemarin, keduanya menggambarkan masalah saya:
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4861" target="_blank">
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4862" target="_blank">

jika itu adalah ekstrak kasar mungkin mengandung garam yang mengganggu kinerja SDS-PAGE

Tapi itu tidak selalu terjadi dengan sampel yang sama.

Misalnya, pada gambar gel pertama, jalur 3, 7, dan 13 semuanya persis sama, tetapi hanya jalur 7 yang memiliki gelombang.

Anda juga dapat melihat halaman SDS &ldquoHall of Shameful Gels&rdquo ini http://www.ruf.rice.edu/

Terima kasih atas tipnya. Saya telah melihat aula gel yang memalukan sebelumnya, tetapi saya cukup yakin antarmuka penumpukan/pemisahan saya bersih dan lurus. Saya juga membilas sumur saya dengan running buffer beberapa kali sebelum memuat.

Saya akan mencoba membiarkan gel berpolimerisasi sedikit lebih lama, serta memastikan sumurnya lurus dan saya tidak melepas sisir dengan cepat atau kasar. Kami akan melihat apakah itu membantu.

selain saran di posting tertaut, jika Anda akan menjalankan gel pada 7C maka Anda harus menggunakan lithium dodecyl sulfate (lds) alih-alih sds. sds mengkristal pada suhu yang lebih rendah dan dapat menyebabkan segala macam kerusakan.

kami biasa memisahkan rantai berat myosin (dari otak) dengan gel gradien 3,5-5% dengan gradien urea 8-0M semalam berjalan pada 5mA (saya pikir, itu sudah lama sekali).


Pita yang diharapkan dalam gel poliakrilamida - Biologi

Prinsip HALAMAN Asli:

Native PAGE menggunakan bagian depan ion klorida dan glisin terputus yang sama seperti SDS-PAGE untuk membentuk batas bergerak yang menumpuk dan kemudian memisahkan polipeptida berdasarkan rasio muatan terhadap massa. Protein disiapkan dalam buffer sampel non-pereduksi non-denaturasi, yang mempertahankan struktur sekunder protein dan kepadatan muatan asli. Oleh karena itu Anda dapat dengan mudah melihat beberapa pita dari camshot gel PAGE asli Anda jika protein target Anda memiliki bentuk terpolimerisasi dalam sampel Anda. Dalam elektroforesis PAGE asli sebagian besar protein memiliki pl asam atau sedikit basa (titik isoelektrik) (

3-8) dan bermigrasi menuju kutub negatif. Jika pl protein Anda lebih besar dari 8,9, misalnya, Anda mungkin harus membalik anoda dan menjalankan gel PAGE asli.

Pelajari lebih lanjut tentang Native-PAGE:

  • Untuk sistem elektroforesis, sistem bio-rad direkomendasikan.
  • Untuk gel susun PAGE asli 5ml

*: Ditambahkan tepat sebelum digunakan.

Untuk gel pemisah PAGE asli 10ml:

Persentase asilamid 6% 8% 10% 12% 15%
Akrilamida/Bis-akrilamida (30%/0,8% b/v) 2ml 2.6ml 3.4ml 4ml 5ml
0,375M Tris-HCl(pH=8,8) 7.89ml 7.29ml 6.49ml 5.89ml 4.89ml
*10% (b/v) amonium persulfat (AP) 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
*TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl

*: Ditambahkan tepat sebelum digunakan.

Sampel penyangga (2x):

62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8
25% gliserol Gliserol
1% Bromofenol Biru

25 mM Tris
192 mM glisin

Catatan: menjalankan buffer harus

pH 8.3. Jangan menyesuaikan pH.

Protokol menjalankan gel:

1. Siapkan gel pemisah dalam jumlah yang sesuai dalam gelas kimia kecil, kemudian tambahkan vol tertentu. AP dan TEMED dan putar beaker secara perlahan untuk memastikan pencampuran yang cukup. Pipet larutan gel ke dalam celah antara pelat kaca pengecoran gel (Jangan terisi penuh). Isi ruang istirahat dengan air (sebagai alternatif isopropanol). Biarkan 20-30 menit untuk gelasi lengkap.

2. Anda dapat menyiapkan larutan gel susun saat gel pemisah sedang mengeras. Siapkan gel susun dalam jumlah yang sesuai dalam gelas kimia dan campur dengan 10% AP dan 1% TEMED. Tuangkan air pada langkah pertama dan pipet larutan gel susun ke dalam celah dan masukkan sisir. Biarkan 20-30 menit untuk membiarkannya menjadi gel.

3. Campur sampel Anda dengan buffer sampel. Jangan memanaskan sampel Anda!

4. Muat campuran sampel dan atur tegangan yang sesuai untuk menjalankan elektroforesis.

Catatan: Lebih baik meletakkan sistem di atas es dan tidak mengatur Volt relatif tinggi jika protein terdegradasi.

5. Lakukan pewarnaan seperti yang Anda lakukan pada protokol standar Coomassie-blue atau lanjutkan ke prosedur immuno-blotting (western-blot).


Catatan : Sebelum menjalankan gel pastikan gel, aparatus gel dan sampel sudah siap.

  1. Untuk merakit, keluarkan gel dari bingkai casting dan klem di peralatan gel. (Pastikan pelat pendek selalu menghadap ke dalam dan jika Anda hanya memiliki satu gel untuk dijalankan, gunakan pelat dummy yang tersedia untuk menyeimbangkan).
  2. Saat pelat telah diamankan, letakkan di dalam kaset dan kemudian kunci.
  3. Tempatkan mereka di tangki berjalan gel.
  4. Isi ruang dalam tangki dengan penyangga. (Sekarang mudah untuk melepas sisir, karena dilumasi).
  5. Lepaskan sisir dengan HATI-HATI (tanpa merusak sumur).
    [Sekarang gel siap memuat sampel]
  6. Bilas ujung pemuatan beberapa kali dengan air suling. (Pastikan bahwa semua air dituangkan sebelum memuat sampel.)
  7. Masukkan ujung pemuatan ke beberapa mm dari dasar sumur dan kirim sampel ke dalam sumur. Bilas jarum suntik dengan air suling setelah memuat beberapa kali.
  8. Pasang catu daya dengan meletakkan tutupnya (Pastikan sambungan sudah benar yaitu hitam - hitam dan merah - merah). Atur tegangan hingga 180 V dan jalankan selama 1 jam. (Jangan biarkan bagian depan pewarna keluar dari gel).

KESIMPULAN

Penggunaan pewarna dan bahan alternatif lain dalam simulasi elektroforesis gel DNA memberikan banyak manfaat selain penghematan biaya. Sebagian besar bahan yang dijelaskan mungkin sudah tersedia di sebagian besar laboratorium sekolah atau harus segera dibeli melalui pemasok laboratorium umum. Waktu dan tenaga juga dapat dihemat dengan menghilangkan kebutuhan untuk menyiapkan sampel DNA yang sebenarnya. Bahkan waktu kelas yang lebih berharga dapat dihemat dengan menghilangkan langkah-langkah tambahan yang diperlukan untuk menodai dan menghilangkan gel DNA untuk memvisualisasikan pita sekaligus meningkatkan keamanan laboratorium.

Penggunaan pewarna juga mengubah elektroforesis gel menjadi "waktu nyata", demonstrasi visual intuitif dari proses dan hasil elektroforesis. Karena pewarna terlihat bermigrasi dan terpisah dalam beberapa menit pertama, siswa dapat terlibat dengan cepat dan merasa lebih mudah untuk mempertahankan minat sementara instruktur mendorong eksplorasi selama waktu yang dibutuhkan untuk elektroforesis dengan pertanyaan yang sesuai. Tidak perlu menunggu sampai setelah pewarnaan gel untuk melihat efek elektroforesis.

Manfaat menggunakan elektroforesis gel berbasis pewarna tampaknya dihargai secara luas, melalui berbagai laporan informal dan kesaksian anekdot oleh siswa sekolah, guru, dan mahasiswa yang disampaikan kepada penulis. Kami hadir di sini satu set lengkap bahan pengganti yang efektif untuk simulasi elektroforesis gel DNA di sekolah. Hal ini juga diharapkan dapat mendukung para pendidik dalam merancang protokol pengajaran langsung mereka sendiri yang bermanfaat dan menarik.


Tonton videonya: Western blot protocol video (Februari 2023).