Informasi

Apakah ada spesies (subspesies?) yang DNA atau RNA-nya hanya mengandung struktur batang-loop?

Apakah ada spesies (subspesies?) yang DNA atau RNA-nya hanya mengandung struktur batang-loop?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya seorang ilmuwan komputer yang bekerja di asam nukleat dari perspektif Teori Bahasa Formal. Saya berurusan dengan beberapa makalah yang menganalisis struktur Stem-Loop DNA.

Saya ingin beberapa referensi yang solid yang menegaskan (atau meniadakan):

1) Keberadaan struktur ini

2) Adanya (spesies, subspesies,… ) yang DNA atau RNA-nya telah dipastikan memiliki string yang merupakan struktur loop batang murni.


Keberadaan dan pentingnya struktur lingkar batang didokumentasikan dengan baik.

Saya tidak yakin persis apa maksud pertanyaan kedua. Jika yang Anda maksud adalah 'organisme yang memiliki setidaknya satu batang, coba HIV. Sistem MS2 juga merupakan protein pengikat loop batang yang banyak digunakan sebagai alat dalam biologi, saya sarankan googling.


Genom komparatif mengidentifikasi ribuan kandidat RNA terstruktur dalam mikrobioma manusia

RNA terstruktur memainkan peran bioregulasi yang bervariasi dalam mikroba. Sampai saat ini, ratusan kandidat RNA terstruktur telah diprediksi menggunakan pendekatan informatika yang mencari struktur motif dalam data urutan genom. Mikrobioma manusia mengandung ribuan spesies dan strain mikroba. Namun, banyak data metagenomik dari mikrobioma manusia tetap tidak ditambang untuk motif RNA terstruktur terutama karena keterbatasan komputasi.

Hasil

Kami berusaha menerapkan pendekatan genomik komparatif skala besar pada organisme ini untuk mengidentifikasi kandidat RNA terstruktur. Dengan analisis otomatis yang dibangun dengan hati-hati, meskipun intensif secara komputasi, kami mengidentifikasi 3161 RNA terstruktur kandidat yang dilestarikan di wilayah intergenik, serta 2022 kandidat RNA terstruktur tambahan yang mungkin tumpang tindih dengan wilayah pengkodean. Kami memvalidasi ekspresi RNA dari 177 struktur kandidat ini dengan menganalisis data RNA-seq fragmen kecil dari empat sampel tinja manusia.

Kesimpulan

Pendekatan ini mengidentifikasi berbagai calon RNA terstruktur, termasuk tmRNA, antitoksin, dan kemungkinan pemimpin protein ribosom, dari berbagai taksa. Secara keseluruhan, saluran kami memungkinkan prediksi konservatif ribuan kandidat RNA terstruktur baru dari mikrobioma manusia.


BioRNA

3.
RNA ribosom (rRNA) berasosiasi dengan satu set protein untuk membentuk ribosom. Struktur kompleks ini, yang secara fisik bergerak di sepanjang molekul mRNA, mengkatalisis perakitan asam amino menjadi rantai protein. Mereka juga mengikat tRNA dan berbagai molekul aksesori yang diperlukan untuk sintesis protein. Ribosom terdiri dari subunit besar dan kecil, yang masing-masing mengandung molekul atau molekul rRNA sendiri.

Translasi adalah seluruh proses di mana urutan basa mRNA digunakan untuk memesan dan menggabungkan asam amino dalam protein. Ketiga jenis RNA berpartisipasi dalam jalur sintesis protein esensial ini di semua sel. Faktanya, perkembangan tiga fungsi RNA yang berbeda mungkin merupakan kunci molekuler untuk asal usul kehidupan. Bagaimana setiap RNA melakukan tugas spesifiknya dibahas di bagian ini, sedangkan peristiwa biokimia dalam sintesis protein dan faktor protein yang diperlukan dijelaskan di bagian akhir bab ini.

Pergi ke:
Messenger RNA Membawa Informasi dari DNA dalam Kode Genetik Tiga Huruf
RNA mengandung ribonukleotida adenin, sitidin, guanin, dan urasil DNA mengandung deoksiribonukleotida adenin, sitidin, guanin, dan timin. Karena 4 nukleotida, diambil satu per satu, hanya dapat mewakili 4 dari 20 kemungkinan asam amino dalam mengkodekan susunan linier dalam protein, sekelompok nukleotida diperlukan untuk mewakili setiap asam amino. Kode yang digunakan harus mampu menentukan setidaknya 20 kata (yaitu, asam amino).

Jika dua nukleotida digunakan untuk mengkode satu asam amino, maka hanya 16 (atau 42) kata sandi yang dapat dibentuk, yang merupakan jumlah yang tidak mencukupi. Namun, jika kelompok tiga nukleotida digunakan untuk setiap kata kode, maka 64 (atau 43) kata kode dapat dibentuk. Setiap kode yang menggunakan kelompok tiga atau lebih nukleotida akan memiliki lebih dari cukup unit untuk mengkodekan 20 asam amino. Banyak sistem pengkodean seperti itu secara matematis mungkin. Namun, kode genetik sebenarnya yang digunakan oleh sel adalah kode triplet, dengan setiap tiga nukleotida "dibaca" dari titik awal yang ditentukan dalam mRNA. Setiap triplet disebut kodon. Dari 64 kemungkinan kodon dalam kode genetik, 61 menentukan asam amino individu dan tiga adalah kodon stop. Tabel 4-2 menunjukkan bahwa sebagian besar asam amino dikodekan oleh lebih dari satu kodon. Hanya dua - metionin dan triptofan - memiliki satu kodon di ekstrem lainnya, leusin, serin, dan arginin masing-masing ditentukan oleh enam kodon yang berbeda. Kodon yang berbeda untuk asam amino tertentu dikatakan sinonim. Kode itu sendiri disebut degenerate, yang berarti mengandung redundansi.

Tabel 4-2. Kode Genetik (RNA ke Asam Amino)*.
Tabel 4-2
Kode Genetik (RNA ke Asam Amino)*.

Sintesis semua rantai protein dalam sel prokariotik dan eukariotik dimulai dengan asam amino metionin. Pada sebagian besar mRNA, kodon awal (inisiator) yang menentukan metionin aminoterminal ini adalah AUG. Dalam beberapa mRNA bakteri, GUG digunakan sebagai kodon inisiator, dan CUG kadang-kadang digunakan sebagai kodon inisiator untuk metionin pada eukariota. Tiga kodon UAA, UGA, dan UAG tidak menentukan asam amino tetapi merupakan sinyal stop (terminator) yang menandai ujung karboksil rantai protein di hampir semua sel. Urutan kodon yang berjalan dari situs awal tertentu ke kodon terminasi disebut kerangka baca. Susunan linier ribonukleotida yang tepat dalam kelompok tiga dalam mRNA ini menentukan urutan linier yang tepat dari asam amino dalam protein dan juga memberi sinyal di mana sintesis rantai protein dimulai dan berhenti.

Karena kode genetik adalah kode triplet yang tumpang tindih tanpa koma, mRNA tertentu secara teoritis dapat diterjemahkan dalam tiga kerangka bacaan yang berbeda. Memang beberapa mRNA telah terbukti mengandung informasi yang tumpang tindih yang dapat diterjemahkan dalam kerangka bacaan yang berbeda, menghasilkan polipeptida yang berbeda (Gambar 4-21). Sebagian besar mRNA, bagaimanapun, dapat dibaca hanya dalam satu bingkai karena kodon stop yang ditemui dalam dua kerangka pembacaan lain yang mungkin menghentikan terjemahan sebelum protein fungsional diproduksi. Susunan pengkodean lain yang tidak biasa terjadi karena pergeseran bingkai. Dalam hal ini mesin sintesis protein dapat membaca empat nukleotida sebagai satu asam amino dan kemudian melanjutkan membaca triplet, atau mungkin membuat cadangan satu basa dan membaca semua triplet berikutnya dalam kerangka baru sampai pemutusan rantai terjadi. Pergeseran bingkai ini bukan peristiwa umum, tetapi beberapa lusin contoh seperti itu diketahui.

Gambar 4-21. Contoh bagaimana kode genetik — kode triplet tanpa koma yang tumpang tindih — dapat dibaca dalam dua bingkai berbeda.
Gambar 4-21
Contoh bagaimana kode genetik — kode triplet tanpa koma yang tumpang tindih — dapat dibaca dalam dua bingkai berbeda. Jika terjemahan urutan mRNA yang ditunjukkan dimulai pada dua situs awal hulu yang berbeda (bukan (lebih.)

Arti setiap kodon adalah sama di sebagian besar organisme yang dikenal — argumen kuat bahwa kehidupan di bumi hanya berevolusi sekali. Baru-baru ini kode genetik telah ditemukan berbeda untuk beberapa kodon di banyak mitokondria, di protozoa bersilia, dan di Acetabularia, tanaman bersel tunggal. Seperti ditunjukkan pada Tabel 4-3, sebagian besar perubahan ini melibatkan pembacaan kodon stop normal sebagai asam amino, bukan pertukaran satu asam amino dengan asam amino lainnya. Sekarang diperkirakan bahwa pengecualian terhadap kode umum ini adalah perkembangan evolusi selanjutnya, yaitu, tidak ada satu kali kode pun yang diperbaiki secara permanen, meskipun perubahan besar tidak ditoleransi setelah kode umum mulai berfungsi di awal evolusi.

Tabel 4-3. Penggunaan Kodon yang Tidak Biasa pada Gen Nuklir dan Mitokondria.
Tabel 4-3
Penggunaan Kodon yang Tidak Biasa pada Gen Nuklir dan Mitokondria.

Pergi ke:
Eksperimen dengan mRNA Sintetis dan Trinukleotida Memecahkan Kode Genetik
Setelah menjelaskan kode genetik, kami secara singkat menceritakan bagaimana kode itu diuraikan — salah satu kemenangan besar biokimia modern. Pekerjaan eksperimental yang mendasari dilakukan sebagian besar dengan ekstrak bakteri bebas sel yang mengandung semua komponen yang diperlukan untuk sintesis protein kecuali mRNA (yaitu, tRNA, ribosom, asam amino, dan nukleotida kaya energi ATP dan GTP).

Awalnya, peneliti menambahkan mRNA sintetik yang mengandung satu jenis nukleotida ke dalam ekstrak tersebut dan kemudian menentukan asam amino yang dimasukkan ke dalam polipeptida yang terbentuk. Dalam percobaan pertama yang berhasil, mRNA sintetik yang hanya terdiri dari residu U [poli(U)] menghasilkan polipeptida yang hanya terdiri dari fenilalanin. Dengan demikian disimpulkan bahwa kodon untuk fenilalanin seluruhnya terdiri dari U. Demikian juga, percobaan dengan poli(C) dan poli(A) menunjukkan bahwa kodon untuk prolin hanya mengandung C dan kodon untuk lisin hanya A (Gambar 4-22). [Poly(G) tidak bekerja dalam jenis percobaan ini karena mengasumsikan struktur bertumpuk yang tidak dapat digunakan yang tidak diterjemahkan dengan baik.] Selanjutnya, mRNA sintetis yang terdiri dari basa alternatif digunakan. Hasil percobaan ini tidak hanya mengungkapkan lebih banyak kodon tetapi juga menunjukkan bahwa kodon memiliki panjang tiga basa. Contoh pendekatan ini diilustrasikan pada Gambar 4-23 mengarah pada identifikasi ACA sebagai kodon untuk treonin dan CAC untuk histidin. Eksperimen serupa dengan banyak polinukleotida campuran semacam itu mengungkapkan sebagian besar kode genetik.

Gambar 4-22. Penetapan kodon menggunakan mRNA sintetik yang mengandung ribonukleotida tunggal.
Gambar 4-22
Penetapan kodon menggunakan mRNA sintetik yang mengandung ribonukleotida tunggal. Penambahan mRNA sintetik tersebut ke ekstrak bakteri yang mengandung semua komponen yang diperlukan untuk sintesis protein kecuali mRNA menghasilkan sintesis polipeptida yang tersusun (lebih lanjut. )

Gambar 4-23. Penetapan kodon menggunakan polinukleotida campuran.
Gambar 4-23
Penetapan kodon menggunakan polinukleotida campuran. (a) Ketika mRNA sintetik dengan residu A dan C bergantian ditambahkan ke ekstrak bakteri sintesis protein, polipeptida yang dihasilkan mengandung residu treonin dan histidin bergantian. Temuan ini (lebih.)

Seluruh kode genetik akhirnya dikerjakan oleh eksperimen jenis kedua yang dilakukan oleh Marshall Nirenberg dan rekan-rekannya. Dalam pendekatan ini, semua trinukleotida yang mungkin diuji kemampuannya untuk menarik tRNA yang melekat pada 20 asam amino berbeda yang ditemukan dalam protein alami (Gambar 4-24). Secara keseluruhan, 61 dari 64 kemungkinan trinukleotida ditemukan mengkode asam amino spesifik, trinukleotida UAA, UGA, dan UAG tidak mengkode asam amino.

Gambar 4-24. Memecah seluruh kode genetik dengan menggunakan trinukleotida yang disintesis secara kimia.
Gambar 4-24
Memecah seluruh kode genetik dengan menggunakan trinukleotida yang disintesis secara kimia. Marshall Nirenberg dan rekan-rekannya menyiapkan 20 ekstrak bakteri bebas ribosom yang mengandung semua kemungkinan aminoasil-tRNA (tRNA dengan asam amino yang melekat). Di setiap (lebih.)

Meskipun mRNA sintetik berguna dalam menguraikan kode genetik, sintesis protein in vitro dari mRNA ini sangat tidak efisien dan menghasilkan polipeptida dengan ukuran yang bervariasi. Sintesis in vitro yang sukses dari protein alami dicapai pertama kali ketika mRNA dari bakteriofag F2 (virus) ditambahkan ke ekstrak bakteri, yang mengarah pada pembentukan mantel, atau kapsid, protein (protein "packaging" yang menutupi partikel virus). Studi dengan mRNA alami tersebut menetapkan bahwa AUG mengkodekan metionin pada awal hampir semua protein dan diperlukan untuk inisiasi sintesis protein yang efisien, sedangkan tiga trinukleotida (UAA, UGA, dan UAG) yang tidak mengkode asam amino bertindak sebagai kodon stop. , diperlukan untuk penghentian sintesis yang tepat.

Pergi ke:
Struktur Lipatan tRNA Mempromosikan Fungsi Decoding-nya
Langkah selanjutnya dalam memahami aliran informasi genetik dari DNA ke protein adalah menentukan bagaimana urutan nukleotida mRNA diubah menjadi urutan asam amino protein. Proses penguraian kode ini membutuhkan dua jenis molekul adaptor: tRNA dan enzim yang disebut sintetase aminoasil-tRNA. Pertama kami menjelaskan peran tRNA dalam decoding kodon mRNA, dan kemudian memeriksa bagaimana sintetase mengenali tRNA.

Semua tRNA memiliki dua fungsi: untuk secara kimiawi terkait dengan asam amino tertentu dan untuk pasangan basa dengan kodon dalam mRNA sehingga asam amino dapat ditambahkan ke rantai peptida yang sedang tumbuh. Setiap molekul tRNA dikenali oleh satu dan hanya satu dari 20 sintetase aminoasil-tRNA. Demikian juga, masing-masing enzim ini menghubungkan satu dan hanya satu dari 20 asam amino ke tRNA tertentu, membentuk aminoasil-tRNA. Setelah asam amino yang benar terpasang, tRNA kemudian mengenali kodon dalam mRNA, sehingga memberikan asam amino ke polipeptida yang sedang tumbuh (Gambar 4-25).

Gambar 4-25. Penerjemahan urutan asam nukleat dalam mRNA menjadi urutan asam amino dalam protein memerlukan proses decoding dua langkah.
Gambar 4-25
Penerjemahan urutan asam nukleat dalam mRNA menjadi urutan asam amino dalam protein membutuhkan proses decoding dua langkah. Pertama, sintetase aminoasil-tRNA memasangkan asam amino spesifik dengan tRNA yang sesuai. Kedua, urutan tiga basis di (lebih.)

Saat studi tentang tRNA dilanjutkan, 30 - 40 tRNA yang berbeda diidentifikasi dalam sel bakteri dan sebanyak 50 - 100 pada sel hewan dan tumbuhan. Dengan demikian jumlah tRNA di sebagian besar sel lebih banyak daripada jumlah asam amino yang ditemukan dalam protein (20) dan juga berbeda dari jumlah kodon dalam kode genetik (61). Akibatnya, banyak asam amino memiliki lebih dari satu tRNA yang dapat mereka lekatkan (menjelaskan bagaimana bisa ada lebih banyak tRNA daripada asam amino) selain itu, banyak tRNA dapat menempel pada lebih dari satu kodon (menjelaskan bagaimana bisa ada lebih banyak kodon daripada tRNA) . Seperti disebutkan sebelumnya, sebagian besar asam amino dikodekan oleh lebih dari satu kodon, membutuhkan beberapa tRNA untuk mengenali lebih dari satu kodon.

Fungsi molekul tRNA, yang panjangnya 70 - 80 nukleotida, bergantung pada struktur tiga dimensinya yang tepat. Dalam larutan, semua molekul tRNA terlipat menjadi susunan batang-loop serupa yang menyerupai daun semanggi ketika digambar dalam dua dimensi (Gambar 4-26a). Keempat batang adalah heliks ganda pendek yang distabilkan oleh pasangan basa Watson-Crick tiga dari empat batang memiliki loop yang berisi tujuh atau delapan basis di ujungnya, sedangkan batang yang tidak dilingkarkan berisi ujung rantai 3′ dan 5 yang bebas. Tiga nukleotida yang disebut antikodon, terletak di tengah satu loop, dapat membentuk pasangan basa dengan tiga nukleotida komplementer membentuk kodon dalam mRNA. Seperti yang dibahas kemudian, sintetase aminoasil-tRNA spesifik mengenali struktur permukaan setiap tRNA untuk asam amino spesifik dan secara kovalen menempelkan asam amino yang tepat ke batang akseptor asam amino yang tidak dilingkarkan. Ujung 3' dari semua tRNA memiliki urutan CCA, yang dalam banyak kasus ditambahkan setelah sintesis dan pemrosesan tRNA selesai. Dilihat dalam tiga dimensi, molekul tRNA yang terlipat memiliki bentuk L dengan loop antikodon dan batang akseptor membentuk ujung kedua lengan (Gambar 4-26b).

Gambar 4-26. Struktur tRNA.
Gambar 4-26
Struktur tRNA. (a) Struktur utama tRNA alanin ragi (tRNAAla), urutan pertama yang ditentukan. Molekul ini disintesis dari nukleotida A, C, G, dan U, tetapi beberapa nukleotida, ditunjukkan dengan warna merah, dimodifikasi setelah sintesis: D = dihydrouridine, I = inosin, T = timin, = pseudouridine, (lebih. )

Selain penambahan CCA pada ujung 3′ setelah molekul tRNA disintesis, beberapa basa asam nukleatnya biasanya dimodifikasi. Misalnya, sebagian besar tRNA disintesis dengan urutan empat basa UUCG di dekat bagian tengah molekul. Uridilat pertama dimetilasi menjadi timidilat yang kedua disusun ulang menjadi pseudouridilat (disingkat ), di mana ribosa melekat pada karbon 5 alih-alih nitrogen 1 dari urasil. Modifikasi ini menghasilkan loop TΨCG karakteristik di wilayah tidak berpasangan pada posisi yang kira-kira sama di hampir semua tRNA (lihat Gambar 4-26a).

Pergi ke:
Pasangan Basa Tidak Standar Sering Terjadi antara Kodon dan Antikodon
Jika pasangan basa Watson-Crick yang sempurna diminta antara kodon dan antikodon, sel harus mengandung tepat 61 spesies tRNA yang berbeda, satu untuk setiap kodon yang menentukan asam amino. Seperti disebutkan di atas, bagaimanapun, banyak sel mengandung kurang dari 61 tRNA. Penjelasan untuk jumlah yang lebih kecil terletak pada kemampuan antikodon tRNA tunggal untuk mengenali lebih dari satu, tetapi tidak harus setiap, kodon yang sesuai dengan asam amino yang diberikan. Pengenalan yang lebih luas ini dapat terjadi karena pasangan yang tidak standar antara basa dalam apa yang disebut posisi "goyang": basa ketiga dalam kodon mRNA dan basa pertama yang sesuai dalam antikodon tRNA-nya. Meskipun basa pertama dan kedua dari kodon membentuk pasangan basa Watson-Crick standar dengan basa ketiga dan kedua dari antikodon yang sesuai, empat interaksi tidak standar dapat terjadi antara basa dalam posisi goyangan. Yang paling penting adalah pasangan basa G·U, yang secara struktural hampir sama dengan pasangan G·C standar. Jadi, antikodon tertentu dalam tRNA dengan G pada posisi pertama (goyangan) dapat berpasangan dengan dua kodon yang sesuai yang memiliki pirimidin (C atau U) pada posisi ketiga (Gambar 4-27). Misalnya, kodon fenilalanin UUU dan UUC (5′ → 3′) keduanya dikenali oleh tRNA yang memiliki GAA (5′ → 3′) sebagai antikodon. Faktanya, dua kodon jenis NNPyr (N = sembarang basa Pyr = pirimidin) mengkodekan satu asam amino dan didekode oleh tRNA tunggal dengan G di posisi pertama (goyangan) antikodon.

Gambar 4-27. Basa pertama dan kedua dalam kodon mRNA membentuk pasangan basa Watson-Crick dengan basa ketiga dan kedua, masing-masing, dari antikodon tRNA.
Gambar 4-27
Basa pertama dan kedua dalam kodon mRNA membentuk pasangan basa Watson-Crick dengan basa ketiga dan kedua, masing-masing, dari antikodon tRNA. Namun, basa pada posisi ketiga (atau goyangan) dari kodon mRNA sering membentuk pasangan basa yang tidak standar dengan (lebih.)

Meskipun adenin jarang ditemukan pada posisi goyangan antikodon, banyak tRNA pada tumbuhan dan hewan mengandung inosin (I), produk deaminasi adenin, pada posisi ini. Inosin dapat membentuk pasangan basa tidak standar dengan A, C, dan U (Gambar 4-28). Sebuah tRNA dengan inosin dalam posisi goyangan dengan demikian dapat mengenali kodon mRNA yang sesuai dengan A, C, atau U di posisi ketiga (goyangan) (lihat Gambar 4-27). Untuk alasan ini, tRNA yang mengandung inosin banyak digunakan dalam terjemahan kodon sinonim yang menentukan asam amino tunggal.Misalnya, empat dari enam kodon untuk leusin memiliki 3′ A, C, atau U (lihat Tabel 4-2) keempat kodon ini semuanya dikenali oleh tRNA yang sama (3′-GAI-5′), yang memiliki inosin dalam posisi goyangan antikodon (dan dengan demikian mengenali CUA, CUC, dan CUU), dan menggunakan pasangan G·U di posisi 1 untuk mengenali kodon UUA.

Gambar 4-28. Pasangan basa goyang yang tidak standar U·G, C·I, A·I, dan U·I.
Gambar 4-28
Pasangan basa goyang yang tidak standar U·G, C·I, A·I, dan U·I. Garis hitam tebal menunjukkan ikatan di mana basa nitrogen menempel pada 1′ karbon ribosa (C1).

Pergi ke:
Sintetase Aminoasil-tRNA Mengaktifkan Asam Amino dengan Menghubungkannya ke tRNA
Pengenalan kodon atau kodon yang menentukan asam amino yang diberikan oleh tRNA tertentu sebenarnya merupakan langkah kedua dalam memecahkan kode pesan genetik. Langkah pertama, perlekatan asam amino yang sesuai ke tRNA, dikatalisis oleh sintetase aminoasil-tRNA spesifik (lihat Gambar 4-25). Masing-masing dari 20 sintetase yang berbeda mengenali satu asam amino dan semua tRNA yang kompatibel, atau serumpun,. Enzim kopling ini menghubungkan asam amino dengan 2′ atau 3′ hidroksil bebas dari adenosin pada ujung 3′ molekul tRNA melalui dua langkah reaksi yang membutuhkan ATP (Gambar 4-29). Sekitar setengah sintetase aminoasil-tRNA mentransfer gugus aminoasil ke 2′ hidroksil dari adenosin terminal (kelas I), dan sekitar setengahnya ke 3′ hidroksil (kelas II). Dalam reaksi ini, asam amino dihubungkan dengan tRNA oleh ikatan berenergi tinggi dan dengan demikian dikatakan teraktivasi. Energi ikatan ini selanjutnya mendorong pembentukan ikatan peptida antara asam amino yang berdekatan dalam rantai polipeptida yang sedang tumbuh. Kesetimbangan reaksi aminoasilasi didorong lebih jauh ke arah aktivasi asam amino dengan hidrolisis ikatan fosfoanhidrida berenergi tinggi dalam pirofosfat. Reaksi keseluruhannya adalah

Gambar ch4e6.jpg
Gambar 4-29. aminoasilasi tRNA. Asam amino secara kovalen terkait dengan tRNA oleh sintetase aminoasil-tRNA.
Gambar 4-29
aminoasilasi tRNA. Asam amino secara kovalen terkait dengan tRNA oleh sintetase aminoasil-tRNA. Masing-masing enzim ini mengenali satu jenis asam amino dan semua tRNA serumpun yang mengenali kodon untuk asam amino itu. Aminoasilasi dua langkah (more.)

Urutan asam amino dari sintetase aminoasil-tRNA (ARSs) dari banyak organisme sekarang diketahui, dan struktur tiga dimensi lebih dari selusin enzim dari kedua kelas telah dipecahkan. Masing-masing enzim ini memiliki tempat pengikatan ATP yang agak tepat (GTP tidak diterima dan CTP dan UTP terlalu kecil) dan kantong pengikat untuk asam amino spesifiknya. Enzim kelas I dan kelas II mengikat wajah berlawanan dari tRNA yang masuk. Permukaan pengikatan enzim kelas I cenderung agak saling melengkapi dengan enzim kelas II. Permukaan pengikatan yang berbeda ini dan penyelarasan akibat ikatan tRNA mungkin sebagian menjelaskan perbedaan gugus hidroksil yang menjadi tujuan transfer gugus aminoasil (Gambar 4-30). Karena beberapa asam amino sangat mirip secara struktural, sintetase aminoasil-tRNA terkadang membuat kesalahan. Ini dikoreksi, bagaimanapun, oleh enzim itu sendiri, yang memeriksa kecocokan di kantong pengikat dan memfasilitasi deailasi dari setiap tRNA misacylated. Fungsi penting ini membantu menjamin bahwa tRNA mengirimkan asam amino yang benar ke mesin sintesis protein.

Gambar 4-30. Pengenalan tRNA oleh aminoasil sintetase. Aspartyl-tRNA synthetase (AspRS) adalah enzim kelas II, dan arginyl-tRNA synthetase (ArgRS) adalah enzim kelas I.
Gambar 4-30
Pengenalan tRNA oleh aminoasil sintetase. Aspartyl-tRNA synthetase (AspRS) adalah enzim kelas II, dan arginyl-tRNA synthetase (ArgRS) adalah enzim kelas I. Ditampilkan di sini adalah garis besar struktur tiga dimensi dari dua sintetase. Lebih. )

Pergi ke:
Setiap Molekul tRNA Diakui oleh Sintetase Aminoasil-tRNA Spesifik
Kemampuan sintetase aminoasil-tRNA untuk mengenali tRNA serumpun yang benar sama pentingnya dengan penerjemahan kode genetik yang akurat sebagai pasangan kodon-antikodon. Setelah tRNA dimuat dengan asam amino, pasangan kodon-antikodon mengarahkan tRNA ke situs ribosom yang tepat jika asam amino yang salah melekat pada tRNA, kesalahan dalam hasil sintesis protein.

Seperti yang sudah disebutkan, setiap sintetase aminoasil-tRNA dapat mengaminiasilat semua tRNA berbeda yang antikodonnya sesuai dengan asam amino yang sama. Oleh karena itu, semua tRNA serumpun ini harus memiliki situs pengikatan yang serupa, atau "elemen identitas" yang dikenali oleh sintetase. Salah satu pendekatan untuk mempelajari elemen identitas dalam tRNA yang dikenali oleh sintetase aminoasil-tRNA adalah dengan menghasilkan gen sintetik yang mengkode tRNA dengan sekuens mutan normal dan beragam dengan teknik yang dibahas dalam Bab 7. TRNA normal dan mutan yang dihasilkan dari gen sintetik tersebut kemudian dapat diuji kemampuannya untuk mengikat sintetase murni.

Sangat mungkin tidak ada struktur atau urutan tunggal yang sepenuhnya menentukan identitas tRNA tertentu. Namun, beberapa fitur struktural penting dari beberapa tRNA E. coli yang memungkinkan sintetase serumpun mengenalinya telah diketahui. Mungkin elemen identitas yang paling logis dalam molekul tRNA adalah antikodon itu sendiri. Percobaan di mana antikodon dari metionin tRNA (tRNAMet) dan valin tRNA (tRNAVal) dipertukarkan menunjukkan bahwa antikodon sangat penting dalam menentukan identitas kedua tRNA ini. Selain itu, analisis kristalografi sinar-x dari kompleks antara glutamin aminoasil-tRNA sintetase (GlnRS) dan glutamin tRNA (tRNAGln) menunjukkan bahwa masing-masing basa antikodon cocok dengan rapi ke dalam "pocket" yang terpisah dalam struktur tiga dimensi GlnRS. Jadi sintetase ini secara khusus mengenali antikodon yang benar.

Namun, antikodon mungkin bukan elemen identitas utama dalam tRNA lain (lihat Gambar 4-30). Gambar 4-31 menunjukkan tingkat konservasi urutan basa di tRNA E. coli yang menjadi terkait dengan asam amino yang sama. Elemen identitas ditemukan di beberapa daerah, terutama ujung lengan akseptor. Kasus sederhana disajikan oleh tRNAAla: pasangan basa G·U tunggal (G3·U70) di batang akseptor diperlukan dan cukup untuk pengenalan tRNA ini oleh aminoasil-tRNA sintetase serumpunnya. Solusi struktur tiga dimensi kompleks tambahan antara sintetase aminoasil-tRNA dan tRNA serumpunnya harus memberikan pemahaman yang jelas tentang aturan yang mengatur pengenalan tRNA oleh sintetase tertentu.

Gambar 4-31. Elemen identitas dalam tRNA terlibat dalam pengenalan oleh sintetase aminoasil-tRNA, seperti yang ditunjukkan oleh konservasi dan eksperimen.
Gambar 4-31
Elemen identitas dalam tRNA terlibat dalam pengenalan oleh sintetase aminoasil-tRNA, seperti yang ditunjukkan oleh konservasi dan eksperimen. Ke-67 urutan tRNA yang diketahui pada E. coli dibandingkan dengan analisis komputer. Nukleotida yang dilestarikan dalam berbagai (lebih.)

Pergi ke:
Ribosom Adalah Mesin Sintesis Protein
Jika banyak komponen yang berpartisipasi dalam menerjemahkan mRNA harus berinteraksi dalam larutan bebas, kemungkinan tumbukan simultan yang terjadi akan sangat rendah sehingga laju polimerisasi asam amino akan sangat lambat. Efisiensi translasi sangat meningkat dengan pengikatan mRNA dan aminoasil-tRNA individu ke kompleks RNA-protein yang paling melimpah di dalam sel – ribosom. Mesin dua bagian ini mengarahkan pemanjangan polipeptida dengan kecepatan tiga hingga lima asam amino yang ditambahkan per detik. Protein kecil dari 100 - 200 asam amino karena itu dibuat dalam satu menit atau kurang. Di sisi lain, dibutuhkan 2 hingga 3 jam untuk membuat protein terbesar yang diketahui, titin, yang ditemukan di otot dan mengandung 30.000 residu asam amino. Mesin yang menyelesaikan tugas ini harus tepat dan gigih.

Dengan bantuan mikroskop elektron, ribosom pertama kali ditemukan sebagai diskrit, struktur bulat menonjol dalam jaringan hewan yang mensekresi sejumlah besar protein pada awalnya, namun, mereka tidak diketahui berperan dalam sintesis protein. Setelah persiapan ribosom yang cukup murni diperoleh, percobaan radiolabeling menunjukkan bahwa asam amino radioaktif pertama-tama dimasukkan ke dalam rantai polipeptida yang sedang tumbuh yang terkait dengan ribosom sebelum muncul dalam rantai jadi.

Ribosom terdiri dari beberapa molekul RNA ribosom (rRNA) yang berbeda dan lebih dari 50 protein, disusun menjadi subunit besar dan subunit kecil. Protein dalam dua subunit berbeda, seperti halnya molekul rRNA. Subunit ribosom kecil mengandung molekul rRNA tunggal, disebut sebagai rRNA kecil. Subunit besar mengandung molekul rRNA besar dan masing-masing satu molekul dari dua rRNA yang jauh lebih kecil pada eukariota (Gambar 4-32). Subunit ribosom dan molekul rRNA biasanya dinyatakan dalam svedbergs (S), ukuran laju sedimentasi partikel tersuspensi yang disentrifugasi dalam kondisi standar (Bab 3). Panjang molekul rRNA, jumlah protein di setiap subunit, dan akibatnya ukuran subunit berbeda dalam sel prokariotik dan eukariotik. (RRNA kecil dan besar memiliki panjang sekitar 1500 dan 3000 nukleotida pada bakteri dan sekitar 1800 dan 5000 nukleotida pada manusia.) Mungkin yang lebih menarik daripada perbedaan ini adalah kesamaan struktural dan fungsional yang besar di antara ribosom dari semua spesies. Konsistensi ini merupakan cerminan lain dari asal usul evolusi umum dari konstituen paling dasar dari sel hidup.

Gambar 4-32. Struktur umum ribosom pada prokariota dan eukariota.
Gambar 4-32
Struktur umum ribosom pada prokariota dan eukariota. Di semua sel, setiap ribosom terdiri dari subunit besar dan kecil. Kedua subunit mengandung rRNA dengan panjang yang berbeda, serta satu set protein yang berbeda. Semua ribosom mengandung dua (lebih.)

Urutan rRNA kecil dan besar dari beberapa ribu organisme sekarang diketahui. Meskipun urutan nukleotida utama dari rRNA ini sangat bervariasi, bagian yang sama dari setiap jenis rRNA secara teoritis dapat membentuk pasangan-basis stem-loop, menghasilkan struktur tiga dimensi yang serupa untuk setiap rRNA di semua organisme. Bukti bahwa loop batang seperti itu terjadi pada rRNA diperoleh dengan memperlakukan rRNA dengan agen kimia yang menghubungkan basa berpasangan sampel kemudian dicerna dengan enzim yang menghancurkan rRNA beruntai tunggal, tetapi tidak setiap daerah ikatan silang (berpasangan basa). Akhirnya, rRNA ikatan silang utuh yang tersisa dikumpulkan dan diurutkan, sehingga mengidentifikasi loop batang dalam rRNA asli. Eksperimen jenis ini telah menemukan sekitar 45 putaran batang pada posisi yang sama pada rRNA kecil dari banyak prokariota dan eukariota yang berbeda (Gambar 4-33). Jumlah yang lebih besar dari loop batang yang diposisikan secara teratur telah ditunjukkan dalam rRNA besar. Semua protein ribosom telah diidentifikasi dan urutannya ditentukan, dan banyak yang telah terbukti mengikat daerah spesifik rRNA. Tampak jelas bahwa mesin sintesis protein mendasar di semua sel masa kini hanya muncul sekali dan telah dimodifikasi menurut rencana umum selama evolusi.

Gambar 4-33. Peta dua dimensi dari struktur sekunder rRNA kecil (16S) dari bakteri, menunjukkan lokasi pasangan basa dan loop.
Gambar 4-33
Peta dua dimensi dari struktur sekunder rRNA kecil (16S) dari bakteri, menunjukkan lokasi pasangan basa dan loop. Secara umum, panjang dan posisi lilitan batang sangat mirip pada semua spesies, meskipun urutannya tepat (lebih )

Selama sintesis protein, ribosom bergerak sepanjang rantai mRNA, berinteraksi dengan berbagai faktor protein dan tRNA dan bahkan sangat mungkin mengalami perubahan bentuk. Terlepas dari kompleksitas ribosom, kemajuan besar telah dibuat dalam menentukan baik struktur keseluruhan ribosom bakteri dan dalam mengidentifikasi situs reaktif yang mengikat protein spesifik, mRNA, dan tRNA dan yang berpartisipasi dalam langkah-langkah penting dalam sintesis protein. Model yang cukup rinci dari subunit ribosom besar dan kecil dari E. coli telah dibangun berdasarkan mikroskop cryoelectron dan studi hamburan neutron (Gambar 4-34). Studi-studi ini tidak hanya telah menentukan dimensi dan bentuk keseluruhan dari subunit ribosom, tetapi juga telah melokalisasi posisi tRNA yang terikat pada ribosom selama pemanjangan rantai protein. Eksperimen kimia yang kuat juga membantu mengungkap interaksi kompleks antara protein dan RNA. Dalam teknik yang disebut footprinting, misalnya, ribosom diperlakukan dengan reagen kimia yang memodifikasi RNA untai tunggal tanpa perlindungan dengan mengikat protein atau RNA lain. Jika urutan total RNA diketahui, maka lokasi nukleotida yang dimodifikasi dapat ditemukan di dalam molekul. (Teknik ini, yang juga berguna untuk menemukan tempat pengikatan protein dalam DNA, dijelaskan dalam Bab 10.) Jadi, struktur dan fungsi keseluruhan ribosom selama sintesis protein akhirnya, setelah 40 tahun, menghasilkan eksperimen yang berhasil. Bagaimana hasil ini membantu dalam memahami langkah-langkah spesifik dalam sintesis protein dijelaskan di bagian berikutnya.

Gambar 4-34. Struktur keseluruhan ribosom E. coli pada resolusi 25-Å disimpulkan dari mikroskop cryoelectron dan rekonstruksi tiga dimensi berdasarkan analisis dari 4300 proyeksi individu.
Gambar 4-34
Struktur keseluruhan ribosom E. coli pada resolusi 25-Å disimpulkan dari mikroskop cryoelectron dan rekonstruksi tiga dimensi berdasarkan analisis dari 4300 proyeksi individu. (a) Model ini menunjukkan bentuk besar (biru) dan (lebih.)

Pergi ke:
RINGKASAN
Informasi genetik disalin ke dalam mRNA dalam bentuk kode triplet tanpa koma, tumpang tindih, dan merosot. Setiap asam amino dikodekan oleh satu atau lebih urutan tiga basa, atau kodon, dalam mRNA. Setiap kodon menentukan satu asam amino, tetapi sebagian besar asam amino dikodekan oleh banyak kodon (lihat Tabel 4-2).
Kodon AUG untuk metionin adalah kodon awal yang paling umum, menentukan asam amino pada ujung NH2 dari rantai protein. Tiga kodon berfungsi sebagai kodon stop dan tidak menentukan asam amino.
Kerangka pembacaan, urutan kodon yang tidak terputus dalam mRNA dari kodon awal tertentu ke kodon berhenti, diterjemahkan ke dalam urutan linier asam amino dalam protein.
Penguraian urutan nukleotida dalam mRNA menjadi urutan asam amino protein bergantung pada RNA transfer dan sintetase amino-asil tRNA (lihat Gambar 4-25).
Semua tRNA memiliki struktur tiga dimensi serupa yang mencakup lengan akseptor untuk perlekatan asam amino spesifik dan loop batang dengan urutan antikodon tiga basa di ujungnya (lihat Gambar 4-26). Antikodon dapat berpasangan basa dengan kodon atau kodon yang sesuai dalam mRNA.
Karena interaksi yang tidak standar, tRNA dapat berpasangan dengan lebih dari satu kodon mRNA, dan sebaliknya, kodon tertentu dapat berpasangan dengan beberapa tRNA.
Masing-masing dari 20 sintetase aminoasil-tRNA mengenali satu asam amino dan secara kovalen menghubungkannya dengan tRNA serumpun, membentuk aminoasil-tRNA (lihat Gambar 4-29). Reaksi ini mengaktifkan asam amino, sehingga dapat berpartisipasi dalam pembentukan ikatan peptida.
Komposisi ribosom - kompleks ribonukleoprotein besar tempat protein disintesis - cukup mirip di semua organisme (lihat Gambar 4-32). Semua ribosom terdiri dari subunit kecil dan besar. Masing-masing mengandung banyak protein berbeda dan satu rRNA (kecil atau besar). Subunit besar juga mengandung satu RNA aksesori (5S).
RRNA analog dari banyak spesies berbeda terlipat menjadi struktur tiga dimensi yang sangat mirip yang mengandung banyak loop batang dan situs pengikatan untuk protein, mRNA, dan tRNA. Saat ribosom bergerak di sepanjang mRNA, wilayah molekul rRNA besar di setiap ribosom secara berurutan mengikat ujung aminoasil dari tRNA yang masuk dan mungkin mengkatalisis pembentukan ikatan peptida (lihat Gambar 4-34).
Dengan kesepakatan dengan penerbit, buku ini dapat diakses dengan fitur pencarian, tetapi tidak dapat dijelajahi.


1. PERKENALAN

Munculnya penyakit virus merupakan ancaman serius bagi kesehatan masyarakat global. Beberapa dekade terakhir telah menyaksikan beberapa epidemi virus yang muncul dengan frekuensi yang meningkat, termasuk virus corona sindrom pernafasan akut yang parah (SARS-CoV diidentifikasi pada 2002/2003), flu babi (influensa H1N1 diidentifikasi pada 2009) dan kemudian penyakit pernapasan Timur Tengah. sindrom virus corona (MERS-CoV diidentifikasi pada 2012). Wabah terbaru penyakit virus corona baru yang dikenal sebagai COVID-19, yang disebabkan oleh sindrom pernafasan akut parah virus corona 2 (SARS-CoV-2) sangat menular dan infeksi virus patogen yang telah menyebar ke seluruh dunia. Virus corona diketahui menyebabkan penyakit pada manusia, mamalia lain, dan burung. Banyak spesies virus corona yang telah diidentifikasi sejauh ini, di mana hanya enam spesies yang diketahui menyebabkan penyakit pada manusia. Mereka diberi nama sebagai HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, dan MERS-CoV. 1, 2 Dari enam spesies virus corona yang teridentifikasi di atas, empat yang pertama adalah endemik lokal dan menyebabkan gejala ringan pada manusia. Dua lainnya dapat menyebabkan penyakit parah. 3 Pada akhir Desember 2019, penyakit pernapasan virus baru muncul dan menyebar sangat cepat ke seluruh dunia yang telah menjadi fokus perhatian global karena epidemi pneumonia yang tidak diketahui penyebabnya. Awalnya, virus tersebut untuk sementara diberi nama 2019 novel corona virus (2019-nCoV). Namun, virus tersebut kini telah diberi nama SARS-CoV-2 oleh International Committee of Taxonomy of Viruses (ICTV). 4 Virus baru ini, 2019-nCoV termasuk dalam subgenus Sarbeco virus dari genus beta-corona virus dari family Coronaviridae. Virus milik keluarga Coronaviridae memiliki untai tunggal, genom positif-sense ribonucleic acid (RNA) yang panjangnya berkisar antara 26 hingga 32 kb. SARS-Cov-2 secara genetik lebih terkait dengan SARS-CoV daripada MERS-CoV, tetapi keduanya adalah virus beta-corona yang diyakini berasal dari kelelawar. Sequencing generasi berikutnya (NGS) dan analisis filogenetik genom mengungkapkan 2019-nCoV terkait erat (88% identik) dengan dua virus korona mirip SARS yang berasal dari kelelawar dan lebih jauh dari SARS-CoV (79%) dan MERS-CoV (50%). Pada tingkat asam amino, 2019-nCoV sangat mirip dengan SARS-CoV, tetapi ada beberapa perbedaan penting. Misalnya, protein 8a yang ada di SARS-CoV tidak ada di 2019-nCoV, protein 8b adalah 84 asam amino di SARS-CoV, tetapi lebih lama di 2019-nCoV, dengan 121 asam amino, protein 3b adalah 154 asam amino di SARS- CoV, tetapi lebih pendek pada 2019-nCoV, dengan hanya 22 asam amino. Seperti SARS-CoV dan MERS-CoV, SARS-CoV-2 dapat menyebabkan pneumonia yang mematikan. Ia juga memiliki kapasitas penularan dari manusia ke manusia yang lebih kuat daripada SARS-CoV dan MERS-CoV. 5, 6 Penyakit COVID-19 terutama menyebar melalui kontak dekat tetesan pernapasan yang dihasilkan oleh individu yang terinfeksi. 7 Manifestasi klinis COVID-19 menunjukkan berbagai gejala mulai dari flu ringan hingga kondisi yang mengancam jiwa.Sebagian besar pasien yang terinfeksi telah melaporkan demam tinggi sementara beberapa menunjukkan dyspnoea dan lesi invasif di kedua paru-paru dengan radiografi dada. Namun, pasien yang sebagian besar berusia muda yang merupakan mayoritas angkatan kerja dan lebih cenderung aktif secara sosial yang terinfeksi SARS-CoV-2 dapat memiliki gejala ringan atau bahkan tanpa gejala dan dapat menularkan virus ke orang lain. Ini mungkin penting dalam penyebaran penyakit lebih lanjut. Pengenalan dini terhadap orang yang terinfeksi dan memutus jalur penularan adalah poin kunci untuk mengendalikan COVID-19. Namun, sebagian besar infeksi tanpa gejala tidak mencari bantuan medis karena tidak ada tanda klinis yang jelas dan kesadaran pencegahan yang buruk, yang berkontribusi pada penyebaran cepat COVID-19. Oleh karena itu, merupakan tantangan besar untuk mencegah dan mengendalikan jenis pasien khusus ini secara global, yang membutuhkan lebih banyak perhatian di seluruh dunia.

COVID-19 telah menjadi masalah kesehatan masyarakat global utama yang telah menyebar sangat cepat dengan morbiditas dan mortalitas yang signifikan di seluruh dunia. Ketika penyakit ini menyebar ke banyak negara, WHO menyatakan wabah itu sebagai darurat kesehatan masyarakat yang menjadi perhatian internasional pada 30 Januari 2020 dan selanjutnya pada 11 Maret 2020 menyatakan wabah virus corona yang menyebar cepat sebagai pandemi. Menurut WHO, laporan situasi COVID-19-147, secara global, pada 22 Agustus 2020, penyakit ini menyebar di 213 negara di dunia dengan 22.812.491 kasus yang dikonfirmasi dan 795.132 kematian yang tercatat di seluruh dunia.

Deteksi dini dengan pemeriksaan yang cepat dan sensitif serta intervensi yang tepat waktu sangat penting untuk memutus penyebaran virus COVID-19 (SARS-CoV-2). 8 Dengan tidak adanya obat atau vaksin antivirus yang sesuai, metode deteksi yang andal dari infeksi SARS-CoV-2 sangat penting tidak hanya untuk pencegahan dan pengendalian pandemi COVID-19, tetapi juga untuk pengobatan klinis. Banyak negara di seluruh dunia menggunakan kombinasi strategi penahanan dan mitigasi, untuk diagnosis dini COVID-19. Strategi yang efektif perlu diterapkan pada waktu yang tepat untuk mencegah penyebaran penyakit dalam populasi. Selain itu, diagnosis dini sangat penting untuk intervensi segera bagi pasien yang berisiko lebih tinggi dan ada kemungkinan mengembangkan komplikasi serius saat terinfeksi COVID-19. Saat ini tersedia beberapa metode diagnosis untuk deteksi dini virus dan penyakit dengan kelebihan dan kekurangannya (Tabel 1). Namun, keberhasilan pendeteksian penyakit tergantung pada beberapa faktor, seperti waktu pengujian sejak awal penyakit, konsentrasi virus dalam sampel, kualitas spesimen yang dikumpulkan dari seseorang, cara pengolahannya, dan formulasi yang tepat. reagen dalam test kit. 28

Teknologi diagnostik Deteksi Jenis sampel Tes laboratorium/titik perawatan Keuntungan Kerugian Referensi
RT-PCR RNA virus Usap nasofaring, dahak, tinja Berbasis laboratorium Deteksi spesifik dan penghematan waktu Hasil negatif palsu juga terdeteksi pada viral load rendah 5, 9-13
ddPCR RNA virus Usap nasofaring, dahak, tinja Berbasis laboratorium Ini dapat mendeteksi SARS-Cov-2 secara akurat dalam sampel viral load rendah dan meminimalkan hasil negatif palsu Lebih mahal dan rentan terhadap kontaminasi eksogen 14, 15
RT-PCR bersarang RNA virus Usap nasofaring Berbasis laboratorium Ini dapat mendeteksi SARS-Cov-2 secara akurat dalam sampel viral load rendah dan meminimalkan hasil negatif palsu Pembukaan tutup setelah putaran pertama nested PCR meningkatkan risiko kontaminasi silang yang dapat menyebabkan hasil positif palsu 16
RT-LAMP RNA virus Usap nasofaring, dahak, tinja Berbasis laboratorium/tempat perawatan Hasil sensitif dan spesifik dalam waktu yang lebih singkat, hasil visualisasi di mata, tidak memerlukan thermo cycler Tidak praktis untuk mengoptimalkan primer dan kondisi reaksi 87
Teknologi Penn-RAMP RNA virus Usap nasofaring Berbasis laboratorium/tempat perawatan Sensitivitas satu tabung Penn-RAMP 10 kali lebih tinggi dari LAMP dan RT-PCR Reagen mahal seperti polimerase dan primer membutuhkan lebih banyak jumlah daripada LAMP 17
CRISPR RNA virus Usap nasofaring, cairan lavage bronchoalveolar Berbasis laboratorium Mudah dilakukan dan biaya rendah. Dalam tes STOP COVID bahkan ekstraksi RNA tidak diperlukan Terkadang memberikan hasil yang salah 18
mikroarray RNA virus Usap nasofaring, cairan lavage bronchoalveolar Berbasis laboratorium Ini dapat mengidentifikasi mutasi apa pun yang terkait dengan SARS-CoV dan dapat mendeteksi SNP yang terkait dengan lonjakan (S) gen SARS-CoV-2 Tingginya biaya percobaan tunggal, banyaknya desain probe berdasarkan urutan spesifisitas rendah, serta kurangnya kontrol atas kumpulan transkrip yang dianalisis 19
Urutan virus RNA virus Usap nasofaring Berbasis laboratorium Nyaman, sensitivitas tinggi, cocok untuk mendeteksi sampel dengan viral load rendah Instrumen canggih, meningkatkan biaya, membutuhkan. Orang yang terlatih 20
Serologi Antibodi/antigen Darah Berbasis laboratorium/tempat perawatan Kurang kompleks daripada tes molekuler Tes deteksi antibodi yang menargetkan COVID-19 juga dapat bereaksi silang dengan patogen lain dan juga hasil negatif palsu dapat muncul pada tingkat antigen rendah pada tahap awal infeksi. 21
ELISA Antibodi Darah Berbasis laboratorium Teknik laboratorium sederhana dan murah, penting untuk pengembangan vaksin dan terapi plasma konvalesen Tes ELISA belum mapan untuk pengujian SARS-CoV-2 COVID-19 22
CT scan Paru-paru Gambar dada Titik perawatan CT scan memiliki sensitivitas yang lebih tinggi (86-98%) dan tingkat negatif palsu yang lebih baik dibandingkan dengan RT-PCR Spesifisitas rendah (25%) karena fitur pencitraan tumpang tindih dengan pneumonia virus lainnya 23
Biosensor Protein S dari SARS-CoV-2 Usap nasofaring, dahak, tinja Titik perawatan Deteksi cepat tanpa perlakuan awal sampel Hemat biaya 24
Biomarker Protein C-reaktif, limfosit, dan RNA SARS-CoV-2 Usap nasofaring dan darah Berbasis laboratorium Tes cepat nonmikrobiologis yang mudah Biomarker yang sama juga abnormal pada penyakit lain dan tidak cukup spesifik untuk menegakkan diagnosis COVID-19 25
Nanoteknologi RNA SARS-CoV-2 Usap nasofaring Titik perawatan Sensitivitas tinggi, diadopsi dalam sistem ekstraksi RNA yang sepenuhnya otomatis, kinerja pengikatan RNA yang sangat baik Langkah-langkah pretreatment yang kompleks, membutuhkan keterampilan, mahal daripada qRT-PCR, dengan risiko photobleaching 26
Budaya virus Virus hidup in vitro Garis sel epitel manusia Berbasis laboratorium Penting untuk identifikasi, deteksi mutasi dan pengembangan vaksin Sensitivitas rendah karena isolasi tidak 100% 27
  • Singkatan: COVID-19, penyakit virus corona CRISPR, clustered regular interspaced short palindromic repeats CT, computed tomography ddPCR, droplet digital polymerase chain reaction ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay LAMP, loop-mediated isothermal amplification qRT-PCR, kuantitatif real-time reverse transcription PCR RNA, asam ribonukleat RT-PCR, PCR real-time SARS-CoV-2, virus corona sindrom pernapasan akut 2 SNP, polimorfisme nukleotida tunggal.

Hingga saat ini, metode diagnosis yang tersedia untuk tes COVID-19 secara luas dikategorikan menjadi dua jenis tes molekuler dan serologis. Kategori pertama, yaitu uji molekuler untuk deteksi RNA virus SARS-CoV-2, menggunakan metode berbasis reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Namun, metode lain seperti uji amplifikasi asam nukleat isotermal, termasuk amplifikasi yang dimediasi transkripsi dan metodologi berbasis pengulangan palindromik pendek (CRISPR) yang dikelompokkan secara teratur, adalah beberapa alternatif yang menjanjikan. Menurut struktur SARS-CoV-2 (Gambar 1) berbagai gen seperti E, n, S, ORF, dan RdRp ditargetkan untuk deteksi molekuler. Selain itu, sekuensing genom virus, teknik canggih telah menjadi alat penting untuk menentukan tingkat dan tingkat variabilitas mutasi yang terkait dengan SARS-CoV-2. Teknik ini juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis virus yang baru muncul untuk pengembangan vaksin yang lebih efektif.

Kategori kedua dari metode diagnostik meliputi uji serologis dan imunologis. Tes serologis ini sebagian besar bergantung pada pendeteksian antibodi yang dihasilkan oleh individu sebagai akibat dari paparan virus sementara metode imunologi didasarkan pada deteksi protein antigenik pada individu yang terinfeksi. Deteksi antibodi sebagai respon terhadap infeksi virus SARS-CoV-2 melalui uji serologis dapat dilakukan melalui enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan lateral flow immunoassay. Penting bahwa, teknik diagnostik ini dapat berfungsi untuk tujuan deteksi dan manajemen pandemi COVID-19. Pengujian RNA virus SARS-CoV-2 dengan metode molekuler mengidentifikasi individu yang terinfeksi SARS-CoV-2 selama fase infeksi akut serta untuk melakukan pelacakan kontak untuk pengelolaan penyakit. Di sisi lain, pengujian serologis berbasis antibodi selanjutnya mengidentifikasi individu yang telah mengembangkan antibodi terhadap virus dan dapat menjadi donor plasma pemulihan potensial. Selain itu, tes basis antibodi ini dapat berguna untuk memantau status kekebalan individu dan kelompok yang terpapar virus dari waktu ke waktu. 29

Dalam skenario saat ini, perlombaan sedang berlangsung untuk mengembangkan alat uji titik kontak yang hemat biaya dan teknik laboratorium yang efisien untuk diagnosis cepat infeksi SARS-CoV-2. Dalam tinjauan ini, diskusi singkat tentang teknologi diagnostik yang berbeda telah dibahas dengan ruang lingkup dan keterbatasannya. Tinjauan ini juga memberikan gambaran tentang perkembangan terkini dalam teknik dan produk diagnostik COVID-19 untuk memfasilitasi peningkatan dan inovasi di masa mendatang.


Virologi - Ujian Tengah Semester 1

2. Penelitian tentang replikasi DNA bakteriofag dan virus hewan meletakkan dasar untuk memahami enzim yang terlibat dalam replikasi DNA seluler.

3. Penyambungan RNA dalam sel eukariotik pertama kali ditemukan dengan mempelajari mRNA virus DNA.

Pengenceran serial suspensi virus ditambahkan ke satu lapis sel bakteri. Saat virus bereplikasi dan menyebar, ia membunuh sel inang bakterinya meninggalkan plak.

MOI = 1 ketika ada 1 virion per 1 sel inang.

4. Replikasi genom virus.

2. Virus tanaman menembus luka yang disebabkan oleh serangga.

3. Virus hewan berselubung menggabungkan selubung lipidnya secara langsung dengan membran plasma, melepaskannya ke dalam sel.

Virus RNA (kecuali retrovirus) harus mensintesis RNA polimerase yang bergantung pada RNA untuk mereplikasi genomnya. Enzim ini tidak ada di sel inang. Ini mereplikasi untai rasa (+) mRNA.

2. Apakah mesin seluler yang sesuai tersedia untuk replikasi virus? Misalnya. Beberapa virus DNA hanya dapat bereplikasi dalam membelah sel yang memiliki tingkat DNTP tinggi yang tersedia untuk sintesis DNA virus.

Kapsid dapat berkumpul secara spontan.

Kapsid sederhana memiliki subunit berulang dengan interaksi yang identik.

Beberapa kapsid virus memiliki simetri ikosahedral.

Kapsid yang lebih kompleks memiliki subunit berulang yang berinteraksi secara kuasi-ekuivalen.

Banyak kapsid virus diatur sebagai tabung heliks yang memiliki simetri heliks.

Gunakan TEM --> lihat virusnya. Apa bentuknya?

Tentukan apakah virus terbungkus atau tidak.

Sebagian besar memiliki kapsid ikosahedral.

Semua virus dsDNA memiliki genom yang tidak terfragmentasi, yaitu semua gen terdapat pada satu molekul DNA.

Semua virus RNA memiliki genom linier.

Kebanyakan genom berukuran kecil dan kapsid tidak berselubung, namun nukleokapsid yang lebih besar terbungkus, mungkin untuk melindungi dari degradasi.

Memiliki nukleokapsid heliks

Diselimuti dengan genom linier.

Banyak yang memiliki genom yang terfragmentasi, oleh karena itu memiliki partikel psudo-viral yang tinggi.

Setiap segmen genom mengkode satu mRNA dan protein.

Harus membawa RNA polimerase.

Kapsid menyediakan struktur yang memposisikan setiap molekul RNA polimerase dan berbagai segmen genom, memungkinkan transkripsi setiap segmen dan transfer terarah setiap mRNA ke dalam sitoplasma.

Menginfeksi dan bereplikasi dalam berbagai macam inang, mungkin karena ia harus membawa RNA polimerasenya sendiri, oleh karena itu ia kurang bergantung pada lingkungan seluler tertentu.

2. Viroid yang tidak mengkode protein tetapi bereplikasi secara independen dari virus lain -> memiliki aktivitas enzimatik otomatis yang mendukung postulat bahwa RNA pernah dapat mereplikasi dirinya sendiri tanpa adanya protein (diduga melibatkan aksi ribozim.)

2. Hipotesis regresif (atau reduksi).

Organisme otonom awalnya mengembangkan hubungan simbiosis tetapi berubah menjadi parasit karena menjadi lebih tergantung pada inang karena hilangnya gen yang sebelumnya penting. Akhirnya ia tidak dapat bereplikasi secara mandiri menjadi parasit intraseluler obligat (virus.)

Mengusulkan bahwa virus mungkin merupakan entitas replikasi pertama, yang ada di dunia pra-seluler sebagai unit yang mereplikasi diri yang memunculkan sel.

Reseptor inang memiliki fungsinya masing-masing tetapi telah dimanfaatkan oleh virus.

Reseptor biasanya sangat terkonservasi dan karena itu tidak mungkin mengalami mutasi (Misalnya CD4, Reseptor LDL, reseptor CXC (kemokin).)

Banyak virus mengikat kelompok karbohidrat pada glikoprotein/lipid. (Misalnya. Influenza mengikat residu asam sialat pada glikoprotein yang ada di hampir semua sel.)

Beberapa glikoprotein memediasi perlekatan dan fusi (Misalnya protein HA influenza menggunakan domain HA1 untuk mengikat asam sialat dan domain HA2 bertindak sebagai faktor fusi membran.)

Penetrasi virus dapat dilakukan secara in vitro dengan menurunkan pH secara artifisial.

2. Dapat diimpor setelah sebagian pembongkaran di sitoplasma.

3. Dapat diimpor setelah pembongkaran di pori nuklir.

4. Virion utuh dapat diangkut melalui kompleks pori nuklir.
Virus hepatitis sangat kecil sehingga kapsid dapat bergerak melalui pori nukleus langsung ke dalam nukleus.

2. Dapat membanjiri ruang ekstraseluler dengan reseptor larut.

3. Dapat memblokir reseptor seluler.

4. Dapat menggunakan agen lisomotropik, ionofor karboksilat dan bafilomisin A1 yang menghambat pengasaman endosom.

5. Dapat menghambat un-coating (menggunakan senyawa amantadine atau WIN.)

Neuraminidase membantu virus flu menerobos membran sel inang.

Tamiflu adalah penghambat neuraminidase influenza yang mengikat ke situs aktif enzim sehingga, virus tidak dapat meninggalkan sel untuk menginfeksi sel lain (Tamiflu dengan demikian menghalangi keluarnya virus.)

1 - Serat mengikat LPS. Fag menunjukkan tropisme inang yang sangat spesifik. Jika ada perubahan pada serat, tidak akan ada pengikatan.

2 - Protein inti dimasukkan melalui ekor fag ke dalam sel, membentuk pori. Gen kelas 1 memasuki sel terlebih dahulu (dimediasi oleh sinyal sel.)

3 - gp16 dapat mulai menurunkan peptidoglikan.

4 - DNA masuk mengekspos 3-P yang mengikat E. coli RNA polimerase.

Gen kelas 1 diperlukan pertama untuk kelas II dan III, dan untuk mematikan fungsi inang.

Kelas II diperlukan untuk replikasi. Kode gen kelas II untuk enzim yang terlibat dalam replikasi DNA tergantung T7. Penggunaan beberapa promotor mengarah ke satu set transkrip tumpang tindih bersarang dengan ujung 3 'yang sama.

Gen kelas II diperlukan untuk perakitan.

2. Kelas II mengontrol aktivitas T7 RNA polimerase oleh lisozim yang dikodekan yang mengikat T7 RNA polimerase untuk mengurangi aktivitasnya.

Gen Lac mengekspresikan enzim yang terlibat dalam pemecahan laktosa dengan adanya laktosa (atau IPTG, analog laktosa.) Pengikatan IPTG memicu transkripsi gen Lac.

Salin dalam jumlah besar menggunakan vektor pET.

Pisahkan protein yang Anda minati menggunakan tag-nya yang Anda masukkan ke dalam gen Anda.

2. Memahami evolusi virus untuk menghindari/menginfeksi jaringan tertentu penting untuk memahami sifat adaptasi virus di dalam pejamu dan keseimbangan antara adaptasi untuk transmisi maksimum dan adaptasi di dalam pejamu.

Baik bakteri dan fag terkait dengan lendir ini.

Serat ekor mengikat protein membran luar LamB (porin yang dapat diinduksi maltosa.)

DNA kemudian disuntikkan melalui periplasma.

T1D tergantung pada keseimbangan antara Sel T efektor auto reaktif dan sel T regulator. Keseimbangan ini dipengaruhi oleh sel dendritik (DC).

- Kapsid Picornavirus mengandung 60 salinan dari masing-masing protein (VP1, VP2, VP3 dan VP4.)

- Virus Polio berikatan dengan reseptor virus polio pada sel inang.

- Setelah terikat pada sel inang, RNA genomik melewati pori-pori yang terbentuk di membran sel oleh protein kapsid VP4 dan VP1.

VPg adalah protein yang terkait dengan N-terminus dari ssRNA.

Penentu utama kelumpuhan adalah langkah-loop V di IRES.

Ini adalah faktor translasi khusus untuk neuron yang memiliki interaksi yang rusak dengan RNA.

Mutasi titik pada loop batang V adalah yang bertanggung jawab atas vaksin Sabin yang dilemahkan.

- Sebuah untai RNA negatif panjang penuh dibuat dan kemudian digunakan sebagai cetakan untuk sintesis untai (+).

- Translasi pertama-tama diperlukan untuk menghasilkan protein replikasi (poliprotein dibelah.)

- Sintesis RNA diprioritaskan oleh VPg yang terikat secara kovalen dengan residu uridin. Uridilasi VPg memungkinkannya untuk berhibridisasi ke ekor poli(A) dan berfungsi sebagai primer untuk sintesis untai (-).

- Sintesis RNA diselesaikan oleh RNA polimerase yang bergantung pada RNA virus (dibawa bersama virus.)

- Lima promotor merakit diri menjadi pentamer.

- Pentamers dan RNA berkumpul menjadi sebuah provirion.

Gejala infeksi virus (nyeri, kelelahan, demam) berasal dari respon imun (bukan virus itu sendiri).

Kasus pertama dalam epidemi disebut kasus indeks.

Satu-satunya perbedaan adalah, flavavirus mengalami translasi cap-dependent.

Semua gen diterjemahkan sebagai poliprotein tunggal diikuti oleh pembelahan proteolitik (sama seperti Picornavirus.)

Tahap awal --> Demam tinggi dan nyeri otot, sakit kepala, dan muntah hebat.

Tahap Diam --> Demam dan Gejala hilang

Tahap Akhir --> Pengulangan gejala awal hanya lebih parah. Dapat menyebabkan kegagalan organ multi-sistem.

- Demam berdarah
= Demam berdarah dengue
- Sindrom syok dengue.

Menyebabkan kematian pada 5% kasus.

- Dengue menargetkan daerah dengan jumlah sel darah putih yang tinggi (hati, limpa, kelenjar getah bening, sumsum tulang dan kelenjar.)

- Dengue memasuki sel darah putih dan jaringan limfatik.

- Protein flavavirus E menutupi seluruh permukaan dan mengarahkan baik pengikatan ke reseptor inang dan fusi membran virus dan seluler. Protein E bersifat imunogenik. Reseptor favavirus host saat ini tidak diketahui.

Setelah perlekatan, masuk ke dalam sel dimediasi oleh endositosis. Vesikel menyatu dengan endosom akhir, menghasilkan penurunan pH. Pengasaman menghasilkan penataan ulang dimer protein E menjadi keadaan trimerik aktif fusi.

- Urutan sinyal dibelah di lumen RE, melepaskan poliprotein.

- Protein C matang dipecah oleh NS1, melepaskan protein kapsid matang.

- Masa inkubasi berlangsung 12-23 hari.

- Replikasi virus terjadi di nasofaring dan kelenjar getah bening regional.

- Viremia terjadi dalam 5-7 hari.

- Plasenta dan janin keduanya terinfeksi selama viremia.

Setelah terikat, virus kemudian mengalami endositosis yang diperantarai reseptor.

Penurunan pH menyebabkan perubahan konformasi pada E1 dan E2 yang mengarah pada fusi membran dan memaparkan peptida fusi hidrofobik.

Protein non-struktural diterjemahkan langsung dari RNA genomik sebagai poliprotein yang dipecah oleh protease virus.

Pada fase awal infeksi, P1234 diproses secara proteolitik dan P4 dibelah. Kode P2 untuk protease dan kode P4 untuk RNA polimerase. P4 berikatan dengan P123 dan membentuk kompleks yang memungkinkan sintesis (-) RNA anti-genom.

Anti-genom berfungsi sebagai template untuk sintesis RNA full-length dan subgenomic.


Perancah RNA Sitoplasma

Beberapa contoh perancah dan umpan RNA sitoplasma yang fleksibel baru-baru ini terungkap, terutama yang melibatkan lncRNA dan mRNA sitoplasma. Ini, bersama dengan perancah RNA fleksibel terkait ribosom yang telah lama diketahui sekarang dibahas ( Gambar 2 dan Tabel 1 ).

7SL – paradigma scaffolding RNA sitoplasma. (1) Terjemahan protein dengan peptida sinyal terminal-N (hijau) diikat oleh kompleks SRP, di-scaffold oleh 7SL. (2) Pengikatan peptida sinyal menginduksi perubahan konformasi SRP dan pengikatan yang lebih erat, sehingga memblokir situs-A ribosom dan menghentikan perpanjangan translasi. (3) Interaksi SRP dengan reseptor SRP memposisikan peptida yang baru lahir untuk masuk ke translokon ER. (4) Disosiasi SRP mengurangi pemanjangan, dan peptida yang baru lahir meluas ke dalam dan terlipat di dalam lumen ER.

Partikel Pengenalan Sinyal Perancah 7SL

Partikel pengenalan sinyal (SRP) adalah kompleks RNP yang dipelajari dengan baik yang dirangkai oleh RNA yang diturunkan dari RNA Polimerase III (7SL Gambar 2). SRP mengenali dan mengikat peptida sinyal N-terminal yang ada pada protein yang ditujukan untuk sekresi atau lokalisasi membran saat mereka muncul dari ribosom. Pengikatan SRP ke peptida sinyal menyebabkan terhentinya pemanjangan translasi, dan menargetkan ribosom ke pori translocon di membran ER di mana translasi kemudian dilanjutkan, menghasilkan peptida baru yang tidak terstruktur yang dimasukkan ke dalam lumen ER, di mana pelipatan dan perdagangan kemudian pada akhirnya dapat terjadi (Keenan et al., 2001).

7SL lncRNA manusia adalah RNA terstruktur panjang � nt yang dicirikan oleh daerah heliks yang membentuk 2 domain yang dipisahkan oleh penghubung fleksibel, domain yang lebih kecil (Alu) dan domain yang lebih besar (S), dengan setiap bagian merekrut protein spesifik (total 6 ) yang membentuk SRP (Pool, 2005). Domain Alu dari 7SL secara istimewa mengikat heterodimer SRP14/SRP9 yang fungsinya melibatkan pengikatan ribosom dan menghambat perpanjangan translasi setelah pengenalan sinyal dengan mengaburkan akses ke situs-A ribosom, sedangkan domain S mengikat heterodimer SRP68/SRP72, SRP19 dan SRP54, dan mengikat di dekat terowongan peptida yang baru lahir (Siegel dan Walter, 1988 Wild et al., 2001). Selain pengikatan peptida sinyal (melalui SRP54), domain S juga memediasi interaksi SRP dengan reseptor SRP pada membran ER (Gowda et al., 1997 Pool et al., 2002). Analisis struktur kristal menunjukkan pengikatan heterodimer SRP68/SRP72 dari 7SL mendorong perubahan konformasi awal yang memungkinkan interaksi yang tepat dari SRP dengan ribosom (Grotwinkel et al., 2014). Lebih lanjut, studi Cryo-EM menunjukkan bahwa SRP yang terikat pada ribosom memanjang ada di setidaknya dua keadaan berbeda. Dalam keadaan “scanning”, SRP mengambil sampel peptida yang baru lahir untuk rangkaian sinyal peptida. Jika tidak ada yang terdeteksi, pengikatan faktor pemanjangan dengan mudah menggantikan domain Alu dari situs-A ribosom, sedangkan dalam keadaan 𠇎ngaged,” dengan SRP54 terikat pada peptida yang baru lahir, domain Alu tetap terikat kuat di dekat A- situs, sehingga menghambat terjemahan (Voorhees dan Hegde, 2015). Dengan demikian, fleksibilitas dinamis dari perancah RNA 7SL sangat penting untuk fungsi SRP.

LncRNA sitoplasma sebagai Perancah dan Umpan RNA

Sementara sebagian besar lncRNA menunjukkan bias yang signifikan terhadap lokalisasi nuklir, banyak juga yang terlokalisasi di sitoplasma dan dengan demikian tidak mengejutkan, semakin dikaitkan dengan serangkaian peran perancah dan umpan yang beragam.

lncRNA dapat berikatan dengan mRNA dalam trans, dan kompleks perancah yang memengaruhi fungsi mRNA. Misalnya, banyak lncRNA yang menyimpan elemen Alu (𠇁/2-sbsRNAs”) diidentifikasi yang membentuk dupleks komplementer sebagian dalam trans dengan elemen Alu hadir dalam berbagai mRNA 3′UTRs (Gong dan Maquat, 2011 Gambar 3). Setelah lncRNA-mRNA mengikat, RNA untai ganda yang dihasilkan berfungsi sebagai situs pengikatan untuk RBP Staufen, yang pada gilirannya merekrut RNA helicase Upf1, menghasilkan degradasi banyak mRNA target dengan proses yang disebut peluruhan yang dimediasi Staufen (SMD) (Kim et al., 2005). Regulasi SMD oleh lncRNA adalah kompleks, mengingat bahwa a) beberapa lncRNA yang mengandung Alu dapat menyebabkan peluruhan mRNA yang sama b) lncRNA yang mengandung Alu dapat mengatur beberapa mRNA dan c) tidak semua target mRNA dengan komplementaritas pada Alu yang diberikan mengandung lncRNA harus mengalami pembusukan, mungkin karena aspek struktural lain dari kompleks mRNA-protein (mRNP) (Gong dan Maquat, 2011 Gong et al., 2012 Park dan Maquat, 2013). Dalam kasus lain, p21, target transkripsi lncRNA yang dipelajari dari p53 dengan banyak fungsi nuklir, juga membentuk hibrida dengan mRNA sitoplasma target (Gambar 3). Secara khusus, p21 menunjukkan komplementaritas dan afinitas pasangan basa parsial yang dimurnikan dengan mRNA CTNNB1 dan JUNB, yang mengkode protein onkogenik β-catenin dan JunB (Yoon et al., 2012). Berdasarkan studi knockdown, p21 memberikan efek penghambatan pada terjemahan mRNA ini, daripada peluruhan mRNA. Konsisten dengan ini, p21 juga memurnikan afinitas dengan penekan translasi RCK dan FMRP, dan fraksinasi dalam polisom, menunjukkan bahwa p21 berpasangan dan merekrut penekan terjemahan ke target mRNA (Yoon et al., 2012).

Contoh perancah dan umpan RNA sitoplasma. Scaffold dan RNA umpan digambarkan dalam warna pink (A) terjemahan mRNA: lncRNA-p21 sebagian basa berpasangan dengan mRNA target yang mengarah pada perekrutan faktor represi terjemahan seperti RCK dan FMRP, sehingga menghambat terjemahan mRNA. (B) peluruhan mRNA: pasangan basa 1/2sbsRNA dengan mRNA target, dsRNA yang dihasilkan merekrut Staufen, yang mengarah pada peluruhan mRNA yang dimediasi staufen. (C) sekuestrasi miRNA: berbagai lncRNA (linier dan sirkular) dalam banyak spesies, diatur dalam jaringan, perkembangan atau cara yang sensitif terhadap lingkungan, dapat memasangkan basa dengan dan mengasingkan miRNA, mencegah regulasi translasi atau pembusukan mRNA. (D) Degradasi protein: HOTAIR lncRNA mengikat dua ligase ubiquitin dan substratnya yang menyebabkan ubiquitinasi dan degradasinya.

Contoh kedua dari 3′UTR perakitan scaffolding co-translationally kompleks protein melibatkan gen Baculoviral IAP repeat-containing protein 3 (BIRC3). BIRC3 mengkodekan ligase ubiquitin, dan pembelahan alternatif dan poliadenilasi menghasilkan isoform mRNA pendek (BIRC3-SU) dan panjang (BIRC3-LU) 3′UTR, yang terakhir diregulasi secara signifikan dalam sel leukemia limfositik kronis (CLL) (Lee dan Mayr , 2019). Meskipun tidak mempengaruhi mRNA BIRC3 atau lokalisasi protein, atau tingkat protein, BIRC3-LU secara khusus terikat oleh HuR dan Staufen, yang pada gilirannya merekrut protein pengatur perdagangan (motif IQ yang mengandung GTPase IQGAP1, dan Ras GTPase RALA) (Lee dan Mayr, 2019). Ini berinteraksi dengan BIRC3 yang baru diterjemahkan sedemikian rupa sehingga scaffolds 3′UTR dari kompleks BIRC3-RALA-IQGAP1. Kompleks ini pada gilirannya mengikat dan mempromosikan daur ulang membran plasma dari protein reseptor yang disebut CXCR-4, yang mendorong perkembangan CLL dengan membantu migrasi sel B ganas dan kelangsungan hidup melalui penargetan ke relung sumsum tulang pelindung (Burger et al., 2005). Akhirnya, BIRC3-LU 3′UTR, berbeda dari isoform BIRC3-SU, secara unik mengikat protein yang terlibat dalam biologi mitokondria dan remodeling kromatin, menunjukkan bahwa beberapa kompleks protein yang berbeda secara fungsional dapat dirangkai oleh 3′UTR khusus ini (Lee dan Mayr, 2019).

Sementara yang paling terkenal dengan fungsi nuklirnya, HOTAIR juga ditemukan di sitoplasma, terutama di bawah kondisi seluler seperti penuaan (Yoon et al., 2013). Sitoplasma HOTAIR berfungsi sebagai situs pengikatan untuk dua ligase ubiquitin DZIP3 dan MEX3B, dan substratnya Snurportin 1 (SNUPN) dan Ataxin-1 (ATXN1) pengikatan ini mengarah pada peningkatan ubiquitinasi SNUPN dan ATXN1 dan degradasinya. Akumulasi HOTAIR diperlukan untuk memunculkan fenotipe penuaan seluler yang tepat sebagai respons terhadap rangsangan penginduksi, mungkin sebagian melalui degradasi SNUPN dan ATXN1 (Yoon et al., 2013). Baik HOTAIR dan p21 diturunkan regulasinya dengan mengikat RBP HuR, yang biasanya menstabilkan mRNA, tetapi dalam kasus lncRNA ini, merangsang perakitan dan perekrutan kompleks pembungkaman miRNA (Let-7/Ago2) untuk mendapatkan pembusukannya (Yoon et al. ., 2012). Dengan demikian, lncRNA sitoplasma dapat mengatur translasi dan peristiwa pergantian protein dan dapat tunduk pada regulasi stabilitas yang dimediasi miRNA.

Sebaliknya, mode fungsi lncRNA yang sangat dihargai di sitoplasma adalah berfungsi sebagai umpan untuk miRNA (alias spons Gambar 3). Pertama kali dijelaskan pada tanaman di mana lncRNA IPS1 mengasingkan miR-399 sebagai bagian dari regulasi homeostasis fosfat (Franco-Zorrilla et al., 2007), beberapa umpan miRNA lncRNA sekarang diketahui, beberapa di antaranya memiliki banyak situs untuk miRNA yang berbeda dan dapat ada sebagai lncRNA sirkular turunan perantara-perantara (Hansen et al., 2013 Memczak et al., 2013). Banyak umpan miRNA tampak sangat diatur, dengan jaringan yang berbeda, pola ekspresi perkembangan dan responsif lingkungan, dan memiliki potensi untuk menunjukkan efek skala besar pada terjemahan dan peluruhan mRNA, karena keragaman molekul miRNA yang fungsinya dapat mereka hambat. Kami memandu pembaca ke ulasan terperinci lainnya tentang topik ini (Ebert dan Sharp, 2010a, b Yoon et al., 2014 Rong et al., 2017).

MRNAs Scaffold Co-translational Assembly of Protein Complexes

Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa mRNA berfungsi sebagai platform perancah untuk perakitan kompleks protein ko-translasi (Natan et al., 2017). Pada prokariota, subunit dari kompleks protein tertentu sering dikodekan dalam operon (sekelompok gen dengan fungsi umum di bawah promotor tunggal), yang ditranskripsi menjadi mRNA polikistronik. Terjemahan mRNA polisistronik pada gilirannya meningkatkan kemungkinan subunit kompleks protein yang disandikan berinteraksi. Interaksi semacam itu dapat terjadi pada mRNA polikistronik bahkan ketika protein yang baru disintesis masih terkait dengan ribosom, sebagian karena kedekatan spasialnya saat sintesis (Shieh et al., 2015). Dengan cara ini, mRNA berfungsi sebagai molekul perancah yang memfasilitasi interaksi protein yang baru lahir. Selanjutnya, gen yang berdekatan dalam operon cenderung menunjukkan antarmuka interaksi protein yang lebih besar (Koonin dan Mushegian, 1996 Dandekar et al., 1998 Shieh et al., 2015 Wells et al., 2016). Temuan ini, dikombinasikan dengan analisis bioinformatika dan struktural tambahan dari perakitan kompleks protein menunjukkan bahwa urutan gen operon sering cocok (dan dengan demikian dapat membantu mengarahkan) urutan perakitan subunit protein (Wells et al., 2016). Selain kedekatan spasial subunit, variasi stoikiometrik yang lebih rendah dalam ekspresi subunit kompleks protein merupakan keuntungan tambahan dari perakitan kompleks protein pada mRNA polikistronik (Swain, 2004 Sneppen et al., 2010 Shieh et al., 2015).

Eukariota tidak memiliki operon, artinya setiap interaksi translasi harus melibatkan dalam trans peristiwa seperti perekrutan protein yang berinteraksi ke mRNP penerjemah, atau penjajaran penerjemahan mRNP. Meskipun demikian, perakitan ko-translasi kompleks protein pada eukariota telah dilaporkan (Natan et al., 2017). Khususnya, studi pemurnian afinitas baru-baru ini dari kompleks protein yang ditandai dengan baik dalam ragi (Shiber et al., 2018) dan sel manusia (Kamenova et al., 2019) menunjukkan dalam banyak kasus bahwa protein yang baru lahir menerjemahkan berinteraksi kuat dengan protein yang ditakdirkan untuk mereka. membentuk kompleks dengan. Interaksi co-translation diidentifikasi melalui pemetaan domain interaksi yang cermat, mikroskopi co-localization mRNA-protein dan secara kritis dengan mendeteksi kedua interaksi protein, dan molekul template mRNA mereka, setelah pemurnian subunit kompleks protein yang diminati. Menggabungkan pemurnian peptida yang baru lahir dengan profil ribosom (metode berbasis sekuensing RNA untuk memetakan jejak kaki mRNA ribosom) memungkinkan penentuan dengan tepat di mana ribosom berada pada mRNA tertentu ketika peptida yang baru lahir berinteraksi dengan protein yang diinginkan (Shiber et al., 2018). Interaksi protein ko-translasi bisa searah (artinya Protein A dan mRNA-nya dimurnikan dengan isolasi Protein B, tetapi tidak sebaliknya) atau dua arah. Ini sangat bergantung pada seberapa dekat domain interaksi protein tertentu dengan C-terminus, karena ini mempengaruhi derajat dan waktu pemaparan domain interaksi dari dalam ribosom penerjemah (Shiber et al., 2018). Perakitan ko-translasi kompleks protein penting dalam mencegah kesalahan lipatan protein dan meningkatkan efisiensi perakitan kompleks protein (Shiber et al., 2018 Kamenova et al., 2019). Dengan demikian, perakitan protein translasi pada eukariota mungkin merupakan fenomena umum.

Dua model utama untuk interaksi protein ko-translasi eukariotik umumnya didalilkan. Yang pertama menyatakan bahwa protein yang disintesis sepenuhnya berinteraksi dengan protein yang baru lahir mensintesis, meskipun apakah ini hanya melibatkan difusi acak, lokalisasi bersama atau proses perekrutan yang digerakkan pendamping aktif tidak jelas. Model kedua adalah bahwa, terutama dalam kasus interaksi protein ko-translasi dua arah, menerjemahkan mRNP dapat ditambatkan satu sama lain. dalam trans oleh peptida mereka yang baru lahir (Natan et al., 2017 Schwarz dan Beck, 2019). Meskipun contoh yang dibahas di atas tidak membedakan antara model-model ini, data terbaru, yang dibahas di bawah, menambah bobot dan wawasan baru untuk kedua ide dan memusatkan perhatian pada pentingnya mRNA sebagai molekul perancah.

MRNA 3′UTR Perancah Kompleks Protein

mRNA memiliki tiga domain utama: UTR 5′, kerangka baca terbuka, dan 3′UTR. Sementara semua terlibat dalam translasi, ribosom biasanya hanya transit melalui 5′UTRs dan ORFs, meninggalkan 3′UTRs sebagai daerah di mana interaksi yang lebih stabil dengan protein dan molekul RNA lainnya dapat dipertahankan. Urutan 3′UTR tidak dibatasi oleh seleksi untuk urutan protein tertentu, secara signifikan lebih panjang dari 5′UTR, dan bertambah panjang dengan kompleksitas organisme (Pesole, 2002 Mayr, 2017). Dengan demikian, tidak mengherankan bahwa sementara interaksi lokal 3′UTR dengan jelas mengatur fungsi mRNA individu, seperti terjemahan, peluruhan, dan lokalisasi (Wilkie et al., 2003 Andreassi dan Riccio, 2009), fungsi baru untuk 3′UTR sedang ditemukan.

Pekerjaan perintis oleh lab Mayr menunjukkan bahwa mRNA 3′UTRs spesifik dapat membentuk interaksi protein-protein di mana protein terikat 3′UTR (atau protein) berinteraksi dengan protein yang baru disintesis yang diterjemahkan pada mRNA itu sendiri, dengan konsekuensi fisiologis yang penting ( Gambar 4 ) . Laporan pertama dari fenomena ini (Berkovits dan Mayr, 2015) berkaitan dengan gen CD47, yang mengkode protein yang mampu ER dan lokalisasi permukaan sel di situs terakhir ini, CD47 melindungi sel dari fagositosis oleh makrofag (Oldenborg et al., 2000 Jaiswal dkk., 2009). Pembelahan alternatif dan penggunaan poliadenilasi, cara yang sangat diatur dengan mana isoform 3′UTR alternatif dihasilkan (Sandberg et al., 2008 Mayr dan Bartel, 2009 Lianoglou et al., 2013), menghasilkan dua isoform mRNA CD47 3′UTR utama - isoform pendek (CD47-SU) dan panjang (CD47-LU). Knockdown CD47-LU menghambat lokalisasi permukaan sel protein CD47, terlepas dari efek lokalisasi mRNA, karena reporter mRNA CD47 pendek dan panjang terlokalisasi ke UGD. Analisis selanjutnya dari situs pengikatan 3′UTR, knockdown gen, pendekatan RNA-imunopresipitasi dan penambatan protein mRNA menentukan bahwa HuR kemungkinan mengikat CD47-LU 3′UTR dalam hubungannya dengan SET. Pada gilirannya, SET berinteraksi dengan protein CD47 yang baru saja diterjemahkan, dan GTPase RAC1 kecil yang melokalisasi membran, yang kemudian membantu translokasi CD47 (dan SET) ke membran plasma (Ten Klooster et al., 2007). Mendasari pentingnya perancah 3′UTR dari kompleks pelokalan protein ini, sel-sel yang dipaksa untuk mengekspresikan CD47-LU atau CD47-SU secara terpisah menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam kerentanan fagositik (sel CD47-LU lebih resisten) dan induksi apoptosis setelahnya. γ-iradiasi (hanya sel CD47-SU yang menginduksi apoptosis) (Berkovits dan Mayr, 2015).

mRNA sebagai perancah RNA sitoplasma. (A) Lokalisasi protein: (1) The CD47-LU mRNA 3′UTR merekrut HuR dan SET. (2) Dalam kompartemen membran TIS11B-ER (butiran TIS), interaksi CD47 yang baru diterjemahkan dengan SET difasilitasi. (3) Rekrutmen RAC1 oleh SET menghasilkan translokasi CD47 berikutnya ke membran plasma. (B) Rakitan butiran mRNP: (1) The RPS28B 3′UTR dianggap merekrut Edc3 sebelum interaksi berikutnya, (2) dengan Rp28. (3) Karena menerjemahkan mRNA dikeluarkan dari butiran mRNP, limpasan ribosom kemungkinan diperlukan untuk RPS28B-Edc3-Rps28 RNP complex untuk membantu nukleasi perakitan P-body ragi.

Perakitan ko-translasi yang didorong 3′UTR dari kompleks protein kemungkinan terjadi di semua eukariota. Kami baru-baru ini mendemonstrasikan dalam ragi bahwa mRNA 3′UTR spesifik bertindak sebagai perancah mRNA yang mempromosikan perakitan badan-P (Fernandes dan Buchan, 2020), yang merupakan organel tanpa membran sitoplasma yang diperkaya dalam mRNP non-translasi. mRNA yang dimaksud adalah RPS28B, satu dari dua RPS28 paralog (yang mengkode protein ribosom S28) yang memiliki panjang 3′UTR (643 nts) yang luar biasa panjang dan yang memiliki elemen struktur loop batang yang mengikat Edc3 (He et al., 2014), protein yang terlibat dalam perakitan tubuh-P (Decker et al., 2007). Menggunakan tes genetika, mikroskop, dan interaksi protein, kami menunjukkan bahwa Edc3 direkrut oleh RPS28B 3′UTR mengikat Rps28b yang baru lahir atau yang baru diterjemahkan dengan cara bergantung pada RPS28 ORF dan 3′UTR sedang dalam cis ( Gambar 4 ). Interaksi Edc3-Rps28 yang dihasilkan pada gilirannya adalah kunci untuk perakitan bodi-P normal.

Untuk pengetahuan kita, RPS28B adalah kasus pertama dari mRNA spesifik yang terlibat dalam perancah butiran mRNP, dan kemungkinan molekul RNA lain (seperti NEAT1 dalam paraspeckles) akan memiliki potensi perancah yang kuat untuk butiran RNP, berdasarkan potensi valensi interaksinya yang tinggi (baik dengan protein atau molekul RNA lainnya (Van Treeck dan Parker, 2018 Van Treeck et al., 2018)) dan kemampuan untuk eksis dalam keadaan tidak menerjemahkan. Memang, data terbaru berpendapat bahwa RNA panjang yang diterjemahkan dengan buruk secara istimewa terakumulasi dalam butiran RNP seperti badan-P dan butiran stres (Khong et al., 2017). RPS28B juga memenuhi kriteria ini (Ingolia, 2009), meskipun masih ada pertanyaan tentang sifat interaksi protein Rps28-Edc3, dan apakah regulasi RPS28B tingkat translasi atau kelimpahan juga dapat terjadi untuk mempengaruhi perakitan P-body. Akhirnya, pekerjaan kami menunjukkan bahwa mRNA dari paralog gen, selain isoform transkrip dari satu gen, mewakili cara lain untuk memungkinkan regulasi perakitan kompleks makromolekul berbasis mRNA. Mengingat bahwa 50�% dari semua gen manusia menghasilkan mRNA dengan 3′UTR alternatif (Lianoglou et al., 2013) peran luas untuk 3′UTR dalam perancah perakitan kompleks protein ko-translasi tampaknya layak (Mayr, 2019).

MRNA Co-localization Dapat Membantu Interaksi Protein Co-translasi

Sementara lokalisasi mRNA jelas memfasilitasi lokalisasi protein (Holt dan Bullock, 2009), lokalisasi mRNA dalam kompartemen seluler tertentu juga dapat membantu interaksi protein ko-translasi dan/atau perakitan kompleks protein. Mekanisme seperti itu merupakan penjelasan yang menarik untuk mekanisme perakitan protein ko-translasi yang dibahas di atas. Menariknya, beberapa penelitian menyarankan keberadaan “translation factory,” di mana mRNA yang terkait secara fungsional terkonsentrasi secara spasial di kompartemen seluler.

Dalam sel manusia, beberapa mRNA penyandi protein membran, termasuk CD47-LU (tetapi bukan CD47-SU), menyimpan situs pengikatan untuk RBP yang disebut TIS11B. MRNA ini, serta SET dan HuR, bergabung dengan TIS11B dalam struktur retikuler ER-terjalin yang disebut butiran TIS, yang mengandalkan ekspresi TIS11B untuk perakitannya (Ma dan Mayr, 2018). Yang penting, ekspresi TIS11, dan pembentukan butiran TIS mendorong interaksi SET dengan CD47, dan lokalisasi CD47 ke membran plasma. Ini mungkin mencerminkan peningkatan retensi CD47 mRNA dan SET dalam butiran TIS berdasarkan pemulihan fluoresensi setelah data photobleaching, sehingga meningkatkan kemungkinan interaksi CD47 co-translasi dengan SET (Ma dan Mayr, 2018).

Dalam ragi, mRNA glikolitik spesifik (Lui et al., 2014) dan mRNA faktor translasi tertentu (Pizzinga et al., 2019) melokalisasi bersama dalam butiran aktif translasi yang berbeda, setidaknya beberapa di antaranya mengkode protein yang secara kolektif membentuk kompleks multi-subunit . Akhirnya, beberapa komponen penyandi mRNA dari kompleks Arp2/Arp3, kompleks pengatur sitoskeleton aktin, terlokalisasi bersama dan setidaknya dalam beberapa kasus diterjemahkan di tepi terdepan fibroblas (Mingle et al., 2005 Willett et al., 2013 ). Namun, pengujian langsung apakah ko-lokalisasi mRNA secara efektif berfungsi sebagai analog eukariotik dari mekanisme perakitan kompleks protein berbasis operon prokariotik tetap menjadi pertanyaan untuk penelitian di masa depan.


SRNA Pasangan Basis Trans-Encoded

Berbeda dengan cis-encoded sRNA, sRNA pasangan basa trans-encoded tidak secara fisik terkait dengan target mRNA mereka dan pembentukan dupleks RNA dimediasi oleh interaksi RNA pendek yang tidak sempurna (Gambar 1C). Fungsi dari banyak sRNA pasangan basa trans-encode tergantung pada protein pengikat RNA Hfq, yang dianggap meningkatkan kemungkinan interaksi produktif antara sRNA dan targetnya (Waters dan Storz, 2009). Ini berbeda dengan sRNA pasangan basa yang dikodekan cis yang umumnya tidak memerlukan partisipasi pendamping RNA (misalnya, Hfq) untuk mengikat mRNA target mereka (Brantl, 2007).

Pada bakteri patogen, penghapusan hfq gen sering menyebabkan pengurangan virulensi, seperti yang diamati untuk E.coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, dan Listeria (Ditinjau dalam Chao dan Vogel, 2010). Misalnya, di E. coli, Hfq ditunjukkan untuk mengatur locus of enterocytes effacement (LEE) yang mengkode sistem sekresi tipe III (TTSS Hansen dan Kaper, 2009 Shakhnovich et al., 2009). Pada patogen intraseluler Salmonella enterica serovar Typhimurium, Hfq diperlukan untuk pertumbuhan optimal dalam sel epitel dan makrofag (Sittka et al., 2007). Burkholderia cenocepacia mengkodekan dua homolog Hfq dan keduanya diperlukan untuk ketahanan optimal terhadap stres dan virulensi (Ramos et al., 2011). Penghapusan hfq gen dari Stafilokokus aureus tidak memiliki efek pada metabolisme tetapi mengurangi virulensi (Bohn et al., 2007 Liu et al., 2010). Namun, dalam Neisseria gonorrhoeae, penghapusan hfq hanya mengarah pada pengurangan virulensi yang lemah (Dietrich et al., 2009). Selain itu, pada beberapa bakteri, Hfq diperlukan untuk fungsi beberapa sRNA tetapi dapat diabaikan untuk yang lain. Misalnya, di V. kolera, Hfq diperlukan untuk kontrol sistem penginderaan kuorum oleh sRNA Qrr1–Qrr4, tetapi dapat diabaikan untuk represi ompA oleh VrrA (Lenz et al., 2004 Lagu et al., 2008). Perlu diperhatikan bahwa Helicobacter pylori tidak mengkodekan homolog Hfq tetapi masih mengekspresikan ratusan sRNA (Sharma et al., 2010). Ini menunjukkan bahwa pada beberapa spesies bakteri, fungsi yang dimediasi oleh Hfq tidak diperlukan untuk regulasi gen yang dimediasi sRNA atau bahwa protein yang belum diketahui dapat melakukan fungsi serupa. Setelah identifikasi luas genom dari sRNA pengikat Hfq, didalilkan bahwa bahkan dalam E. coli, beberapa sRNA pasangan basa mungkin tidak mengikat, atau menggunakan Hfq (Zhang et al., 2003). Tinjauan yang cermat terhadap literatur terkait Hfq, Jousselin et al. (2009) untuk mendalilkan bahwa kebutuhan Hfq dalam interaksi mRNA–sRNA terkait dengan sejumlah faktor. Pertama, semakin tinggi kandungan GC keseluruhan dari genom bakteri, semakin besar kemungkinan Hfq diperlukan dan Hfq tampaknya dapat dibuang pada bakteri yang genomnya menampilkan nilai GC rendah, seperti S. aureus (32% GC). Kedua, Hfq dapat diabaikan ketika interaksi sRNA–mRNA dimediasi oleh pasangan yang lama (㸰) dan tidak terputus. Ketiga, mereka mengamati korelasi antara persyaratan untuk Hfq dan panjang ekstensi terminal-C dari Hfq, yang membentuk permukaan interaksi mRNA. Protein Hfq yang memiliki C-terminus pendek cenderung ditemukan pada bakteri di mana Hfq dapat dibuang.

Di dalam L. pneumophila, penghapusan hfq gen mempengaruhi durasi fase lag setelah inokulasi dalam kaldu segar (McNealy et al., 2005). Selain itu, L. pneumophila hfq mutan menunjukkan tingkat pertumbuhan yang berkurang dalam media yang ditentukan secara kimia yang mengandung konsentrasi besi yang rendah dan pengurangan ekspresi regulator serapan besi (bulu). Di dalam E. coli, sRNA RyhB secara negatif mengatur ekspresi bulu dengan cara yang bergantung pada Hfq (Vecerek et al., 2007). Selain itu, L. pneumophila hfq mutan menunjukkan penurunan kecil dalam pertumbuhan intraseluler (McNealy et al., 2005). Efek yang agak terbatas dari menghapus hfq gen aktif L. pneumophila fenotipe menunjukkan bahwa Hfq tidak penting untuk interaksi sRNA–mRNA dalam organisme ini. Konten GC dari L. pneumophila genom rendah (38%) dan keselarasan urutan protein Hfq dengan homolog lain (Gambar 2) mengungkapkan bahwa wilayah terminal-C pendek dan sebanding dengan panjang V. kolera Hfq yang tidak esensial untuk semua interaksi mRNA–sRNA. Menurut postulat Jousselin et al. (2009), orang dapat berhipotesis bahwa Hfq tidak akan diperlukan untuk semua interaksi sRNA–mRNA di L. pneumophila.

Gambar 2. Penjajaran protein Hfq dari E. coli (Eko), V. kolera (Vch), L. pneumophila (Lpn), dan S. aureus (Sau) dilakukan dengan ClustalW2 (Chenna et al., 2003).

Meskipun demikian, orang dapat berspekulasi bahwa dalam L. pneumophila, sRNA pasangan basa yang bekerja melalui Hfq dapat mengatur perolehan zat besi, fungsi terkait virulensi dan mungkin juga sistem lain, meskipun fungsi Hfq tidak penting untuk ini. Profil ekspresi dari a hfq-kurang L. pneumophila strain akan menjelaskan pentingnya Hfq pada regulasi gen dan sangat membantu dalam mengidentifikasi fenotipe yang dapat dipengaruhi olehnya. Pendekatan serupa digunakan untuk bakteri lain seperti: E. coli (Zhang et al., 2003), Typhimurium (Sittka et al., 2008), B. cenocepacia (Ramos et al., 2011), Pseudomonas aeruginosa (Sonnleitner et al., 2006), dan N. gonorrhoeae (Dietrich et al., 2009). Selain itu, imunopresipitasi Hfq dengan identifikasi selanjutnya dari sRNA terikat oleh pengurutan RNA enzimatik (Christiansen et al., 2006), microarray ubin (Zhang et al., 2003), atau pengurutan dalam (Sittka et al., 2008) akan menjelaskan spesies mRNA yang dipengaruhi oleh Hfq dan sRNA potensial yang fungsinya setidaknya sebagian bergantung pada Hfq. Windbichler dkk. (2008) telah menggunakan prosedur kromatografi afinitas untuk mengidentifikasi protein pengikat RNA dalam E. coli. Secara singkat, mereka menandai sejumlah sRNA yang diketahui dengan aptamer RNA pengikat streptomisin, memungkinkan mereka untuk mengikat ke kolom berlapis streptomisin, yang kemudian digunakan untuk menangkap protein pengikat RNA dari ekstrak seluler. Mereka menemukan bahwa tiga protein secara konsisten terikat pada berbagai urutan sRNA: subunit Hfq, RNAP β dan subunit ribosom kecil S1. Selain itu, mereka menunjukkan bahwa protein spesifik dapat berinteraksi dengan sRNA tertentu, tergantung pada urutan dan struktur sekundernya. Oleh karena itu, perburuan protein pengikat sRNA diperlukan untuk menyelesaikan lanskap regulasi yang dimediasi sRNA dan untuk sepenuhnya memahami sejauh mana dampaknya terhadap regulasi fungsi seluler.

Di dalam L. pneumophila, sejumlah kandidat sRNA pasangan basa trans-enkode telah diidentifikasi tetapi studi mekanistik diperlukan untuk mengevaluasi cara kerjanya dan untuk memvalidasinya sebagai sRNA pasangan basa otentik (Tabel 1). Lima RNA intergenik diidentifikasi berdasarkan prediksi komputer dengan menggunakan perangkat lunak sRNA Predict (Faucher et al., 2010). Dengan mencari terminator Rho-independen di daerah intergenik yang didahului oleh urutan yang dilestarikan di lainnya L. pneumophila strain, 143 molekul sRNA diprediksi. Menggunakan microarray yang dibuat khusus, ekspresi 101 dari sRNA yang diprediksi ini dipantau selama pertumbuhan dalam berbagai kondisi. Pendekatan dua langkah ini mengarah pada identifikasi 12 molekul sRNA yang diekspresikan secara aktif, termasuk 6S RNA, enam 3′UTR, dan lima sRNA yang ditranskripsi secara independen (Faucher et al., 2010 Tabel 1). Pada titik ini fungsi dari lima sRNA yang diidentifikasi tidak jelas. Menariknya, ekspresi LprA selama pertumbuhan eksponensial bergantung pada OxyR tetapi bergantung pada RpoS selama fase pasca-eksponensial (Gambar 3). Karena RpoS adalah pengatur virulensi yang penting, tergoda untuk berspekulasi bahwa LprA dapat menjadi bagian dari kaskade pengaturannya dan berperan dalam ekspresi faktor virulensi. Terlepas dari fase pertumbuhan, keberadaan H2HAI2 menginduksi ekspresinya, yang menunjukkan bahwa LprA merespons stres oksidatif. Ini mirip dengan E. coli sRNA OxyS, yang merupakan bagian dari respon stres oksidatif dan mengurangi efek mutageniknya (Altuvia et al., 1997).

Gambar 3. Model jaringan regulasi yang melibatkan sRNA di L. pneumophila. Garis menunjukkan interaksi antara pemain: Panah, bilah T aktivasi, garis putus-putus represi, diduga, atau interaksi yang diprediksi. Lihat teks untuk detailnya.

Sekuensing RNA mengidentifikasi 38 molekul sRNA yang dikodekan di daerah intergenik yang dapat dianggap sebagai sRNA trans-enkode potensial (Weissenmayer et al., 2011 Tabel 1). Dari jumlah tersebut, sembilan diprediksi berfungsi berdasarkan stabilitas struktur sekunder yang diprediksi pada 37ଌ. Struktur yang diprediksi dari satu sRNA (Lpr0010) kurang stabil dibandingkan 1000 sekuens permutasi acak dengan panjang dan komposisi dasar yang sama pada 20 atau 37ଌ, menunjukkan bahwa struktur sekunder tersebut berada di bawah tekanan evolusioner untuk membentuk struktur sekunder yang tidak stabil. Relevansi biologis ini tidak dieksplorasi lebih lanjut, tetapi orang dapat berhipotesis bahwa strukturnya hanya stabil pada suhu rendah (kurang dari 20 ° C) dan itu bisa menjadi bagian dari respons seluler terhadap suhu rendah. Menariknya lima pasangan sRNA diidentifikasi, di mana dua sRNA berbeda ditranskripsikan antisense satu sama lain (Weissenmayer et al., 2011). Di dalam E. coli, sRNA RyeB dan SraC dikodekan berlawanan satu sama lain dan RyeB sepenuhnya melengkapi segmen SraC yang lebih panjang (Vogel et al., 2003). Ukuran SraC adalah � nt, tetapi ketika RyeB hadir, pita yang lebih pendek (� nt) juga terdeteksi. Pengurangan ukuran ini tampaknya tergantung pada RNase III, menunjukkan bahwa RyeB memediasi degradasi SraC. Untuk pasangan sRNA yang diidentifikasi dalam Legionella, satu sRNA dapat bertindak sebagai regulator negatif dari yang lain, secara efisien mengasingkannya dengan memasangkan basa yang diperpanjang dan berpotensi menargetkannya untuk degradasi. Selain itu, mRNA juga dapat mengatur sRNA. Mekanisme ini, bernama trap-RNA, dijelaskan untuk sRNA MicM yang menginduksi degradasi mRNA porin YbfM. NS chb mRNA polisistronik mengandung urutan yang melengkapi MicM dan ekspresi chb operon mengarah ke hibridisasi dan degradasi MicM, menghasilkan stabilisasi ybfM mRNA (Figueroa-Bossi et al., 2009 Overgaard et al., 2009). Sekali lagi, pekerjaan tambahan diperlukan untuk memahami fungsi regulasi dari Legionella sRNA pasangan basa trans-encoded.

Ada sejumlah sRNA pasangan basa yang dikodekan dalam genom bakteri lain yang diketahui mempengaruhi virulensi. Beberapa contoh diberikan di bawah ini yang mungkin relevan dalam konteks: L. pneumophila pertumbuhan intraseluler. Salah satu patogen intraseluler yang identifikasi dan karakterisasi sRNA secara ekstensif telah dan sedang dilakukan adalah Salmonella. Pada spesies ini, ekspresi protein membran luar (OMP) diatur oleh jaringan sRNA. Salah satunya, InvR, dikodekan pada Salmonella patogenisitas pulau-1, diperoleh melalui transfer gen horizontal (HGT) dan pengkodean TTSS yang bertanggung jawab untuk invasi enterosit (Pfeiffer et al., 2007). Ekspresi sRNA ini tergantung pada HilD, pengatur utama ekspresi TTSS. Ketika TTSS diekspresikan, InvR bertindak sebagai pengatur negatif sintesis OmpD, salah satu OMP paling melimpah di Typhimurium. Bukti tidak langsung menunjukkan bahwa represi OmpD dapat menstabilkan membran dalam konteks ekspresi TTSS, memungkinkan keberhasilan translokasi efektor bakteri (Vogel, 2009). Oleh karena itu, InvR diperkirakan telah membantu pembentukan urutan TTSS setelah HGT dengan menekan ekspresi OMP yang tidak sesuai dengan keunggulan virulensi yang diberikan oleh TTSS (Vogel, 2009). Oleh karena itu, tergoda untuk berspekulasi bahwa mekanisme serupa ada di L. pneumophila untuk menekan OMP selama ekspresi sistem Icm/Dot, sistem sekresi Tipe IVA (lvr/lvh) atau sistem konjugasi Tra. Namun, hingga saat ini, tidak ada sRNA trans-encoded yang telah diidentifikasi di sekitar sistem ini, tetapi, seperti dijelaskan di atas, satu sRNA yang dikodekan cis adalah antisense terhadap lvrA (lpg1259).

sRNA VrrA dari V. kolera adalah bagian dari jalur respon stres membran yang dimediasi oleh σ E dan target ompA mRNA, mungkin untuk membatasi sintesis OMP (Song et al., 2008). Penghapusan vrrA mengarah pada peningkatan sintesis vesikel membran luar yang diketahui terlibat dalam pengiriman faktor virulensi ke sel inang (Mashburn-Warren dan Whiteley, 2006). Selain itu, VrrA tampaknya secara negatif mengatur ekspresi molekul adhesi Tcp dan karenanya mempengaruhi kolonisasi usus (Song et al., 2008). Ada kesamaan struktural antara VrrA dan LprD dari L. pneumophila dan tergoda untuk berspekulasi peran LprD dalam regulasi sintesis OMP. Namun, perbandingan struktur sRNA trans-encoded telah membantu terbatas untuk memprediksi fungsi atau target, dan strategi eksperimental harus diambil untuk menentukan apakah LprD mengatur sintesis OMP.

Sistem kuorum V. kolera terdiri dari empat sRNA redundan bernama Qrr1–Qrr4 dan dua molekul pemberi sinyal, furanosyl borate diester (AI-2) dan α-hydroxyketone Cqs (Lenz et al., 2004). Pada kepadatan sel yang rendah, sistem secara positif mengatur ekspresi Qrr1–Qrr4, yang mengacaukan mRNA dari hapR, regulator negatif dari virulensi. Oleh karena itu, pada kepadatan sel yang rendah, hapR terdegradasi memungkinkan ekspresi sifat virulensi. L. pneumophila juga memiliki sistem kuorum yang diduga, hanya berdasarkan pada keberadaan α-hydroxyketone Lqs dan sistem dua komponen (TCS) LqsR/LqsS (Tiaden et al., 2007 Spirig et al., 2008). Selain tidak adanya pensinyalan AI-2 di L. pneumophila arsitektur sistem kuorum dari L. pneumophila dan V. kolera cukup mirip (Tiaden et al., 2010). Namun, dalam L. pneumophila belum ada sRNA yang terlibat dalam sistem regulasi ini. Setelah pengurutan RNA, dua sRNA (Lpr0001, dan Lpr0069) ditemukan memiliki homologi substansial baik pada urutan maupun tingkat struktur sekunder, yang mengingatkan pada sRNA Qrr1–Qrr4 (Weissenmayer et al., 2011). Pencarian sekuens homolog di seluruh genom mengungkapkan 20 salinan lebih banyak dari sRNA ini, satu (Lpr0049) sebagian antisense terhadap lpg2142, yang mengkodekan ORF diduga. Struktur konsensus sRNA ini adalah loop batang panjang dengan dua tonjolan pusat terdiri dari dua jepit rambut kecil yang diekstrusi dari kedua sisi batang pusat 20 nt sebelum loop (Weissenmayer et al., 2011). Banyak dari urutan ini ditemukan di tempat lain Legionella strain juga, seringkali dalam konfigurasi yang sama, yang menunjukkan bahwa mereka dilestarikan secara evolusioner dan cenderung memainkan peran yang bermanfaat. Selain itu, baik sistem Lqs dan sekuens sRNA homolog tidak ada di L.longbeachae. Pengamatan ini hanya sugestif dan bukti eksperimental diperlukan untuk menghubungkan sistem penginderaan kuorum Lqs dengan kelompok sekuens sRNA homolog ini. Perlu dicatat bahwa penghapusan keempat sRNA QRr diperlukan untuk melihat fenotipe pada sistem penginderaan kuorum (Lenz et al., 2004). Karena hanya Lpr0001 dan Lpr0069 yang tampaknya diekspresikan pada level yang baik, mungkin informatif untuk menghasilkan double lpr0001/lpr0069 mutan dan memantau efeknya pada fenotipe terkait kepadatan populasi.

Meskipun sebagian besar sRNA pasangan basa tidak mengkodekan protein, setidaknya ada dua contoh di mana mereka melakukannya. Di dalam E. coli NS sgrS gen mengkodekan sRNA, SgrS, dan protein kecil, SgrT, yang bersama-sama mengatur penyerapan glukosa dengan strategi yang berbeda (Wadler dan Vanderpool, 2007). Di dalam S. aureus, sRNA RNA III menargetkan faktor virulensi dan berfungsi sebagai pengatur utama virulensi, tetapi juga mengkodekan 26 asam amino hemolisin (Boisset et al., 2007). Oleh karena itu, perlu diingat bahwa sRNA tidak selalu non-coding. Kami baru-baru ini mengidentifikasi dua molekul RNA kecil, LstA dan LstB yang diprediksi mengkode protein kecil dengan motif transmembran (Faucher et al., 2010). Karena protein kecil sulit diprediksi secara akurat dari sekuens genom, perburuan molekul RNA kecil juga memiliki manfaat potensial untuk mengisi celah anotasi genom dengan juga mengidentifikasi protein kecil yang diduga dan mengoreksi kesalahan dalam anotasi genom.


Karakterisasi genom mitokondria Diphyllobothrium latum (Cestoda: Pseudophyllidea) – implikasi untuk filogeni eucestodes

Urutan nukleotida lengkap dari genom mitokondria ditentukan untuk cacing pita ikan Diphyllobothrium latum. Genom ini panjangnya 13.608 bp dan mengkodekan 12 gen penyandi protein (tetapi tidak memiliki atp8 ), 22 gen RNA transfer (tRNA) dan 2 gen RNA ribosom (rRNA), sesuai dengan pelengkap gen yang sejauh ini ditemukan di mitokondria cacing pipih lainnya ( mt) DNA. Susunan gen cestode pseudophyllidean ini sama dengan 6 cestode cyclophyllidean yang dicirikan hingga saat ini, dengan hanya sedikit variasi dalam struktur di antara genom-genom lain ini, posisi relatif trnS2 dan trnL1 dialihkan di Hymenolepis diminuta . Analisis filogenetik dari rangkaian asam amino yang digabungkan untuk 12 gen penyandi protein dari semua mtDNA cestoda lengkap mengkonfirmasi penilaian taksonomi dan filogenetik sebelumnya, dengan D. latum menjadi takson saudara bagi cyclophyllideans. Dukungan nodal yang tinggi dan kesesuaian filogenetik antara metode yang berbeda menunjukkan bahwa genom mt mungkin berguna dalam menyelesaikan hubungan ordinal dalam cestoda. Semua spesies Diphyllobothrium menginfeksi vertebrata pemakan ikan, dan D. latum umumnya menginfeksi manusia melalui konsumsi ikan mentah, kurang dimasak atau diasamkan. Genom mitokondria lengkap menyediakan banyak penanda genetik yang dapat berguna untuk mengidentifikasi tahapan siklus hidup yang berbeda dan untuk menyelidiki genetika populasi, ekologi, dan epidemiologinya.


C. RNA Kecil: miRNA dan siRNA pada Eukariota

RNA mikro (miRNA) dan RNA pengganggu kecil (siRNA) ditemukan di C. elegan, nematoda kecil (cacing gelang) yang dengan cepat menjadi model untuk studi biologi dan perkembangan sel dan molekuler. Atraksi tertentu C. elegan apakah (a) genomnya memiliki

21.700 gen, sebanding dengan

25.000 gen dalam genom manusia! (b) ia menggunakan produk dari gen-gen ini untuk menghasilkan cacing dewasa yang terdiri dari hanya 1031 sel yang diorganisasikan ke dalam semua organ utama yang ditemukan pada organisme yang lebih tinggi (c) Dimungkinkan untuk melacak asal-usul embrio dari setiap sel dalam tubuhnya! C. elegan diilustrasikan di bawah ini.

1. RNA Pengganggu Kecil (siRNA)

siRNA pertama kali ditemukan pada tumbuhan dan juga pada C. elegan. Namun, siRNA (dan miRNA) umum terjadi pada banyak organisme tingkat tinggi. siRNA dinamakan demikian karena mereka mengganggu dengan fungsi RNA lain yang asing bagi sel atau organisme. Aksi mereka dijuluki gangguan RNA (RNAi). Untuk penemuan siRNA mereka, A. Z. Fire dan C. C. Mello berbagi Hadiah Nobel 2006 dalam Fisiologi atau Kedokteran. Tindakan siRNA yang menargetkan DNA asing diilustrasikan di bawah ini.

Ketika sel mengenali RNA untai ganda asing (misalnya, beberapa genom RNA virus) sebagai alien, PEMAIN DADU A nuklease disebut menghidrolisis mereka. Produk hidrolisis untai ganda pendek yang dihasilkan ( siRNA) gabungkan dengan Rtidak Sayatergoda Smencela Ckompleks, atau RISC protein. NS antisense untai siRNA dalam hasil siRNA-RISC kompleks mengikat ke daerah pelengkap RNA asing, menargetkan mereka untuk degradasi. Penggunaan RISC seluler untuk mengontrol ekspresi gen dengan cara ini mungkin berasal dari penggunaan protein RISC oleh miRNA sebagai bagian dari mekanisme pertahanan seluler, yang akan dibahas selanjutnya.

SiRNA yang dirancang khusus telah digunakan untuk menonaktifkan ekspresi gen tertentu untuk mempelajari fungsinya in vivo dan in vitro. Baik siRNA dan miRNA sedang diselidiki sebagai alat terapi yang mungkin untuk mengganggu RNA yang ekspresinya mengarah pada kanker atau penyakit lain.

Sebagai contoh, lihat video Youtube tentang hasil eksperimen RNAi yang tidak terduga di tautan ini. Dalam percobaan yang dijelaskan, RNAi digunakan untuk memblokir ekspresi embrionik dari ortodontik (odt) gen yang biasanya diperlukan untuk pertumbuhan tanduk kumbang kotoran. Efek dari ini mutasi gugur seperti yang diharapkan, untuk mencegah pertumbuhan tanduk. Namun, yang tidak terduga adalah perkembangan mata di tengah kepala kumbang ("mata ketiga" dalam mikrograf).

Mata ke-3 tidak hanya terlihat seperti mata, tetapi juga fungsional. Hal ini ditunjukkan dengan mencegah perkembangan mata normal di odt-mutan KO. Mata ke-3 muncul&hellip, dan responsif terhadap cahaya! Perlu diingat bahwa ini adalah kumbang dengan mata ke-3, bukan Drosophila! Mengutip Justin Kumar dari Indiana University, yang meskipun tidak terlibat dalam penelitian ini, menyatakan bahwa &ldquo&pelajaran yang didapat dari Drosophila mungkin tidak dapat diterapkan secara umum seperti yang saya atau Drosophilists lainnya, ingin percayai &hellip Kemampuan untuk menggunakan RNAi dalam sistem model non-tradisional adalah kemajuan besar yang mungkin akan mengarah pada pandangan pembangunan yang lebih seimbang.&rdquo

2. RNA Mikro (miRNA)

miRNA menargetkan yang tidak diinginkan endogen RNA seluler untuk degradasi. Mereka ditranskripsi dari gen yang sekarang diketahui didistribusikan secara luas pada eukariota. Jalur dari transkripsi pra-miRNA melalui pemrosesan dan degradasi mRNA target diilustrasikan pada halaman berikutnya.

Saat ditranskripsi, pra-miRNA terlipat menjadi struktur loop batang yang hilang selama pemrosesan sitoplasma. Seperti SiRNA, miRNA matang bergabung dengan protein RISC. NS RISC kompleks protein-miRNA menargetkan mRNA lama atau yang tidak lagi dibutuhkan atau mRNA yang rusak selama transkripsi.

Diperkirakan 250 miRNA pada manusia mungkin cukup untuk mengikat H ke beragam RNA target, hanya target dengan komplementaritas yang kuat dengan kompleks protein-miRNA RISC yang akan terdegradasi.


Metode

Untuk mencari sekuens intergenik yang dilestarikan, NCBI/BLAST BLAST Rakit Genom http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi[56] dan BLAST dengan genom mikroba http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sutils/genom_table.cgi[57] digunakan. Ledakan dengan genom mikroba menggunakan nilai 10 untuk ekspektasi dan filter default. Pencarian ledakan nukleotida dioptimalkan untuk megablas sekuens yang sangat mirip dan megablas yang tidak berdekatan. Parameter default digunakan. Untuk megablast sekuens serupa, parameternya adalah: sekuens target maksimum, 100 secara otomatis disesuaikan untuk ekspektasi sekuens pendek, 10 ukuran kata, 28. Skor kecocokan/ketidakcocokan terputus-putus, biaya kesenjangan 1,-2, filter linier, wilayah dengan kompleksitas rendah. Megablas terputus-putus: parameter yang sama dengan megablas urutan serupa dengan pengecualian ukuran kata, 11 skor kecocokan/ketidakcocokan, 2, biaya celah -3, keberadaan: 5 ekstensi: 2.

Swiss Institute of Bioinformatics SIB ExPASy Blast server [46] digunakan untuk menemukan homologi protein. Program ledakan dan basis data yang digunakan adalah: blastp – kueri terhadap Basis Pengetahuan UniProt (Swiss-Prot + TrEMBL) dan parameter default seperti yang ditunjukkan di bawah "Opsi" digunakan. Database adalah database yang lengkap.

Pencarian awal untuk urutan berulang dan motif RNA dilakukan dengan urutan intergenik "berjalan" dari plasmid lp28 dari B. afzelii Pko. Selain itu, beberapa daerah yang mengandung sekuens intergenik yang relatif besar dari B. burgdorferi B31 dan Borrelia garinii PB plasmid juga dipindai.

Daerah intergenik dipindai pada 200 bp sekaligus untuk urutan yang dilestarikan atau sebagian. Urutan ini kemudian dimodelkan untuk loop batang RNA yang dilestarikan. Pemotong di daerah 5' dan 3' dari loop batang yang ditentukan dibuat ketika urutan tambahan gagal menyediakan loop batang yang dilestarikan. Urutan transkrip terbalik serta urutan yang tumpang tindih di persimpangan 200 bp juga dimodelkan secara struktur. Urutan berulang ditemukan yang menampilkan struktur batang-loop, tetapi struktur ini juga tidak ditemukan dilestarikan dalam urutan homolog di tempat lain. Borrelia spesies, atau identitas urutan nt terlalu tinggi dan dengan demikian struktur tidak menunjukkan perubahan pasangan basa. Ini dibuang. Kriteria identifikasi RNA potensial adalah sebagai berikut: 1) adanya sekuens pada tiga atau lebih daerah plasmid yang berbeda dan/atau dua atau lebih Borrelia spesies, 2) adanya lingkar batang yang terkonservasi dengan setidaknya 9 pasangan basa yang berdekatan, 3) dua atau lebih perubahan basa kompensasi yang mempertahankan batang, 4) dalam beberapa kasus, keberadaan lingkar keluar atau posisi menonjol yang lestari.

Pemodelan struktur sekunder RNA dari urutan nt berulang dilakukan dengan Zuker dan Turner mfold, versi 3.2 [28, 29]. Parameter yang digunakan adalah: parameter jendela default, ukuran loop interior/tonjolan maksimum = 30, Asimetri maksimum loop interior/tonjolan = 30, dan tidak ada batasan jarak maksimum antara basis berpasangan.


Tonton videonya: Jenis jenis Virus DNA atau RNA (Februari 2023).