Informasi

Sebuah pertanyaan terkait dengan analisis qPCR

Sebuah pertanyaan terkait dengan analisis qPCR


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Inilah masalahnya. Saya menggunakan metode, yang disebut TU-Tagging, untuk mengisolasi RNA spesifik tipe sel. Anda dapat menemukan lebih banyak tentang metode ini di sini: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2783170/

Untuk menjelaskannya secara singkat, ada enzim yang disebut UPRT (Uracil Phosphoribosyltransferase) yang diekspresikan dalam Toksoplasma gondii. Dalam keadaan normal UPRT membuat UMP dari urasil sel inang dan UMP ini tergabung dalam RNA. Namun, mereka menemukan bahwa enzim ini tidak dapat membedakan urasil dan analog urasil 4-Tiourasil (Pada dasarnya memiliki tio pada posisi ke-4 urasil). Jadi, ketika 4-TU disediakan secara eksternal, UPRT menggabungkan 4-TU ke dalam RNA dan Anda mendapatkan tio-RNA. Kemudian dengan biotinilasi dasar dan isolasi streptaividin Anda bisa mendapatkan tio-RNA dari total isolat RNA Anda. (Tentu saja UPRT harus dimasukkan ke jenis sel tertentu yang Anda minati)

Bagaimanapun, setelah penjelasan (mungkin itu tidak perlu) inilah pertanyaan saya.

Setelah saya mengisolasi apa yang disebut RNA spesifik saya, saya memeriksa kemurniannya dengan qPCR menggunakan penanda spesifik tipe sel. Saya tidak memiliki gen referensi. Satu-satunya hal yang saya minati adalah ada atau tidaknya penanda (dan juga perubahan lipatan tentu saja). Sekarang, saya memiliki beberapa data tetapi saya tidak tahu bagaimana menyajikannya (Tidak ada seorang pun di lab saya yang berpengalaman dengan qPCR dan pengalaman saya sangat terbatas).

Apakah Anda punya ide bagaimana saya bisa mengatasi masalah ini? Saya melihat ke dalam beberapa perhitungan tetapi kebanyakan dari mereka diperlukan untuk gen referensi atau beberapa hal lainnya. Satu-satunya hal yang saya miliki adalah nomor siklus dan efisiensi primer saya. Apakah Anda pikir saya dapat melakukan sesuatu dengan masukan ini? (Saya tahu bahwa nomor siklus tidak berarti apa-apa dalam sebuah plot, jadi saya tidak ingin menempatkan nomor siklus pada dasarnya.)

Terima kasih telah membacanya. Setiap bantuan/ide akan sangat dihargai. Saya sangat putus asa. Terima kasih.


Oke, mari kita mulai dari awal. Kita tahu apa yang membuat satu jenis sel berbeda dari jenis sel lain adalah ekspresinya - yaitu gen apa yang sebenarnya sedang ditranskripsi menjadi RNA. Oleh karena itu, harus ada RNA tertentu dalam satu jenis sel yang tidak boleh keluar di jenis sel lain. Jika Anda mengisolasi RNA dari jenis sel tertentu, katakanlah sebuah neuron dan Anda ingin menunjukkan bahwa sampel RNA Anda hanya berisi RNA neuronal, maka Anda harus membuktikan 2 hal:

  1. Bahwa sampel Anda mengandung urutan RNA tertentu yang diketahui berada di neuron
  2. Bahwa sampel Anda TIDAK mengandung urutan RNA tertentu yang diketahui TIDAK berada di neuron

Ada beberapa prosedur laboratorium untuk mengidentifikasi ada/tidaknya urutan RNA tertentu dalam sampel, teknik yang Anda pilih adalah qPCR. Berikut adalah penjelasan singkat tentang cara kerja qPCR.

Anda memasukkan sampel RNA Anda bersama dengan primer spesifik urutan di mesin qPCR. Primer akan mengikat urutan tertentu dan kemudian untai itu akan direplikasi. Ini akan terus berulang, siklus demi siklus. Jadi jika Anda mulai dengan 1 urutan katakanlah urutanA, setelah siklus 1, Anda akan berakhir dengan 2, lalu 4, lalu 8 dan seterusnya.

Bagaimanapun, jika tujuan Anda adalah menggunakan qPCR untuk membuktikan sampel RNA Anda berasal dari neuron, maka Anda harus menemukan beberapa urutan yang diketahui spesifik untuk neuron. Kemudian temukan primer untuk urutan ini. Kemudian gunakan primer ini untuk memperkuat beberapa RNA dari sampel Anda. Jika Anda mendapatkan amplifikasi, maka Anda harus memiliki urutan itu dalam sampel RNA Anda. Untuk lebih mendukung diri Anda sendiri, Anda mungkin juga ingin mencari beberapa urutan yang diketahui TIDAK diekspresikan dalam neuron dan menggunakan prinsip yang sama membuktikan bahwa urutan ini TIDAK dalam sampel Anda.

Di atas akan memberi Anda data kualitatif, itu hanya akan memberi tahu Anda jika urutan tertentu keluar atau tidak ada dalam sampel RNA Anda. Karena Anda hanya tertarik pada ada atau tidaknya penanda, ini sudah cukup. Namun, jika Anda ingin mengukur data Anda, yaitu mencari tahu berapa banyak urutan tertentu yang diekspresikan, baca terus.

Anda juga bisa mendapatkan data kuantitatif dari qPCR (setelah semua qPCR adalah singkatan dari PCR kuantitatif). Jumlah salinan urutan RNA setelah sejumlah siklus tertentu sebanding dengan jumlah salinan awal urutan itu dalam sampel Anda. Dengan kata lain, jika sampel RNA awal Anda memiliki banyak urutanA dan sedikit urutanB, maka pada setiap siklus, Anda akan melihat lebih banyak urutanA.

Kita bisa memanfaatkan hubungan ini. Ada dua metode umum yang dapat Anda gunakan untuk mengukur hasil Anda. Salah satunya disebut kuantifikasi absolut dan kuantifikasi relatif lainnya.

Gagasan di balik kuantifikasi absolut adalah Anda menjalankan dua qPCR. Dalam satu, Anda melakukan sampel RNA Anda. Di bagian kedua, Anda menjalankan sampel standar, di mana kurva standar tersedia. Anda kemudian dapat membandingkan hasil sampel RNA Anda dengan hasil standar untuk mendapatkan gambaran tentang jumlah salinan dalam sampel Anda.

Gagasan di balik kuantifikasi relatif adalah Anda membandingkan hasil qPCR untuk urutan yang Anda minati dengan hasil qPCR dari gen referensi. Ini hanya akan memberi Anda gambaran tentang berapa kali lebih banyak atau lebih sedikit urutan minat Anda jika diekspresikan daripada gen referensi. Karena Anda tidak memiliki gen referensi, Anda tidak dapat menggunakan metode ini, tetapi Anda dapat menggunakan metode kuantifikasi absolut yang dijelaskan dalam paragraf di atas!

Berikut adalah tautan yang sangat berguna untuk mengukur menggunakan qPCR: http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction#Quantification_of_gene_expression

http://relative.gene-quantification.info/

Beri tahu saya jika Anda memerlukan klarifikasi lebih lanjut.


Kami mengembangkan paket R untuk menerapkan metode penilaian kualitas, analisis, dan pengujian data qPCR untuk signifikansi statistik. Delta Ganda CT dan model kurva standar diterapkan untuk mengukur ekspresi relatif gen target dari CT dalam eksperimen kelompok kontrol qPCR standar. Selain itu, perhitungan efisiensi amplifikasi dan kurva dari percobaan qPCR pengenceran serial digunakan untuk menilai kualitas data. Akhirnya, pengujian dua kelompok dan model linier digunakan untuk menguji signifikansi perbedaan dalam kelompok kontrol ekspresi dan kondisi yang diinginkan.

Menggunakan dua kumpulan data dari eksperimen qPCR, kami menerapkan penilaian kualitas, analisis, dan pengujian statistik yang berbeda dalam paket pcr dan membandingkan hasilnya dengan artikel asli yang diterbitkan. Nilai ekspresi relatif akhir dari model yang berbeda, serta keluaran perantara, diperiksa terhadap hasil yang diharapkan dalam makalah asli dan ternyata akurat dan dapat diandalkan.


Abstrak

Metode umum untuk menghitung hasil dari percobaan qPCR adalah perbandingan Ct metode, juga disebut metode 2 -ΔΔCt. Namun, beberapa asumsi dimasukkan dalam metode 2 -ΔΔCt dan analisis statistik standar tidak dapat diterapkan secara langsung. Di sini, kami menjelaskan metode yang berbeda, X0 metode, untuk perhitungan hasil dan analisis statistik dari percobaan qPCR. X0 metode berbeda dari metode 2 -ΔΔCt dengan memperkenalkan konversi nilai Ct yang terkait secara eksponensial menjadi X yang terkait linier0 nilai, yang mewakili jumlah bahan awal dalam percobaan qPCR. Hasil dihitung dengan X0 metode diilustrasikan untuk percobaan qPCR dengan ulangan teknis dan biologis, termasuk prosedur untuk menghitung deviasi standar. Penggabungan efisiensi primer dalam perhitungan oleh X0 metode juga dijelaskan. Secara keseluruhan, X0 Metode ini merupakan alternatif yang sangat sederhana dan akurat untuk metode 2 -ΔΔCt untuk perhitungan hasil dari data qPCR.


Peran abadi terlihat untuk qPCR

Bahkan saat dPCR berkembang, pemasok percaya bahwa qPCR akan tetap menjadi teknologi pekerja keras dalam penelitian biologi molekuler.

Mengapa? Pertama, qPCR telah mapan sebagai teknologi yang kredibel dan mumpuni serta diandalkan oleh para peneliti untuk kecepatan, sensitivitas, spesifisitas, dan kemudahan penggunaannya. Ini paling berguna untuk eksperimen ekspresi gen relatif dan sebagai alat validasi yang mendukung metode genomik lainnya termasuk microarray DNA dan aplikasi pengurutan generasi berikutnya (NGS). Juga, karena qPCR telah ada sejak 1993, sebagian besar peneliti memiliki akses mudah ke teknologi dan banyak literatur yang tersedia untuk referensi.

Para peneliti dapat mengambil dari data historis mereka sendiri ketika merancang dan menafsirkan eksperimen mereka dalam analisis ekspresi gen, genotipe, deteksi patogen, kuantifikasi virus, analisis metilasi DNA dan analisis peleburan resolusi tinggi, antara lain.

Seperti namanya, PCR real-time mengukur amplifikasi PCR saat terjadi. Sifat relatif qPCR, yang menghitung konsentrasi target atau kelimpahan relatif dengan membandingkannya dengan konsentrasi atau kontrol yang diketahui, membuat metode ini sangat cocok untuk analisis ekspresi gen. Saat menggunakan qPCR, seperti yang umum dengan banyak alat biologis lainnya, perubahan hasil ekspresi target paling berarti jika dibandingkan dengan kondisi eksperimental yang berbeda, seperti jaringan yang sakit versus jaringan yang sehat.

Tes qPCR yang dirancang dengan baik dapat mendeteksi beberapa hingga jutaan salinan urutan target per reaksi sehingga memberikan rentang dinamis yang cukup besar. Sangat cocok untuk penyaringan atau eksperimen validasi hilir dengan kemampuannya untuk mendeteksi target dengan jumlah salinan yang sangat rendah dan sangat tinggi dalam proses yang sama.

Saat menggunakan qPCR, peneliti dapat memilih kimia pendeteksiannya. Mereka dapat memilih dari pewarna interkalasi yang murah (seperti SYBR green) hingga berbagai probe spesifik target (TaqMan, beacon molekuler, dll). Harga per sampel sangat fleksibel karena pengguna dapat dengan mudah mengubah volume reaksi, throughput, dan metode deteksi untuk memenuhi kebutuhan eksperimental.


Replikasi & Propagasi Kesalahan

Satu tempat di mana sejumlah kesalahan tampaknya merayap adalah perawatan ulangan dalam eksperimen PCR.

Kesalahan yang paling sering saya lihat adalah penggunaan jenis mean yang salah saat menghitung rasio rata-rata. Fakta kunci untuk diingat adalah untuk selalu menggunakan rata-rata aritmatika pada apa pun pada skala linier dan selalu menggunakan rata-rata geometrik pada apa pun pada skala eksponensial.

Lebih ringkasnya, jika nilai CT (atau perbedaannya), maka gunakan mean aritmatika. Jika itu adalah nilai konsentrasi (apa pun yang $$Efisiensi^$$) lalu gunakan mean geometrik.

Saya juga sering menemukan perlakuan yang salah terhadap bilah kesalahan. Seringkali orang akan mengambil simpangan baku (atau kesalahan standar) dari data konsentrasi, atau rasio, dan menggambarkannya secara langsung dalam diagram batang mereka. Namun, metrik ini mengasumsikan data terdistribusi normal yang hanya berlaku untuk nilai CT itu sendiri, bukan rasio atau konsentrasi. Secara singkat, jika sumbu y Anda pada bagan Anda adalah skala linier dan bilah kesalahan Anda sama di kedua sisi, maka ini salah.

Akhirnya kita harus berurusan dengan propagasi kesalahan. Kesalahan dalam eksperimen Anda terdiri dari kesalahan $$(Treated,Ref) + (Untreated,Target) + (Treated,Ref) + (Treated,Target)$$. Kesalahan ini biasanya akan lebih dari kesalahan yang tersirat dengan mengambil kesalahan standar nilai CT untuk setiap ulangan. Namun, untuk variabel yang tidak berkorelasi, kita dapat menyebarkan kesalahan aditif menggunakan rumus:

Ini bekerja dengan baik untuk delta delta CT karena kesalahan hanyalah produk dari beberapa kesalahan aditif. Namun, untuk pendekatan kurva standar, kami juga memiliki kesalahan dari nilai Efisiensi yang kami hitung untuk kurva kami dan ini tidak dapat dinyatakan sebagai faktor aditif.

Sebaliknya kita perlu menggunakan deret Taylor untuk menyebarkan kesalahan. Ini memungkinkan keenam sumber varians (4x CTs + 2x Efisiensi) untuk dimasukkan dalam perhitungan kesalahan akhir.


Normalisasi

Normalisasi data bertujuan untuk mengatasi beberapa kekurangan yang tercantum di atas, dan ada banyak pendekatan berbeda, dengan yang baru selalu diusulkan. Normalisasi ke total massa atau volume sampel adalah pendekatan warisan yang tersisa dari teknik blotting utara ketika pemuatan gel dan transfer sampel ke kertas saring divalidasi dengan menyelidiki rRNA atau yang disebut gen rumah tangga seperti GAPDH, yang ekspresinya diasumsikan stabil antara individu , kondisi eksperimental atau keadaan fisiologis. Sementara masih digunakan untuk pengukuran RT-qPCR, ada beberapa kelemahan dalam mengukur tingkat mRNA atau miRNA relatif terhadap massa atau volume sampel. Misalnya, dalam perbandingan sampel dari asal yang berbeda mis. biopsi tumor dan jaringan normal adalah tidak benar untuk mengasumsikan bahwa massa jaringan yang sama mengandung jumlah sel yang sama, atau bahwa distribusi relatif dari sel-sel yang berproliferasi adalah sama. Normalisasi terhadap RNA total akan meremehkan ekspresi gen target dalam biopsi tumor. Pendekatan ini mungkin lebih cocok ketika sampel diekstraksi menggunakan laser menangkap mikro diseksi dan jumlah yang tepat dan sel-sel yang sama ditargetkan meskipun pendekatan ini tidak ideal. Teknik terkait, sekali lagi mengingatkan pada blotting utara, adalah untuk menormalkan konsentrasi DNA atau RNA. Sementara mengukur jumlah salinan gen relatif terhadap konsentrasi DNA masukan adalah pendekatan yang benar-benar valid, situasinya lebih rumit untuk kuantifikasi transkrip. Ketika konsentrasi RNA ditentukan, sebagian besar komponen RNA adalah RNA ribosom (rRNA). Transkripsi rRNA tidak tergantung pada transkripsi messenger RNA (mRNA) karena ditranskripsi oleh enzim yang berbeda. Selanjutnya sebagai rRNA membentuk

80% dari fraksi RNA, normalisasi ke rRNA akan menutupi perubahan halus dalam komponen mRNA yang biasanya terdiri dari 2-5%. Selain itu, pendekatan ini tidak memperhitungkan variasi dalam kualitas RNA templat, atau perubahan level rRNA yang bergantung pada status diferensiasi/proliferasi seluler. Meskipun demikian, meskipun tidak ideal, mungkin ada situasi di mana tidak ada alternatif lain selain mengukur relatif terhadap total RNA dan beberapa paket analisis seperti perangkat lunak GenEx dari MultiD6 memungkinkan konsentrasi RNA total dievaluasi sebagai teknik normalisasi bersama dengan pendekatan lain. Salah satu solusi teoretis adalah memurnikan mRNA dan menormalkan terhadap total mRNA. Sayangnya proses pemurnian menimbulkan ketidakakuratan dan langkah pemrosesan tambahan yang tidak diinginkan dan dalam banyak kasus biopsi terlalu kecil untuk memungkinkan pemurnian re mRNA yang efisien. Pendekatan yang sangat umum untuk mengoreksi perbedaan sampel adalah dengan mengekspresikan konsentrasi target relatif terhadap gen referensi internal tunggal. Agar pendekatan ini valid, ekspresi gen referensi tunggal harus tetap konstan di antara semua sampel eksperimental. Untuk menemukan target yang nyaman seperti itu, validasi tambahan diperlukan, namun bahkan saat ini pendekatan yang terlalu umum dan salah arah adalah memilih gen ini secara acak tanpa validasi GAPDH, b aktin dan 18S adalah favorit tertentu dalam literatur yang diterbitkan, biasanya digunakan tanpa validasi atau pembenaran. . Ketika gen referensi tidak diekspresikan secara stabil di antara semua sampel, rasio gen target yang diinginkan dengan gen referensi akan mencerminkan perubahan ekspresi kedua target. Ini tidak membantu ketika perilaku ekspresi dari kedua target tidak ditentukan dan dapat menyebabkan ketidakakuratan dan hasil yang salah7. Amandemen terhadap pendekatan ini adalah untuk memvalidasi gen referensi yang dipilih8 atau memilih gen referensi yang signifikan dengan biologi yang ditentukan di mana respons transkripsi dicirikan dengan baik (suatu pendekatan yang disebut sebagai normalisasi ke Referensi Internal Spesifik, atau SIR). Dengan cara ini biologi gen target diekspresikan relatif terhadap perubahan biologi gen referensi. Masalah dengan menggunakan pendekatan gen referensi tunggal ini adalah bahwa resolusi mereka (pengukuran percaya diri minimum) terbatas pada kesalahan minimum teknik.

Pendekatan alternatif, yang merupakan standar emas saat ini, adalah untuk mengekspresikan data relatif terhadap perilaku beberapa gen referensi dan menggunakan rata-rata geometrik untuk mengukur dan mengontrol tren yang diinduksi kesalahan dalam ekspresi gen referensi relatif. Ada berbagai pendekatan seperti yang ditawarkan oleh geNorm atau Normfinder10,11 yang memungkinkan jumlah gen referensi potensial untuk dibandingkan dalam kelompok sampel eksperimen dan kontrol yang dipilih. Ini menggunakan variasi gabungan dari beberapa gen untuk menghasilkan faktor referensi yang stabil untuk normalisasi. Namun, persyaratan untuk pengukuran transkrip referensi ganda, meskipun sangat akurat dan berpotensi memberikan resolusi 0,5 kali lipat12, membebani waktu, sampel, dan sumber daya. Selanjutnya, penggunaan gen referensi tunggal, SIR atau gen referensi ganda memerlukan validasi yang tepat. Perkembangan terbaru menunjukkan solusi yang mungkin untuk teka-teki ini. Metode ini menormalkan ekspresi gen target yang diinginkan ke beberapa ratus transkrip berbeda dengan menargetkan ALU Repeats (EARs) yang diekspresikan tertanam dalam sistem primata atau B-Element Expressed Repeats (dalam model tikus). Ini menghindari masalah yang terkait dengan bias apa pun yang disebabkan oleh penggunaan segelintir gen, memungkinkan normalisasi yang tidak lagi bergantung pada jaringan atau pengobatan dan menjanjikan peningkatan transparansi dan reproduktifitas data. Pendekatan serupa dapat digunakan untuk normalisasi ekspresi microRNA, di mana nilai ekspresi rata-rata dari semua miRNA yang diekspresikan dalam sampel tertentu digunakan sebagai faktor normalisasi untuk data PCR kuantitatif real-time microRNA dan terbukti mengungguli strategi normalisasi saat ini dalam hal pengurangan variasi teknis yang lebih baik dan apresiasi yang lebih akurat dari perubahan biologis13.


LinRegPCR dan Factor-qPCR

LinRegPCR dikembangkan oleh Dr Jan Ruijter, seorang peneliti utama di departemen Anatomi, Embriologi dan Fisiologi (Pusat Medis Akademik, Amsterdam, Belanda). Analisis statistik dari data penelitiannya sendiri mengarah pada pengembangan program yang banyak digunakan ini yang disebut LinRegPCR

LinRegPCR adalah program untuk analisis data PCR kuantitatif (qPCR) berdasarkan nilai efisiensi PCR yang berasal dari kurva amplifikasi. Program mengimpor data yang dikoreksi non-baseline, melakukan koreksi baseline pada setiap sampel secara terpisah, menentukan window-of-linearity dan kemudian menggunakan analisis regresi linier untuk menentukan efisiensi PCR per sampel dari kemiringan garis regresi. Efisiensi PCR rata-rata per amplikon dihitung. Ambang fluoresensi kemudian diatur untuk menentukan nilai Cq. Efisiensi PCR rata-rata per amplikon dan nilai Cq per sampel kemudian digunakan untuk menghitung konsentrasi awal per sampel, yang dinyatakan dalam unit fluoresensi arbitrer.

Klik di sini untuk mengunduh program LinRegPCR GRATIS Anda

    Kinetika peningkatan fluoresen dari reporter fluoresen berbeda yang digunakan untuk qPCR bergantung pada pemantauan kimia, urutan target, jenis input DNA, dan efisiensi PCR. Microchimica Acta 2014 (DOI 10.1007/s00604-013-1155-8) Evaluasi metode analisis kurva qPCR untuk penemuan biomarker yang andal: bias, resolusi, presisi, dan implikasi. Metode 59: 32-46, 2013 . Bias pada nilai Cq yang diamati dengan PCR kuantitatif berbasis probe hidrolisis dapat dikoreksi dengan perkiraan nilai efisiensi PCR. Metode 50: 313-322, 2010 Efisiensi amplifikasi: menghubungkan baseline dan bias dalam analisis data PCR kuantitatif. Penelitian Asam Nukleat 37: e45, 2009 Signifikansi statistik PCR kuantitatif. BMC Bioinformatics 8: 131, 2007 Kuantifikasi relatif mRNA: perbandingan metode yang saat ini digunakan untuk analisis data PCR waktu nyata. BMC Mol Biol 8:113, 2007 Analisis data kuantitatif real-time PCR tanpa asumsi. Neurosci Letters 339: 62-66, 2003

Faktor-qPCR

Dr Jan Ruijter baru-baru ini mengembangkan program lain yang disebut Factor-qPCR. Program ini menghilangkan “multiplicative between-run variasi” yang terjadi ketika eksperimen PCR kuantitatif mencakup banyak pelat untuk mengakomodasi semua sampel, target, dan ulangan. Replikasi berjalan ini menunjukkan perbedaan proporsional yang sama antara kondisi eksperimental, tetapi nilai absolut yang berbeda, meskipun pengukuran mungkin dilakukan dalam keadaan yang sama. Dalam kebanyakan kasus, variasi antar sesi bersifat multiplikatif dan oleh karena itu, dapat dihilangkan dengan pembagian data di setiap sesi dengan faktor koreksi khusus sesi.

Klik di sini untuk mengunduh program Factor-qPCR GRATIS Anda

    Penghapusan variasi antar-lari dalam percobaan qPCR multi-pelat. Deteksi dan Kuantifikasi Biomolekuler In Press, 2015. Koreksi faktor sebagai alat untuk menghilangkan variasi antar-sesi dalam eksperimen ulangan: aplikasi pada biologi molekuler dan retrovirologi. Retrovirologi 3:2, 2006. RDML: bahasa terstruktur dan pedoman pelaporan untuk data PCR kuantitatif waktu nyata. RDML-Ninja dan RDMLdb untuk pertukaran standar data qPCR.

Produk Terkait

Memperkenalkan “ mikrofon ” qPCR Cycler pribadi Anda

Yang CEPAT, AKURAT, KOMPAK dan SKALA.

Ini adalah instrumen qPCR PERTAMA yang mengikuti prinsip LinRegPCR untuk analisis data qPCR-nya.

Dan Dirancang dan Diproduksi oleh Bio Molecular System, sebuah perusahaan Australia yang didirikan oleh inovator terkemuka dari perusahaan sebelumnya Corbett Research Life Sciences.


Abstrak

Real-time kuantitatif polymerase-chain-reaction (qPCR) adalah teknik standar di sebagian besar laboratorium yang digunakan untuk berbagai aplikasi dalam penelitian dasar. Analisis data qPCR adalah bagian penting dari keseluruhan eksperimen, yang telah mengarah pada pengembangan sejumlah besar metode. Alat yang dirilis mencakup bagian tertentu dari alur kerja atau memberikan solusi analisis lengkap.

Di sini, kami mensurvei 27 paket perangkat lunak akses terbuka dan alat untuk analisis data qPCR. Survei ini mencakup 8 Microsoft Windows, 5 berbasis web, 9 berbasis R dan 5 alat dari platform lain. Paket dan alat yang ditinjau mendukung analisis berbagai aplikasi qPCR, seperti kuantifikasi RNA, metilasi DNA, genotipe, identifikasi variasi nomor salinan, dan PCR digital. Kami melaporkan ikhtisar fungsionalitas, fitur, dan persyaratan khusus dari masing-masing perangkat lunak, seperti format pertukaran data, ketersediaan antarmuka pengguna grafis, prosedur yang disertakan untuk penyajian data grafis, dan metode statistik yang ditawarkan. Selain itu, kami memberikan gambaran tentang strategi kuantifikasi, dan melaporkan berbagai aplikasi qPCR.

Survei komprehensif kami menunjukkan bahwa sebagian besar alat menggunakan format file mereka sendiri dan hanya sebagian kecil dari alat yang ada saat ini mendukung format pertukaran data standar RDML. Untuk memungkinkan analisis data qPCR yang lebih ramping dan sebanding, lebih banyak vendor dan alat perlu menyesuaikan format standar untuk mendorong pertukaran data antara perangkat lunak instrumen, alat analisis, dan peneliti.


Pertanyaan terkait analisis qPCR - Biologi

  • Pathway Focused - Profil ekspresi panel gen terpilih yang relevan dengan jalur atau keadaan penyakit.
  • Sederhana dan Akurat - Metode PCR real-time sederhana memberikan keunggulan qRT-PCR = sensitivitas tinggi dan rentang kuantifikasi dinamis yang lebih luas.
  • Kuantitatif -Jika diterapkan dengan benar, itu sepenuhnya kuantitatif dan menunjukkan reproduktifitas yang baik.
  • Dirancang untuk aplikasi troughput tinggi dan penggunaan rutin - Menghadirkan profil ekspresi ke hampir semua lab dengan instrumen PCR real-time berbasis blok.
  • Sensitivitas - Dengan sensitivitas hingga 1 ng per pengaturan reaksi atau 5 g total RNA per seluruh pelat larik memberikan lebih dari 80 persen tingkat panggilan saat ini (dinyatakan oleh produsen).
  • Reproduksibilitas - Reproduksibilitas sistem yang tinggi, dengan koefisien korelasi replika r > 0.99 , berarti bahwa sampel eksperimental dapat dibandingkan secara andal di seluruh pelat susunan dan dalam beberapa kali proses.
  • Spesifisitas - Kekhususan sistem, yang diberikan oleh kombinasi primer SYBR Green atau campuran Probe dan campuran master PCR, menjamin satu produk dengan ukuran yang diprediksi dari setiap reaksi tanpa produk sekunder seperti dimer primer.
  • Beberapa gen referensi untuk normalisasi nanti melalui gen referensi yang divalidasi (lihat Genorm atau Normfinder)
  • Kontrol untuk kontaminasi DNA genom = Kontrol pembawa DNA
  • Kontrol transkripsi terbalik = kontrol RT
  • kontrol PCR positif

makalah aplikasi array qPCR

PCR perbatasan berikutnya PCR
Pekerja keras biologi molekuler modern sedang maju menggunakan metode konvensional dan digital untuk mengeksplorasi sel tunggal dan bahkan molekul tunggal.
Nathan Blow melaporkan.
METODE ALAM VOL 4 (10) 2007: 869

Reproduksibilitas array RT-PCR kuantitatif dalam profil ekspresi miRNA dan perbandingan dengan analisis microarray.
Chen Y, Gelfond JA, McManus LM, Shireman PK.
Departemen Bedah, Pusat Ilmu Kesehatan Universitas Texas, San Antonio, TX 78229, AS
Genomik BMC. 2009 Agustus 2810: 407.

Fenotip Molekul yang Disesuaikan dengan Ekspresi Gen Kuantitatif dan Analisis Pengenalan Pola
Shreeram Akilesh, Daniel J. Shaffer, dan Derry Roopenian
Res. Genom 2003 13(7): 1719-1727
Laboratorium Jackson, Bar Harbor, Maine 04609, AS

Array PCR Real-Time untuk Identifikasi Hirarki Isolat Francisella
Kerstin Svensson1,2, Malin Granberg1, Linda Karlsson1, Vera Neubauerova3, Mats Forsman1, Anders Johansson1,2
1 Divisi Pertahanan dan Keamanan CBRN, Badan Penelitian Pertahanan Swedia, Ume , Swedia, 2 Departemen Mikrobiologi Klinis, Penyakit Menular dan Bakteriologi, Universitas Ume , Ume , Swedia, 3 Institut Kesehatan Militer Pusat, Praha, Republik Ceko
PLoS ONE 4(12): e8360

Faktor penggabung ujung nonhomolog Artemis menekan pembentukan tumor multi-jaringan dan mencegah hilangnya heterozigositas
Y Woo, SM Wright, SA Maas1,7, TL Alley1, LB Caddle1, S Kamdar1, J Affourtit, O Foreman1, EC Akeson, D Shaffer, RT Bronson, HC Morse, D Roopenian dan KD Mills
Onkogen. 2007 26(41): 6010-6020

  • ". gambaran komprehensif tentang teknologi RT-PCR, yang se-up-to-date seperti buku." Mareike Viebahn dalam Current Issues in Molecular Biology (2009)
  • ". buku yang bermanfaat bagi siswa ." dari J. Microbiological Methods
  • "memberikan fokus ganda dengan bertujuan, di bab-bab awal, untuk memberikan teori dan kepraktisan teknologi yang beragam dan sederhana ini, mengimbangi ini di bab-bab selanjutnya dengan aplikasi dunia nyata, yang mencakup penyakit menular, biodefence, molekul haplotyping dan standar makanan.” dari Mikrobiologi Hari Ini
  • "sebuah karya referensi yang harus ditemukan baik di perpustakaan universitas maupun di rak-rak spesialis aplikasi yang berpengalaman." dari Mikrobiologi Hari Ini
  • "panduan komprehensif teknologi PCR real-time dan aplikasinya" dari Abstrak Ilmu dan Teknologi Pangan (2009) Volume 41 Nomor 6
  • Volume ini harus sangat menarik bagi semua peneliti yang tertarik dan terlibat dalam menggunakan RT-PCR. protokol RT-PCR yang tercakup dalam buku ini akan menarik bagi sebagian besar, jika tidak semua, peneliti yang terlibat dalam penelitian yang menggunakan teknik penting ini . buku seimbang yang mencakup banyak potensi penggunaan PCR waktu nyata. berharga untuk semua yang tertarik dengan RT-PCR." dari ulasan Doodys (2009)
  • "memberikan panduan kepada pengguna pemula dan berpengalaman tentang teknologi, instrumentasi, dan aplikasinya" dari SciTech Book News Juni 2009 hal. 64
  • ". ditulis oleh penulis internasional yang ahli dalam prinsip dan aplikasi teknis tertentu . ringkasan yang berguna dari aplikasi dasar dan lanjutan untuk ilmuwan laboratorium. Ini adalah buku teks pengantar yang ideal dan akan berfungsi sebagai buku pegangan praktis di laboratorium di mana teknologi digunakan." dari Christopher J. McIver, Departemen Mikrobiologi, Rumah Sakit Prince of Wales, New South Wales, Australia menulis di Australia J. Med. Sci. 2009. 30(2): 59-60

Perusahaan yang menyediakan array qPCR:

Buku Putih: Sistem Ekspresi Gen StellARray - Mengungkap Profil dengan Signifikansi yang Tidak Bias
Daniel Shaffer, Aaron Brown, William Olver
Bar Harbor BioTechnology, Inc. dan Marjorie Smithhisler, Lonza Walkersville, Inc.

Dalam makalah ini, kami menyajikan tiga contoh aplikasi yang menunjukkan kegunaan Sistem Ekspresi Gen StellARray untuk mengungkapkan perubahan tingkat ekspresi gen dalam konteks biologis yang beragam seperti toksikologi, kanker, dan diferensiasi sel induk. Dengan menggabungkan Sel Manusia Primer Clonetics dan Poietics dengan Sistem Ekspresi Gen StellARray, semuanya dari Lonza, peneliti dilengkapi dengan sistem sinergis untuk mengungkapkan perubahan kasar dan halus dalam ekspresi gen ketika menganalisis model in vitro jaringan manusia. Ini dicapai dengan mudah dalam Array StellARrayqPCR berformat 96 dan 384 dengan baik menggunakan instrumen qPCR standar dan Reagen Master Mix berbasis SYBR Green generik. Alat Analisis Data Pengenalan Pola Global (GPR) secara optimal cocok untuk menghasilkan daftar peringkat gen yang berubah secara signifikan dalam set data qPCR. GPR mengatasi inkonsistensi yang terkait dengan prosedur normalisasi gen tunggal konvensional dengan menghilangkan pilihan normalizer apriori. Secara keseluruhan, hasil menunjukkan bagaimana Sistem Ekspresi Gen StellARray menghilangkan positif palsu dan memberikan hasil BENAR yang didukung oleh analisis statistik yang ketat.

Analisis data PCR Real-Time yang sederhana dan akurat menggunakan perangkat lunak Bar Harbor Biotechnology GPR
http://www.bhbio.com/products/gpr/

Bioteknologi Bar Harbor telah memecahkan salah satu masalah paling mendasar yang dihadapi eksperimen menggunakan Real-Time PCR. Bagaimana cara menganalisis data dan menentukan perubahan NYATA dalam ekspresi gen? Jawaban atas pertanyaan ini ditemukan dalam algoritma Global Pattern Recognition (GPR) milik Bar Harbor Biotechnology, Inc., yang membuat analisis ekspresi gen menjadi sederhana, cepat, dan andal. Berikut adalah beberapa alasan mengapa kami mengembangkan algoritma ini.

SA Biosciences (perusahaan QIAGEN)

  • halaman web array qPCR
  • Tutorial Analisis Data Array PCR
  • RT2 - teknologi PCR profiler - tayangan slide
  • buku pegangan array qPCR
  • Pusat eLearning oleh SA Biosciences:
    • Seminar - Bagaimana cara kerja array qPCR?
    • Film tentang penerapan array qPCR
    • Analisis seluruh genom microRNA dari reaksi sintesis cDNA tunggal
    • Divalidasi dengan urutan microRNA terbaru yang dijelaskan oleh Sanger miRBASE Rilis 14
    • Protokol yang mudah digunakan menghadirkan profil ekspresi microRNA ke lab mana pun dengan instrumen PCR waktu nyata
    • Versi 2.0 RT seluruh Genom MicroRNA PCR Array
    • tersedia untuk manusia, tikus dan tikus.
    • Human RT Whole Genome MicroRNA PCR Arrays (96-well dan 384-well v2.0)
    • MouseRT Whole Genome MicroRNA PCR Arrays (96-sumur dan 384 sumur v2.0)
    • RatRT Whole Genome MicroRNA PCR Arrays (96-well dan 384-well v2.0)

    Maksimalkan efisiensi - Pilih tes untuk target pilihan Anda dari daftar gen keluarga gen yang terkait secara fungsional atau jalur biologis. Pesan mereka sebagai pengujian tunggal atau konfigurasikan panel kustom Anda sendiri pada LightCycler 480 Multiwell Plate.

    Pastikan hasil yang optimal - Andalkan pengujian fungsi qPCR berdasarkan teknologi Universal ProbeLibrary yang telah terbukti, dengan informasi latar belakang bioinformatika yang mendetail dan fitur deteksi kesalahan baru.

    • Panel Gen Referensi Manusia
    • Panel Regulasi Siklus Sel Manusia
    • Panel Apoptosis Manusia
    • Panel GPCR Manusia
    • Panel Reseptor Nuklir Manusia
    • Panel Transporter ABC Manusia
    • temukan lebih banyak detail
    • Bentuk amplifikasi yang bagus
    • Cp konsentrasi cDNA tertinggi = 34
    • PCR efficiency 2.0 +/- 0.2,
    • R value of standard curve between 0.99 and 1.00
    • Linear dynamic range of at least 3 logs
    • Similar signal heights of amplification curves
    • High specificity, no side products (tested on gels)
    • for more details

    Featuring validated and Tm-normalized LNAbased capture probes, the miRCURY LNAarrays offer global microRNA expression profiling with unmatched specificity and sensitivity.

    • Animation about the Exiqon LNA technology
    • Exiqon E-talk - view other animations, presentations and scientific movies
    • Sensitivity - microRNA profiling possible from as low as 30 ng total RNA
    • Specificity - efficient discrimination between closely related microRNA family members
    • Coverage get access to the 428 unique human microRNAs (miRPlus ) on our human, mouse and rat array or the 4168 mature microRNAs from 85 species on our Other species array
    • Reproducibility - high reproducibility with 99% correlation between arrays
    • Dynamic range - greater than 4 orders of magnitude
    • Diversity - the most comprehensive probe set available
    • Open platform - protocols available for Tecan and MAUI hybridization stations, and for manual hybridization.

    microRNA Ready-to-Use PCR Panels
    Ready-to-Use panels contain pre-aliquoted microRNA PCR primer sets in 384-well PCR plates. Just add cDNA and PCR master mix to the wells and run your real-time PCR profiling of up to 730 microRNAs => Read more details

    Universal cDNA Synthesis and SYBR Green master mix kits
    Highly optimized reagents for first strand synthesis and real-time PCR amplification => Read more details

    Our new interactive tutorial will walk you through every step of a microRNA experiment from RNA Isolation to Functional Analysis.

    Custom TaqMan Assay Manufacturing & Plating Service
    If your research application requires special manufacturing modifications - such as a different dye or assay volume, or you would like to have your assays plated in a specific way, our custom services can help.

    TaqMan Gene Expression Assays
    TaqMan Gene Expression Assays provide over 1.3 million predesigned primer/probe sets covering 23 species, the most comprehensive set of quantitative gene expression assays available. Alternatively, custom assays enable you to study the expression of any gene or splice variant in any organism.

    TaqMan MicroRNA Assays
    Innovative TaqMan Assays for microRNA and other small RNAs, as well as longer noncoding RNA transcripts such as pri-miRNAs and long noncoding RNA. We offer products for noncoding RNA discovery, profiling, quantitation, validation, and functional analysis.

    TaqMan Protein Assays
    Revolutionary TaqMan Protein Assays enable fast, easy identification, and relative quantification of protein markers from limited quantities of cultured cells. Choose from predesigned assays for human stem cell pluripotency markers and control proteins, or create your own assay from your biotinylated antibodies.

    Next Generation Real-time PCR Comes of Age

    The WaferGen SmartChip System enables profiling and validation workflows on a single platform, by combining high-throughput, cost-effective target discovery with the sensitivity, precision, and dynamic range of real-time PCR for validation studies.

    Gene Expression Profiling - Discover More
    Gene expression profiling of specific diseases has become increasingly important in drug development. Comparison of gene expression patterns between normal and diseased patients or expression profiles in the presence or absence of drugs leads to discovery of genes or a set of genes that can be used in drug development. This requires monitoring of tens, hundreds or thousands of mRNAs in large numbers.
    The WaferGen SmartChip System offers the capability to achieve this level of throughput with a high degree of accuracy.

    MicroRNA Profiling - Comprehensive human microRNA profile on a single chip
    MicroRNAs (miRNA) are post-transcriptional regulators of cell proliferation, tissue differentiation, embryonic development, and apoptosis. Specific miRNA expression profiles may be characteristic of diseases or disease states and used as biomarkers. The identification of miRNA profiles has become important for streamlining drug development processes. The comparison of miRNA patterns from normal and disease samples or contrasting miRNA profiles of the same sample in the presence or absence of a drug leads to a greater understanding of pathways and mechanisms of action.
    The WaferGen SmartChip System in conjunction with the pre-validated SmartChip human miRNA panel, offers researchers the ability to carry out comprehensive, rapid miRNA profiling on their human samples simply, cost-effectively, and accurately.
    Fluidigm

    These new integrated fluidic circuits (IFCs) are capable of performing 9,216 simultaneous experiments without any pre-spotting and with complete flexibility for the researcher. In a word, they are revolutionary. Flyer

    The 96.96 Dynamic Arrays are at the heart of Fluidigm s BioMark Genetic Analysis System, which delivers new efficiencies in Gene Expression and Genotyping. Fluidigm products enable and accelerate your Single Cell Gene Expression, Copy Number Variation and Absolute Quantitation research in completely new ways.


    Speaker bios

    Stephen A. Bustin, Ph.D.

    Queen Mary, University of London
    London, UK

    Stephen Bustin obtained his Ph.D. in molecular genetics from Trinity College in Dublin and is currently Professor of Molecular Science at Barts and the London School of Medicine and Dentistry, a part of Queen Mary, University of London, and serves as Visiting Professor of Molecular Biology at the University of Middlesex. His research group’s general areas of interest are the small and large bowel, as well as colorectal cancer with particular emphasis on investigating the process of invasion and metastasis. An important aim is to translate molecular techniques into clinical practice by including molecular parameters into clinical tumor staging. He also has a special interest in real-time polymerase chain reactions (PCR) and has written and edited two books and published numerous peer-reviewed publications and book chapters on this subject. He advised the U.K. High Court and the U.S. Department of Justice on PCR technology in the measles, mumps, rubella (MMR) vaccine/Autism class action, and was an expert witness at the MMR trial in Washington, D.C. He coordinated the recent Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) initiative.

    Gregory L. Shipley, Ph.D.

    University of Texas Health Science Center at Houston
    Houston, TX

    Dr. Gregory Shipley completed both his undergraduate and graduate training at the University of California, Santa Barbara, after which he moved to the University of Florida in Gainesville and then to MIT in Cambridge, Massachusetts, to carry out his postdoctoral training. Following academic appointments at Texas A&M University and the University of Houston, Texas, Dr. Shipley moved to the University of Texas Health Science Center in Houston, Medical School in 1990, where he is currently the director of the Quantitative Genomics Core Laboratory. There he and his team perform quantitative protein assays using the MesoScale technology and multiple assay types utilizing real-time quantitative PCR. Dr. Shipley oversees the running and analysis of all real-time qPCR assays as well as the development of new assays. He publishes his work regularly and is also one of the authors of the MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR), together with Dr. Stephen Bustin.

    Manju R. Sethi

    Ilmiah Thermo Fisher
    Wilmington, DE

    Manju Sethi joined Thermo Fisher Scientific in 2008, and as senior product manager is responsible for the development and management of its NanoDrop products line. Sethi specializes in the unique technology and workflow solution needs of life science customers and brings over 20 years of biotech and life science product management, as well as marketing and business development experience to the Thermo Fisher Scientific team. Previously, Sethi was a business consultant for various Fortune 100 companies and was also a senior member of the management team for the Qualicon biotech division at DuPont, where she served as the director of strategic planning and director of business development. Sethi holds a B.Tech. (ChemE) from the Indian Institute of Technology and an M.S. (ChemE) from Clarkson University.

    Sean Sanders, Ph.D.

    Sains/AAAS
    Washington DC

    Dr. Sanders did his undergraduate training at the University of Cape Town, South Africa, and his Ph.D. at the University of Cambridge, UK, supported by the Wellcome Trust. Following postdoctoral training at the National Institutes of Health and Georgetown University, Dr. Sanders joined TranXenoGen, a startup biotechnology company in Massachusetts working on avian transgenics. Pursuing his parallel passion for writing and editing, Dr. Sanders joined BioTechniques as an editor, before joining Sains/AAAS in 2006. Currently, Dr. Sanders is the Director and Senior Editor for Custom Publishing for the journal Sains and Program Director for Outreach.


    Tonton videonya: REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION qPCR (November 2022).