Informasi

RT-qPCR dari gen yang diekspresikan diferensial yang dipilih: pengenceran mana dalam kurva kalibrasi?

RT-qPCR dari gen yang diekspresikan diferensial yang dipilih: pengenceran mana dalam kurva kalibrasi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya telah melihat dalam pedoman MIQE bahwa kurva kalibrasi diperlukan saat melakukan RT-qPCR. Saya akan menggunakan DNA genom untuk melakukan kurva kalibrasi ini.

Pertanyaan saya adalah saya tidak tahu kisaran konsentrasi yang akan diuji.

Gen yang akan saya periksa untuk ekspresi diferensial memiliki logFC antara 2-8 (basis 2).

50 ng/μL adalah konsentrasi sampel yang akan saya miliki saat melakukan Eksperimen CT Perbandingan, tetapi 98% adalah RNA ribosom.

Tolong beri tahu saya saran Anda dan kemungkinan buku / makalah referensi untuk direvisi.


Ekspresi gen adalah proses di mana informasi dari gen digunakan dalam sintesis produk gen fungsional. Produk ini sering berupa protein, tetapi dalam gen penyandi nonprotein seperti gen rRNA atau gen tRNA, produknya adalah RNA struktural atau housekeeping. Selain itu, RNA non-coding kecil (miRNA, piRNA) dan berbagai kelas RNA non-coding panjang terlibat dalam berbagai fungsi pengaturan (Taft, R. Pang, KC Mercer, TR Dinger, M. dan Mattick, JS 2010 ).

Ketika mempelajari ekspresi gen dengan reaksi berantai polimerase waktu nyata (PCR), para ilmuwan biasanya menyelidiki perubahan – peningkatan atau penurunan – dalam ekspresi gen atau kumpulan gen tertentu dengan mengukur kelimpahan transkrip spesifik gen. Penyelidikan memantau respons gen terhadap pengobatan dengan senyawa atau obat yang diinginkan, di bawah serangkaian kondisi yang ditentukan. Studi ekspresi gen juga dapat melibatkan melihat profil atau pola ekspresi beberapa gen. Apakah menghitung perubahan tingkat ekspresi atau melihat keseluruhan pola ekspresi, PCR waktu nyata digunakan oleh sebagian besar ilmuwan yang melakukan ekspresi gen.


Pengantar

Sel mikroba yang tumbuh di bawah kondisi dan lingkungan yang sama sering dianggap sebagai populasi seragam yang dapat dijelaskan secara memadai dengan nilai rata-rata (Brehm-Stecher dan Johnson, 2004). Namun, bukti muncul bahwa populasi isogenik dari mikroorganisme yang tumbuh secara eksponensial memiliki heterogenitas sel ke sel yang substansial baik pada ekspresi gen dan tingkat laju pertumbuhan (Kelly dan Rahn, 1932, Maloney dan Rotman, 1973, Siegele dan Hu, 1997, Becskei et al., 2005, Kuang dkk., 2004, Colman-Lerner dkk., 2005, Golding dkk., 2005, Le dkk., 2005, Kaern dkk., 2005, Pedraza dan van Oudenaarden, 2005, Rosenfeld dkk., 2005, Strovas dkk., 2007, Strovas dan Lidstrom, 2009). Telah disarankan bahwa heterogenitas ekspresi gen dapat muncul dari stokastisitas, atau noise, dalam ekspresi gen setiap individu. Amplitudo kebisingan tersebut dalam ekspresi gen dikendalikan oleh banyak faktor, termasuk tingkat transkripsi, dinamika regulasi, dan faktor genetik sel (Banerjee et al., 2004, Colman-Lerner et al., 2005, Pedraza dan van Oudenaarden, 2005). , Rosenfeld et al., 2005, Newman et al., 2006, Strovas et al., 2007). Sebagai akibat dari faktor-faktor ini, sel-sel individu dalam populasi yang secara genetik homogen mengandung jumlah salinan molekul RNA (mRNA) yang berbeda, yang pada akhirnya dapat menyebabkan jumlah molekul protein yang berfungsi berbeda. Suara-suara itu, setelah diperkuat, dapat menawarkan kesempatan untuk menghasilkan heterogenitas jangka panjang pada tingkat sel dalam populasi mikroba klon. Selain itu, dalam ekosistem alami, sel mikroba dengan beragam genotipe dan fenotipe yang mengekspresikan jalur metabolisme berbeda, respons stres, dan aktivitas biologis spesifik lainnya disandingkan (Macfarlane dan Dillon, 2007). Mekanisme yang berkontribusi terhadap heterogenitas genetik dan fisiologis ini termasuk gradien kimia skala mikro, adaptasi dengan kondisi lingkungan lokal, ekspresi gen stokastik dan variasi genotipe yang terjadi melalui mutasi dan seleksi (Stewart dan Franklin, 2008). Heterogenitas ekspresi gen dari komunitas mikroba menunjukkan bahwa hanya dengan memanen mRNA atau protein dari seluruh populasi, pola unik ekspresi gen yang terkait dengan wilayah tertentu dari konsorsium atau subpopulasi fungsional yang berbeda dalam komunitas mungkin akan hilang. Selain itu, diperkirakan hanya kurang dari 1% spesies mikroba di lingkungan alami yang dapat dikultur dan diakses dengan metode analisis ekspresi gen tradisional yang biasanya membutuhkan sejumlah besar sel. Ada minat besar dalam memperoleh sel bakteri individu menggunakan metode seperti penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi dan kemudian menganalisis ekspresi gen secara langsung dalam sel bakteri tunggal.

Beberapa pendekatan telah diusulkan untuk mengukur ekspresi gen dalam sel bakteri tunggal, seperti pendekatan gen/protein reporter yang memanfaatkan protein fluoresen hijau atau luciferase (Golding et al., 2005, Le et al., 2005, Le et al., 2006, Cai et al., 2006, Yu et al., 2006, Strovas et al., 2007, Guet et al., 2008, Stewart dan Franklin, 2008, Strovas dan Lidstrom, 2009), probe fluoresen dalam fluoresensi di tempat percobaan hibridisasi (FISH) (Levsky et al., 2002, Capodieci et al., 2005), dan di tempat PCR dikombinasikan dengan di tempat transkripsi terbalik (di tempat RT-PCR) (Aoi, 2002). Namun, metode ini memerlukan galur yang direkayasa secara genetik atau protokol biologi molekuler yang sangat memakan waktu dan tenaga untuk mendapatkan pengukuran, dan oleh karena itu sangat sulit untuk meningkatkan hasil pengukurannya. Metode lain untuk analisis ekspresi gen adalah teknik deteksi molekul tunggal confocal (SMD) untuk mendeteksi molekul fluoresen tunggal dengan rasio signal-to-noise (SNR) yang tinggi. Namun, analisis ini biasanya memiliki persyaratan instrumen yang lebih tinggi dan juga sangat memakan waktu dan tenaga (Lu et al., 1998, Korn et al., 2003, Raj et al., 2008, Raj dan van Oudenaarden, 2009). Sebuah alternatif, pendekatan yang mungkin lebih mudah dan terukur, adalah dengan melakukan reverse-transcript (RT) polymerase chain reaction (PCR) secara langsung dalam sel bakteri tunggal (Kubista et al., 2006, Nolan et al., 2006). Digabungkan dengan berbagai metode penyortiran dan pengumpulan sel, beberapa protokol telah diterbitkan untuk analisis ekspresi gen oleh RT-qPCR untuk sel mamalia sel tunggal (Lindqvist et al., 2002, Hartshorn et al., 2007, Wacker et al., 2008, Taniguchi dkk., 2009, Li dkk., 2010). Protokol yang paling canggih diterbitkan oleh Taniguchi et al. (2009) yang menggunakan metode PCR kuantitatif yang menampilkan perpustakaan cDNA sel tunggal yang dapat digunakan kembali yang diimobilisasi pada manik-manik untuk mengukur ekspresi beberapa target cDNA (dari beberapa salinan hingga beberapa ratus ribu salinan) dalam satu sel mamalia, dan hasilnya menunjukkan bahwa kesalahan eksperimental kurang dari 15,9%, menunjukkan bahwa metode ini cukup akurat untuk menyelidiki heterogenitas sel tunggal.


Hasil

Semua gen referensi yang diuji menunjukkan tingkat ekspresi yang tinggi dengan CT nilai di bawah 35, seperti yang direkomendasikan sebelumnya 60 , dan dipilih untuk evaluasi lebih lanjut dari stabilitas ekspresi. Sebagai gen target, kami menggunakan prekursor kloroplas subunit IV pusat reaksi Fotosistem I (PSI) 44 dan Heat Stress Transcription factor A-1d (HSF) 61 .

Efisiensi RT-qPCR serupa antara dua konsentrasi untuk 12 gen kandidat (10 gen referensi dan 2 gen target) dan kami memilih konsentrasi terendah (yaitu 100 nM) untuk semua pasangan primer. Analisis kurva disosiasi setelah 40 siklus amplifikasi mengungkapkan bahwa semua pasangan primer memperkuat produk PCR tunggal dan elektroforesis gel dari produk PCR mengkonfirmasi ukuran amplikon yang diharapkan (data tidak ditampilkan). Semua PCR menampilkan koefisien korelasi yang lebih besar dari 0,95 dan efisiensi berkisar antara 88 dan 114% (Tabel 1 dan Gambar Tambahan S1). Replikasi variabilitas dari CT nilai antara 3 ulangan teknis diperiksa untuk setiap kombinasi sampel-gen. Pengulangan pengujian antara ulangan teknis konsisten di seluruh gen yang berbeda dengan variabilitas ulangan berada dalam batas siklus π.5 yang ditetapkan untuk semua kombinasi gen sampel yang diuji.

Seleksi dan validasi gen referensi terbaik untuk normalisasi akurat ekspresi gen di bawah batasan cahaya dilakukan menggunakan perangkat lunak geNorm 49 dalam paket perangkat lunak qbase+, BestKeeper 57 dan NormFinder 56 . Semua sampel diukur dalam proses yang sama untuk gen referensi yang diberikan (yaitu strategi maksimalisasi sampel 58 ). Stabilitas ekspresi gen referensi ditentukan oleh (i) M (stabilitas ekspresi rata-rata, nilai M yang lebih rendah sesuai dengan ekspresi gen yang lebih stabil) dalam perangkat lunak NormFinder dan geNorm (Gbr. 3A,B). Untuk sebagian besar gen referensi, nilai M berada di bawah 1, mencerminkan stabilitas relatif dalam menanggapi redaman cahaya, kecuali untuk gen S4 dan adenosylhomocysteinase (nilai M antara 1 dan 3 untuk NormFinder, Gambar 3A dan nilai M antara 1 dan 2,5 untuk geNorm, Gambar 3B). Namun, gen referensi kandidat menunjukkan rentang yang luas dalam nilai M mereka, ekspresi paling stabil di bawah batasan cahaya ditemukan untuk PolyA untuk NormFinder (M =𠂐.14, Gbr. 3A ) dan faktor inisiasi translasi 1 subunit beta untuk geNorm (M =𠂐.545 Gbr. 3B ). Analisis variasi berpasangan (V) kemudian digunakan untuk menentukan jumlah optimal gen referensi yang akan digunakan (yaitu dengan memperkirakan pengaruh memasukkan gen tambahan 55 . Vandesompele dkk. 55 mengusulkan variasi berpasangan sebesar 0,15 sebagai nilai batas fleksibel di bawahnya yang tidak memerlukan penyertaan gen referensi tambahan. Menurut nilai batas ini, hasil kami menunjukkan bahwa jumlah gen referensi yang optimal untuk secara akurat menormalkan ekspresi gen target dalam Z. muelleri dalam menanggapi keterbatasan cahaya adalah 4 (V4/5 =𠂐.115, Gbr. 3C). Penambahan gen referensi kelima tidak menghasilkan penurunan lebih lanjut dari faktor normalisasi, tetapi peningkatan yang cukup signifikan (V5/6 =𠂐.174, Gambar 3C).

Nilai stabilitas ekspresi rata-rata (seperti yang didefinisikan oleh Normfinder, A dan oleh geNorm, B) untuk setiap gen kandidat dan variasi berpasangan (seperti yang didefinisikan oleh geNorm, C) untuk penentuan jumlah optimal gen referensi untuk normalisasi. Garis putus-putus menunjukkan 0,15 sebagai nilai batas yang di bawahnya tidak diperlukan penyertaan gen referensi tambahan. S4: protein ribosom 30S S4 AHCY: Adenosylhomocysteinase 18S: protein ribosom 18S PoliA: Poli(A) RNA polimerase GADPH: Gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase TubB: rantai Tubulin beta-1 Calmo: Calmodulin EloF1b: Faktor inisiasi translasi 1 subunit beta EloF2b: Terjemahan faktor inisiasi 2 subunit beta.

Menggunakan BestKeeper, koefisien determinasi masing-masing gen memberikan reliabilitas tertinggi untuk GADPH, PolyA, S4 dan TubB ( Tabel 2 ). Perbandingan peringkat yang dihasilkan oleh tiga pendekatan (geNorm, Normfinder dan BestKeeper) menunjukkan perbedaan yang signifikan ( Tabel 3 ). Namun, dengan menggunakan paket RankAggreg kami dapat membuat daftar konsensus antara 3 algoritma yang berbeda. Daftar konsensus ini memasukkan PolyA, GADPH, ELOF1 dan TubB sebagai empat gen referensi terbaik (Tabel 3), yang kemudian digunakan untuk mengevaluasi profil ekspresi gen target di Z. muelleri di bawah batasan cahaya. Kuantifikasi relatif (55) menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen PSI dan HSF berbeda secara signifikan di bawah batasan cahaya dengan dua minggu perawatan naungan yang menghasilkan pengurangan tingkat ekspresi gen PSI 2 kali lipat (Gbr. 4A, Kontrol & #x02009=𠂑.303 ±𠂐.516 Cahaya redup =𠂐.665 ±𠂐.140 Uji-T, t3 =𠂒.295, p =𠂐.0416) dan dalam 9 kali lipat up-regulation untuk gen HSF ( Gbr. 4B , Control =𠂑.196 &# x000b1𠂐.567 Cahaya redup =�.217 ± 4.615 Uji-T, t3 =𠂒.196, p =𠂐.0465).

Ekspresi relatif PSI (Fotosistem I, subunit pusat reaksi IV, prekursor kloroplas, (A) dan HSF (faktor Transkripsi Tegangan Panas A-1d, (B) dinormalisasi ke konsensus empat gen referensi paling stabil (Poly(A) RNA polimerase, Gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase, Faktor inisiasi terjemahan 1 subunit beta dan rantai Tubulin beta-1). Perbedaan statistik antara rata-rata ditunjukkan sebagai *P <𠂐.05. Bilah kesalahan mewakili SEM dengan 3 ulangan biologis.

Meja 2

 GADPH18SEloF1tenangEloF2Bak BAktinAHCYPoliAS4
n6666666666
Rata-rata Geometris (Ct)24.2925.8724.1923.1026.2824.2925.9231.0528.6929.17
Standar deviasi (ଜt)0.971.550.890.841.060.990.692.760.754.23
Koefisien determinasi0.6860.2840.3080.3550.4970.6080.4560.0450.6770.638
nilai P0.0420.2760.2540.2130.1170.0670.1410.6890.0440.056

Tabel 3

GeNormPencari NormaPenjaga TerbaikKonsensus 3 genKonsensus 4 genKonsensus 5 genKonsensus 6 gen
EloF1PoliAGADPHPoliAPoliAGADPHGADPH
EloF2AktinPoliAGADPHGADPHPoliAPoliA
TenangGADPHS4EloF2EloF1EloF2EloF2
Bak BBak BBak B Bak BBak BBak B
GADPHEloF2EloF2  Aktintenang
PoliAtenangAktin   Aktin
AktinEloF1tenang    
18S18SEloF1    
AHCYAHCY18S    
S4S4AHCY    

Kandidat terdaftar dari atas ke bawah dalam urutan penurunan stabilitas ekspresi.


Hasil

EVALUASI KINERJA DUPLEX BCR-ABL1 DAN ABL1 UJI DENGAN RT-dPCR

Sebelum analisis klinis, eksperimen validasi dilakukan menggunakan platform QS3D. Tujuannya adalah untuk menilai karakteristik kinerja dari uji RT-qPCR yang diterapkan secara klinis pada platform RT-dPCR. Pengenceran plasmid ERM-AD623 dan Wessex digunakan untuk mengukur dan membandingkan 2 target (BCR-ABL1 dan ABL1). Karakteristik kinerja yang dievaluasi termasuk pengaturan reaksi (konsentrasi probe primer, suhu anil, dan perbandingan reaksi uniplex dan duplex juga dinilai pada 2 platform digital lainnya), linearitas dan sensitivitas pengujian, dan identifikasi bias antara 2 target ( lihat Gambar Tambahan online. S2–S6).

Menggunakan bahan referensi ERM-AD623, reaksi dupleks dilakukan dengan hasil yang sebanding dengan reaksi uniplex. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam konsentrasi terukur (P = 0,385) (lihat Gambar Tambahan online. S6A). Untuk rentang yang diselidiki, rasio antara 2 target tidak menunjukkan penyimpangan yang signifikan dari rasio yang diharapkan dari 1 (P = 0,471 lihat Gambar Tambahan online. S6B). Oleh karena itu, percobaan dupleks digunakan untuk sisa penelitian.

Linearitas dipertahankan di seluruh rentang pengenceran untuk kedua target dengan R 2 dari 0,99 (lihat Gambar Tambahan online. S6C). Pengenceran plasmid Wessex inhouse disiapkan dan diukur dibandingkan dengan yang diperoleh dengan standar ERM-AD623. Sebagai konsentrasi mantan ditentukan oleh spektrofotometri, perbandingan dengan bahan referensi ERM-AD623 digunakan untuk menentukan apakah faktor konversi diperlukan. Bias sistematis yang sangat signifikan sekitar 50% diidentifikasi dengan plasmid Wessex dibandingkan dengan ERM-AD623 (P < 0,0001) (lihat Gambar Tambahan online. S7A). Bias serupa juga diidentifikasi dalam studi evaluasi ERM (12) dan dijelaskan oleh penetapan nomor salinan dengan asumsi plasmid Wessex untai tunggal, tetapi plasmid ERM untai ganda. Menggunakan plot Rasio Bland-Altman faktor konversi 0,46 dihitung dan digunakan untuk sisa penelitian. Yang penting, tidak ada perbedaan signifikan dalam rasio kedua target (lihat Gambar Tambahan online. S7B).

EVALUASI dPCR UNTUK KUANTIFIKASI SAMPEL KLINIK

Untuk semua sampel klinis BCR-ABL1 dan ABL1 transkrip diukur dengan RT-qPCR dan RT-dPCR pada sampel cDNA yang sama, dan rasio persentase antara 2 target dibandingkan. Untuk platform QS3D, 2 negatif ABL1 populasi diamati di semua sampel. Ini tidak dipisahkan dengan jelas satu sama lain, tetapi jelas berbeda dari populasi partisi positif (lihat Gambar Tambahan online. S8). Investigasi subset sampel cDNA yang diobati dengan dan tanpa DNase, selain menggunakan yang berbeda ABL1 tes, mengidentifikasi penyebab masalah ini menjadi kontaminasi DNA genom dari proses ekstraksi. Oleh karena itu, dalam semua analisis QS3D, populasi negatif tambahan dimasukkan dalam penghitungan partisi negatif dengan menyesuaikan nilai ambang intensitas fluoresen (lihat Gambar Tambahan S8) online. Ini tidak diamati dalam percobaan dengan 2 platform tetesan.

ABL1 nomor salinan transkrip mengukur semua 3 platform RT-dPCR menunjukkan korelasi yang baik dengan RT-qPCR di semua kelompok sampel (R 2 = 0,91, 0,93, dan 0,95 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing Gambar 1A). Kuantifikasi RT-dPCR dari BCR-ABL1 nomor salinan transkrip berkorelasi baik dengan RT-qPCR di ketiga platform hanya hingga 0,1% (R 2 = 0,85, 0,94, dan 0,92 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing Gambar 1B). Di bawah 0,1%, sementara korelasi jumlah salinan antara RT-qPCR dan pengukuran 3 RT-dPCR dipertahankan, RT-dPCR menghasilkan variasi yang lebih besar dalam pengukuran ulangan untuk setiap sampel yang tidak diamati untuk pengukuran pasangan RT-qPCR. Menariknya, konsentrasi nomor salinan untuk BCR-ABL1 transkrip serupa di 4 platform sementara ABL1 konsentrasi menunjukkan lebih banyak variabilitas. Sebagai %BCR-ABL1 IS secara intrinsik terkait dengan konsentrasi jumlah salinan untuk kedua target, peningkatan variabilitas dari ABL1 transkrip menghasilkan %BCR-ABL IS sering bervariasi dengan 1 urutan besarnya bila dibandingkan dengan RT-qPCR (R 2 = 0,89, 0,92, 0,97 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing Gambar 1C). Selain itu, tidak ada platform yang mampu secara substansial meningkatkan sensitivitas kuantifikasi oleh RT-qPCR pada sampel pasien dengan %BCR-ABL1 tingkat IS <0,001%.

Perbandingan RT-qPCR dengan RT-dPCR untuk kuantifikasi BCR-ABL1 dan ABL1 nomor salinan transkrip dalam sampel klinis.

Plot pencar yang menunjukkan hubungan linier antara kuantifikasi (A), BCR-ABL1, (B), ABL1, dan C), %BCR-ABL1 ADALAH . Kuantifikasi cDNA yang berasal dari sampel klinis dengan RT-qPCR (x-sumbu) dibandingkan dengan platform QS3D (biru), QX200 (hijau), dan RainDrop (merah). Setiap titik data mewakili nilai rata-rata yang berasal dari reaksi rangkap tiga atau 9 ulangan. Koefisien korelasi adalah sebagai berikut: (R 2 = 0,91, 0,93, 0,95 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing) untuk ABL1 nomor salinan transkrip (R 2 = 0,85, 0,94, 0,92 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing) untuk BCR-ABL1 nomor salinan transkrip (R 2 = 0,89, 0,92, 0,97 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing) untuk %BCR-ABL1 ADALAH .

Plot pencar yang menunjukkan hubungan linier antara kuantifikasi (A), BCR-ABL1, (B), ABL1, dan C), %BCR-ABL1 ADALAH . Kuantifikasi cDNA yang berasal dari sampel klinis dengan RT-qPCR (x-sumbu) dibandingkan dengan platform QS3D (biru), QX200 (hijau), dan RainDrop (merah). Setiap titik data mewakili nilai rata-rata yang berasal dari reaksi rangkap tiga atau 9 ulangan. Koefisien korelasi adalah sebagai berikut: (R 2 = 0,91, 0,93, 0,95 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing) untuk ABL1 nomor salinan transkrip (R 2 = 0,85, 0,94, 0,92 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing) untuk BCR-ABL1 nomor salinan transkrip (R 2 = 0,89, 0,92, 0,97 untuk QS3D, QX200, RainDrop, masing-masing) untuk %BCR-ABL1 ADALAH .

Saat menggunakan QS3D, ada korelasi yang baik hingga sekitar 20 salinan BCR-ABL1 transkrip, di bawah mana dataran tinggi diamati (Gbr. 2). Untuk kuantifikasi 2 kategori CML residual terendah, 0,001% (di mana RT-qPCR mengembalikan nilai konsisten 1 salinan per 3 L cDNA untuk semua 10 pasien) dan <0,001% (di mana hasil qPCR negatif), semua 3 RT Instrumen -dPCR mendeteksi amplifikasi BCR-ABL1 target (Gbr. 2). Namun, kelompok kontrol non-CML juga menunjukkan pengukuran positif untuk BCR-ABL1 yang membuat pengukuran yang diperoleh pada kelompok penyakit rendah tidak dapat dibedakan dari kebisingan latar belakang normal (Gbr. 2). Seperti yang diharapkan, RT-qPCR secara konsisten negatif tanpa BCR-ABL1 transkrip diukur dalam kategori <0.001% (sampel dalam kategori ini dipilih berdasarkan pembacaan nol oleh RT-qPCR), tetapi terdeteksi 1-3 salinan di beberapa kelompok pasien kontrol dan NTC. Platform QS3D dan Raindrop memiliki tingkat positif palsu yang cukup besar (FPR) dalam reaksi NTC sementara hanya satu tetesan positif yang diamati pada 1 dari 30 reaksi NTC menggunakan platform QX200 (Gbr. 2).

Perbandingan dari BCR-ABL1 nomor salinan transkrip diukur per reaksi pada pasien tingkat penyakit rendah (≤0,01%) dan sampel kontrol yang cocok.

3 pasien tingkat penyakit rendah yang diukur dengan RT-qPCR (0,01%, 0,001%, dan <0,001%) ditunjukkan dengan kontrol non-CML yang cocok (SNH dan SNB) yang nominalnya 0% BCR-ABL1 ADALAH . Reaksi NTC dihasilkan dengan air sebagai pengganti cDNA. Plot kotak menunjukkan rentang median dan interkuartil dengan kumis yang menunjukkan titik data minimum dan maksimum dari 9 ulangan untuk setiap platform. Garis horizontal putus-putus menunjukkan nol BCR-ABL1 salinan transkrip per reaksi.

3 pasien tingkat penyakit rendah yang diukur dengan RT-qPCR (0,01%, 0,001%, dan <0,001%) ditunjukkan dengan kontrol non-CML yang cocok (SNH dan SNB) yang nominalnya 0% BCR-ABL1 ADALAH . Reaksi NTC dihasilkan dengan air sebagai pengganti cDNA. Plot kotak menunjukkan rentang median dan interkuartil dengan kumis yang menunjukkan titik data minimum dan maksimum dari 9 ulangan untuk setiap platform. Garis horizontal putus-putus menunjukkan nol BCR-ABL1 salinan transkrip per reaksi.

Untuk platform QX200, dataran tinggi itu kurang menonjol dibandingkan dengan yang diamati dengan QS3D. FPR terlihat lebih rendah daripada platform QS3D dan Raindrop. Namun, untuk QX200, pembacaan yang diperoleh dari 3 kategori CML terendah (≤0,01%) tidak dapat dibedakan dari kelompok pasien kontrol negatif (Gbr. 2). Hanya platform Raindrop yang mampu mengukur % BCR-ABL1 IS dalam kisaran <0,001% pada tingkat yang lebih tinggi dari FPR pada kelompok pasien kontrol (Gbr. 2). Ini mungkin terkait dengan volume cDNA yang lebih besar yang ditambahkan ke setiap reaksi (10 L dibandingkan dengan 1 L). Namun, dalam sampel pasien CML, platform Raindrop tidak mengidentifikasi perbedaan dalam BCR-ABL1 transkrip dibandingkan dengan tingkat penyakit mereka ditugaskan oleh RT-qPCR (0,01%, 0,001% atau <0,001% Gambar. 2).

Kami mengeksplorasi efek dari jumlah yang berbeda dari cDNA input pada sensitivitas dengan melakukan 9 reaksi ulangan pada platform dPCR dengan 20.000 partisi (yaitu, menggunakan total 9 mikroliter cDNA) untuk sampel yang diketahui berada di bawah MMR (0,1% IS) sebagai a berarti untuk menguji volume cDNA yang lebih besar per sampel. Ini meningkatkan presisi kuantitatif tetapi tidak meningkatkan sensitivitas tes.


Validasi gen referensi untuk normalisasi RT-qPCR pada kacang umum selama cekaman biotik dan abiotik

Pemilihan gen referensi merupakan pertimbangan penting untuk meningkatkan presisi dan kualitas analisis ekspresi relatif dengan metode RT-PCR kuantitatif. Stabilitas delapan tag urutan yang diekspresikan dievaluasi untuk menentukan gen referensi potensial untuk mempelajari ekspresi diferensial gen target kacang umum di bawah biotik (interaksi yang tidak kompatibel antara kacang dan jamur biasa Colletotrichum lindemuthianum) dan tekanan abiotik (kekeringan salinitas suhu dingin). Efisiensi kurva amplifikasi dan siklus kuantifikasi (C Q) ditentukan menggunakan perangkat lunak LinRegPCR. Stabilitas gen referensi kandidat diperoleh dengan menggunakan perangkat lunak geNorm dan NormFinder, sedangkan normalisasi ekspresi diferensial gen target [beta-1,3-glukanase 1 (BG1) gen untuk stres biotik dan pengikatan elemen responsif dehidrasi (DREB) gen untuk stres abiotik] didefinisikan oleh perangkat lunak REST. Stabilitas tinggi diperoleh untuk enzim pendegradasi insulin (IDE), bertindak-11 (UU11), tidak diketahui 1 (Ukn1) dan tidak diketahui 2 (Ukn2) gen selama stres biotik, dan untuk SKP1/ASK-protein interaksi 16 (Lewati 16), UU11, Tubulin beta-8 (β-bak 8) dan Unk1 gen di bawah tekanan abiotik. Namun, IDE dan UU11 diindikasikan sebagai kombinasi terbaik dari gen referensi untuk analisis cekaman biotik, sedangkan Lewati 16 dan UU11 gen adalah kombinasi terbaik untuk mempelajari stres abiotik. Gen-gen ini harus berguna dalam normalisasi ekspresi gen dengan analisis RT-PCR pada kacang biasa, legum yang paling penting yang dapat dimakan.

Ini adalah pratinjau konten langganan, akses melalui institusi Anda.


Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Luis Roberto Aguiar atas bantuannya dalam membesarkan banyak ratu yang dibutuhkan untuk penelitian ini, Gustavo Jacomini Tiberio atas bantuannya dalam pembedahan ovarium, dan Dr. Karina R. Guidugli-Lazzarini atas bantuannya dalam pengujian RT-qPCR. Studi ini menerima dukungan keuangan dari Fundação de Amparo Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, nomor hibah 2014/08147-3 , 2011/03171-5 , 2012/01808/-9 ) dan Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq , hibah nomor 303401/2014-1 ).


Latar belakang

Infeksi sistemik yang disebabkan oleh bakteri Gram-negatif Francisella noatunensis tetap menjadi ancaman serius bagi cod Atlantik Gadhu morhua L. bertani di Norwegia. Penyakit serupa yang terkait dengan strain yang berbeda dari F. noatunensis telah dilaporkan pada ikan air tawar dan air laut yang dibudidayakan di Taiwan dan Jepang [1] Chili [2], Amerika [3], dan Inggris [4]. Kesenjangan pengetahuan yang besar ada, bagaimanapun, dalam kaitannya dengan patogenesis dan mekanisme perkembangan penyakit. Analisis genom terbaru telah mengungkapkan adanya beberapa lokus penentu virulensi pada patogen ikan Francisella spp., yang berbagi identitas urutan tingkat tinggi dengan patogen manusia F. tularensis[5]. Beberapa gen yang paling menarik dilokalisasi pada 33-kb Francisella Pathogenicity Island (FPI) [6,7], termasuk gen operon lokus pertumbuhan intraseluler iglABCD. NS iglC gen juga telah terbukti penting untuk virulensi dalam F. noatunensis sp. orientalis[8,9].

Salah satu cara untuk menyelidiki patogenesis penyakit pada tingkat molekuler adalah dengan analisis reverse transcription kuantitatif PCR (RT-qPCR) transkripsi gen pada berbagai tahap perkembangan penyakit. Namun, penggunaan RT-qPCR untuk studi transkripsi gen memiliki kelemahan. Metode ini memiliki persyaratan intrinsik untuk normalisasi tingkat transkripsi gen target terhadap gen referensi untuk memastikan interpretasi data yang dapat diandalkan, seperti yang dicontohkan oleh Dedha et al. [10], dan Guitierrez et al. [11]. Penggunaan minimal tiga gen referensi yang divalidasi telah disarankan [12]. Demikian pula, pentingnya standarisasi teknik ekstraksi RNA, evaluasi kualitas RNA dan penggunaan gen referensi telah ditekankan dalam beberapa publikasi [13-15].

Dalam penelitian ini, stabilitas transkripsi dari delapan gen referensi di Francisella noatunensis sp. diselidiki di bawah tiga kondisi lingkungan yang berbeda menggunakan perangkat lunak berbasis excel geNorm [12]. Untuk secara akurat mengukur perubahan tingkat transkripsi target mRNA tertentu, iglC gen dipilih dan dinormalisasi terhadap gen referensi yang dipilih yang mengalami kondisi pertumbuhan yang sama menggunakan protokol yang ditetapkan.


Informasi penulis

Afiliasi

Université de Toulouse INSA, UPS, INP LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077, Toulouse, Prancis

Agustina Llanos, Jean Marie François & Jean-Luc Parrou

INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400, Toulouse, Prancis

Agustina Llanos, Jean Marie François & Jean-Luc Parrou

CNRS, UMR5504, F-31400, Toulouse, Prancis

Agustina Llanos, Jean Marie François & Jean-Luc Parrou

Cinabio-Adisseo France S.A.S., 135 Avenue de Rangueil, 31077, Toulouse, Prancis

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Penulis yang sesuai


Referensi

AbuQamar, S., Chai, M.-F., Luo, H., Lagu, F., dan Mengiste, T. (2008). Protein kinase 1b tomat memediasi pensinyalan respons tanaman terhadap jamur nekrotrofik dan herbivora serangga. Sel tanaman 20, 1964�. doi: 10.1105/tpc.108.059477

AbuQamar, S., Chen, X., Dhawan, R., Bluhm, B., Salmeron, J., Lam, S., dkk. (2006). Profil ekspresi dan analisis mutan mengungkapkan jaringan regulasi kompleks yang terlibat dalam respons Arabidopsis terhadap infeksi Botrytis. Tanaman J 48, 28�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2006.02849.x

Alba, R., Payton, P., Fei, Z., McQuinn, R., Debbie, P., Martin, G. B., dkk. (2005). Analisis transkriptom dan metabolit terpilih mengungkapkan beberapa titik kontrol etilen selama pengembangan buah tomat. Sel tanaman 17, 2954�. doi: 10.1105/tpc.105.036053

Audenaert, K., Pattery, T., Cornelis, P., dan H཯te, M. (2002). Induksi resistensi sistemik terhadap Botrytis cinerea dalam tomat oleh Pseudomonas aeruginosa 7NSK2: peran asam salisilat, pyochelin, dan pyocyanin. mol. Tumbuhan Mikroba Berinteraksi. 15, 1147�. doi: 10.1094/MPMI.2002.15.11.1147

Ballini, E., Nguyen, T. T., dan Morel, J.-B. (2013). Keanekaragaman dan genetika kerentanan yang diinduksi nitrogen terhadap jamur blas pada beras dan gandum. Beras 6:32. doi: 10.1186/1939-8433-6-32

Benjamini, Y., dan Hochberg, Y. (1995). Mengontrol tingkat penemuan palsu: pendekatan praktis dan kuat untuk beberapa pengujian. Statistik J.R. Soc B doi: 10.1198/016214504000001907

Berger, S., Sinha, A. K., dan Roitsch, T. (2007). Fisiologi tanaman bertemu dengan fitopatologi: metabolisme primer tanaman dan interaksi patogen tanaman. J. Eks. Bot. 58, 4019�. doi: 10.1093/jxb/erm298

Berrocal-Lobo, M., Molina, A., dan Solano, R. (2002). Ekspresi konstitutif ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 di Arabidopsis memberikan resistensi terhadap beberapa jamur nekrotrofik. Tanaman J 29, 23�. doi: 10.1046/j.1365-313x.2002.01191.x

Blanco-Ulate, B., Vincenti, E., Powell, A. L. T., dan Cantu, D. (2013). Transkriptom tomat dan analisis mutan menunjukkan peran hormon stres tanaman dalam interaksi antara buah dan Botrytis cinerea. Depan. Ilmu Tanaman. 4:142. doi: 10.3389/fpls.2013.00142

Bolton, M.D. (2009). Metabolisme primer dan pertahanan tanaman�han bakar untuk api. mol. Tumbuhan Mikroba Berinteraksi. 22, 487�. doi: 10.1094/MPMI-22-5-0487

Boyle, E. I., Weng, S., Golub, J., Jin, H., dan Botstein, D. (2004). GO:: TermFinder—perangkat lunak sumber terbuka untuk mengakses informasi Ontologi Gen dan menemukan istilah Ontologi Gen yang diperkaya secara signifikan terkait dengan daftar gen. Bioinformatika 20, 3710�. doi: 10.1093/bioinformatika/bth456

Breitling, R., Armengaud, P., Amtmann, A., dan Herzyk, P. (2004). Peringkat produk: metode baru yang sederhana, namun kuat, untuk mendeteksi gen yang diatur secara berbeda dalam eksperimen microarray yang direplikasi. FEBS Lett. 573, 83�. doi: 10.1016/j.febslet.2004.07.055

Caarls, L., Pieterse, C. M. J., dan Van Wees, S. C. M. (2015). Bagaimana asam salisilat mengambil kendali transkripsi atas pensinyalan asam jasmonic Depan. Ilmu Tanaman. 6:170. doi: 10.3389/fpls.2015.00170

Cama༞s, G., Pastor, V., Cerezo, M., Garc໚-Andrade, J., Vicedo, B., Garc໚-Agustín, P., dkk. (2012). Penghapusan di NRT2.1 melemahkan gangguan hormonal yang diinduksi Pseudomonas syringae, menghasilkan pertahanan tanaman yang prima. Fisiol Tumbuhan. 158, 1054�. doi: 10.1104/pp.111.184424

Canessa, P., Schumacher, J., Hevia, M. A., Tudzynski, P., dan Larrondo, L. F. (2013). Menilai efek cahaya pada diferensiasi dan virulensi patogen tanaman Botrytis cinerea: karakterisasi Kompleks Kerah Putih. PLoS SATU 8:e84223. doi: 10.1371/journal.pone.0084223

Cantu, D., Blanco-Ulate, B., Yang, L., Labavitch, J. M., Bennett, A. B., dan Powell, A. L. T. (2009). Kerentanan buah tomat yang diatur pematangannya terhadap botrytis cinerea membutuhkan NOR tetapi tidak RIN atau Etilen. Fisiol Tumbuhan. 150, 1434�. doi: 10.1104/pp.109.138701

Cantu, D., Vicente, A. R., Greve, L. C., Dewey, F. M., Bennett, A. B., Labavitch, J. M., dkk. (2008). Persimpangan antara pembongkaran dinding sel, pematangan, dan kerentanan buah terhadap Botrytis cinerea. Prok. Natal akad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 105, 859�. doi: 10.1073/pnas.0709813105

Castro Marín, I., Loef, I., Bartetzko, L., Searle, I., Coupland, G., Stitt, M., dkk. (2010). Nitrate regulates floral induction in Arabidopsis, acting independently of light, gibberellin and autonomous pathways. tanaman 233, 539�. doi: 10.1007/s00425-010-1316-5

Catinot, J., Huang, J. B., and Huang, P. Y. (2015). ETHYLENE RESPONSE FACTOR 96 positively regulates Arabidopsis resistance to necrotrophic pathogens by direct binding to GCC elements of jasmonate𠄺nd …. Tanaman. doi: 10.1111/pce.12583

Davidson, J. A., Pande, S., Bretag, T. W., Lindbeck, K. D., and Krishna-Kishore, G. (2007). 𠇋iology and management of botrytis spp. in legume crops,” in Botrytis: Biology, Pathology and Control, eds Y. Elad, B. Williamson, P. Tudzynski, and N. Delen (Dordrecht: Springer), 295�. doi: 10.1007/978-1-4020-2626-3_16

Dean, R., van Kan, J. A. L., Pretorius, Z. A., Hammond-Kosack, K. E., Di Pietro, A., Spanu, P. D., et al. (2012). The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. mol. Plant Pathol. 13, 414�. doi: 10.1111/J.1364-3703.2011.00783.X

Dechorgnat, J., Patrit, O., Krapp, A., Fagard, M., and Daniel-Vedele, F. (2012). Characterization of the Nrt2.6 gene in Arabidopsis thaliana: a link with plant response to biotic and abiotic stress. PLoS SATU 7:e42491. doi: 10.1371/journal.pone.0042491

Dekkers, B. J. W., Willems, L., Bassel, G. W., van Bolderen-Veldkamp, R. P. M., Ligterink, W., Hilhorst, H. W. M., et al. (2012). Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Fisiol Sel Tumbuhan. 53, 28�. doi: 10.1093/pcp/pcr113

D໚z, J., ten Have, A., and van Kan, J. A. (2002). The role of ethylene and wound signaling in resistance of tomato to Botrytis cinerea. Plant Physiol. 129, 1341�. doi: 10.1104/pp.001453

Dietrich, R., Plo, ß. K., and Heil, M. (2004). Constitutive and induced resistance to pathogens in Arabidopsis thaliana depends on nitrogen supply. Plant Cell Environ. 27, 896�. doi: 10.1111/j.1365-3040.2004.01195.x

Dordas, C. (2008). Role of nutrients in controlling plant diseases in sustainable agriculture. A Rev. Agron. Mempertahankan. Dev. 28, 33�. doi: 10.1051/agro:2007051

Edgar, R., Domrachev, M., and Lash, A. E. (2002). Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Asam Nukleat Res. 30, 207�. doi: 10.1093/nar/30.1.207

Edwards, K., Johnstone, C., and Thompson, C. (1991). A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Asam Nukleat Res. 19, 1349.

Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., and Botstein, D. (1998). Analisis klaster dan tampilan pola ekspresi seluruh genom. Prok. Natal akad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 95, 14863�

Fagard, M., Launay, A., Clément, G., Courtial, J., Dellagi, A., Farjad, M., et al. (2014). Nitrogen metabolism meets phytopathology. J. Eks. Bot. 65, 5643�. doi: 10.1093/jxb/eru323

Farmer, E. E., Alméras, E., and Krishnamurthy, V. (2003). Jasmonates and related oxylipins in plant responses to pathogenesis and herbivory. Curr. pendapat. Tumbuhan Biol. 6, 372�. doi: 10.1016/S1369-5266(03)00045-1

Ferrari, S., Plotnikova, J. M., and De Lorenzo, G. (2003). Arabidopsis local resistance to Botrytis cinerea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2, but not SID2, EDS5 or PAD4. Tanaman J 35, 193�. doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01794.x

Fu, Y., Yi, H., Bao, J., and Gong, J. (2015). LeNRT2.3 functions in nitrate acquisition and long-distance transport in tomato. FEBS Lett. 589, 1072�. doi: 10.1016/j.febslet.2015.03.016

Gachon, C., and Saindrenan, P. (2004). Real-time PCR monitoring of fungal development in Arabidopsis thaliana infected by Alternaria brassicicola and Botrytis cinerea. Plant Physiol. Biokimia. 42, 367�. doi: 10.1016/j.plaphy.2004.04.001

Gautier, L., Cope, L., Bolstad, B. M., and Irizarry, R. A. (2004). affy𠅊nalysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level. Bioinformatika 20, 307�. doi: 10.1093/bioinformatics/btg405

Giovannoni, J. J. (2007). Fruit ripening mutants yield insights into ripening control. Curr. pendapat. Tumbuhan Biol. 10, 283�. doi: 10.1016/j.pbi.2007.04.008

Glazebrook, J. (2005). Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. annu. Pdt. Fitopatol. 43, 205�. doi: 10.1146/annurev.phyto.43.040204.135923

Good, A. G., Shrawat, A. K., and Muench, D. G. (2004). Can less yield more? Is reducing nutrient input into the environment compatible with maintaining crop production? Tren Tanaman Sci. 9, 597�. doi: 10.1016/j.tplants.2004.10.008

Hey, S. J., Byrne, E., and Halford, N. G. (2010). The interface between metabolic and stress signalling. Ann. Bot. 105, 197�. doi: 10.1093/aob/mcp285

Hirel, B., Tétu, T., Lea, P. J., and Dubois, F. (2011). Improving nitrogen use efficiency in crops for sustainable agriculture. Keberlanjutan 3, 1452�. doi: 10.3390/su3091452

Hoffland, E., Jeger, M. J., and van Beusichem, M. L. (2000). Effect of nitrogen supply rate on disease resistance in tomato depends on the pathogen. Plant Soil 218, 239�. doi: 10.1023/A:1014960507981

Hoffland, E., van Beusichem, M. L., and Jeger, M. J. (1999). Nitrogen availability and susceptibility of tomato leaves to Botrytis cinerea. Plant Soil 210, 263�. doi: 10.1023/A:1004661913224

Hwang, I. S., An, S. H., and Hwang, B. K. (2011). Pepper asparagine synthetase 1 (CaAS1) is required for plant nitrogen assimilation and defense responses to microbial pathogens. Tanaman J 67, 749�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2011.04622.x

Irizarry, R. A., Hobbs, B., Collin, F., Beazer-Barclay, Y. D., Antonellis, K. J., Scherf, U., et al. (2003). Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostat. 4, 249�. doi: 10.1093/biostatistics/4.2.249

Jones, P., Binns, D., Chang, H.-Y., Fraser, M., Li, W., McAnulla, C., et al. (2014). InterProScan 5: genome-scale protein function classification. Bioinformatika 30, 1236�. doi: 10.1093/bioinformatics/btu031

Kachroo, P., Shanklin, J., Shah, J., Whittle, E. J., and Klessig, D. F. (2001). A fatty acid desaturase modulates the activation of defense signaling pathways in plants. Prok. Natal akad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 98, 9448�. doi: 10.1073/pnas.151258398

Kangasjärvi, S., Neukermans, J., Li, S., Aro, E.-M., and Noctor, G. (2012). Photosynthesis, photorespiration, and light signalling in defence responses. J. Eks. Bot. 63, 1619�. doi: 10.1093/jxb/err402

Kliebenstein, D. J., Rowe, H. C., and Denby, K. J. (2005). Secondary metabolites influence Arabidopsis/Botrytis interactions: variation in host production and pathogen sensitivity. Tanaman J 44, 25�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02508.x

Lamb, C., and Dixon, R. A. (1997). The oxidative burst in plant disease resistance. annu. Pdt. Fisiol Tumbuhan. Tanaman Mol. Biol. 48, 251�. doi: 10.1146/annurev.arplant.48.1.251

Lau, G., and Hamer, J. E. (1996). Regulatory genes controlling MPG1 expression and pathogenicity in the rice blast fungus magnaporthe grisea. Sel tanaman 8, 771�. doi: 10.1105/tpc.8.5.771

Lecompte, F., Abro, M. A., and Nicot, P. C. (2010). Contrasted responses of Botrytis cinerea isolates developing on tomato plants grown under different nitrogen nutrition regimes. Plant Pathol. 59, 891�. doi: 10.1111/j.1365-3059.2010.02320.x

Lecompte, F., Abro, M. A., and Nicot, P. C. (2013). Can plant sugars mediate the effect of nitrogen fertilization on lettuce susceptibility to two necrotrophic pathogens: Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum? Plant Soil 369, 387�. doi: 10.1007/s11104-012-1577-9

Li, C., He, X., Luo, X., Xu, L., Liu, L., Min, L., et al. (2014). Cotton WRKY1 mediates the plant defense-to-development transition during infection of cotton by Verticillium dahliae by activating JASMONATE ZIM-DOMAIN1 expression. Plant Physiol. 166, 2179�. doi: 10.1104/pp.114.246694

Li, J., Brader, G., and Palva, E. T. (2004). The WRKY70 transcription factor: a node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. Sel tanaman 16, 319�. doi: 10.1105/tpc.016980

Li, L., Stoeckert, C. J. Jr., and Roos, D. S. (2003). OrthoMCL: identification of ortholog groups for eukaryotic genomes. Res. Genom 13, 2178�. doi: 10.1101/gr.1224503

Linquist, B. A., Byous, E., Jones, G., Williams, J. F., and Six, J. (2008). Nitrogen and potassium fertility impacts on aggregate sheath spot disease and yields of rice. Plant Prod. Sci. 11, 260�. doi: 10.1626/pps.11.260

Liu, G., Ji, Y., Bhuiyan, N. H., Pilot, G., Selvaraj, G., Zou, J., et al. (2010). Amino acid homeostasis modulates salicylic acid-associated redox status and defense responses in Arabidopsis. Sel tanaman 22, 3845�. doi: 10.1105/tpc.110.079392

Long, D. H., Lee, F. N., and TeBeest, D. O. (2007). Effect of nitrogen fertilization on disease progress of rice blast on susceptible and resistant cultivars. Tanaman Dis. 84, 403�. doi: 10.1094/PDIS.2000.84.4.403

Lorenzo, O., Piqueras, R., Sánchez-Serrano, J. J., and Solano, R. (2003). ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Sel tanaman 15, 165�. doi: 10.1105/tpc.007468

Løvdal, T., and Lillo, C. (2009). Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to nitrogen, cold, and light stress. dubur. Biokimia. 387, 238�. doi: 10.1016/j.ab.2009.01.024

Masclaux-Daubresse, C., and Daniel-Vedele, F. (2010). Nitrogen uptake, assimilation and remobilization in plants: challenges for sustainable and productive agriculture. Ann Bot. 105, 1141�. doi: 10.1093/aob/mcq028

Massad, T. J., Dyer, L. A., and Vega, C. G. (2012). Costs of defense and a test of the carbon-nutrient balance and growth-differentiation balance hypotheses for two co-occurring classes of plant defense. PLoS SATU 7:e47554. doi: 10.1371/journal.pone.0047554

Mathioni, S. M., Bel, ó. A., Rizzo, C. J., Dean, R. A., and Donofrio, N. M. (2011). Transcriptome profiling of the rice blast fungus during invasive plant infection and in vitro stresses. BMC Genomics 12:049. doi: 10.1186/1471-2164-12-49

McGrath, K. C., Dombrecht, B., Manners, J. M., Schenk, P. M., Edgar, C. I., Maclean, D. J., et al. (2005). Repressor- and activator-type ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol. 139, 949�. doi: 10.1104/pp.105.068544

Morris, J. H., Apeltsin, L., Newman, A. M., Baumbach, J., Wittkop, T., Su, G., et al. (2011). clusterMaker: a multi-algorithm clustering plugin for Cytoscape. Bioinformatika BMC 12:436. doi: 10.1186/1471-2105-12-436

Nandi, A., Moeder, W., and Kachroo, P. (2005). Arabidopsis ssi2-conferred susceptibility to Botrytis cinerea is dependent on EDS5 and PAD4. mol. Plant Pathol. 18, 363�. doi: 10.1094/MPMI-18-0363

von Wirén, N., Lauter, F. R., Ninnemann, O., Gillissen, B., Walch-Liu, P., Engels, C., et al. (2000). Differential regulation of three functional ammonium transporter genes by nitrogen in root hairs and by light in leaves of tomato. Tanaman J 21, 167�. doi: 10.1046/j.1365-313x.2000.00665.x

Obayashi, T., Okamura, Y., Ito, S., Tadaka, S., Aoki, Y., Shirota, M., et al. (2014). ATTED-II in 2014: evaluation of gene coexpression in agriculturally important plants. Fisiol Sel Tumbuhan. 55, e6(1𠄷). doi: 10.1093/pcp/pct178

Olesen, J. E., Jørgensen, L. N., Petersen, J., and Mortensen, J. V. (2003). Effects of rates and timing of nitrogen fertilizer on disease control by fungicides in winter wheat. 2. Crop growth and disease development. J.Ag. Sci. 140, 15�. doi: 10.1017/S0021859602002897

Pageau, K., Reisdorf-Cren, M., Morot-Gaudry, J.-F., and Masclaux-Daubresse, C. (2006). The two senescence-related markers, GS1 (cytosolic glutamine synthetase) and GDH (glutamate dehydrogenase), involved in nitrogen mobilization, are differentially regulated during pathogen attack and by stress hormones and reactive oxygen species in Nicotiana tabacum L. daun-daun. J. Eks. Bot. 57, 547�. doi: 10.1093/jxb/erj035

Pan, X., Zhu, B., Luo, Y., and Fu, D. (2013). Unraveling the protein network of tomato fruit in response to necrotrophic phytopathogenic Rhizopus nigricans. PLoS SATU 8:e73034. doi: 10.1371/journal.pone.0073034

Pieterse, C. M. J., Leon-Reyes, A., Van der Ent, S., and Van Wees, S. C. M. (2009). Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nat Chem Biol. 5, 308�. doi: 10.1038/nchembio.164

Poultney, C. S., Gutiérrez, R. A., Katari, M. S., Gifford, M. L., Paley, W. B., Coruzzi, G. M., et al. (2007). Sungear: interactive visualization and functional analysis of genomic datasets. Bioinformatika 23, 259�. doi: 10.1093/bioinformatics/btl496

Pusztahelyi, T., Holb, I. J., and P༼si, I. (2015). Secondary metabolites in fungus-plant interactions. Depan. Ilmu Tanaman. 6:573. doi: 10.3389/fpls.2015.00573

Reid, K. E., Olsson, N., Schlosser, J., and Peng, F. (2006). An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development. Biol Tanaman BMC. 6:27. doi: 10.1186/1471-2229-6-27

Rizhsky, L., Davletova, S., Liang, H., and Mittler, R. (2004). The zinc finger protein Zat12 is required for cytosolic ascorbate peroxidase 1 expression during oxidative stress in Arabidopsis. J.Biol. Kimia 279, 11736�. doi: 10.1074/jbc.M313350200

Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Tzin, V., and Mysore, K. S. (2014). Regulation of primary plant metabolism during plant-pathogen interactions and its contribution to plant defense. Depan. Ilmu Tanaman. 5:17. doi: 10.3389/fpls.2014.00017

Scalschi, L., Sanmartín, M., Cama༞s, G., Troncho, P., Sánchez-Serrano, J. J., Garc໚-Agustín, P., et al. (2015). Silencing of OPR3 in tomato reveals the role of OPDA in callose deposition during the activation of defense responses against Botrytis cinerea. Tanaman J 81, 304�. doi: 10.1111/tpj.12728

Schneider, C. A., Rasband, W. S., and Eliceiri, K. W. (2012). NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Metode 9, 671�. doi: 10.1038/nmeth.2089

Seifi, H., De Vleesschauwer, D., Aziz, A., and H཯te, M. (2014). Modulating plant primary amino acid metabolism as a necrotrophic virulence strategy: the immune-regulatory role of asparagine synthetase in Botrytis cinerea-tomato interaction. Plant Signal. Perilaku 9:e27995. doi: 10.4161/psb.27995

Seifi, H. S., Curvers, K., De Vleesschauwer, D., Delaere, I., Aziz, A., and H཯te, M. (2013). Concurrent overactivation of the cytosolic glutamine synthetase and the GABA shunt in the ABA-deficient sitiens mutant of tomato leads to resistance against Botrytis cinerea. Fitol Baru. 199, 490�. doi: 10.1111/nph.12283

Shannon, P., Markiel, A., Ozier, O., Baliga, N. S., Wang, J. T., Ramage, D., et al. (2003). Cytoscape: lingkungan perangkat lunak untuk model terintegrasi dari jaringan interaksi biomolekuler. Res. Genom 13, 2498�. doi: 10.1101/gr.1239303

Smith, J. E., Mengesha, B., Tang, H., Mengiste, T., and Bluhm, B. H. (2014). Resistance to Botrytis cinerea in Solanum lycopersicoides involves widespread transcriptional reprogramming. BMC Genomics 15:334. doi: 10.1186/1471-2164-15-334

Snoeijers, S. S., Pérez-Garc໚, A., Joosten, M. H. A. J., and De Wit, P. J. G. M. (2000). The effect of nitrogen on disease development and gene expression in bacterial and fungal plant pathogens. Eur. J. Plant Pathol. 106, 493�. doi: 10.1023/A:1008720704105

Su, G., Kuchinsky, A., Morris, J. H., States, D. J., and Meng, F. (2010). GLay: community structure analysis of biological networks. Bioinformatika 26, 3135�. doi: 10.1093/bioinformatics/btq596

Thimm, O., Bläsing, O., Gibon, Y., Nagel, A., Meyer, S., Krüger, P., et al. (2004). mapman: a user𢄭riven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. Tanaman J 37, 914�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2004.02016.x/pdf

Thomma, B. P., Penninckx, I. A., Cammue, B. P., and Broekaert, W. F. (2001). The complexity of disease signaling in Arabidopsis. Curr Opin Immunol. 13, 63�. doi: 10.1016/S0952-7915(00)00183-7

Torres, M. A., Jones, J. D. G., and Dangl, J. L. (2006). Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. Plant Physiol. 141, 373�. doi: 10.1104/pp.106.079467

Vanacker, H., Sandalio, L., Jiménez, A., Palma, J. M., Corpas, F. J., Meseguer, V., et al. (2006). Roles for redox regulation in leaf senescence of pea plants grown on different sources of nitrogen nutrition. J. Eks. Bot. 57, 1735�. doi: 10.1093/jxb/erl012

Van Baarlen, P., Staats, M., and Van Kan, J. A. (2004). Induction of programmed cell death in lily by the fungal pathogen Botrytis elliptica. mol. Plant Pathol. 5, 559�. doi: 10.1111/J.1364-3703.2004.00253.X

Van der Does, D., Leon-Reyes, A., Koornneef, A., Van Verk, M. C., Rodenburg, N., Pauwels, L., et al. (2013). Salicylic acid suppresses jasmonic acid signaling downstream of SCFCOI1-JAZ by targeting GCC promoter motifs via transcription factor ORA59. Sel tanaman 25, 744�. doi: 10.1105/tpc.112.108548

Vidal, E. A., Araus, V., Lu, C., Parry, G., Green, P. J., Coruzzi, G. M., et al. (2010). Nitrate-responsive miR393/AFB3 regulatory module controls root system architecture in Arabidopsis thaliana. Prok. Natal akad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 107, 4477�. doi: 10.1073/pnas.0909571107

Vidal, E. A., Moyano, T. C., Canales, J., and Gutiérrez, R. A. (2014). Nitrogen control of developmental phase transitions in Arabidopsis thaliana. J. Eks. Bot. 65, 5611�. doi: 10.1093/jxb/eru326

Vlot, A. C., Dempsey, D. A., and Klessig, D. F. (2009). Salicylic Acid, a multifaceted hormone to combat disease. annu. Pdt. Fitopatol. 47, 177�. doi: 10.1146/annurev.phyto.050908.135202

Walters, D., and Heil, M. (2007). Costs and trade-offs associated with induced resistance. Fisiol. mol. Plant P. 71, 3�. doi: 10.1016/j.pmpp.2007.09.008

Walters, D. R., and Bingham, I. J. (2007). Influence of nutrition on disease development caused by fungal pathogens: implications for plant disease control. Ann. aplikasi Biol. 151, 307�. doi: 10.1111/j.1744-7348.2007.00176.x

Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., and Crawford, N. M. (2003). Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiol. 132, 556�. doi: 10.1104/pp.103.021253

Wang, R., Tischner, R., Gutiérrez, R. A., Hoffman, M., Xing, X., Chen, M., et al. (2004). Genomic analysis of the nitrate response using a nitrate reductase-null mutant of Arabidopsis. Plant Physiol. 136, 2512�. doi: 10.1104/pp.104.044610

Wang, Y. H., Garvin, D. F., and Kochian, L. V. (2001). Nitrate-induced genes in tomato roots. Array analysis reveals novel genes that may play a role in nitrogen nutrition. Plant Physiol. 127, 345�. doi: 10.1104/pp.127.1.345

Ward, J. L., Forcat, S., Beckmann, M., Bennett, M., Miller, S. J., Baker, J. M., et al. (2010). The metabolic transition during disease following infection of Arabidopsis thaliana by Pseudomonas syringae pv. tomato. Tanaman J 63, 443�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2010.04254.x

Weirauch, M. T., Yang, A., Albu, M., Cote, A. G., Montenegro-Montero, A., Drewe, P., et al. (2014). Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. Sel 158, 1431�. doi: 10.1016/j.cell.2014.08.009

Windram, O., Madhou, P., McHattie, S., Hill, C., Hickman, R., Cooke, E., et al. (2012). Arabidopsis defense against Botrytis cinerea: chronology and regulation deciphered by high-resolution temporal transcriptomic analysis. Sel tanaman 24, 3530�. doi: 10.1105/tpc.112.102046

Windram, O., Penfold, C. A., and Denby, K. J. (2014). Network modeling to understand plant immunity. annu. Pdt. Fitopatol. 52, 93�. doi: 10.1146/annurev-phyto-102313-050103

Zhang, G.-B., Yi, H.-Y., and Gong, J.-M. (2014). The Arabidopsis ethylene/jasmonic acid-NRT signaling module coordinates nitrate reallocation and the trade-off between growth and environmental adaptation. Sel tanaman 26, 3984�. doi: 10.1105/tpc.114.129296

Zhang, H., Rong, H., and Pilbeam, D. (2007). Signalling mechanisms underlying the morphological responses of the root system to nitrogen in Arabidopsis thaliana. J. Eks. Bot. 58, 2329�. doi: 10.1093/jxb/erm114

Keywords: nitrate nutrition, tomato, defense mechanisms, jasmonic acid, gene network analysis, ethylene signaling, microarray analysis

Citation: Vega A, Canessa P, Hoppe G, Retamal I, Moyano TC, Canales J, Gutiérrez RA and Rubilar J (2015) Transcriptome analysis reveals regulatory networks underlying differential susceptibility to Botrytis cinerea in response to nitrogen availability in Solanum lycopersicum. Depan. Ilmu Tanaman. 6:911. doi: 10.3389/fpls.2015.00911

Received: 29 July 2015 Accepted: 12 October 2015
Published: 04 November 2015.

Stéphane Hacquard, Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Germany

Katherine Denby, University of Warwick, UK
Barbara Blanco-Ulate, University of California, Davis, USA

Copyright © 2015 Vega, Canessa, Hoppe, Retamal, Moyano, Canales, Gutiérrez and Rubilar. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons (CC BY). Penggunaan, distribusi atau reproduksi di forum lain diperbolehkan, asalkan penulis asli atau pemberi lisensi dikreditkan dan publikasi asli dalam jurnal ini dikutip, sesuai dengan praktik akademik yang diterima. Penggunaan, distribusi, atau reproduksi tidak diizinkan yang tidak mematuhi ketentuan ini.


Tonton videonya: Tutorial Membuat Grafik Regresi dan Nilai Korelasi Dengan MS Excel (November 2022).