Informasi

9: Jaringan Genom, Gen & Pengatur - Biologi

9: Jaringan Genom, Gen & Pengatur - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pada titik ini kami telah memperkenalkan gen, DNA, dan protein, tetapi kami telah meninggalkan sejumlah pertanyaan penting yang belum terselesaikan. Kuncinya adalah tetap tenang dan menganalisa!


Jaringan Pengatur Gen

Eric H. Davidson , dalam Genom Regulasi , 2006

Ringkasan Penerbit

Bab ini berfokus pada implikasi evolusioner dari struktur dan fungsi jaringan pengatur gen. Perubahan dalam hubungan fungsional yang diberikan dari jaringan pengatur gen terjadi pada tingkat DNA dengan perubahan urutan cis-regulasi yang menentukan situs target faktor transkripsi. Gen diferensiasi diposisikan secara unik dalam struktur jaringan pengatur, berada di pinggiran jaringan. Tidak seperti semua gen yang membentuk struktur internal jaringan, produk mereka tidak memiliki fungsi mengendalikan gen lain. Kendala pada perubahan evolusioner dalam fungsi baterai gen diferensiasi secara langsung tunduk pada seleksi, karena mereka menghasilkan secara rinci sebagian besar fungsi fenotipik yang dihadapi hewan dengan lingkungannya. Rencana tubuh dikodekan di wilayah internal jaringan pengatur gen, yang selama pengembangan menentukan perkembangan keadaan pengatur spasial, bukan bisnis baterai gen diferensiasi. Banyak efek regional kotor dari keuntungan atau hilangnya mutasi fungsi pada morfologi yang telah dicatat selama beberapa dekade terakhir mengingatkan pada diversifikasi evolusioner.


Tautan yang berhubungan

Referensi: Sebuah ensiklopedia komparatif elemen DNA dalam genom tikus. Yue F, Cheng Y, Breschi A, Vierstra J, Wu W, Ryba T, Sandstrom R, Ma Z, Davis C, Paus BD, Shen Y, Pervouchine DD, Djebali S, Thurman RE, Kaul R, Rynes E, Kirilusha A , Marinov GK, Williams BA, Trout D, Amrhein H, Fisher-Aylor K, Antoshechkin I, DeSalvo G, Lihat LH, Fastuca M, Drenkow J, Zaleski C, Dobin A, Prieto P, Lagarde J, Bussotti G, Tanzer A , Denas O, Li K, Bender MA, Zhang M, Byron R, Groudine MT, McCleary D, Pham L, Ye Z, Kuan S, Edsall L, Wu YC, Rasmussen MD, Bansal MS, Kellis M, Keller CA, Morrissey CS, Mishra T, Jain D, Dogan N, Harris RS, Cayting P, Kawli T, Boyle AP, Euskirchen G, Kundaje A, Lin S, Lin Y, Jansen C, Malladi VS, Cline MS, Erickson DT, Kirkup VM, Learned K, Sloan CA, Rosenbloom KR, Lacerda de Sousa B, Beal K, Pignatelli M, Flicek P, Lian J, Kahveci T, Lee D, Kent WJ, Ramalho Santos M, Herrero J, Notredame C, Johnson A, Vong S , Lee K, Bates D, Neri F, Diegel M, Canfield T, Sabo PJ, Wilken MS, Reh TA, Giste E, Shafer A, Kutyavin T, Haugen E, Dunn D, Reynolds AP, N eph S, Humbert R, Hansen RS, De Bruijn M, Selleri L, Rudensky A, Josefowicz S, Samstein R, Eichler EE, Orkin SH, Levasseur D, Papayannopoulou T, Chang KH, Skoultchi A, Astaga S, Disteche C, Treuting P, Wang Y, Weiss MJ, Blobel GA, Cao X, Zhong S, Wang T, PJ Baik, Lowdon RF, Adams LB, Zhou XQ, Pazin MJ, Feingold EA, Wold B, Taylor J, Mortazavi A, Weissman SM, Stamatoyannopoulos JA, Snyder MP, Guigo R, Gingeras TR, Gilbert DM, Hardison RC, Beer MA, Ren B Mouse ENCODE Consortium. Alam. 2014 Nov 20515(7527):355-64. doi: 10.1038/alam13992. PMID: 25409824.

Konservasi sirkuit trans-acting selama evolusi regulasi mamalia. Stergachis AB, Neph S, Sandstrom R, Haugen E, Reynolds AP, Zhang M, Byron R, Canfield T, Stelhing-Sun S, Lee K, Thurman RE, Vong S, Bates D, Neri F, Diegel M, Giste E, Dunn D, Vierstra J, Hansen RS, Johnson AK, Sabo PJ, Wilken MS, Reh TA, Treuting PM, Kaul R, Groudine M, Bender MA, Borenstein E, Stamatoyannopoulos JA. Alam. 2014 Nov 20515(7527):365-70. doi: 10.1038/alam13972. PMID: 25409825.

Prinsip-prinsip konservasi informasi peraturan antara tikus dan manusia. Cheng Y, Ma Z, Kim BH, Wu W, Cayting P, Boyle AP, Sundaram V, Xing X, Dogan N, Li J, Euskirchen G, Lin S, Lin Y, Visel A, Kawli T, Yang X, Patacsil D , Keller CA, Konsorsium ENCODE Tikus Giardine B, Kundaje A, Wang T, Pennacchio LA, Weng Z, Hardison RC, Snyder MP. Alam. 2014 Nov 20515(7527):371-5. doi: 10.1038/alam13985. PMID: 25409826.

Domain yang berasosiasi secara topologi adalah unit stabil dari regulasi waktu replikasi. Paus BD, Ryba T, Dileep V, Yue F, Wu W, Denas O, Vera DL, Wang Y, Hansen RS, Canfield TK, Thurman RE, Cheng Y, Gülsoy G, Dennis JH, Snyder MP, Stamatoyannopoulos JA, Taylor J , Hardison RC, Kahveci T, Ren B, Gilbert DM. Alam. 2014 Nov 20515(7527):402-5. doi: 10.1038/alam13986. PMID: 25409831.

Lanskap DNA pengatur tikus mengungkapkan prinsip global evolusi pengaturan cis Vierstra J, Rynes E, Sandstrom R, Zhang M, Canfield T, Hansen RS, Stehling-Sun S, Sabo PJ, Byron R, Humbert R, Thurman RE, Johnson AK, Vong S, Lee K, Bates D, Neri F, Diegel M, Giste E, Haugen E, Dunn D, Wilken MS, Josefowicz S, Samstein R, Chang KH, Eichler EE, De Bruijn M, Reh TA, Skoultchi A, Rudensky A, Orkin SH, cPapayannopoulou T, Treuting PM, Selleri L, Kaul R, Groudine M, Bender MA, Stamatoyannopoulos JA. Sains. 2014 Nov 21346(6212)::1007-12. doi: 10.1126/science.1246426. PMID: 25411453.

Perbandingan lanskap transkripsi antara jaringan manusia dan tikus. Lin S, Lin Y, Nery JR, Urich MA, Breschi A, Davis CA, Dobin A, Zaleski C, Beer MA, Chapman WC, Gingeras TR, Ecker JR, Snyder MP. Proc Natl Acad Sci AS. 2014 Des 2111(48)::17224-9. doi: 10.1073/pnas.1413624111. Epub 2014 20 November. PMID: 25413365.

Pendanaan: Institut Penelitian Genom Manusia Nasional (NHGRI), Institut Nasional Ilmu Kedokteran Umum (NIGMS), Institut Kanker Nasional (NCI), Institut Nasional Diabetes dan Penyakit Pencernaan dan Ginjal (NIDDK), Institut Nasional Kesehatan Anak dan Manusia Eunice Kennedy Shriver Development (NICHD), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), National Institute on Drug Abuse (NIDA), National Institute of Mental Health (NIMH), National Institute of Neurological Disorders dan Stroke (NINDS), dan NIH Common Fund Spanish Plan Nacional Wellcome Trust Howard Hughes Medical Institute National Science Foundation dan American Recovery and Reinvestment Act.


Hasil

Evaluasi oksidan dan antioksidan dari tiga aksesi kapas dataran tinggi CRI12, LAT40 dan MAR85 dalam kondisi cekaman garam

Ketiga genotipe kapas dataran tinggi secara morfologis identik dan tidak menunjukkan variasi yang signifikan ketika terkena segala bentuk stres, sehingga tidak ada pertimbangan berbagai sifat morfologi yang dipertimbangkan dalam penelitian ini. Namun, kami mengamati variasi pada pertumbuhan akar dan akumulasi biomassa, CRI12 dan LAT40 memiliki akar yang relatif lebih tinggi dan biomassa yang lebih tinggi secara keseluruhan dibandingkan dengan MAR85 (Gbr. 1a). Selain itu, dalam melakukan analisis mendalam pada tingkat konsentrasi enzim oksidan dan antioksidan pada jaringan daun dari tiga kultivar di bawah kondisi cekaman garam, MAR85 dan CRI12 menunjukkan konsentrasi prolin dan superoksida dismutase (SOD) yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan LAT40 (Gbr. 2). 1b), sebuah indikasi bahwa CRI12 dan MAR85 kurang terpengaruh di bawah tekanan garam dibandingkan dengan LAT40. Selanjutnya, kadar konsentrasi Malondialdehyde (MDA) di dalam tanaman merupakan indikasi bahwa tanaman tersebut menderita stres oksidatif, karena MDA merupakan produk sampingan dari peroksidasi lipid [22]. Hasil yang diperoleh sesuai dengan temuan sebelumnya di mana knockdown faktor transkripsi trihelix pada kapas mengurangi toleransi kekeringan dan cekaman garam dan pada gilirannya mempercepat akumulasi berbagai oksidan dan kadar MDA di bawah paparan cekaman kekeringan dan garam [22].

Karakteristik morfologi dan fisiologis MAR85, CRI12 dan LAT40 setelah perlakuan stres garam-alkali. A Fenotipe bibit pada berbagai tahap perkembangan pada tiga aksesi kapas dataran tinggi. B Konten PRO, MDA, dan SOD dinamis setelah perlakuan stres garam-alkali

Identifikasi pengurutan dan transkrip

Analisis transkripsi tiga aksesi G.hirsutum berbeda secara signifikan dalam karakteristik morfologi serta wawasan tingkat sistem penting mereka ke dalam mekanisme molekuler yang mendasari respon stres alkali-garam [23, 24]. Dalam penelitian ini, satu kultivar kapas dataran tinggi (CRI12, Cina) dan dua kultivar kapas dataran tinggi liar lainnya (LAT40, G.hirsutum ras latifolium40 dan MAR85, G.hirsutum race mari-garant85) digunakan untuk analisis transkripsi dengan melakukan RNA-Sequencing pada jaringan mereka ketika terkena tekanan salinitas. Dipertimbangkan dua organ yaitu daun dan akar dari ketiga aksesi, pada empat tahap perlakuan yang berbeda sampel diberi kode Rt_0h, Rt_3h, Rt_12h, Rt_48h untuk sampel akar dan sampel daun diberi kode Lf_0h, Lf_3h, Lf_12h dan Lf_48h, semuanya sampel diulang tiga kali. Kinerja ketiga aksesi kapas dataran tinggi dikategorikan ke dalam empat kelompok yang berbeda, sebagai tahap pertumbuhan normal (CK0), tahap respon cekaman alkali-garam awal (SS3), tahap bibit rusak parah (SS12) dan tahap pemulihan bibit (SS48). Untuk menyelidiki dinamika transkriptom selama perlakuan stres alkali-garam, RNA total diisolasi dari daun dan akar tiga aksesi G.hirsutum dalam empat tahap pengobatan yang berbeda. Secara total, 1.106.485.712 jumlah pembacaan mentah dihasilkan dari 48 perpustakaan cDNA, setelah dibersihkan, diperoleh 1.097.617.134 (99,19%) pembacaan bersih. Persentase bacaan terpetakan antar clean read di setiap perpustakaan berkisar antara 83,88 hingga 89,61%, terlebih lagi persentase clean read dengan nilai kualitas Phred 30% berkisar antara 94,37 hingga 97,05%. Selanjutnya, pembacaan bersih diselaraskan dengan genom referensi Gossypium hirsutum (IKLAN1), di mana 83,06 hingga 89,73% bacaan yang dihasilkan dari 48 sampel dipetakan ke genom referensi, menghasilkan 77,4-82,3% dari bacaan yang dipetakan secara unik ke genom referensi. G.hirsutum genom. Yang lebih menarik, bacaan yang dipetakan secara unik dipetakan ke genom referensi dengan menggunakan HT-seq (paket Python), dengan efisiensi dan akurasi yang lebih tinggi (Tabel 1 dan https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ PRJNA531727).

Analisis transkripsi dan ekspresi di berbagai jaringan dari tiga spesies kapas di bawah kondisi stres garam

Sebanyak 64.737 gen diidentifikasi, dan jumlah gen yang diekspresikan dalam sampel berbeda bervariasi dari 51.586 hingga 57.263 seperti yang dideteksi oleh analisis data urutan RNA (Gbr. 2a). Untuk memahami perbedaan global dalam dinamika transkriptom selama tahap pengobatan yang berbeda, analisis distribusi ekspresi, analisis korelasi, analisis komponen utama (PCA) dan pengelompokan hierarkis telah dicapai secara realistis berdasarkan nilai FPKM untuk semua gen yang diekspresikan dalam setidaknya satu dari 32 sampel jaringan (Gbr. 2b). Sampel daun menunjukkan tingkat ekspresi yang lebih rendah dari akar, dan perlakuan jaringan/tahap perlakuan yang sama pada ketiga aksesi G.hirsutum menunjukkan distribusi ekspresi yang sama. Analisis koefisien korelasi Pearson, di antara 32 sampel gabungan menggambarkan korelasi yang lebih signifikan pada jaringan/tahap perawatan yang sama di antara tiga aksesi G.hirsutum (Gbr. 2c). Seperti yang diharapkan, transkriptom daun dari tiga ras kapas dataran tinggi yang kontras mengelompok bersama dan menunjukkan perbedaan substansial dengan titik perlakuan. LAT40 dan CRI12 menunjukkan korelasi yang lebih tepat dan fenotipe serupa pada daun setelah perlakuan alkali-garam menunjukkan kesamaan yang tinggi dalam program transkripsi mereka. Dibandingkan dengan stadium CK0, SS3, SS12 dan SS48 menunjukkan lebih dekat pada akar dan daun dari tiga aksesi kapas dataran tinggi (Gbr. 2d). Ini menunjukkan perbedaan yang signifikan dari program transkripsi antara kondisi stres standar dan alkali-garam. Secara keseluruhan, tahap jaringan/pengobatan menunjukkan korelasi yang lebih tinggi dalam analisis ini yang diharapkan memiliki transkriptom dan fungsi/aktivitas yang lebih mirip.

Analisis ekspresi gen tiga aksesi G.hirsutum. A distribusi tingkat ekspresi dari sampel yang berbeda B Peta panas hasil analisis korelasi sampel berdasarkan ekspresi transkriptom global di bawah tekanan alkali-garam C Plot Analisis komponen utama (PCA) berdasarkan ekspresi transkriptom global di bawah tekanan alkali-garam D Pengelompokan sampel berdasarkan ekspresi transkriptom global di bawah tekanan alkali-garam

Ekspresi gen diferensial setelah perlakuan alkali-garam

Untuk menyelidiki pola ekspresi diferensial dari berbagai faktor transkripsi di tiga aksesi kapas dataran tinggi, dua jaringan diprofilkan, jaringan daun dan akar di bawah kondisi cekaman garam. Jumlah total gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) bervariasi, mulai dari 8663 (MAR85L_CK0 vs. MAR85L_SS12) hingga 22.068 (CRI12R_CK0 vs. CRI12R_SS12) lebih jauh lagi, DEG diperoleh dari perbandingan berpasangan (MAR85L: MAR85L_CK0 vs. MAR85L_SS3 MAR85L_SS3 vs. Perbandingan berpasangan MAR85L_CK0 vs. MAR85L_SS48 MAR85R, LAT40L/R dan CRI12L/R serupa dengan MAR85L) dengan menggunakan perangkat lunak DEGseq (Gbr. 3a). Lebih banyak DEG yang diamati pada akar (total 41.132 DEG) daripada di daun (total 35.724 DEG) yang menunjukkan bahwa akar dapat menjadi jaringan utama yang dipengaruhi oleh stres garam dan dengan demikian memiliki regulasi gen yang lebih dinamis dan kompleks. untuk mengurangi toksisitas garam ke sel akar. Hasil yang diperoleh sesuai dengan temuan sebelumnya dalam pola ekspresi gen yang cenderung spesifik jaringan Magwanga et al. [25], menemukan bahwa tingginya jumlah LEA gen sangat diregulasi dalam jaringan daun dibandingkan dengan jaringan batang dan akar di bawah kondisi cekaman kekeringan. Dibandingkan dengan stadium SS3 (21.738 dan 30.525, masing-masing pada daun dan akar) dan SS48 (23.418 dan 26.533, pada daun dan akar), tahap SS12 (28.521 dan 32.560, masing-masing pada daun dan akar) menunjukkan jumlah tertinggi. DEG di akar dan daun, menunjukkan tahap SS12 lebih aktif untuk menanggapi stres alkali-garam. Menariknya, MAR85 menunjukkan jumlah DEG terendah di semua tahapan dibandingkan dengan LAT40 (jumlah DEG tertinggi) dan CRI12. Hal ini menunjukkan bahwa respon yang tidak konsisten terhadap cekaman alkali-garam dari tiga aksesi kapas dataran tinggi. Selain itu, 3509 (SS3 VS. CK0) 8138 (SS12 VS. CK0), dan 5955 (SS48 VS. CK0) DEG umum diidentifikasi pada setiap tahap selanjutnya perlakuan alkali-garam pada daun tiga aksesi kapas dataran tinggi. Kemudian, 8870 (SS3 VS. CK0), (Gbr. 3e), 10.428 (SS12 VS. CK0), dan 7281 (SS48 VS. CK0), DEG diidentifikasi di akar (Gbr. 3b). Jumlah variabel gen yang diekspresikan secara berbeda menunjukkan bahwa setiap tahap perawatan jaringan / garam alkali mempertahankan program perkembangan independen mereka sendiri. Atau, kompleksitas transkripsi mungkin hanya mencerminkan kerumitan tahap benih yang ditangkap, yang berisi lebih dari satu jenis sel.

Analisis gen ekspresi berbeda (DEGs) dari tiga aksesi G.hirsutum. A Nomor DEG setelah perawatan garam alkali B-G DEG dalam berbagai tahap perlakuan pada daun dan akar (L3 h, L12 h, L48 h, R3h, R12h dan R48h), masing-masing

Anotasi fungsional DEG ditetapkan dalam tiga aksesi kapas dataran tinggi pada jaringan yang berbeda (daun dan akar)

Sebanyak 22.359 DEG (masing-masing 11.818 dan 15.674 di daun dan akar) digunakan untuk pengayaan fungsional dan analisis jaringan ko-ekspresi tertimbang (WGCNA). Analisis klaster, konsekuensi dari 27.492 DEG serupa dengan analisis klaster semua gen. Pengamatan empiris ini mendukung 22.359 DEG yang diperoleh dari jaringan daun dan akar pada tiga aksesi kapas yang berbeda dapat secara tepat menggambarkan variasi sampel yang dianalisis. DEG umum dari setiap jaringan/tahap dalam tiga aksesi kapas dataran tinggi selanjutnya digunakan untuk melakukan pengayaan ontologi gen (GO) dan ensiklopedia Kyoto analisis pengayaan gen dan genom (KEGG). Sebanyak 17.985 gen dianotasi, dengan 7836 dan 10.149 ditemukan diekspresikan secara berbeda dalam daun dan akar, masing-masing. Di antara 7836 DEG beranotasi, 105 istilah GO diperkaya secara signifikan di P-nilai 0,05, FDR 0,05 (Berkas tambahan 6: Tabel S2). Di root, lebih banyak DEG yang dianotasi, namun, hanya 96 istilah GO yang ditemukan diperkaya secara signifikan (File tambahan 7: Tabel S3). Selain itu, 54 istilah GO umumnya diperkaya antara daun dan jaringan akar, termasuk proses reduksi oksidasi (GO: 0055114), proses metabolisme karbohidrat (GO: 0005975), aktivitas oksidoreduktase (GO: 0016491), aktivitas protein serin/treonin kinase (GO: 0016491). GO: 0004713) dan aktivitas faktor transkripsi (GO: 0003700), yang diketahui terlibat dalam respon stres abiotik.

Istilah GO pengayaan spesifik jaringan diamati di mana DEG yang diperoleh dari daun diperkaya secara signifikan dalam fotosintesis (GO: 0015979) dan istilah GO terkait fotosintesis (GO: 0019684, GO: 0009765). Selain itu, semua 4163 DEG (masing-masing 2426 dan 2667 DEG pada daun dan akar) diperkaya dengan menggunakan database KEGG. DEG daun dan akar secara signifikan diperkaya dalam 30 dan 34 istilah KEGG, masing-masing, dengan nilai Q ≤0.0001, dan nomor gen untuk setiap istilah yang dianalisis ditetapkan pada 3 (File tambahan 8: Tabel S4 dan File tambahan 9: Tabel S5). Transduksi sinyal hormon tanaman (ko04075) dan biosintesis metabolit sekunder (ko01110) adalah jalur KEGG yang paling umum terdeteksi (File tambahan 2: Gambar S1 dan S2), dan kedua jalur tersebut sebelumnya telah ditemukan secara signifikan terlibat dalam respon stres abiotik [26,27,28,29].Selain itu, istilah KEGG yang diperkaya secara khusus daun yang terdeteksi adalah yang terkait dengan peralatan fotosintesis daun tanaman, seperti Fotosintesis (ko00195) dan Fotosintesis - protein antena (ko00196). Meskipun respons stres alkali-garam terlibat dalam jalur yang lebih kompleks, transduksi sinyal dan proses reduksi oksidasi, tetapi DEGS yang terdeteksi dapat memainkan peran inti dalam jaringan daun dan akar kapas di bawah kondisi stres garam. Terlepas dari DEG, kami menganalisis berbagai faktor transkripsi tanaman dengan fungsi diduga dalam meningkatkan toleransi cekaman garam di antara tiga kultivar kapas yang digunakan. Sebanyak 2080 TF diidentifikasi, di mana 991 TF terdeteksi di antara DEG di jaringan daun sementara 1577 TF berasal dari DEG yang dianalisis dari akar jaringan akar (File tambahan 10: Tabel S6). Hasil yang diperoleh untuk TF berkorelasi positif dengan distribusi DEG di mana lebih banyak ditemukan di akar dibandingkan dengan jaringan daun, indikasi bahwa akar bisa menjadi jaringan tanaman utama, yang sangat terpengaruh di bawah garam. kondisi stres. Di semua TF yang diidentifikasi, 53 keluarga gen yang berbeda ditemukan terkait dengan TF seperti keluarga TF ZF-HD, SRS, S1Fa-like, SAP dan NF-X1 diidentifikasi untuk DEG untuk jaringan akar sementara keluarga YABBY TF , terdeteksi untuk DEG yang ditemukan untuk jaringan daun.

Jaringan ekspresi bersama dan konstruksi modul

Untuk menyelidiki jaringan regulasi gen dari respons stres alkali-garam pada kapas dataran tinggi, kami mengidentifikasi set gen yang diekspresikan bersama melalui analisis jaringan koekspresi gen tertimbang (WGCNA) yang dapat digunakan untuk menemukan jaringan (modul) gen yang sangat berkorelasi [30 ]. Dalam penelitian ini, 22.359 DEG digunakan untuk WGCNA. Untuk memastikan jaringan bebas skala, kekuatan dari = 12 (skala R2 bebas = 0,8740) dipilih secara akurat dengan penentuan daya ambang batas lunak (File tambahan 3: Gambar S3A/B) dan evaluasi analisis topologi bebas skala (File tambahan 3: Gambar S3C/D). Mewakili interaksi di antara gen dengan profil ekspresi yang serupa, beberapa jaringan yang disebut sebagai modul ekspresi bersama, diidentifikasi. Sebanyak 20 modul diidentifikasi melalui metode Dynamic Tree Cut (parameter inti: MEDissThres = 0,25), bervariasi dari 135 gen dalam modul mistyrose hingga 4793 gen dalam modul darkmagenta. Di antara 20 modul, 17 gen tidak berguna, yang ditampilkan dalam modul abu-abu, tidak dapat dipilih oleh modul lain (File tambahan 4: Gbr. 4a-b). Seribu gen dipilih secara acak untuk visualisasi jaringan gen. Gen dalam modul yang sama menunjukkan tumpang tindih topologi yang lebih tinggi (File tambahan 4: Gambar S4), menunjukkan jaringan (modul) yang dibangun oleh WGCNA memiliki fungsi biologis yang bermanfaat.

Pembangunan jaringan koekspresi tiga aksesi kapas dataran tinggi. A Mengelompokkan dendrogram dari 22.359 gen yang diekspresikan berbeda, dengan perbedaan berdasarkan tumpang tindih topologi. Baris warna memberikan perbandingan visual sederhana dari penugasan modul (stek cabang) berdasarkan metode pemotongan cabang hibrida dinamis. B Nomor gen setiap jaringan/modul

Identifikasi dan visualisasi modul jaringan/tahap spesifik pada daun dan akar kapas dataran tinggi

Profil ringkasan (eigenene) untuk setiap modul yang diperoleh oleh WGCNA. Misalnya, pengelompokan peta panas dan plot batang eigenene dari modul yang sangat berkorelasi dengan sifat, yang ditunjukkan pada (Gbr. 5a), itu mewakili tingkat ekspresi gen dari setiap modul. Untuk menentukan korelasi antara modul dan sifat, kami menghubungkan eigenene dengan tahap perlakuan alkali-garam dan ras kapas dataran tinggi masing-masing melalui analisis koefisien korelasi Pearson. Menariknya, tidak ada modul yang secara signifikan terkait dengan tiga ras kapas dataran tinggi (r 0,60, p 0,01) namun, 11 modul ekspresi bersama menunjukkan korelasi yang relatif lebih tinggi (r 0,60) dengan stadium SS3, SS12, SS48 pada daun dan akar kapas dataran tinggi (Gbr. 5b-c). Ini menunjukkan bahwa jaringan ko-ekspresi berbeda secara signifikan pada tahap yang berbeda. Sebaliknya, tidak ada jaringan koekspresi yang ditemukan terkait dengan tiga aksesi kapas dataran tinggi, yang menunjukkan bahwa jaringan pengaturan tertentu dari respons stres alkali-garam pada ras kapas dataran tinggi yang berbeda. Tahap SS12 dan SS48 berkorelasi dengan lebih dari satu modul. Tahap SS12 berkorelasi dengan coklat 2 (Nomor gen: 1163, r = 0,79), hijau zaitun tua (Nomor gen: 416, r = 0,76) dan hijau laut gelap 4 (Nomor gen: 237, r = 0,68) modul di daun, dan dikorelasikan dengan anggrek sedang (Nomor gen: 241, r = 0,66) dan ungu biru (Nomor gen: 2632, r = 0,71) modul di root, masing-masing. Tahap SS48 dikaitkan dengan mawar berkabut (Nomor gen: 135, r = 0,67) dan biru muda (Nomor gen: 1300, r = 0,87) modul di daun, dan terkait dengan baja ringan biru1 (Nomor gen: 1218, 0,87) dan oranye merah 4 (Nomor gen: 536, r = 0,85) modul di root, masing-masing. Sedangkan, hanya satu modul yang dikorelasikan dengan tahap SS3 (navajo white (Nomor Gen: 326, r = 0,88) tahap moduleSS3 di daun jingga merah1 (Nomor gen: 1836, r = 0,95) tahap modul-SS3 di root). Menariknya, modul berkorelasi tinggi dan signifikan semuanya berkorelasi positif dengan tahapan yang berbeda, menunjukkan bahwa gen ekspresi yang berbeda dalam jaringan/tahap yang berbeda sebagian besar diregulasi ke atas untuk menanggapi stres alkali-garam.

Visualisasi tingkat ekspresi gen dan nilai eigenene dari modul signifikan. A Peta panas pengelompokan dan plot batang mewakili tingkat ekspresi gen dari setiap modul. Di peta panas, warna berkisar dari hijau ke merah, masing-masing menunjukkan tingkat ekspresi rendah hingga tinggi. B Heatmap korelasi antara modul dan tahapan perlakuan yang berbeda pada daun dan akar. C Peta panas korelasi antar modul dan tiga aksesi kapas dataran tinggi pada daun dan akar. Warna mulai dari biru melalui putih ke merah menunjukkan korelasi rendah melalui menengah ke tinggi, masing-masing. ME, komponen utama pertama dari profil ekspresi standar dari modul yang diberikan

Analisis pengayaan GO

Kami melakukan analisis pengayaan gen GO dalam modul spesifik jaringan/tahap. Istilah GO yang diperkaya disajikan dalam (File tambahan 12: Tabel S8). Analisis GO mengkategorikan gen menjadi tiga kelompok yang mungkin, yaitu komponen seluler (CC), fungsi molekuler (MF) dan proses biologis (BP). Fungsi molekuler yang terdeteksi untuk DEG adalah aktivitas transduser sinyal (GO:0004871) dan aktivitas regulator respons fosforelay (GO:0000156) yang diperkaya secara signifikan pada tahap SS3, aktivitas protein tirosin kinase (GO:0004713), aktivitas protein kinase (GO :0004672) dan aktivitas protein serin/treonin kinase (GO:0004674) adalah tiga teratas yang sangat diperkaya pada tahap SS12 dalam daun sedangkan pengikatan asam nukleat daerah pengatur (GO:0001067), pengikatan DNA daerah pengatur transkripsi (GO:0044212), pengikatan DNA daerah pengatur transkripsi pengikatan DNA wilayah (GO:0000975) adalah tiga teratas yang diperkaya secara signifikan pada tahap SS48 (P < 0,001, FDR < 0,05) dalam daun. Dalam analisis pengayaan GO untuk proses biologis (BP), tidak ada jalur signifikan yang diidentifikasi pada tahap SS3 dalam fosforilasi protein daun (GO:0006468), modifikasi makromolekul (GO:0043412) dan proses modifikasi protein (GO:0036211). tiga jalur teratas pada tahap SS12 di daun sedangkan proses metabolisme organisme tunggal (GO:0044710), proses metabolisme karbohidrat (GO:0005975) dan proses reduksi oksidasi (GO:0055114) adalah tiga jalur teratas pada tahap SS48 di daun . Untuk analisis GO fungsi molekuler, aktivitas faktor transkripsi pengikat asam nukleat (GO:0001071), aktivitas faktor transkripsi, pengikatan DNA spesifik-urutan (GO:0003700) dan aktivitas oksidoreduktase yang bekerja pada donor berpasangan, dengan penggabungan atau reduksi molekul oksigen (GO :0016705) adalah tiga teratas yang diperkaya secara signifikan pada tahap SS3 di akar Selain itu, aktivitas dehidrogenase UDP-N-asetilmuramat (GO:0008762), pengikatan kromatin (GO:0003682), pengikatan kompleks makromolekul (GO:0044877) adalah tiga teratas yang sangat diperkaya pada tahap SS12 di akar sedangkan aktivitas oksidoreduktase (GO:0016491), aktivitas dehidrogenase Asil-CoA (GO:0003995) dan aktivitas katalitik (GO:0003824) adalah tiga teratas yang diperkaya secara signifikan pada tahap SS48 di akar. Menariknya, aktivitas oksidoreduktase ditemukan pada berbagai tahap diferensiasi. Dalam analisis pengayaan GO dari proses biologis, regulasi proses biosintetik RNA (GO: 2001141), regulasi transkripsi, DNA-templated (GO:0006355), regulasi transkripsi asam nukleat-templated (GO:1903506) adalah tiga teratas yang diperkaya secara signifikan Istilah GO dalam tahap SS3 dalam regulasi akar proses metabolisme RNA (GO:0051252), regulasi proses biosintesis RNA GO: 2001141dan regulasi transkripsi, template DNA (GO:0006355) adalah tiga jalur teratas pada tahap SS12 di akar. Demikian pula dengan tahap SS12 di daun, proses metabolisme organisme tunggal (GO: 0044710), proses organisme tunggal (GO: 0044699) dan proses reduksi oksidasi (GO: 0055114) adalah tiga jalur teratas pada tahap SS48 di akar. Secara keseluruhan, transduksi sinyal dilakukan pada tahap SS3 dan SS12 dan transkripsi regulasi dilakukan pada tahap SS48 di daun. Meskipun rumit untuk mengatur stres alkali-garam di akar, regulasi oksidasi-reduksi dilakukan di semua tahap. Hasil yang diperoleh sesuai dengan temuan sebelumnya di mana istilah GO serupa telah diidentifikasi untuk berbagai gen responsif stres seperti LEA gen [25], PASANGAN gen [31] antara lain.

Identifikasi gen sentral dan sangat terhubung

Untuk mengidentifikasi gen hub di bawah tekanan garam-alkali, dua metode berbeda digunakan untuk menyaring gen. Setiap bobot kemungkinan gen (P. bobot) nilai diperoleh dengan fungsi penyaringan jaringan paket WGCNA berdasarkan signifikansi gen (GS), keanggotaan modular (MM), dan lebih rendah P. Nilai bobot menunjukkan bahwa gen tersebut berkorelasi lebih tinggi dengan sifat (tahap perlakuan). 30 teratas pusat gen diidentifikasi berdasarkan p. Berat. Dalam metode kedua, 150 dan 300 gen teratas yang sangat terhubung untuk modul korelasi yang lebih tinggi dari berbagai tahap dipilih untuk analisis berdasarkan matriks tumpang tindih topologi (TOM) dari semua gen ekspresi diferensial. Selain itu, 30 gen teratas yang merupakan pusat dan sangat terhubung divisualisasikan menggunakan perangkat lunak Cytoscape 3.3.0 (File tambahan 11: Tabel S7, Gambar 6a-b). Totalnya, 180 pusat gen yang berkorelasi lebih tinggi dengan tahap pengobatan yang berbeda ditemukan dan 180 gen konektivitas yang lebih tinggi juga dipilih dalam enam tahap yang berbeda, di mana 39 gen umum diidentifikasi dengan dua metode berbeda yang menunjukkan peran inti gen ini dalam menanggapi stres alkali-garam. Menariknya, 19 dan 18 gen umum diperoleh pada tahap SS3L dan SS48L, tetapi tidak ada gen umum yang ditemukan pada tahap lain. Protein transmembran (Pfam: DUF3082), Gh_D11G2953 dan Gh_A11G2587, adalah gen yang paling berkorelasi dengan gen lain dan pada tahap SS3L di bawah tekanan alkali-garam. Protein famili galaktosiltransferase (Gh_D05G1401 dan Gh_A05G1229) dan protein keluarga lisin dekarboksilase (Gh_D05G1724 dan Gh_A03G0267) juga mengamati indikasi bahwa gen ini merupakan faktor penting yang signifikan pada tahap SS3L dalam kaitannya dengan toleransi cekaman garam.

Visualisasi koneksi gen dalam berbagai modul dengan heatmap dan Cytoscape 3.3.0. Di bagian atas gambar A-F, plot peta panas yang menggambarkan hubungan di antara 30 gen paling signifikan yang diidentifikasi oleh penyaringan jaringan. Setiap kolom dan baris peta panas sesuai dengan satu gen warna terang berarti tumpang tindih topologi semakin gelap warna sesuai dengan tumpang tindih topologi yang lebih tinggi. Di bagian bawah gambar A-F, koneksi dari 30 gen hub yang dipilih dari 150 gen teratas yang sangat terhubung dan 300 koneksi teratas dari gen yang sangat terhubung dari modul korelasi yang lebih tinggi. Plot A-F menggambarkan pusat jaringan gen L3 h, L12 h, L48 h, R3h, R12h dan R48h, masing-masing

Tiga enzim percabangan pati yang berbeda (Gh_A02G1739, Gh_D02G0995 dan Gh_Sca006745G03) dan dua protein superfamili RING/U-box (Gh_D05G0963 dan Gh_D07G1649) diidentifikasi yang dapat memainkan peran penting dalam tahap SS48L. Pasangan gen homolog diidentifikasi pada saat yang sama oleh WGCNA, menunjukkan peran kunci potensial mereka dalam regulasi stres alkali-garam pada kapas. Sebanyak 35 TF ditemukan di antara pusat gen, dari 26 TF menunjukkan konektivitas yang lebih tinggi ke berbagai DEG. Selain itu, di antara 35 TF, 4 gen umum memiliki korelasi lebih tinggi dengan gen lain dan tahap pengobatan di bawah tekanan garam alkali, adalah anggota jari seng kotak B ganda (DBB, Gh_A10G0877 dan Gh_A11G2610) dan faktor inti YA (NF-YA, Gh_D03G0606 dan Gh_Sca006219G01) keluarga TF. Secara keseluruhan, 321 pusat gen diidentifikasi, termasuk 35 faktor transkripsi.

Validasi gen hub oleh RT-qPCR

Untuk mendeteksi level ekspresi dan fungsi dari pusat gen, 12 gen dipilih dan analisis ekspresinya. Di masing-masing gen yang dipilih diperiksa secara acak dalam lima sampel dengan RT-qPCR. Informasi primer gen dari 12 pusat gen dirancang dan detailnya terkandung dalam (File tambahan 5: Tabel S1, File tambahan 6: Tabel S2, File tambahan 7: Tabel S3, File tambahan 8: Tabel S4, File tambahan 9: Tabel S5, File tambahan 10: Tabel S6 , File tambahan 11: Tabel S7, File tambahan 12: Tabel S8). Kami menemukan bahwa data tingkat ekspresi gen dari RT-qPCR sangat berkorelasi secara signifikan (cor = 0,7397, P-nilai = 1.458e-11) dengan data dari RNA-seq (Gbr. 7a). Hasil ini membuktikan data RNA-seq dapat diandalkan dalam penelitian ini. Selain itu, dibandingkan dengan tingkat ekspresi bibit kontrol, gen hub diekspresikan secara berbeda dalam kondisi stres garam, yang menunjukkan bahwa gen hub yang diidentifikasi oleh WGCNA memiliki peran diduga dalam respons stres garam-alkali.

Validasi gen hub oleh RT-qPCR

Sensitivitas garam yang ditingkatkan dalam GhSOS3 dan GhCBL10 bibit pembungkaman gen yang diinduksi virus (VIGS)

Untuk menyelidiki lebih lanjut fungsi gen hub, GhSOS3 dan GhCBL10, VIGS pYL156-GhPDS, pYL156-Ctrl, pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 tanaman diamati di bawah tekanan garam-alkali. Daun albino diamati pada bibit yang diinokulasi pYL156-PDS setelah 7 hari inokulasi. Dibandingkan dengan bibit yang terinfeksi, kami menemukan bahwa bibit kontrol memiliki pertumbuhan yang cepat setelah 20 hari inokulasi. Selain itu, tidak ada perbedaan yang dicatat antara bibit yang terinfeksi (Gbr. 8a). Tingkat ekspresi GhSOS3 dan GhCBL10 diperiksa dengan RT-qPCR Dibandingkan dengan bibit pYL156-Ctrl, tingkat ekspresi GhSOS3 dan GhCBL10 diatur ke bawah dalam bibit pembungkaman gen yang sesuai setelah 20 hari inokulasi (Gbr. 8b). cuti dari pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 bibit layu dan layu dibandingkan dengan kontrol dan bibit pYL156-Ctrl setelah 20 hari perlakuan cekaman garam-alkali (Gbr. 8c). Selain itu, konten PRO dan SOD lebih rendah di pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 bibit dibandingkan dengan kontrol dan bibit pYL156-Ctrl setelah 20 hari perlakuan cekaman garam-alkali. Sebaliknya, konten MDA lebih tinggi pada pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 bibit dibandingkan dengan kontrol dan bibit pYL156-Ctrl (Gbr. 8d). Hasil ini menyarankan pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 sensitivitas bibit ditingkatkan.

Evaluasi fenotipe, analisis ekspresi dan uji biokimia pada VIGS dan tanaman tipe liar di bawah tekanan Alkali-garam. A Fenotipe normal (CK), pYL156-Ctrl, pYL156-PDS, pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 bibit MAR85. B Fenotipe normal (CK), pYL156-Ctrl, pYL156-PDS, pYL156-GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 bibit MAR85 setelah 20 hari pasca perlakuan cekaman garam-alkali. C tingkat ekspresi GhCBL10 dan GhSOS3 gen pada VIGS, WT dan tanaman yang dikontrol secara positif dalam kondisi normal (D) PRO, MDA dan SOD konten dalam normal (CK), pYL156-Ctrl, GhSOS3 dan pYL156-GhCBL10 bibit MAR85 setelah perlakuan stres garam-alkali


Metode

Jaringan dan motif regulasi gen.

Kami mengambil set interaksi regulasi untuk E. coli dari kumpulan data dalam ref. 2, yang menggunakan informasi yang tersedia di database RegulonDB 7 dan menyediakan interaksi baru yang dikompilasi dari literatur. Ada 1.409 interaksi regulasi yang melibatkan 121 faktor transkripsi dan 795 gen target. Kami menemukan 42 FFM dan 30 SIM di jaringan ini. Kami mengambil faktor transkripsi dan gen targetnya dalam ragi dari kumpulan data di ref. 3, yang terdiri dari 906 interaksi yang melibatkan 109 faktor transkripsi dan 402 gen target. Ada 131 FFM dan 29 SIM di jaringan ini. Jumlah besar FFMs dalam ragi mencerminkan faktor transkripsi yang luas antar-regulasi dalam eukariota dibandingkan dengan prokariota. Rincian tentang ini disediakan dalam Catatan Tambahan online.

Identifikasi gen yang digandakan.

Mendeteksi homologi di antara protein paralogous jauh dalam suatu organisme adalah tugas yang sulit karena divergensi urutan. Tetapi diketahui bahwa struktur protein lebih kekal daripada urutannya. Jadi, untuk secara andal mendeteksi hubungan jarak jauh di antara E. coli dan protein ragi, kami menggunakan penetapan domain struktural tiga dimensi dari protein dalam jaringan sebagai ukuran homologi. Jika dua protein memiliki arsitektur domain yang sama, atau serangkaian domain dari keluarga protein yang sama, kami berasumsi bahwa mereka berasal dari nenek moyang yang sama, sebagaimana didukung oleh analisis struktur protein 26 dan urutan 27 .

Kami memperoleh arsitektur domain dari penetapan domain dalam database SUPERFAMILY 13 (versi 1.61) untuk urutan protein dalam ragi dan E. coli genom. Informasi evolusioner tentang domain melekat dalam skema klasifikasi database SCOP 28 , dan model Markov tersembunyi dari database SUPERFAMILY didasarkan pada domain ini.

Kami menganggap arsitektur domain yang hanya dibedakan oleh celah atau pengulangan domain sebagai homolog, karena pengulangan terkadang terlewatkan oleh metode penugasan struktural. Jika dibandingkan dengan kluster urutan yang ditemukan oleh FASTA 29 dari seluruh urutan (nilai E 0,01 dalam database besar, cocok dengan lebih dari 80% urutan), metode kami untuk membandingkan arsitektur domain tidak pernah membagi kluster urutan. Beberapa cluster urutan memiliki arsitektur domain yang sama, namun. Untuk mengilustrasikan cakupan metode ini, 48% dari semua protein ragi dalam genom memiliki penetapan domain, sedangkan hanya 5% yang dapat dikelompokkan oleh FASTA dengan cara yang dijelaskan di atas.

Jika ada penetapan domain hanya untuk satu protein dalam pasangan gen yang diatur oleh faktor transkripsi, kami dapat melacak duplikasi hanya jika pasangan tersebut tertanam dalam topologi jaringan yang sesuai. Misalnya, jika faktor transkripsi tidak memiliki penetapan domain tetapi mengatur dua gen yang homolog, kami masih dapat melacak evolusi interaksi tersebut (Gbr. 2b).

Identifikasi tepi duplikat dan prosedur simulasi.

Kami menilai signifikansi interaksi bersama di antara homolog dengan perbandingan dengan skenario di mana arsitektur domain diacak secara acak melintasi protein. Kami mensimulasikan ini dengan mempertahankan topologi jaringan nyata dan mengacak arsitektur domain secara acak di antara node tersebut dengan informasi arsitektur domain. Kami mengocok faktor transkripsi secara terpisah dari gen target. Kami melakukan simulasi 10.000 kali, dan setiap kali kami menghitung jumlah faktor transkripsi homolog dengan target bersama dan gen target homolog dengan faktor transkripsi bersama. Fraksi homolog dengan interaksi bersama tidak pernah setinggi yang diamati di jaringan nyata di semua 10.000 iterasi perhitungan (Metode Tambahan online).

Informasi tentang kumpulan data yang digunakan dan penugasan struktural tersedia di http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/madanm/net_evol/.

Catatan: Informasi tambahan tersedia di situs web Nature Genetics.


Bahan dan metode

Interaksi regulasi

Kami memperoleh interaksi regulasi dari RegulonDB 5.6 [1]. Setelah menghilangkan gen RNA dan pseudogen, dan faktor sigma rumah tangga RpoD, kami memiliki 159 TF yang dikarakterisasi, 1.354 gen yang diatur, dan 3.085 interaksi pengaturan di antara mereka. Beberapa TF adalah heterodimer dalam kasus ini, kami hanya menganalisis satu dari dua subunit. Kami juga memeriksa TF dan anotasi gen di EcoCyc [47] dan operon yang dikenal di RegulonDB.

Sejarah evolusi TF

Kami menyelidiki sejarah evolusi TF dengan membandingkan pohon gen dengan pohon spesies. Sebagai langkah pertama, kami menggunakan pohon yang bergabung dengan tetangga cepat [48] untuk COG, PFams, dan AD hoc Keluarga BLAST dari browser pohon MicrobesOnline [49] dan kami membandingkan pohon gen dengan pohon spesies MicrobesOnline. (Bagian yang paling relevan dari pohon spesies ditunjukkan pada Gambar 2, dan konstruksi pohon spesies dijelaskan di bawah.)

Diberikan pohon gen dan pohon spesies, kami mengidentifikasi peristiwa transfer horizontal menggunakan kombinasi filogeni gen dan pola keberadaan gen dan ketidakhadiran gen. Jika clade yang sangat didukung di pohon gen hadir dalam genom yang berbeda, sehingga tiga atau lebih peristiwa penghapusan diperlukan untuk menjelaskan distribusi subfamili pada pohon spesies, maka kami menetapkan peristiwa HGT. Penghapusan dalam genom yang sangat berkurang dari kelompok endosimbion serangga (Buchnera, Wigglesworthia, dan Blochmannia) tidak dianggap sebagai bukti untuk HGT. Mengingat bahwa HGT tampaknya umum pada bakteri, ambang tiga atau lebih peristiwa penghapusan adalah konservatif. Secara khusus, dengan ambang batas yang lebih tinggi, sejumlah besar penghapusan dari bakteri leluhur diperlukan untuk menjelaskan distribusi gen saat ini, yang mengharuskan bakteri leluhur memiliki genom yang terlalu besar [50, 51].

Jika pohon gen menunjukkan paralog, dan filogeni dua subkelompok konsisten dengan pohon spesies, maka kami menetapkan peristiwa duplikasi gen. Sejarah yang tidak memenuhi salah satu kriteria ini dianggap asli, bahkan jika ada perbedaan kecil antara pohon spesies dan pohon gen. Jika gen menunjukkan bukti untuk HGT dan duplikasi, maka kami menggunakan peristiwa terbaru untuk mengklasifikasikan asal gen (misalnya, dengung/rbsR, pada Gambar 4, diklasifikasikan sebagai duplikasi).

Setelah kami memiliki klasifikasi tentatif, kami mengkonfirmasinya dengan memeriksa homolog dekat (dengan BLASTp) yang mungkin tidak ada dari keluarga gen (karena keterbatasan penugasan keluarga gen) dan dengan membangun pohon filogenetik yang lebih kecil dan lebih akurat untuk yang dipilih himpunan bagian dari homolog. Untuk membangun pohon berkualitas lebih tinggi ini, kami menggunakan OTOT [52] untuk menyelaraskan urutan pengkodean protein, Gblocks untuk memangkas keberpihakan [53], dan TreePuzzle [54] dan phyml [55] untuk membangun pohon filogenetik.

Kami juga bertanya apakah peristiwa HGT diduga memengaruhi E. coli garis keturunan. Misalnya, seperti yang terlihat untuk crp (Gambar 5), pohon menunjukkan peristiwa transfer dari E. colinenek moyangnya ke garis keturunan lain, tetapi ini tidak berarti bahwa E. colinenek moyang memperoleh gen oleh HGT. Gen-gen ini diklasifikasikan sebagai asli.

Kami berasumsi bahwa gen ini dipindahkan dari bakteri lain ke E. coli garis keturunan, bukan dan sebaliknya, meskipun secara teoritis mungkin bahwa TF ini muncul di E. coli garis keturunan relatif baru dan kemudian dipindahkan ke tempat lain. Karena sebagian besar TF milik keluarga besar yang hadir di banyak garis keturunan bakteri lain, dan juga karena TF ini sering memiliki paralog jauh di E. coli, asal baru-baru ini dari keluarga-keluarga ini dalam E. coli garis keturunan tidak masuk akal.

Pohon spesies

Pohon spesies dihitung dari pohon kemungkinan maksimum protein gabungan dengan menggunakan representasi matriks kekikiran [56]. Pohon kemungkinan maksimum dihasilkan dari pohon pemandu berkualitas rendah dengan memilih, untuk setiap simpul internal di pohon pemandu, sejumlah kecil genom turunan dan kelompok luar dekat (total kurang dari 20 genom). Mengingat kelompok kecil genom ini, kami mengidentifikasi COG [22] yang hadir sebagai salinan tunggal di setiap genom. Karena kelompok genom ini biasanya terdiri dari kerabat dekat, biasanya ada ratusan gen yang dilestarikan. Kami menyelaraskan dan memangkas setiap COG, sekali lagi menggunakan OTOT dan Gblocks, dan menggabungkan penyelarasan. Karena keselarasan yang dihasilkan seringkali sangat besar, kami menghapus situs invarian, dan jika penyelarasan masih berisi lebih dari 5.000 posisi maka kami mengambil sampel situs secara acak. Kami kemudian membangun pohon dengan phyml, menggunakan empat kategori tingkat evolusi. Kami mengonversi pohon ke matriks karakter [56] dan menggunakan PAUP 4.0b10 [57] untuk menyimpulkan pohon yang paling pelit. Akhirnya, kami menggunakan PHYLIP [58] untuk menyimpulkan kemungkinan panjang cabang maksimum, dengan tingkat terdistribusi gamma, dari keselarasan gabungan dari 74 protein yang sangat terkonservasi.

Penjelasan lebih lengkap tentang konstruksi pohon spesies tersedia online [49]. Pohon tidak mengandung nilai bootstrap, tetapi sebagian besar pohon sumber memiliki dukungan bootstrap yang kuat dan kongruen satu sama lain (data tidak ditampilkan). Ketidakpastian yang paling relevan adalah penempatan Fotorabdus, dan apakah Sodalis harus dikelompokkan dengan endosimbion serangga lainnya (Buchnera dan seterusnya).

Pengambilan sampel regulator

Kami memeriksa semua dari 20 regulator global teratas, yang mencakup sekitar dua pertiga dari interaksi regulasi di RegulonDB. Untuk regulator tetangga, kami memeriksa yang dijelaskan dalam kompilasi sebelumnya tentang interaksi regulasi, ColiNet 1.1 [59], yang kami gunakan pada fase awal proyek ini. Meskipun ini bukan sampel yang benar-benar acak, kami tidak tahu alasan apa pun mengapa regulator yang lebih baru dicirikan akan memiliki sejarah evolusi yang berbeda. Kami memeriksa sampel acak dari 23 regulator berkarakteristik lainnya di RegulonDB. Sekali lagi, ini terutama regulator yang dijelaskan di ColiNet.

Kami mengidentifikasi regulator diduga di E. coli K12 dengan mencari ontologi gen GO:0003700 ('transkripsi faktor aktivitas') menggunakan database MicrobesOnline. Kami memilih 20 secara acak untuk diperiksa, dan kami memverifikasi bahwa mereka diprediksi mengandung domain helix-turn-helix (dengan menggunakan InterPro), bahwa mereka tidak dijelaskan sebagai enzim restriksi atau enzim modifikasi DNA, dan bahwa mereka belum dikarakterisasi menurut EcoCyc [47].

Identifikasi otomatis gen HGT

Untuk mengidentifikasi HGT secara otomatis, kami mencari gen yang tidak memiliki homolog dekat dalam kelompok bakteri terkait yang berurutan (Gambar 9). Kami mendefinisikan homolog 'dekat' dengan skor BLAST, dan untuk mengkonfirmasi dugaan HGT kami menggunakan tes kuartet (lihat Gambar 9). Pendekatan ini kontras dengan pendekatan yang sangat bergantung pada pohon gen [13, 24] dan lebih mirip dengan analisis ada/tidaknya [60, 61]. Meskipun metode ini konservatif, dan melewatkan banyak peristiwa HGT (data tidak ditampilkan), metode ini mengklasifikasikan sekitar seperempat gen pengkode protein dalam E. coli K12 sebagai HGT, yang menghasilkan sampel yang cukup besar untuk dianalisis.

Identifikasi otomatis gen HGT. Kami memeriksa skor Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tertinggi dari homolog dalam kelompok genom pada jarak yang semakin jauh dari Escherichia coli. Jika skor BLAST secara substansial lebih rendah (dengan faktor 1,3) dalam dua kelompok berturut-turut relatif terhadap skor terbaiknya pada genom yang lebih jauh, maka gen tersebut dianggap sebagai kandidat untuk transfer gen horizontal (HGT). Dengan kandidat seperti itu, kami kemudian menggunakan tes kuartet untuk menentukan apakah pukulan terbaik dari genom yang lebih jauh sebenarnya lebih dekat hubungannya dengan E. coli gen daripada hits terbaik dari genom menengah. Tes kuartet mengkonfirmasi HGT pada 92% kasus ini, dan untuk 71% gen yang topologi kuartetnya menunjukkan HGT, topologinya sangat didukung (P < 0,05, dengan uji Shimodaira-Hasegawa dalam teka-teki pohon [54]). 'HPVS' mengacu pada Haemophilus, Pasteurella, Vibrio, Shewanella, dan spesies terkait.

Uji kuartet tidak dilakukan jika tidak ada homolog yang lebih jauh di masing-masing kelompok genom yang 'hilang' hit yang baik untuk gen, karena dalam kasus ini kita tidak memiliki empat gen untuk membentuk kuartet. Jika kami memang memiliki gen dari setiap kelompok genom, kami menyelaraskan empat gen dengan OTOT, kami menghapus posisi dengan celah dan kami menguji kemungkinan ketiga topologi dengan teka-teki pohon [54], menggunakan tingkat evolusi terdistribusi gamma.

Jaringan pengaturan yang diacak

Untuk menguji apakah kesamaan peraturan antara paralog terjadi lebih sering daripada yang kami harapkan secara kebetulan, kami menggunakan hipotesis nol sederhana bahwa jaringan peraturan berkembang secara acak. Hipotesis nol ini setara dengan model netral sederhana di mana situs pengikatan untuk regulator muncul secara netral, dan situs pengikatan untuk regulator global muncul lebih sering daripada untuk regulator lain, sehingga mereka mengatur lebih banyak gen.

Untuk menguji hipotesis nol ini, kami mengacak jaringan sehingga jumlah interaksi untuk setiap TF dan untuk setiap gen yang diatur tidak berubah (mirip dengan laporan oleh Maslov dan Sneppen [62] tetapi untuk jaringan pengatur). Lebih tepatnya, kami memilih gen yang diatur untuk setiap TF dengan mengambil sampel tanpa penggantian dari set lengkap gen yang diatur. Kami mengambil sampel ulang bagian jaringan untuk menghindari interaksi duplikat antara gen yang diatur dan TF. Ini memberi jaringan dengan distribusi derajat yang sama dengan jaringan asli, baik untuk TF maupun untuk gen yang diatur.

Tes pengacakan alternatif adalah mengubah hubungan paralogi alih-alih jaringan regulasi. (Lihat laporan oleh Teichmann dan Babu [4], meskipun mereka menggunakan terminologi 'arsitektur domain' daripada paralogi.) Tes ini menegaskan bahwa evolusi konvergen lebih umum di jaringan nyata daripada yang diharapkan secara kebetulan ketiga jenis kesamaan konvergen pada Tabel 1 lebih umum di jaringan nyata daripada di 999 atau lebih dari 1.000 pengocokan paralogi yang kami jalankan.

Memprediksi situs pengikatan untuk regulator global

Kami memperoleh situs pengikatan CRP yang dikarakterisasi di E. coli dari DPInteract [34]. Kami menyelaraskan situs-situs ini dengan MEME [63], mengubah keselarasan menjadi matriks bobot dengan simetri palindromik, dan menggunakan patser [64] untuk mencari situs. Kami mencari dari -200 hingga +100 relatif terhadap setiap kodon awal gen, dan kami hanya mempertimbangkan situs potensial dengan skor 6,0 bit atau lebih tinggi. Batas ini cukup lemah dan mengarah ke sensitivitas tinggi tetapi spesifisitas sederhana kami menemukan situs di E. coli untuk 13 dari 16 gen yang diatur CRP yang kami periksa, tetapi 13% dari wilayah hulu yang dipilih secara acak untuk xenolog E. coli gen memiliki hit pada 6.0 bit atau lebih tinggi. Namun demikian, situs CRP xenolog pada Tabel 2 tidak mungkin terjadi secara kebetulan yiaK dan gntK memiliki hit lebih dari 10 bit, yang terjadi di kurang dari 1% wilayah hulu, dan Arab memiliki dua situs terdekat, yang menunjukkan pengikatan kooperatif dan juga tidak mungkin terjadi secara kebetulan.

Analisis untuk regulator global lain yang memiliki matriks bobot di DPInteract dilakukan dengan cara yang sama, tetapi tanpa memaksa matriks bobot menjadi palindromik. Beberapa faktor sigma memiliki beberapa model, dalam hal ini kami menggunakan skor terbaik untuk model apa pun. Matriks bobot untuk lrp dan fis tidak digunakan karena memiliki spesifisitas yang buruk [34].


Referensi

Lee TI, Rinaldi NJ, Robert F, Odom DT, Bar-Joseph Z, Gerber GK, Hannett NM, Harbison CT, Thompson CM, Simon I, dkk: Jaringan regulasi transkripsi di Saccharomyces cerevisiae. Sains. 2002, 298: 799-804. 10.1126/sains.1075090.

Stormo GD: Situs pengikatan DNA: representasi dan penemuan. Bioinformatika. 2000, 16:16-23. 10.1093/bioinformatika/16.1.16.

Cliften P, Sudarsanam P, Desikan A, Fulton L, Fulton B, Majors J, Waterston R, Cohen BA, Johnston M: Menemukan fitur fungsional di Saccharomyces genom dengan jejak filogenetik. Sains. 2003, 301: 71-76. 10.1126/sains.1084337.

Kellis M, Patterson N, Endrizzi M, Birren B, Lander ES: Urutan dan perbandingan spesies ragi untuk mengidentifikasi gen dan elemen pengatur. Alam. 2003, 423: 241-254. 10.1038/alam01644.

Aparicio S, Morrison A, Gould A, Gilthorpe J, Chaudhuri C, Rigby P, Krumlauf R, Brenner S: Mendeteksi elemen regulasi yang dilestarikan dengan genom model ikan buntal Jepang, Rubi fugu. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92: 1684-1688.

Pritsker M, Liu YC, Beer MA, Tavazoie S. Penemuan seluruh genom dari situs pengikatan faktor transkripsi menggunakan konservasi tingkat jaringan. Res. Genom 2004, 14: 99-108. 10.1101/gr.1739204.

Hughes JD, Estep PW, Tavazoie S, GM Gereja: Identifikasi komputasional dari cis -elemen pengatur yang terkait dengan kelompok gen yang terkait secara fungsional di Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 2000, 296: 1205-1214. 10.1006/jmbi.2000.3519.

Zhu J, Zhang MQ: SCPD: database promotor ragi Saccharomyces cerevisiae. Bioinformatika. 1999, 15: 607-611. 10.1093/bioinformatika/15.7.607.

Yamaguchi-Iwai Y, Dancis A, Klausner RD: AFT1: mediator kontrol transkripsi yang diatur besi di Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 1995, 14:1231-1239.

Beer MA, Tavazoie S: Memprediksi ekspresi gen dari urutan. Sel. 2004, 117: 185-198. 10.1016/S0092-8674(04)00304-6.

Erives A, Levine M: Penguat koordinat berbagi fitur organisasi umum dalam genom Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 101: 3851-3856. 10.1073/pnas.0400611101.

Sudarsanam P, Pilpel Y, Church GM: Kemunculan bersama elemen promotor di seluruh genom mengungkapkan kaset pengatur cis dari motif transkripsi rRNA di Saccharomyces cerevisiae. Res. Genom 2002, 12: 1723-1731. 10.1101/gr.301202.

Blaiseau PL, Thomas D. Beberapa kompleks aktivasi transkripsi menambatkan aktivator ragi Met4 ke DNA. EMBO J. 1998, 17: 6327-6336. 10.1093/emboj/17.21.6327.

Chiang DY, Moses AM, Kellis M, Lander ES, Eisen MB: Pasangan kata yang dilestarikan secara filogenetik dan spasial terkait dengan perubahan ekspresi gen dalam ragi. Biola genom. 2003, 4: R43-10.1186/gb-2003-4-7-r43.

Davidson EH: Sistem Regulasi Genom. 2001, San Diego, CA: Pers Akademik

Coghlan A, Wolfe KH. Tingkat penataan ulang genom empat kali lebih cepat pada nematoda daripada di Drosophila. Res. Genom 2002, 12: 857-867. 10.1101/gr.172702.

Maduro MF, Rothman JH: Membuat nyali cacing: jaringan pengatur gen dari Caenorhabditis elegans endoderm. Dev Biol. 2002, 246: 68-85. 10.1006/dbio.2002.0655.

Cui M, Han M: Persyaratan regulasi Cis untuk ekspresi spesifik sel vulva dari Caenorhabditis elegans gen faktor pertumbuhan fibroblast egl-17. Dev Biol. 2003, 257: 104-116. 10.1016/S0012-1606(03)00033-2.

Gaudet J, Mango SE: Regulasi organogenesis oleh Caenorhabditis elegans Protein FoxA PHA-4. Sains. 2002, 295: 821-825. 10.1126/sains.1065175.

Maduro MF, Meneghini MD, Bowerman B, Broitman-Maduro G, Rothman JH: Pembatasan mesendoderm ke blastomer tunggal oleh aksi gabungan SKN-1 dan homolog GSK-3 dimediasi oleh MED-1 dan -2 di C. elegan. Sel Mol. 2001, 7: 475-485. 10.1016/S1097-2765(01)00195-2.

Harfe BD, Fire A: Regulasi spesifik otot dan saraf dari faktor homeodomain kelas NK-2 baru di Caenorhabditis elegans. Perkembangan. 1998, 125: 421-429.

Jantsch-Plunger V, Fire A: Struktur kombinatorial dari penambah transkripsi khusus otot tubuh di Caenorhabditis elegans. J Biol Chem. 1994, 269: 27021-27028.

Tsukiyama T, Becker PB, Wu C. Gangguan nukleosom yang bergantung pada ATP pada promotor kejutan panas yang dimediasi oleh pengikatan faktor transkripsi GAGA. Alam. 1994, 367: 525-532. 10.1038/367525a0.

King-Jones K, Korge G, Lehmann M. Protein helix-loop-helix dAP-4 dan tanpa anak mengikat baik in vitro dan in vivo ke situs SEBP3 yang diperlukan untuk aktivasi transkripsi gen Drosophila Sgs-4. J Mol Biol. 1999, 291: 71-82. 10.1006/jmbi.1999.2963.

Krause M, Fire A, Harrison SW, Priess J, Weintraub H: Akumulasi CeMyoD menentukan nasib sel otot dinding tubuh selama C. elegan embriogenesis. Sel. 1990, 63: 907-919. 10.1016/0092-8674(90)90494-Y.

Hu YF, Luscher B, Admon A, Mermod N, Tjian R: Faktor transkripsi AP-4 berisi beberapa domain dimerisasi yang mengatur spesifisitas dimer. Pengembang Gen.1990, 4: 1741-1752.

Blackwell TK, Weintraub H. Perbedaan dan persamaan dalam preferensi pengikatan DNA dari kompleks protein MyoD dan E2A yang diungkapkan oleh pemilihan situs pengikatan. Sains. 1990, 250: 1104-1110.

Krause M, Park M, Zhang J, Yuan J, Harfe B, Xu S, Greenwald I, Cole M, Paterson B, Fire A: A C. elegan Protein bHLH E/Daughterless menandai perkembangan otot saraf tetapi tidak lurik. Perkembangan. 1997, 124: 2179-2189.

Furuyama T, Nakazawa T, Nakano I, Mori N. Identifikasi pola distribusi diferensial mRNA dan urutan pengikatan konsensus untuk homolog DAF-16 mouse. Biochem J. 2000, 349: 629-634. 10.1042/0264-6021:3490629.

Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, Li H, Kenyon C: Gen yang bertindak di hilir DAF-16 untuk memengaruhi umur Caenorhabditis elegans. Alam. 2003, 424: 277-283. 10.1038/alam01789.

Lee SS, Kennedy S, Tolonen AC, Ruvkun G: DAF-16 gen target yang mengontrol C. elegan rentang hidup dan metabolisme. Sains. 2003, 300: 644-647. 10.1126/sains.1083614.

Gronostajski RM: Analisis faktor nuklear I yang mengikat DNA menggunakan oligonukleotida degenerasi. Asam Nukleat Res. 1986, 14: 9117-9132.

Lee W, Mitchell P, Tjian R. Faktor transkripsi murni AP-1 berinteraksi dengan elemen penambah yang dapat diinduksi TPA. Sel. 1987, 49: 741-752. 10.1016/0092-8674(87)90612-X.

Kockel L, Homsy J, Bohmann D: Drosophila AP-1: pelajaran dari invertebrata. Onkogen. 2001, 20: 2347-2364. 10.1038/sj.onc.1204300.

Karin M, Liu Z, Zandi E. Fungsi dan regulasi AP-1. Curr Opin Sel Biol. 1997, 9: 240-246. 10.1016/S0955-0674(97)80068-3.

Grandori C, Cowley SM, James LP, Eisenman RN: Jaringan Myc/Max/Mad dan kontrol transkripsi perilaku sel. Annu Rev Sel Dev Biol. 2000, 16: 653-699. 10.1146/annurev.cellbio.16.1.653.

Rice DA, Mouw AR, Bogerd AM, Parker KL: Elemen promotor bersama mengatur ekspresi tiga enzim steroidogenik. Mol Endokrinol. 1991, 5: 1552-1561.

Ueda H, Sun GC, Murata T, Hirose S. Motif pengikatan DNA baru berbatasan dengan domain jari seng dari reseptor hormon nuklir serangga FTZ-F1 dan protein pengikat berulang terminal panjang embrional tikus. Sel Mol Biol. 1992, 12: 5667-5672.

Shaywitz AJ, Greenberg ME: CREB: faktor transkripsi yang diinduksi stimulus yang diaktifkan oleh beragam sinyal ekstraseluler. Annu Rev Biochem. 1999, 68: 821-861. 10.1146/annurev.biochem.68.1.821.

Dijk MAV, Voorhoeve PM, Murre C: Pbx1 diubah menjadi aktivator transkripsi setelah memperoleh wilayah N-terminal E2A pada leukemia limfoblastoid akut pra-sel B. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993, 90: 6061-6065.

Manak JR, Mathies LD, Scott MP: Regulasi penambah midgut decapentaplegic oleh protein homeotik. Perkembangan. 1994, 120: 3605-3619.

Mauhin V, Lutz Y, Dennefeld C, Alberga A. Definisi repertoar situs pengikatan DNA untuk faktor transkripsi Drosophila SNAIL. Asam Nukleat Res. 1993, 21: 3951-3957.

Huber HE, Edwards G, Goodhart PJ, Patrick DR, Huang PS, Ivey-Hoyle M, Barnett SF, Oliff A, Heimbrook DC: Faktor transkripsi E2F mengikat DNA sebagai heterodimer. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993, 90: 3525-3529.

Boxem M, vanden Heuvel S: C. elegan gen multivulva sintetik kelas B bekerja dalam regulasi G(1). Curr Biol. 2002, 12: 906-911. 10.1016/S0960-9822(02)00844-8.

Ceol CJ, Horvitz HR: dpl-1 DP dan efl-1 E2F bertindak dengan lin-35 Rb untuk memusuhi pensinyalan Ras di C. elegan perkembangan vulva. Sel Mol. 2001, 7: 461-473. 10.1016/S1097-2765(01)00194-0.

Kwon JY, Hong M, Choi MS, Kang S, Duke K, Kim S, Lee S, Lee J: Gen respons etanol dan regulasinya dianalisis dengan mikroarray dan pendekatan genom komparatif dalam nematoda Caenorhabditis elegans. genomik. 2004, 83: 600-614. 10.1016/j.ygeno.2003.10.008.

Lund J, Tedesco P, Duke K, Wang J, Kim SK, Johnson TE: Profil transkripsi penuaan pada C. elegan. Curr Biol. 2002, 12: 1566-1573. 10.1016/S0960-9822(02)01146-6.

Ohler U, Yekta S, Lim LP, Bartel DP, Burge CB: Pola konservasi urutan mengapit dan motif hulu karakteristik untuk identifikasi gen microRNA. RNA. 2004, 10: 1309-1322. 10.1261/rna.5206304.

Celniker SE, Rubin GM: The Drosophila melanogaster genom. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2003, 4: 89-117. 10.1146/annurev.genom.4.070802.110323.

Matsukage A, Hirose F, Hayashi Y, Hamada K, Yamaguchi M: Urutan DRE TATCGATA, elemen pengaktif promotor diduga untuk Drosophila melanogaster gen terkait proliferasi sel. gen. 1995, 166: 233-236. 10.1016/0378-1119(95)00586-2.

Choi T, Cho N, Oh Y, Yoo M, Matsukage A, Ryu Y, Han K, Yoon J, Baek K: Sistem faktor pengikatan elemen (DRE)-replikasi DNA (DREF) mungkin terlibat dalam ekspresi NS Drosophila melanogaster gen TBP. FEBS Lett. 2000, 483: 71-77. 10.1016/S0014-5793(00)02085-8.

Park SY, Kim YS, Yang DJ, Yoo MA: Regulasi transkripsi gen katalase Drosophila oleh sistem DRE/DREF. Asam Nukleat Res. 2004, 32: 1318-1324. 10.1093/nar/gkh302.

Hanes SD, Brent R. Model genetik untuk interaksi heliks pengenalan homeodomain dengan DNA. Sains. 1991, 251: 426-430.

Anderson MG, Perkins GL, Chittick P, Shrigley RJ, Johnson WA: Drifter, faktor transkripsi domain POU Drosophila, diperlukan untuk diferensiasi dan migrasi sel trakea dan glia garis tengah yang benar. Pengembang Gen. 1995, 9: 123-137.

Bhat KM, Poole SJ, Schedl P: Gen miti-mere dan pdm1 berkolaborasi selama spesifikasi garis keturunan RP2/sib di Drosophila neurogenesis. Sel Mol Biol. 1995, 15: 4052-4063.

Junger MA, Rintelen F, Stocker H, Wasserman JD, Vegh M, Radimerski T, Greenberg ME, Hafen E: The Drosophila Faktor transkripsi forkhead FOXO memediasi pengurangan jumlah sel yang terkait dengan penurunan pensinyalan insulin. J Biol. 2003, 2: 20-10.1186/1475-4924-2-20.

Erickson JW, Cline TW: Aspek kunci dari mekanisme penentuan jenis kelamin primer dilestarikan di seluruh genus Drosophila. Perkembangan. 1998, 125: 3259-3268.

Waterston RH, Lindblad-Toh K, Birney E, Rogers J, Abril JF, Agarwal P, Agarwala R, Ainscough R, Alexandersson M, An P, dkk: Urutan awal dan analisis komparatif genom tikus. Alam. 2002, 420: 520-562. 10.1038/alam01262.

Suske G: Keluarga Sp dari faktor transkripsi. gen. 1999, 238: 291-300. 10.1016/S0378-1119(99)00357-1.

Ramji DP, Foka P: CCAAT/protein pengikat penambah: struktur, fungsi dan regulasi. Biochem J. 2002, 365: 561-575.

Latchman D: Faktor Transkripsi Eukariotik. 1997, London: Pers Akademik

Vo N, Goodman RH: Protein pengikat CREB dan p300 dalam regulasi transkripsi. J Biol Chem. 2001, 276: 13505-13508.

Bernards R. Regulasi transkripsi. Membalik tombol Myc. Curr Biol. 1995, 5: 859-861. 10.1016/S0960-9822(95)00173-4.

Nasrin N, Ercolani L, Denaro M, Kong XF, Kang I, Alexander M. Elemen respons insulin dalam gen dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat mengikat protein nuklir yang diinduksi oleh insulin dalam sel yang dikultur dan oleh manipulasi nutrisi in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990, 87: 5273-5277.

Suzuki F, Goto M, Sawa C, Ito S, Watanabe H, Sawada J, Handa H: Interaksi fungsional faktor transkripsi subunit protein pengikat GA manusia. J Biol Chem. 1998, 273: 29302-29308. 10.1074/jbc.273.45.29302.

Zimmermann AG, Wright KL, Ting JP, Mitchell BS: Regulasi ekspresi gen inosin-5'-monofosfat dehidrogenase tipe II dalam sel T manusia. Peran untuk urutan oktamer palindromik 5' novel. J Biol Chem. 1997, 272: 22913-22923. 10.1074/jbc.272.36.22913.

Gottlieb S, Hanes SD, Golden JA, Oakey RJ, Budarf ML: seperti goosecoid, sebuah gen yang dihapus dalam DiGeorge dan sindrom velocardiofacial, mengenali DNA dengan kekhususan seperti bicoid dan diekspresikan dalam otak tikus yang sedang berkembang. Hum Mol Gen. 1998, 7: 1497-1505. 10.1093/hmg/7.9.1497.

Singh H, Sen R, Baltimore D, Sharp PA: Faktor nuklir yang mengikat motif urutan yang dilestarikan dalam elemen kontrol transkripsi gen imunoglobulin. Alam. 1986, 319: 154-158. 10.1038/319154a0.

Nie Z, Mei Y, Ford M, Rybak L, Marcuzzi A, Ren H, Stiles GL, Ramkumar V: Stres oksidatif meningkatkan ekspresi reseptor adenosin A1 dengan mengaktifkan faktor nuklir kappa B. Mol Pharmacol. 1998, 53: 663-669.

Glasgow JN, Wood T, Perez-Polo JR: Identifikasi dan karakterisasi situs pengikatan faktor nuklir B di promotor bcl-x murine. J Neurokimia. 2000, 75: 1377-1389. 10.1046/j.1471-4159.20000.0751377.x.

Whitfield ML, Sherlock G, Saldanha AJ, Murray JI, Ball CA, Alexander KE, Matese JC, Perou CM, Hurt MM, Brown PO, Botstein D: Identifikasi gen yang diekspresikan secara berkala dalam siklus sel manusia dan ekspresinya dalam tumor. Sel Mol Biol. 2002, 13: 1977-2000. 10.1091/mbc.02-02-0030..

Rustici G, Mata J, Kivinen K, Lio P, Penkett CJ, Burns G, Hayles J, Brazma A, Perawat P, Bahler J: Program ekspresi gen periodik dari siklus sel ragi fisi. Nat Gen. 2004, 36: 809-817. 10.1038/ng1377.

Stormo GD, Fields DS: Spesifisitas, energi bebas dan kandungan informasi dalam interaksi protein-DNA. Tren Biokimia Sci. 1998, 23: 109-113. 10.1016/S0968-0004(98)01187-6.

Kalir S, Alon U: Menggunakan cetak biru kuantitatif untuk memprogram ulang dinamika jaringan gen flagela. Sel. 2004, 117: 713-720. 10.1016/j.cell.2004.05.010.

Waterman MS, Eggert M: Algoritma baru untuk penyelarasan suburutan terbaik dengan aplikasi untuk perbandingan tRNA-rRNA. J Mol Biol. 1987, 197: 723-728. 10.1016/0022-2836(87)90478-5.

Wolfertstetter F, Frech K, Herrmann G, Werner T. Identifikasi elemen fungsional dalam urutan asam nukleat yang tidak selaras dengan algoritma pencarian tuple baru. Aplikasi Komputer Biosci. 1996, 12: 71-80.

Zhang MQ: Identifikasi promotor inti gen manusia dalam silikon. Res. Genom 1998, 8: 319-326.

Curwen V, Eyras E, Andrews TD, Clarke L, Mongin E, Searle SM, Clamp M: Sistem anotasi gen otomatis ENSEMBL. Res. Genom 2004, 14: 942-950. 10.1101/gr.1858004.

Pusat Pengurutan Genom Manusia di Baylor College of Medicine: Proyek genom Drosophila. [http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/drosophila]

Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cherry JM, Davis AP, Dolinski K, Dwight SS, Eppig JT, dkk: Ontologi gen: alat untuk penyatuan biologi. Konsorsium Ontologi Gen. Nat Gen. 2000, 25: 25-29. 10.1038/75556.

Mewes HW, Amid C, Arnold R, Frishman D, Guldener U, Mannhaupt G, Munsterkotter M, Pagel P, Strack N, Stumpflen V, dkk: MIPS: analisis dan anotasi protein dari seluruh genom. Asam Nukleat Res. 2004, D41-D44. 10.1093/nar/gkh092. 32 Basis Data

Gusfield D: Algoritma pada String, Pohon, dan Urutan. 1997, Cambridge, Inggris: Cambridge University Press

Tekan WH, Flannery BP, Teukolsky SA, Vetterling WT: Resep Numerik di C: Seni Komputasi Ilmiah. 1993, Cambridge, Inggris: Cambridge University Press

Pilpel Y, Sudarsanam P, GM Gereja: Mengidentifikasi jaringan regulasi dengan analisis kombinatorial elemen promotor. Nat Gen. 2001, 29: 153-159. 10.1038/ng724.

Yuh CH, Bolouri H, Davidson EH: Genomic cis -logika regulasi: analisis eksperimental dan komputasi dari gen landak laut. Sains. 1998, 279: 1896-1902. 10.1126/sains.279.5358.1896.

Needleman SB, Wunsch CD: Sebuah metode umum yang berlaku untuk mencari kesamaan dalam urutan asam amino dari dua protein. J Mol Biol. 1970, 48: 443-453.

Matys V, Fricke E, Geffers R, Gössling E, Haubrock M, Hehl R, Hornischer K, Karas D, Kel AE, Kel-Margoulis OV, dkk: TRANSFAC: regulasi transkripsi, dari pola ke profil. Asam Nukleat Res. 2003, 31: 374-378. 10.1093/nar/gkg108.

Gollub J, Ball CA, Binkley G, Demeter J, Finkelstein DB, Hebert JM, Hernandez-Boussard T, Jin H, Kaloper M, Matese JC, dkk: Stanford Microarray Database: akses data dan alat penilaian kualitas. Asam Nukleat Res. 2003, 31: 94-96. 10.1093/nar/gkg078.

Stuart JM, Segal E, Koller D, Kim SK. Jaringan koekspresi gen untuk penemuan global modul genetik yang dilestarikan. Sains. 2003, 302: 249-255. 10.1126/sains.1087447.

Lieb JD, Liu X, Botstein D, Brown PO: Pengikatan Rap1 spesifik-promotor yang diungkapkan oleh peta-peta luas-genom dari asosiasi protein-DNA. Nat Gen. 2001, 28: 327-334. 10.1038/ng569.

Balasubramanian B, Lowry CV, Zitomer RS: Penindas Rox1 dari Saccharomyces cerevisiae gen hipoksia adalah protein pengikat DNA spesifik dengan motif kelompok mobilitas tinggi. Sel Mol Biol. 1993, 13: 6071-6078.

Gasch AP, Spellman PT, Kao CM, Carmel-Harel O, Eisen MB, Storz G, Botstein D, Brown PO: Program ekspresi genomik dalam respons sel ragi terhadap perubahan lingkungan. Sel Mol Biol. 2000, 11: 4241-4257.


Diskusi

Perbedaan fenotipik antara gen ortologis manusia dan tikus sering dianggap sebagai kegagalan model tikus dan jarang dilaporkan dalam kasus tertentu (Bakker et al. 2013 Chandrasekera dan Pippin 2013 Seok et al. 2013). Dengan demikian, masih belum jelas gen ortologi mana yang telah mengalami perubahan fenotipik yang signifikan dan jenis peristiwa evolusi molekuler apa yang berkontribusi pada perbedaan fenotipik. Dalam penelitian ini, kami menetapkan untuk pertama kalinya pendekatan terpadu untuk perbandingan genotipe-fenotipe untuk mengungkapkan beragam peristiwa evolusi molekuler yang kemungkinan berkontribusi pada perbedaan fenotipe yang dihasilkan dari perbedaan antara genom manusia dan tikus. Kami merancang sistem penilaian PS kuantitatif (gbr. 1) untuk memetakan perbandingan fenotipe skala genom untuk menganalisis kesesuaian atau perbedaan pada penyakit manusia dan fenotipe tikus. Kami menemukan bahwa perbedaan fenotipik sebagian dijelaskan oleh perbedaan dalam elemen pengatur noncoding dan profil transkriptomik daripada perbedaan dalam urutan pengkodean protein (gambar 2-4).

Skor PS memberikan penilaian statistik tentang signifikansi kesamaan fenotipik dibandingkan dengan model yang diharapkan berdasarkan dugaan fungsi ortologi (gbr. 1). Namun, kami bertanya-tanya apakah keakuratan skor PS dipengaruhi oleh ketidaklengkapan pemetaan genotipe-fenotipe saat ini. Dengan demikian, kami mengkonfirmasi bahwa perhitungan skor PS kuat ketika menghapus 15% pemetaan genotipe-fenotipe (Pearson ρ = 0,95), atau saat menggunakan database pemetaan versi lama (ρ = 0,91), dengan demikian mensimulasikan ketidaklengkapan pemetaan ( gambar tambahan S16 , Materi Tambahan online). Kami juga mengkonfirmasi bahwa kumpulan data kami untuk perbandingan fenotipe tidak bias terhadap kelas fenotipe tertentu, dan menunjukkan bahwa itu mewakili peta gen-fenotipe manusia dan tikus saat ini (gambar tambahan. S17, Bahan Tambahan online). Secara khusus, proporsi gen dengan kelas HPO dan MPO dalam kumpulan data kami sangat berkorelasi dengan proporsi dalam basis data OMIM dan MGI, masing-masing (ρ = 1,00 dalam OMIM, ρ = 0,98 dalam MGI), menunjukkan bahwa komposisi istilah fenotipe dalam kumpulan data kami memberikan representasi yang baik dari mereka dalam kumpulan gen lengkap. Secara bersama-sama, pendekatan fenomik kami menggunakan skor PS dapat diterapkan untuk perbandingan hubungan gen-fenotipe saat ini antara kedua spesies.

Kami menemukan bahwa divergensi regulasi dikaitkan dengan perbedaan fenotipik pada gen ortologis manusia dan tikus (gbr. 3). Munculnya perbedaan fenotip yang sering mungkin diakibatkan oleh divergensi evolusioner antara spesies daripada kesalahan acak dalam perbandingan genotipe-fenotipe. Dilaporkan bahwa perubahan urutan regulasi gen dapat menjadi sumber evolusi fenotipik (Carroll 2008 Indjeian et al. 2016). Kelompok gen sering diatur bersama dan fungsinya dipengaruhi oleh mutasi sakelar pada gen pengatur (Babu et al. 2004 Voordeckers et al. 2015). Memang, kami menemukan bahwa gen yang terletak di jalur atau modul fungsional yang sama cenderung menunjukkan perbedaan fenotipik bersamaan, yang konsisten dengan laporan sebelumnya yang menyiratkan bahwa perubahan fenotip dapat terjadi secara modular (Ryan et al. 2013 Han et al. 2015 Kachroo et al.2015). Misalnya, dari analisis LPG, 13 dari 17 gen jalur anemia Fanconi (FAP) dengan skor PS yang sama memiliki perbedaan fenotipik yang signifikan ( tabel tambahan S4 , Bahan Tambahan online). Memang, mutasi gen FAP tikus tidak menunjukkan kelainan perkembangan yang sering diamati pada pasien FA manusia ( Bakker et al. 2013).

Hasil kami memberikan bukti bahwa analisis data transkriptomik komparatif harus dilakukan untuk mengidentifikasi di jaringan mana ekspresi gen tikus merupakan model yang cocok untuk penyakit manusia, dan menunjukkan kebutuhan untuk mengoptimalkan penggunaan model hewan secara hati-hati. Hasil kami menunjukkan bahwa, dalam banyak kasus, perubahan profil ekspresi spesifik jaringan lintas spesies mampu menjelaskan perbedaan fenotipik antara gen ortologis manusia dan tikus (gbr. 4). Data transkriptom komparatif terbaru mengungkapkan bahwa banyak gen ortologis manusia/tikus memiliki profil transkriptom yang berbeda dalam jaringan atau tipe sel yang berbeda (Forrest et al. 2014 Yue et al. 2014). Perbandingan data transkriptom dapat sangat berharga untuk mengidentifikasi jaringan atau tipe sel mana yang terhubung dengan perubahan fenotipik atau konservasi gen tertentu antara manusia dan organisme model (Breschi et al. 2017) karena perubahan transkriptomik dianggap sebagai “fenotipe molekuler menengah” dan konsekuensi dari variasi genetik yang mencerminkan keadaan sistem saat ini (yaitu, jaringan, organ, atau spesies) (Burga dan Lehner 2013).

Phenolog, gen ortologis dengan fenotipe yang identik di seluruh spesies, sangat membantu ketika menyelidiki mekanisme molekuler yang mendasari fenotipe penyakit manusia melalui pendekatan genetik tikus (McGary et al. 2010 McWhite et al. 2015). Namun, penemuan fenotipe sulit karena perbedaan fenotip sering diamati antara gen ortologis, dan pemetaan hubungan genotipe-fenotipe manusia dan tikus seringkali tidak lengkap. Dengan demikian, kami menyelidiki konservasi ekspresi spesifik jaringan di semua gen ortologis manusia dan tikus menggunakan basis data FANTOM dan ENCODE ( data tambahan S2, Materi Tambahan online dan lihat situs pendamping kami https://sbi.postech.ac.kr/w/PS ). Gen ortologis dengan konservasi ekspresi tinggi mungkin berguna untuk mengidentifikasi fenolog diduga.

Dalam analisis kami, divergensi urutan pengkode protein tidak dapat menjelaskan perbedaan fenotipik antara gen ortologis manusia dan tikus (gbr. 2). Menurut teori netral evolusi molekuler, divergensi urutan gen dapat dihasilkan dari fiksasi banyak mutasi netral acak, serta seleksi positif mutasi menguntungkan, yang mempengaruhi evolusi adaptif fenotipe (Orr 2005). Juga, karena kompleksitas pemetaan genotipe-fenotipe yang tinggi, perbedaan fenotipik hanya dapat dijelaskan dengan integrasi beragam fitur evolusi molekuler yang diperoleh dari perbandingan lintas spesies dari pendekatan multi-omik, termasuk fitur evolusi molekuler yang terkait dengan urutan noncoding atau pengkodean ( Maher 2012 Breschi dkk. 2017). Dengan demikian, studi lebih lanjut tentang beragam peristiwa evolusi molekuler diperlukan untuk lebih memahami perbedaan fenotipik antar spesies. Kami mengantisipasi bahwa perbandingan lintas spesies peta genotipe-fenotipe kami yang dikombinasikan dengan penggunaan data dari pendekatan multi-omics akan terbukti menjadi sumber daya yang berharga, termasuk sebagai kumpulan referensi untuk pelatihan dan pembuatan model komputasi yang dapat menjelaskan sifat kompleks dari perbedaan fenotipik melalui fitur evolusi molekuler (Breschi et al. 2017).


Pengantar

Tubuh manusia dewasa terdiri dari

37 triliun sel 1 , yang merupakan unit fungsional sistem organisme. Meskipun setiap sel mengandung informasi genom yang hampir identik, setidaknya beberapa ratus jenis sel utama dengan morfologi, perilaku, dan fungsi yang berbeda diharapkan ada dalam tubuh manusia. Penyimpangan dari identitas sel fungsional yang ditakdirkan adalah penyebab utama penyakit manusia. Komposisi seluler yang berbeda dari jaringan tumor dapat menghasilkan respons dan prognosis obat yang berbeda. Varian genetik terkait penyakit hanya memengaruhi tipe sel tertentu, yang membuat validasi fungsional varian kandidat yang berasal dari studi asosiasi genome menjadi menantang 2 . Oleh karena itu, memahami operasi tubuh manusia pada resolusi seluler adalah tujuan akhir dalam biologi dan kedokteran.

Investigasi jenis sel individu in vivo secara teknis menantang. Analisis flow cytometry telah digunakan untuk pembuatan profil sel tunggal selama beberapa dekade terakhir 3 , meskipun dengan beberapa keterbatasan. Pertama, ini adalah metode analisis yang ditargetkan hanya untuk sekumpulan molekul yang telah dipilih sebelumnya. Kedua, karena keterbatasan spektral protein fluoresen, metode ini dapat membuat profil hingga 17 protein secara bersamaan, yang diperluas hingga

40 protein dengan sitometri massa 4 . Baru-baru ini, kami telah menyaksikan peningkatan pesat dalam teknologi sekuensing RNA sel tunggal (scRNA-seq), yang memang merupakan pengubah permainan di bidang biologi sel tunggal. Teknologi scRNA-seq saat ini dapat dengan mudah menghasilkan data seluruh transkriptom untuk ratusan hingga ribuan sel dari reaksi sekuensing tunggal dan mengidentifikasi gen kunci yang terkait dengan setiap jenis atau status sel dengan analisis ekspresi diferensial di seluruh kelompok seluler berbeda dari transkriptom serupa. Oleh karena itu, kami sekarang mengkarakterisasi jenis atau keadaan sel individu dalam jaringan yang umumnya terdiri dari berbagai jenis sel. Sampai saat ini, berbagai metode untuk pembuatan dan analisis data scRNA-seq telah dikembangkan, dan metode tersebut dijelaskan secara ekstensif dalam ulasan bagus lainnya 4,5,6,7 . Studi pembandingan terbaru juga menunjukkan bahwa protokol scRNA-seq berbeda secara substansial dalam kemampuan mereka untuk menangkap RNA, skalabilitas, dan efektivitas biaya 8,9 .

Meskipun banyak perbaikan, omics sel tunggal mungkin tidak cukup untuk memahami heterogenitas seluler. Meskipun analisis ekspresi diferensial dari data scRNA-seq dapat mengidentifikasi gen yang spesifik untuk tipe dan keadaan sel, memahami identitas seluler hanya dari daftar gen yang naik atau turun regulasi akan menjadi tugas yang menakutkan karena efek fungsional gen bergantung pada hubungan mereka. Fungsi gen dan efek varian terkait penyakit sebagian besar disebabkan oleh mitra interaksi gen ini dalam konteks seluler tertentu 10,11 . Dari perspektif biologi sistem, pemodelan jaringan gen akan sangat berguna untuk memahami organisasi fungsional dari regulator utama yang terlibat dalam jalur operasional setiap keadaan sel 12 . Biologi jaringan telah mengubah persepsi kita tentang sel dari sistem yang sebagian besar terdiri dari jalur pensinyalan linier ke sistem yang ditempati oleh banyak koneksi terjalin yang sangat kompleks di antara molekul. Secara khusus, jaringan pengatur gen (GRN) adalah model grafik yang intuitif tetapi serbaguna untuk analisis fungsional yang telah digunakan secara luas selama dekade terakhir. GRN telah memberikan kontribusi yang signifikan untuk mengidentifikasi biomarker penyakit dan target terapi dan akhirnya direalisasikan sebagai alat penting untuk menguraikan data genomik medis 13 . Meneliti interaksi pengaturan antara gen dalam berbagai konteks biologis akan memberikan wawasan berharga tentang bagaimana fungsi yang muncul dari sistem kehidupan tertentu dirancang untuk diatur.

Dalam artikel ulasan ini, kami memperkenalkan definisi biologi jaringan sel tunggal dan menyajikan metodologi saat ini untuk menyimpulkan GRN dari data scRNA-seq dan menentukan bagaimana mereka dapat meningkatkan pemahaman kami tentang sirkuit pengaturan untuk identitas seluler dan memfasilitasi praktik kedokteran presisi.


Bahan dan metode

Media Pertumbuhan dan Strain

Bakteri dikultur dalam media minimal garam-T yang dilengkapi dengan glukosa (0,2% b/v) ditambah 30 μM KH2PO4 untuk chemostat atau 1 mM KH2PO4 untuk kultur batch (Spira et al. 1995). Bakteri untuk uji fenotip ditumbuhkan atau minimal medium A atau L-broth (seperti yang dijelaskan oleh Miller [1972]). Semua pertumbuhan berada pada suhu 37 o C. Untuk chemostat jangka panjang, MC4100TF ditumbuhkan semalaman dalam garam-T dan diinokulasi ke dalam chemostat 80-ml yang mengandung garam-T, glukosa 0,2% dan 30 μM KH2PO4 seperti yang dijelaskan (Spira dan Ferenci 2008). Konsentrasi bakteri dalam chemostat stabil selama 37 hari, antara 1,5 dan 2,5 × 108 bakteri/ml.

Strain yang digunakan dalam penelitian ini dijelaskan pada tabel 2 . Alel yang berbeda dari rpoS, hfq, dan titik dipindahkan dari galur yang berevolusi menjadi galur leluhur atau dari galur leluhur menjadi galur yang berevolusi dengan transduksi P1 seperti yang dijelaskan dalam Miller (1972). Untuk pemindahan titik mutasi, zib563::Tn10 digunakan sebagai penanda seleksi terkait. Untuk pemindahan rpoS dan hfq dari isolat yang berevolusi menjadi strain leluhur atau dari leluhur menjadi isolat yang berevolusi, pertama-tama kami membangun cysD::amp dan purA::tet strain menggunakan protokol yang dijelaskan dalam Yu dan Pengadilan (1998). Kedekatan cysD::Amp tempat untuk rpoS dan purA::tet tempat untuk hfq kotransduksi yang diizinkan (㺐% kotransduksi dalam kedua kasus). Transduktan diuji untuk alel dengan sekuensing.

Meja 2

Strain yang Digunakan dalam Studi

StrainGenotipe yang relevanReferensi atau Asal
MC4100TFF-araD139 D(argF-lac)U169 rspL150 deoCl relA1 thiA ptsF25 flb5301 rbsRSpira dkk. (2008)
BW4218Isolat berevolusi ChemostatPelajaran ini
BW4223Isolat berevolusi ChemostatPelajaran ini
BW4227Isolat berevolusi ChemostatPelajaran ini
BW4236Isolat berevolusi ChemostatPelajaran ini
BW3454MC4100TF bertemuC162::Tn10Notley-McRobb dan Ferenci (1999)
BW4239Isolat berevolusi ChemostatPelajaran ini
BW5151DY330 purA:: Tn10Pelajaran ini
BW5153MC4100TF purA:: Tn10Pelajaran ini
BW5166MC4100 hfq4223Pelajaran ini
BW6006BW4223 hfq4100Pelajaran ini
BW5197BW4236 titik4100TFPelajaran ini
BW5199MC4100 titik4236Pelajaran ini
BW5200MC4100TF zib563::Tn10Spira dkk. (2008)
BW6007DY330 cysD::ampliPelajaran ini
BW6008MC4100TF cysD::ampPelajaran ini
BW6009BW4218 cysD::ampliPelajaran ini
BW6010BW4227 cysD::ampliPelajaran ini
BW6011BW4239 cysD::ampliPelajaran ini
BW6012MC4100 rpoS4218Pelajaran ini
BW6013MC4100 rpoS4227Pelajaran ini
BW6014MC4100 rpoS4239Pelajaran ini
BW6015BW4218 rpoS4100Pelajaran ini
BW6016BW4227 rpoS4100Pelajaran ini
BW6017BW4239 rpoS4100Pelajaran ini
DY330W3110 ΔlacU169 gal490 㮼l857 Δ(cro-bioA)Yu dkk. (2000)

Deteksi dari rpoS Status

Tingkat RpoS dinilai dengan pewarnaan glikogen dengan yodium intensitas warna coklat bervariasi sesuai dengan tingkat σ S dalam sel (Notley-McRobb et al. 2002). Untuk kuantisasi, foto-foto dipindai secara densitometri melintasi 2-μl bercak berbintik pada L-agar menggunakan perangkat lunak Image J dan kepadatan yang terkait dengan nilai leluhur. Untuk noda, kultur bakteri ditumbuhkan semalaman dalam media LB pada suhu 37 o C. Protein dari 2 × 109 sel diselesaikan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat (SDS)�lam gel 12,5%, dan RpoS dalam noda terdeteksi dengan antibodi anti-RpoS monoklonal yang diencerkan (NeoClone). Kit Super Signal West Pico (Pierce) digunakan untuk mendeteksi pita RpoS seperti yang direkomendasikan oleh pabrikan. Intensitas sinyal pada autoradiogram dipindai dan dihitung menggunakan perangkat lunak Image J. Setidaknya tiga budaya ulangan digunakan dan diuji untuk signifikansi statistik.

Uji Alkali Fosfatase

p-nitrofenil-fosfat (p-NPP) digunakan sebagai substrat seperti yang dijelaskan (Spira et al. 1995), dan unit aktivitas AP didefinisikan sebagai peningkatan absorbansi pada 410 nm/menit. Kepadatan sel optik pada 600/nm.

Uji Kerentanan SDS

Sensitivitas terhadap SDS diuji dari kultur semalam yang ditumbuhkan dalam kaldu-L dengan menempatkan kultur (2 μl) pada pelat L-agar yang mengandung 3% (b/v) SDS. Kultur cair yang mengandung 3% SDS diikuti dengan mengukur absorbansi 6 kali lipat ulangan strain dalam L-kaldu di piring mikrotiter.

Metil α-glukosida (α-MG)

Untuk menguji sensitivitas terhadap α-MG, kultur (2 μl) dioleskan pada media minimal A 0,2% gliserol agar dengan atau tanpa 1% α-MG. Untuk kuantisasi, foto-foto dipindai secara densitometri melintasi patch pertumbuhan menggunakan perangkat lunak Image J dan kepadatan yang terkait dengan nilai leluhur.

Hasil Pertumbuhan

Hasil ditentukan dengan mengukur kepadatan optik budaya pada 600 nm.

Tes Biologi

Katabolisme strain awal dan isolat chemostat dengan 95 substrat ditentukan menggunakan Biolog GN2 (Biolog) yang tersedia secara komersial seperti yang dijelaskan sebelumnya (King et al. 2004).

Tes Ketahanan Stres

Bakteri dari kultur semalam dalam L-broth dicuci dua kali dan diencerkan dalam NaCl 0,9% hingga kepadatan 𢏄 × 10 3 sel/ml. Untuk stres oksidatif, H . yang baru diencerkan2HAI2 ditambahkan ke 1 ml kultur hingga konsentrasi akhir 1, 2, 3, 4, dan 5 mM dan ditahan pada suhu kamar selama 30 menit. Untuk osmolaritas, suspensi 4 × 10 3 sel/ml diinkubasi dalam 1, 2, 3, 4, 5 M NaCl selama 1 jam pada suhu kamar.

Uji Serapan Pi

Untuk uji transportasi, 500 μl bakteri dari kultur chemostat terbatas Pi berumur 30 jam dicampur dengan 5 μl dari 100 μM KH2PO4 dan 10 μl dari 1㯌i 32 P/μl (MP Biomedis). Sampel (100 μl) yang diambil pada titik waktu disaring melalui filter ukuran pori 0,45-μm, segera dicuci dengan larutan pencuci 5 ml (garam T ditambah 100 μM KH2PO4). Tingkat penyerapan ditentukan dengan mengukur kilau 32 P dalam 5 × 10 7 sel pada filter.

Uji ppGpp

Sel yang tumbuh secara eksponensial dalam T-garam/glukosa dilengkapi dengan dan 0,25 mM 32 P-KH2PO4 (100 㯌i/ml) pada OD600 = 0,2. Sampel dipanen setelah 70, 80, dan 90 menit. Sampel berlabel dianalisis seperti pada Spira et al. (2008).

Eksperimen Kebugaran di Chemostat

Untuk perbandingan kebugaran, turunan tahan tetrasiklin dari MC4100TF membawa a bertemuC::Tn10 penyisipan digunakan, dan media dilengkapi dengan 4 μg/ml metionin. Kompetisi Chemostat seperti yang dijelaskan sebelumnya (Maharjan et al. 2006) dan koefisien seleksi berdasarkan persamaan di Dykhuizen dan Hartl (1983).

Detail dan strategi proteomik dan genomik dijelaskan dalam tabel tambahan S1 dan S2 (Bahan Tambahan online) dan legenda terkait.