Informasi

Interaksi Ab C-myc/anti-myc dengan Protein Fusion

Interaksi Ab C-myc/anti-myc dengan Protein Fusion


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya akan menyiapkan protein fusi c-myc dengan konfigurasi berikut:

(28-urutan sinyal residu)-(c-myc)-(GGGSGGGSG Linker)-(Protein of Interest (POI))

POI adalah protein transmembran dan urutan sinyal 28-residu diperlukan untuk penggabungan membran di ER.

Kekhawatiran saya adalah terganggunya interaksi c-myc/anti-myc Ab karena fakta bahwa c-myc menyatu di kedua ujungnya. Adakah yang punya pengalaman atau referensi dengan konstruksi serupa?


Setelah beberapa penelitian lebih lanjut, saya menemukan makalah yang melaporkan eksperimen ko-imunopresipitasi yang berhasil dengan protein fusi POI-myc-His.

Selain itu, saya pikir urutan sinyal akan dibelah oleh peptidase sinyal yang akan membuat tag c-myc terpapar pada N-terminus hanya dengan residu tambahan. Saya tidak berpikir bahwa satu residu tambahan akan menimbulkan masalah.

Inilah alat yang saya gunakan untuk mencari tahu di mana urutan sinyal akan dibelah: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

Berikut adalah referensi untuk eksperimen POI-myc-Nya:

  • DOI: 10.1016/j.cub.2006.08.085
  • DOI: 10.1073/pnas.97.2.668

LUMIER: Alat Penemuan untuk Jaringan Interaksi Protein Mamalia

Interaksi protein-protein (PPI) memainkan peran penting dalam semua proses biologis. In vivo, PPI terjadi secara dinamis dan bergantung pada isyarat ekstraseluler. Untuk menemukan interaksi protein-protein baru dalam sel mamalia, kami mengembangkan teknologi otomatis throughput tinggi yang disebut LUMIER (Interactome Mamalia berbasis LUminescence). Dalam pendekatan ini, kami bersama-sama mengekspresikan protein fusi bertanda Luciferase (LUC) bersama dengan protein bertanda Bendera dalam garis sel yang dapat ditransfeksi secara efisien seperti sel HEK-293T. Interaksi antara dua protein ditentukan oleh co-imunopresipitasi menggunakan antibodi anti-Bendera, dan keberadaan interaksi yang ditandai dengan LUC di kompleks kemudian dideteksi melalui aktivitas luciferase-nya. LUMIER dapat dengan mudah mendeteksi mitra protein transmembran, interaksi yang bergantung pada pensinyalan atau sambungan isoform, serta interaksi yang mungkin terjadi hanya dengan adanya modifikasi pascatranslasi. Menggunakan berbagai koleksi protein bertanda Bendera, kami telah menghasilkan jaringan interaksi protein untuk beberapa reseptor keluarga TGF-β, anggota jalur Wnt, dan telah secara sistematis menganalisis efek penyambungan alternatif spesifik saraf pada jaringan interaksi protein. Hasilnya telah memberikan wawasan penting tentang relevansi fisiologis dan fungsional dari beberapa interaksi baru yang ditemukan. LUMIER sangat skalabel dan dapat digunakan untuk strategi throughput rendah dan tinggi. LUMIER dengan demikian merupakan alat yang berharga untuk identifikasi dan karakterisasi PPI yang diatur secara dinamis dalam sistem mamalia. Di sini, kami menjelaskan versi manual LUMIER dalam format 96-sumur yang dapat dengan mudah diimplementasikan di laboratorium mana pun.

Kata kunci: Kompleks biner LUMIER Sel mamalia Interaksi protein-protein Jalur sinyal Kompleks terner Protein transmembran.


Protein fusi

Penggunaan Protein Fusi

Teknik pembuatan protein fusi telah diperluas ke mitra fusi lainnya, dan penggunaan tambahan telah dikembangkan untuk mitra fusi. Tiga dari kegunaan yang paling penting dari protein fusi adalah: sebagai bantuan dalam pemurnian gen kloning, sebagai reporter tingkat ekspresi, dan sebagai tag histokimia untuk memungkinkan visualisasi lokasi protein dalam sel, jaringan, atau organisme.

Untuk pemurnian, protein yang dapat dengan mudah dan nyaman dimurnikan dengan kromatografi afinitas digabungkan dengan protein yang ingin dipelajari oleh peneliti. Sejumlah protein dan peptida telah digunakan untuk tujuan ini, termasuk staphylococcus protein A, glutathione-S-transferase, protein pengikat maltosa, protein pengikat selulosa, domain pengikat kitin, thioredoxin, strepavidin, RNaseI, polihistidin, hormon pertumbuhan manusia. , ubiquitin, dan epitop antibodi.

Protein yang paling sering digunakan sebagai mitra fusi untuk konstruksi reporter adalah -galactosidase, luciferase, dan green fluorescent protein (GFP). -galaktosidase memiliki keuntungan dari banyak substrat yang tersedia secara komersial, termasuk beberapa yang menghasilkan produk berwarna dan beberapa yang mengarah pada produksi cahaya. Luciferase dan GFP keduanya menghasilkan cahaya, dan dapat divisualisasikan secara langsung atau dihitung menggunakan luminometer atau fluorometer, masing-masing. GFP memiliki keunggulan karena tidak memerlukan substrat, sedangkan luciferase membutuhkan substratnya, luciferin, serta ATP, O2, dan Mg2+ . GFP memancarkan cahaya hijau saat tereksitasi oleh cahaya biru atau UV, dan dalam banyak kasus dapat digunakan pada sel dan organisme hidup yang utuh.

Perpanjangan protein fusi yang berguna sebagai reporter adalah sistem dua-hibrida. Dalam metode ini, dua fusi terpisah digunakan untuk menguji interaksi antara dua protein, di mana pengikatan dua protein menyatukan mitra fusi mereka dan menghasilkan transkripsi aktif dari gen reporter.


Fusi DARPin ke Aldolase Memungkinkan Visualisasi Protein Kecil oleh Cryo-EM

Memecahkan struktur protein dengan mikroskop cryoelectron partikel tunggal (cryo-EM) telah menjadi alat penting dalam biologi struktural. Sementara kemajuan menarik sedang dibuat menuju visualisasi makromolekul kecil, ukuran protein rata-rata pada eukariota dan bakteri masih di luar jangkauan cryo-EM. Untuk mengatasi masalah ini, kami menerapkan strategi platform di mana target protein kecil dilekatkan secara kaku ke basis simetris yang besar melalui adaptor yang dapat dipilih. Dari tujuh desain kami, konstruksi terbaik menggunakan protein berulang ankyrin (DARPin) yang dirancang secara kaku menyatu dengan aldolase otot kelinci tetramerik melalui penghubung heliks. DARPin mempertahankan kemampuannya untuk mengikat targetnya: GFP. Kami memecahkan struktur kompleks ini menjadi resolusi 3,0 secara keseluruhan, dengan resolusi 5-8 di wilayah GFP. Karena fleksibilitas dalam posisi DARPin membatasi resolusi target secara keseluruhan, kami menjelaskan strategi untuk memperkuat elemen ini.

Kata kunci: CryoEM DARPin Elektron cryo-microscopy Analisis partikel tunggal aldolase protein buatan desain protein platform cryo-electron microscopy.


Pengembangan Sistem Co-Display Antigen-Antibodi untuk Mendeteksi Interaksi Reseptor G-Protein-Coupled dan Fragmen Variabel Rantai Tunggal

Reseptor G-protein-coupled (GPCRs), terutama reseptor kemokin, adalah target ideal untuk obat antibodi monoklonal. Mempertimbangkan struktur transmembran multi-pass khusus GPCR, seringkali merupakan pekerjaan yang melelahkan untuk mendapatkan informasi antibodi tentang target yang tidak diinginkan dan epitop pada antigen. Untuk mempercepat proses tersebut, perlu dikembangkan metode yang cepat dan sederhana. Ragi dua sistem hibrida (YTH) berbasis split-ubiquitin digunakan sebagai skrip biru untuk metode baru. Dengan menyatu dengan peptida transmembran, antibodi scFv dirancang untuk ditambatkan pada sitomembran, di mana GPCR juga ditampilkan bersama. Sistem split-ubiquitin yang digabungkan mengubah sinyal interaksi scFv-GPCR menjadi ekspresi gen reporter. Dengan mengoptimalkan struktur topologi protein fusi scFv dan elemen kunci, termasuk peptida sinyal, peptida transmembran, dan penghubung fleksibel, sistem bernama Antigen-Antibody Co-Display (AACD) dibuat, yang dengan cepat mendeteksi interaksi antara antibodi dan GPCR targetnya. , CXCR4 dan CXCR5, sementara juga menentukan antibodi yang tidak sesuai target dan epitop terkait antibodi. Sistem AACD dapat dengan cepat menentukan hubungan antara GPCR dan kandidat antibodinya dan mempersingkat periode penelitian untuk deteksi di luar target dan identifikasi epitop. Sistem ini harus meningkatkan proses pengembangan antibodi GPCR dan memberikan strategi baru untuk skrining antibodi GPCR.

Kata kunci: Antibodi reseptor berpasangan protein G epitop ragi dua hibrida.

Pernyataan konflik kepentingan

Para penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain penelitian dalam pengumpulan, analisis, atau interpretasi data dalam penulisan naskah atau dalam keputusan untuk mempublikasikan hasil.


Protogenin mendefinisikan tahap transisi selama neurogenesis embrionik dan mencegah diferensiasi neuron sebelum waktunya.
Fann MJ
The Journal of neuroscience : jurnal resmi Society for Neuroscience 30.12 (24 Maret 2010): 4428-39.

Regulasi Fasciclin II dan pengembangan terminal sinaptik oleh faktor splicing beag.
McCabe BD
The Journal of neuroscience : jurnal resmi Society for Neuroscience 32.20 (2012 Mei 16): 7058-73.

Sc65 adalah protein retikulum endoplasma baru yang mengatur homeostasis massa tulang.
Morelo R
Jurnal penelitian tulang dan mineral: jurnal resmi American Society for Bone and Mineral Research 29.3 (2014 Maret): 666-75.

Neuronal nitric oxide synthase-dependent S-nitrosylation dari gephyrin mengatur pengelompokan gephyrin di sinapsis GABAergic.
Schwarz G
The Journal of neuroscience : jurnal resmi Society for Neuroscience 34.23 (2014 4 Juni): 7763-8.

Protogenin mendefinisikan tahap transisi selama neurogenesis embrionik dan mencegah diferensiasi neuron sebelum waktunya.
Fann MJ
The Journal of neuroscience : jurnal resmi Society for Neuroscience 30.12 (24 Maret 2010): 4428-39.

Protein sine menambatkan inti otot pada sambungan neuromuskular.
Han M
Prosiding National Academy of Sciences Amerika Serikat 102,12 (22 Maret 2005): 4359-64.

Regulasi Fasciclin II dan pengembangan terminal sinaptik oleh faktor splicing beag.
McCabe BD
The Journal of neuroscience : jurnal resmi Society for Neuroscience 32.20 (2012 Mei 16): 7058-73.


Aplikasi

  • Memurnikan atau imunopresipitasi protein fusi bertanda myc dari lisat sel
  • Identifikasi protein yang diberi tag myc
  • Lakukan studi interaksi protein-protein throughput tinggi

Informasi produk tambahan

Silakan lihat Sertifikat Analisis produk untuk informasi tentang kondisi penyimpanan, komponen produk, dan spesifikasi teknis. Silakan lihat Daftar Komponen Kit untuk menentukan komponen kit. Sertifikat Analisis dan Daftar Komponen Kit terletak di bawah tab Dokumen.

Takara Bio USA, Inc.
Amerika Serikat/Kanada: +1.800.662.2566 &banteng Asia Pasifik: +1.650.919.7300 &banteng Eropa: +33.(0)1.3904.6880 &banteng Jepang: +81.(0)77.565.6999
UNTUK PENGGUNAAN PENELITIAN SAJA. TIDAK UNTUK DIGUNAKAN DALAM PROSEDUR DIAGNOSTIK. © 2021 Takara Bio Inc. Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang. Semua merek dagang adalah milik Takara Bio Inc. atau afiliasinya di AS dan/atau negara lain atau pemiliknya masing-masing. Merek dagang tertentu mungkin tidak terdaftar di semua yurisdiksi. Produk tambahan, kekayaan intelektual, dan informasi penggunaan terbatas tersedia di takarabio.com.

Takara Bio Europe adalah anggota Takara Bio Group, perusahaan ilmu hayati terkemuka yang berkomitmen untuk meningkatkan kondisi manusia melalui bioteknologi. Melalui merek Takara, Clontech, dan Cellartis kami, misi kami adalah mengembangkan alat dan layanan inovatif berkualitas tinggi untuk mempercepat penemuan.


Referensi

Chernomordik, L.V. & Kozlov, M.M. Interaksi protein-lipid dalam fusi dan pembelahan membran biologis. annu. Pdt. Biokimia. 72, 175–207 (2003).

Chernomordik, L.V., Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. Membran dunia bersatu! J. Sel Biol. 175, 201–207 (2006).

Helenius, A., Kartenbeck, J., Simons, K. & Fries, E. Tentang masuknya virus Semliki Forest ke dalam sel BHK-21. J. Sel Biol. 84, 404–420 (1980). Salah satu dari beberapa makalah di mana Helenius, Simons dan rekan kerja mereka menunjukkan bahwa pH asam endosom adalah pemicu fusi virus. Demonstrasi bahwa virus telah berevolusi untuk 'merasakan' konsentrasi proton lokal merupakan kontribusi baik untuk pengetahuan kita tentang mekanisme masuknya virus dan pemahaman kita tentang sifat-sifat jalur endositik secara lebih umum..

White, J. & Helenius, A. fusi tergantung pH antara membran virus Semliki Forest dan liposom. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 77, 3273–3277 (1980).

Kuzmin, P.I., Zimmerberg, J., Chizmadzhev, Y.A. & Cohen, F.S. Model kuantitatif untuk fusi membran berdasarkan zat antara berenergi rendah. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 98, 7235–7240 (2001).

Zimmerberg, J., Blumenthal, R., Sarkar, D.P., Curran, M. & Morris, S.J. Pergerakan terbatas lipid dan pewarna air melalui pori-pori yang dibentuk oleh hemagglutinin influenza selama fusi sel. J. Sel Biol. 127, 1885–1894 (1994).

Plonsky, I. & Zimmerberg, J. Pori fusi awal yang diinduksi oleh baculovirus GP64 berukuran besar dan terbentuk dengan cepat. J. Sel Biol. 135, 1831–1839 (1996).

Melikyan, G.B., Markosyan, R.M., Brener, S.A., Rozenberg, Y. & Cohen, F.S. Peran ekor sitoplasma protein Env virus ekotropik Moloney murine leukemia dalam pembentukan pori fusi. J. Viral. 74, 447–455 (2000).

Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Pengikatan reseptor dan fusi membran dalam masuknya virus: hemagglutinin influenza. annu. Pdt. Biokimia. 69, 531–569 (2000).

Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S.C. Kantong pengikat ligan dalam glikoprotein amplop virus dengue. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 100, 6986–6991 (2003).

Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S.C. Struktur protein selubung virus dengue setelah fusi membran. Alam 427, 313–319 (2004).

Roche, S., Bressanelli, S., Rey, F.A. & amp Gaudin, Y. Struktur kristal bentuk pH rendah dari glikoprotein virus stomatitis vesikular G. Sains 313, 187–191 (2006).

Roche, S., Rey, F.A., Gaudin, Y. & amp Bressanelli, S. Struktur bentuk prefusi glikoprotein virus stomatitis vesikular G. Sains 315, 843–848 (2007).

Yin, H.S., Paterson, R.G., Wen, X., Lamb, R.A. & Jardetzky, T.S. Struktur ektodomain yang tidak terputus dari protein fusi paramyxovirus (hPIV3). Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 102, 9288–9293 (2005).

Yin, H.S., Wen, X., Paterson, R.G., Lamb, R.A. & Jardetzky, T.S. Struktur protein 5 F virus parainfluenza dalam konformasi prefusi yang metastabil. Alam 439, 38–44 (2006).

Lescar, J. et al. Cangkang glikoprotein fusi virus Semliki Forest: rakitan ikosahedral yang disiapkan untuk aktivasi fusogenik pada pH endosom. Sel 105, 137–148 (2001).

Gibbons, D.L. dkk. Perubahan konformasi dan interaksi protein-protein dari protein fusi virus Semliki Forest. Alam 427, 320–325 (2004).

Wilson, I.A., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Struktur glikoprotein membran haemaglutinin virus influenza pada resolusi 3 . Alam 289, 366–373 (1981). Hasil struktural awal terobosan dari kolaborasi Skehel-Wiley pada hemagglutinin virus influenza. Sebuah tonggak sejarah dalam biologi struktural dan biokimia permukaan-glikoprotein, makalah ini mendahului hampir 15 tahun laporan berikutnya dari struktur protein fusi virus yang berbeda. Ini membantu membentuk seluruh bidang entri virus yang diselimuti dan antigenisitas virus.

Wiley, D.C., Wilson, I.A. & Skehel, J.J. Identifikasi struktural situs pengikatan antibodi hemaglutinin influenza Hong Kong dan keterlibatannya dalam variasi antigenik. Alam 289, 373–378 (1981).

Bullough, P.A., Hughson, F.M., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Struktur haemaglutinin influenza pada pH fusi membran. Alam 371, 37–43 (1994). Makalah ini, yang melaporkan struktur konformasi pasca-fusi virus influenza HA2, mengakhiri upaya dua belas tahun untuk memvisualisasikan produk transisi konformasi yang ditemukan oleh Skehel dkk. 23 . Tingkat pelipatan ulang HA2 tidak terduga, dan melihatnya mengubah apresiasi kami terhadap kemungkinan repertoar transisi konformasi protein.

Chen, J.et al. Struktur situs pembelahan prekursor hemaglutinin, penentu patogenisitas influenza dan asal konformasi labil. Sel 95, 409–417 (1998).

Weis, W. dkk. Struktur hemaglutinin virus influenza dikomplekskan dengan reseptornya, asam sialat. Alam 333, 426–431 (1988).

Skehel, J.J. dkk. Perubahan konformasi hemagglutinin virus influenza pada pH optimum fusi membran yang dimediasi virus. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 79, 968–972 (1982). Penemuan bahwa pengikatan proton (pH rendah) memicu perubahan konformasi yang mendalam pada hemagglutinin virus influenza. Para penulis dapat menyimpulkan karakteristik penting (walaupun belum sejauh mana) dari perubahan konformasi hemagglutinin, dengan menggunakan proteolisis selektif dan dengan interpretasi yang bijaksana dari efek pelarutan deterjen nonionik..

Chen, J., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Residu terminal-N dan C bergabung dalam subunit HA2 hemagglutinin influenza fusi-pH untuk membentuk tutup N yang mengakhiri kumparan beruntai tiga. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 96, 8967–8972 (1999).

Carr, C.M. & Kim, P.S. Mekanisme pegas untuk perubahan konformasi hemaglutinin influenza. Sel 73, 823–832 (1993).

Daniels, R.S. dkk. Fusion mutan dari virus influenza hemagglutinin glikoprotein. Sel 40, 431–439 (1985).

Han, X., Bushweller, J.H., Cafiso, D.S. & Tamm, L.K. Struktur membran dan perubahan konformasi pemicu fusi dari domain fusi dari hemagglutinin influenza. Nat. Struktur. Biol. 8, 715–720 (2001).

Borrego-Diaz, E., Peeples, ME, Markosyan, R.M., Melikyan, G.B. & Cohen, F.S. Penyelesaian pembentukan jepit rambut trimerik dari virus influenza hemagglutinin mendorong pembukaan dan pembesaran pori fusi. Ilmu pengetahuan virus 316, 234–244 (2003).

Park, HE, Gruenke, J.A. & White, J.M. Leash dalam mekanisme alur fusi membran. Nat. Struktur. Biol. 10, 1048–1053 (2003).

Heinz, F.X. dkk. Perubahan struktural dan kontrol fungsional glikoprotein E virus ensefalitis tick-borne oleh asosiasi heterodimerik dengan protein prM. Ilmu pengetahuan virus 198, 109–117 (1994).

Zhang, W. dkk. Visualisasi domain protein membran dengan mikroskop cryo-electron virus dengue. Nat. Struktur. Biol. 10, 907–912 (2003).

Mukhopadhyay, S., Kim, B.S., Chipman, PR, Rossmann, M.G. & Kuhn, R.J. Struktur virus West Nile. Sains 302, 248 (2003).

Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C., Kunz, C. & Harrison, S.C. Glikoprotein amplop dari virus ensefalitis tick-borne pada resolusi 2 . Alam 375, 291–298 (1995).

Allison, S.L. dkk. Penataan ulang oligomer protein selubung virus ensefalitis tick-borne yang diinduksi oleh pH asam. J. Viral. 69, 695–700 (1995).

Bressanelli, S. et al. Struktur glikoprotein amplop flavivirus dalam konformasi fusi membran yang diinduksi pH rendah. EMBO J. 23, 728–738 (2004).

Stiasny, K., Kossl, C., Lepault, J., Rey, F.A. & amp Heinz, F.X. Karakterisasi intermediet struktural fusi membran flavivirus. Pathog PLoS. 3, e20 (2007).

Kampmann, T., Mueller, D.S., Mark, A.E., Young, PR & amp Kobe, B. Peran residu histidin dalam fusi membran virus yang dimediasi pH rendah. Struktur 14, 1481–1487 (2006).

Roche, S. & Gaudin, Y. Karakterisasi keseimbangan antara konformasi asli dan fusi-inaktif glikoprotein virus rabies menunjukkan bahwa kompleks fusi terbuat dari beberapa trimer. Ilmu pengetahuan virus 297, 128–135 (2002).

Durrer, P., Gaudin, Y., Ruigrok, R.W., Graf, R. & Brunner, J. Photolabeling mengidentifikasi domain fusi diduga dalam amplop glikoprotein virus rabies dan stomatitis vesikular. J.Biol. Kimia 270, 17575–17581 (1995).

Heldwein, E.E. et al. Struktur kristal glikoprotein B dari virus herpes simpleks 1. Sains 313, 217–220 (2006).

Hannah, B.P., Heldwein, E.E., Bender, F.C., Cohen, G.H. & Eisenberg, R.J. Bukti mutasi dari loop fusi internal pada glikoprotein B virus herpes simpleks. J. Viral. 81, 4858–4865 (2007).

Chandran, K., Sullivan, N.J., Felbor, U., Whelan, S.P. & amp Cunningham, J.M. Proteolisis endosom dari glikoprotein virus Ebola diperlukan untuk infeksi. Sains 308, 1643–1645 (2005).

Simmons, G. et al. Inhibitor cathepsin L mencegah masuknya coronavirus sindrom pernafasan akut yang parah. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 102, 11876–11881 (2005).

Schornberg, K. dkk. Peran cathepsin endosomal dalam entri yang dimediasi oleh glikoprotein virus Ebola. J. Viral. 80, 4174–4178 (2006).

Godley, L. dkk. Pengenalan ikatan intersubunit disulfida di daerah membran-distal dari hemagglutinin influenza menghapuskan aktivitas fusi membran. Sel 68, 635–645 (1992).

Stiasny, K., Allison, S.L., Schalich, J. & Heinz, F.X. Interaksi membran protein fusi virus ensefalitis tick-borne virus E pada pH rendah. J. Viral. 76, 3784–3790 (2002).

Liao, M. & Kielian, M. Domain III dari protein fusi kelas II berfungsi sebagai penghambat fusi membran virus yang dominan-negatif. J. Sel Biol. 171, 111–120 (2005).

Russell, CJ, Jardetzky, T.S. & Domba, R.A. Mesin fusi membran paramyxoviruses: penangkapan zat antara fusi. EMBO J. 20, 4024–4034 (2001).

Blacklow, S.C., Lu, M. & Kim, P.S. Subdomain trimerik dari glikoprotein amplop simian immunodeficiency virus. Biokimia 34, 14955–14962 (1995).

Chan, D.C., Fass, D., Berger, J.M. & Kim, P.S. Struktur inti gp41 dari glikoprotein amplop HIV. Sel 89, 263–273 (1997).

Weissenhorn, W., Dessen, A., Harrison, S.C., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Struktur atom ektodomain dari HIV-1 gp41. Alam 387, 426–430 (1997).

Wild, C.T., Shugars, D.C., Greenwell, T.K., McDanal, C.B. & amp Matthews, T.J. Peptida yang sesuai dengan domain alfa-heliks prediktif human immunodeficiency virus tipe 1 gp41 adalah penghambat ampuh infeksi virus. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 91, 9770–9774 (1994).

Furuta, R.A., Wild, C.T., Weng, Y. & Weiss, C.D. Penangkapan konformasi fusi-aktif awal HIV-1 gp41. Nat. Struktur. Biol. 5, 276–279 (1998).

Munoz-Barroso, I., Durell, S., Sakaguchi, K., Appella, E. & Blumenthal, R. Pelebaran pori fusi glikoprotein amplop human immunodeficiency virus-1 terungkap oleh aksi penghambatan peptida sintetis dari gp41. J. Sel Biol. 140, 315–323 (1998).

Kilby, J.M. & Eron, J.J. Terapi baru berdasarkan mekanisme masuknya sel HIV-1. N. Inggris. J. Med. 348, 2228–2238 (2003).

Reeves, JD et al. Sensitivitas HIV-1 terhadap penghambat masuk berkorelasi dengan afinitas selubung/koreseptor, densitas reseptor, dan kinetika fusi. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 99, 16249–16254 (2002).

Reeves, JD et al. Mutasi resistensi enfuvirtide: dampak pada fungsi selubung virus human immunodeficiency, sensitivitas entry inhibitor, dan netralisasi virus. J. Viral. 79, 4991–4999 (2005).

Frey, G. dkk. Keadaan fusi menengah HIV-1 gp41 yang ditargetkan oleh antibodi penetralisir secara luas. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 105, 3739–3744 (2008).

Danieli, T., Pelletier, S.L., Henis, Y.I. & White, J.M. Fusi membran yang dimediasi oleh hemagglutinin virus influenza membutuhkan aksi bersama dari setidaknya tiga trimer hemagglutinin. J. Sel Biol. 133, 559–569 (1996).

Yang, X., Kurteva, S., Ren, X., Lee, S. & amp Sodroski, J. Subunit stoikiometri dari human immunodeficiency virus tipe 1 amplop glikoprotein trimer selama virus masuk ke sel inang. J. Viral. 80, 4388–4395 (2006).

Rand, R.P. & Parsegian, V.A. Pertimbangan kekuatan fisik dalam model dan membran biologis. Bisa. J. Biokimia. Biol Sel. 62, 752–759 (1984).

Matahari, Z.Y. dkk. Antibodi penetralisir HIV-1 secara luas mengekstrak epitopnya dari wilayah ektodomain gp41 yang tertekuk pada membran virus. Kekebalan 28, 52–63 (2008).

Kemble, G.W., Danieli, T. & White, J.M. Hemagglutinin influenza berlabuh lipid mempromosikan hemifusi, bukan fusi lengkap. Sel 76, 383–391 (1994).

Melikyan, G.B., White, J.M. & Cohen, F.S. Hemagglutinin influenza berlabuh GPI menginduksi hemifusi ke sel darah merah dan membran bilayer planar. J. Sel Biol. 131, 679–691 (1995).

Armstrong, R.T., Kushnir, A.S. & White, J.M. Domain transmembran dari hemagglutinin influenza menunjukkan persyaratan panjang yang ketat untuk mendukung transisi hemifusi ke fusi. J. Sel Biol. 151, 425–437 (2000).

Frey, G. dkk. Molekul kecil yang mengikat inti dalam gp41 dan menghambat fusi yang dimediasi amplop HIV. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 103, 13938–13943 (2006).

Lin, P.F. dkk. Penghambat HIV-1 molekul kecil yang menargetkan amplop HIV-1 dan menghambat pengikatan reseptor CD4. Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat 100, 11013–11018 (2003).

Chen, B.et al. Struktur inti virus simian immunodeficiency virus gp120 yang tidak berligan. Alam 433, 834–841 (2005).


BAHAN DAN METODE

Kultur sel dan transfeksi

Semua garis sel diinkubasi dalam atmosfer yang dilembabkan pada 37 ° C dengan 5% CO2. Sel P493-6 dan Jurkat T ditumbuhkan dalam medium RPMI dan sel HEK293, HEK293T, U2OS dan HeLa ditumbuhkan dalam medium DMEM+Glutamax, keduanya dilengkapi dengan 10% serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas dan 1% penisilin/streptomisin (P/S). ). Untuk penghentian pertumbuhan dan penekanan MYC, sel P493-6 B diunggulkan pada 5 × 105 /ml dan diobati dengan tetrasiklin 0,1 g/ml selama 72 jam. Untuk menginduksi ekspresi MYC, tetrasiklin dihilangkan dengan mencuci sel dua kali dengan phosphate buffered saline (PBS) dan menambahkan media RPMI segar yang mengandung 10% FCS (+MYC). Sel kontrol dipertahankan dalam medium yang mengandung tetrasiklin sampai panen (-MYC).

Transfeksi plasmid dilakukan dengan menggunakan metode kalsium fosfat (35, 36). Eksperimen dipanen 36 hingga 48 jam setelah transfeksi ketika hanya plasmid yang mengekspresikan protein yang digunakan. Eksperimen dengan plasmid yang mengekspresikan RNA jepit rambut pendek (pSuper) dipanen 72 jam setelah transfeksi. Transfeksi sementara dengan Dharmacon siRNA dilakukan menggunakan reagen transfeksi HiPerfect (Qiagen, Hilden Germany) sesuai dengan instruksi pabrik pada konsentrasi akhir 15-20 nM.

Kolam Dharmacon siRNA (Thermo Scientific)

Kontrol: siGENOME Non-Penargetan siRNA Pool #2 (D-001206-14)

ASH2L: SMARTpool siGENOME ASH2L siRNA (M-019831-01)

MYC: SMARTpool siGENOME MYC siRNA (M-003282-07)

Dharmacon Set dari 4 siRNA tunggal (Thermo Scientific)

ASH2L: siGENOME ASH2L siRNA (MQ-019831-01)

MYC: siGENOME MYC siRNA (MQ-003282-07)

Keempat siOligos individu diuji untuk efisiensi knockdown (data tidak ditampilkan). Dua siOligos yang paling efisien kemudian digunakan dalam eksperimen kontrol tambahan (ditunjukkan pada Gambar Tambahan S6 dan S7).

Plasmid, siRNA dan protein rekombinan

pcDNA3-Flag-MYC-1-439 (berat), -1-410, -1-350, -1-180, -101-439, -148-439, -178-439, -Δ103-263, -Δ265 -329, -Δ265-367, -Δ319-341 dan pCGN-HA-MYC-1-439 (berat), -1-366, -1-293, -1-220, -221-439, -294-439 , -367-439 disediakan dengan baik oleh W. Tansey ( 37). Plasmid yang mengekspresikan ASH2L telah dijelaskan sebelumnya (38). Mutan dihasilkan menggunakan teknik kloning standar. Konstruksi pSuper ( 39) berikut digunakan: pSuper-ASH2L 5'-GGATTCACTTACCGCCCT pSuper-Control (ASH2Lmut) 5'-CCCTGCAGATCCATGCTT. plasmid pcDNA3-Flag-MLL2 653 (Addgene 11017), pcDNA3-Flag-WDR5 (Addgene 15552) dan pcDNA3 RbBP5 (Addgene 15550) digunakan untuk ekspresi komponen kompleks KMT2.

Protein rekombinan diproduksi di Escherichia coli (E. coli) BL21(DE)pLysS sebagai GST-fusion atau His6-fusion protein menggunakan konstruksi berikut pGEX4T3-ASH2L-wt, -1-121, -1-279, -1-394, -1-444, pGEX2T-MYC-1-262 (N262), -1-156, - 263-439, pGEX3X-MAX, pGEX2T-YY1, pGEX4T3-H3-N, pQE30-ASH2-1-387, pRSET-His6-WDR5 ( 40). Bakteri yang diubah ditumbuhkan ke OD 0,7-0,9 dan ekspresi protein diinduksi dengan 0,4 mM IPTG baik pada 37°C selama 4 jam atau pada 21°C selama 16 jam. Pelet bakteri dilisiskan dalam buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,5% (v/v) Nonidet P40, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0,2 mM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF), 1% ( v/v) Aprotinin), disonikasi, dan disentrifugasi pada 10.000 xg pada 4°C selama 30 menit. Protein fusi GST dipisahkan dari lisat sel dengan glutathione-agarose (Sigma-Aldrich) dan dielusi dari manik-manik dengan 10 mM glutathione dalam buffer A.

Fusi protein-MYC pengikat maltosa (MBP-MYC) dan MBP (41) dimurnikan dari E. coli BL21(DE)pLysS ditanam di NZC-medium (1% NZ-Amine A, 0,5% (b/v) NaCl, 0,2% (b/v) MgCl2, 0,2% glukosa) diinduksi pada OD 0,5 dengan 0,3 mM IPTG pada 30°C selama 4 jam. Sel dilisiskan dalam buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF, 1% (v/v) Aprotinin), disonikasi, dan disentrifugasi pada 10.000 xg pada 4°C selama 30 menit. Protein MBP dipisahkan dari lisat sel dengan amilosa-agarosa (New England Biolabs) dan dielusi dari manik-manik dengan 10 mM maltosa dalam buffer A. Histon inti dan histon rekombinan H3 (New England Biolabs) dan GST-Histone H3 N'-terminal -ekor (disediakan oleh Y. Shinkai) ( 40) digunakan sebagai substrat.

Uji tarik-turun GST

Untuk reaksi pengikatan, 3 g GST atau protein fusi GST diikat ke manik-manik glutathione-agarose dan diinkubasi dengan [35 S] berlabel metionin, in vitro protein yang ditranskripsi dan diterjemahkan dalam buffer pengikat atau dengan 3 g His rekombinan6- protein fusi ( 42). Untuk in vitro translasi/transkripsi, TNT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) digunakan dengan plasmid pcDNA3-Flag-MYC dan pcDNA3-Flag-ASH2L.

Ko-imunopresipitasi

Untuk dalam uji interaksi sel, lisat sel utuh dari 2 × 107 sel disiapkan dalam buffer-F (10 mM Tris-HCl, pH 7,05, 50 mM NaCl, 30 mM Na3PO4, 50 mM NaF, 5 M ZnCl, 100 M Na3VO4, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 unit/ml 2-macroglobulin, 2,5 unit/ml pepstatin A, 2,5 unit/ml leupeptin, 0,15 mM benzamidin). Protein ko-imunopresipitasi dideteksi dengan analisis western blot (43, 44).

Uji histon metiltransferase

Lisis sel utuh dari sel 3 × 107 disiapkan dalam buffer-F untuk imunopresipitasi MYC atau ASH2L dan MTase terkait. MTase terkait MYC dan ASH2L diukur dengan histon inti 5 g atau ekor terminal N GST-H3 sebagai substrat dengan adanya 1,5 l [ 3 H]-SAM (Perkin-Elmer Life Sciences, NET-155H, 0,55 mCi/ ml, 79,8 Ci/mmol) pada 30°C selama 30 menit. Protein yang dimodifikasi divisualisasikan oleh SDS-PAGE dan autoradiogaphy. Spesifisitas situs dan aktivitas metiltransferase terkait MYC diukur dengan 1 g histon rekombinan H3 dengan adanya 100 M SAM pada 30 ° C selama 1 jam. Metilasi Histon H3 dideteksi dengan imunoblotting dengan antibodi spesifik metil H3K4 dan H3K9 yang berbeda.

Pewarnaan imunofluoresensi

Sel-sel HeLa diunggulkan ke kaca penutup, ditransfeksi secara sementara dengan pSuper-ASH2L dan difiksasi dalam PBS yang mengandung 3,7% paraformaldehyde 72 jam setelah transfeksi. Sel dipermeabilisasi dalam PBS dengan 0,2% Triton X-100 pada suhu kamar selama 5 menit dan diwarnai dengan tikus spesifik ASH2L mAb 4C5 dan antibodi poliklonal kelinci spesifik H3K4me3 ab8898 (abcam) pada 37 ° C selama 45 menit. Antibodi sekunder anti-tikus-Cy3 dan anti-kelinci-Cy2 digunakan pada suhu 37°C selama 30 menit. Coverslips dipasang dengan Moviol (Merck) di PBS yang mengandung 2,5% N-propilgallat (Sigma). Untuk uji ligasi kedekatan (PLA), sistem fluoresensi DuolinkII digunakan bersama dengan kit Probemaker Plus untuk pelabelan antibodi anti-tikus sekunder sesuai dengan instruksi pabrik (Olink Bioscience) ( 45).

Antibodi

Antibodi berikut digunakan untuk IP, chromatin immunoprecipitations (ChIP), dan western blot: anti-MYC kelinci (N262, sc-764 C19, sc-788, keduanya Santa Cruz IG13, 022Y, 1236 ketiganya disediakan oleh L.-G Larsson), kelinci anti-MAX (C17, sc-197, Santa Cruz), anti-MXD1 tikus (5F4), anti-nukleolin tikus (MS-3, sc-8031, Santa Cruz) kelinci anti-ASH2L (A300– 489A, Betil sera 548 dan 549 (antigen ASH2L-1-444)), anti-ASH2L tikus (4C5 dan 4B5 (antigen ASH2L-1-279)), anti-WDR5 tikus (ab56919, abcam), anti-RbBP5 kelinci ( A300-109A, Betil), kelinci anti-H3 (ab1791, abcam), kelinci anti-H3ac (06-599, Millipore), kelinci anti-H3K9ac (ab4441, abcam), kelinci anti-H3K27ac (ab4729, abcam), kelinci anti-H3K4me3 (ab8580, abcam), kelinci anti-H3K4me2 (07-030, Millipore), kelinci anti-H3K4me1 (ab8895, abcam), kelinci anti-H3K9me3 (ab8898, abcam), kelinci H3K9me2 (07-212, Millipore) , kelinci anti-H3K9me1 (ab9045, abcam), kelinci anti-H3K27me3 (ab6002, abcam), kelinci anti-CBP (C-20, sc-583, Santa Cruz), kelinci anti-p300 (N- 15, sc-584, Santa Cruz), kelinci IgG (Kch-504-250, Diagenode), anti-aktin tikus (MP Biomedis), anti-HA tikus (3F10, Roche), anti-Bendera tikus (M2, Sigma- Aldrich), kelinci anti-caspase 5 (2157, disediakan oleh A. Krippner-Heidenreich).

ChIP- dan Re-Chip-qPCR

Uji ChIP-qPCR dilakukan dengan kit Diagenode OneDay ChIP sesuai dengan instruksi pabrik. Sel P493-6 dan HEK293T dihubungkan silang dengan formaldehida 1% (dengan menambahkan formaldehida 37% ke media) pada platform pengocok selama 10 menit pada suhu kamar dan didinginkan selama 5 menit dengan menambahkan 125 mM glisin. Sel dilisiskan dalam 100 l buffer lisis (sel 2 × 107 P493-6 dan sel 1 × 107 HEK293T) dan kromatin dicukur selama 15 menit menggunakan Bioruptor (Diagenode). Imunopresipitasi dilakukan dengan 100 g kromatin (input) dan 2 g antibodi. DNA dimurnikan dan reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) dilakukan dengan pasangan primer berikut:

Ctrl pp4 (untuk): 5'-GCGTGACTCAAATTGTGTGTGCT-3'

Ctrl hlm4 (putaran): 5'-ATCAAGCATTCAGCAGCGTTC CA-3'

CCND2 prom1 (untuk): 5'-CCCCTTCCTCCTGGAGTGAAAATAC-3'

CCND2 prom2 (rev): 5'-CGTGCTCTAACGCATCCTTGAGTC-3'

CCND2 Ex1 (untuk): 5'-GGGAGAGCGAGACCAGTTTTAAG-3'

CCND2 Ex1 (putaran): 5'-CCTTTGGCTAAATAGGGGGTTTTC-3'

Kotak elektronik ODC (untuk): 5'-ATCACTTCCAGGTCCCTTGCAC-3'

Kotak elektronik ODC (rev): 5'-TTCCACCTGGCGTTCAGTACCT-3'

NCL In1 (untuk): 5'-TGGCCGGGGAAATGGCGGTA-3'

NCL In1 (rev): 5'-TAGGCCACCACGTGCCCGAA-3'

Untuk percobaan Re-ChIP, IP pertama dilakukan dengan 100–200 g kromatin (input). Chromatin was released from beads using release buffer (TE buffer, pH 7.5, 1% SDS, 10 mM DTT) for 30 min at 37°C and diluted in 4 volumes ChIP buffer (Diagenode OneDay ChIP kit, with protease inhibitor cocktail and 10 mM iodoacetamide). Then, 2 μg of antibody were added for the second immunoprecipitation, followed by DNA purification and qPCR. PCR was performed as described below.

The DNA was purified from one tenth of the input chromatin that was used for the ChIPs, diluted two-fold and used for qPCR amplification. The dilution factor was included in the % input calculation of all the qPCR results.

QRT-PCR

Total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and DNase digestion (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. 1 μg of RNA was reverse transcribed into cDNA using the QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) and analyzed by qPCR with SensiMix SYBR Green Mix (Bioline) in a Rotor-Gene Q (Qiagen) machine.

The following primer pairs were used for amplification:

β-glucuronidase (GUS) for: 5’-CTCATTTGGAATTTTGCCGATT-3’,

β-glucuronidase (GUS) rev: 5’-CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA-3’

QuantiTect primer assays (Qiagen): MYC (Hs_Myc_1_SG), ASH2L (Hs_ASH2L_1_SG), CCND2 (Hs_CCND2_1_SG), ODC (Hs_ODC1_1_SG), NCL (Hs_NCL_1_SG). Relative mRNA expression was calculated by the comparative ΔΔCt method and normalized to the housekeeping gene GUS using Rotor-Gene Q software.

P493-6 cells were harvested by centrifugation, washed with PBS and fixed by adding 100% methanol at -20°C. After RNase A treatment (20 μg/ml) cells were stained with propidium iodide (PI, 50 μg/ml) for 15 min at room temperature and analyzed using a FACSCanto II (BD Biosciences).

Bioinformatics analysis of publicly available ChIP-Seq data

Public data from ChIP experiments followed by massively parallel DNA sequencing (ChIP-Seq) was used to analyze the occupancy of the factors MYC, WDR5 and POL II and the occurrence of the histone modifications H3K4me3, H3K4me1 and H3K27me3 in normal human epidermal keratinocytes (NHEK). Data from histone modifications, POL II, MYC and controls were obtained from the ENCODE project (GEO accession GSE29611, GSM748557). WDR5 ChIP-Seq was obtained from published findings ( 46) (GEO accession GSE42180). No read alignments were provided in GEO for WDR5 and MYC. For those, the alignments from original sequence reads were performed using Burrows-Wheeler Alignment tool with default parameters ( 47). All alignments were based on the human reference genome Hg19. Peak calling was performed with MACS ( 48) with a P-value of 10 −5 and the ChIP-Seq control as input.

Definition of regulatory features

Publicly available data for histone modifications were combined to define regulatory regions in NHEK cells: active promoters (both H3K27ac and H3K4me3 peaks overlapping with the core promoter, 200 bps upstream of a gene transcription start site (TSS)), active enhancers (regions distant from core promoters with peaks of both H3K4me1 and H3K27ac), poised promoters (H3K4me3 and H3K27me3 ( 49)), poised enhancers (H3K4me1, lack of H3K27ac ( 50)) and closed chromatin regions (only H3K27me3). Regions not fitting any of these criteria were indicated as ‘other’. bedTools ( 51) was used to find the regions of overlap between these sites that contain histone with specific modifications and the TSS of genes. Gene TSS positions were based on Hg19 RefSeq annotation obtained from USCD Table Browser. Additionally, the overlap of these regions with POL II ChIP-Seq peaks was evaluated. As a last step, the peaks from MYC, WDR5 and regions containing both MYC and WDR5 peaks were related to the above-mentioned regulatory features (see Supplementary Tables S1 and S2 for statistics).

Analysis of transcription factor binding sites

To analyze the presence of binding sites for MYC and ASH2L inside ChIP-Seq peaks, the summit regions of the Chip-Seq peaks (positions with highest reads within a peak as provided by MACS), extended by 125 bps in each direction, were inspected. This procedure ensures that all peaks possess the same size and avoids biasing the binding site statistics. The choice of peaks with a size of 250 bps is in accordance with previously published work ( 52). Note that other choices of peak sizes (500, 100 and 80 bps) resulted in similar qualitative results (data not shown). As background, random genomic regions with the same characteristics of the ChIP-Seq peaks were obtained. The MYC position weight matrix (MA0147.1) from the Jaspar database ( 53) and the ASH2L position weight matrix from ( 54) were used. Biopython ( 55) was employed to perform binding site searches. Functions provided by the Motif class were applied to calculate a bit-score based on the application of a position Weight Matrix in the ChIP-Seq peaks. An empirical statistical test based on dynamic programming was used to define a bit-score threshold with a false discovery rate of 0.0001 ( 56). The number of MYC, WDR5 and both MYC and WDR5 ChIP-Seq peaks with at least one binding site motif were counted and a Fisher's Exact test performed to evaluate whether the proportion of peaks with binding sites is higher than in the background regions (Supplementary Table S3). Using the same analysis, but classifying the MYC or WDR5 peaks that belong to the previously described regulatory features, no relation between the proportion of binding sites and the regulatory features surrounding the peaks was detected (not shown). The analysis was performed with the Regulatory Genomics Toolbox available at https://code.google.com/p/reg-gen/.

Analysis of gene expression

To evaluate if regions of ChIP-Seq peaks and NHEK expression data from RNA-Seq experiments are related, the alignment of RNA-Seq reads from the ENCODE project (GSM958736) was analyzed. The summits of peaks of MYC, WDR5 and both MYC and WDR5 were extended by 1000 bps to capture the expression of neighboring genes. The number of aligned reads inside the ChIP-Seq peaks was counted and normalized by the size of the peaks. In addition, the same analysis was performed considering only ChIP-Seq peaks overlapping with the region 200 bps upstream of a TSS.


C-myc/anti-myc Ab Interaction with Fusion Proteins - Biology

Integrin ligand binding induces a signaling complex formation via the direct association of the docking protein p130 Cas (Cas) with diverse molecules. We report here that the 14-3-3ζ protein interacts with Cas in the yeast two-hybrid assay. We also found that the two proteins associate in mammalian cells and that this interaction takes place in a phosphoserine-dependent manner, because treatment of Cas with a serine phosphatase greatly reduced its ability to bind 14-3-3ζ. Furthermore, the Cas-14-3-3ζ interaction was found to be regulated by integrin-mediated cell adhesion. Thus, when cells are detached from the extracellular matrix, the binding of Cas to 14-3-3ζ is greatly diminished, whereas replating the cells onto fibronectin rapidly induces the association. Consistent with these results, we found that the subcellular localization of Cas and 14-3-3 is also regulated by integrin ligand binding and that the two proteins display a significant co-localization during cell attachment to the extracellular matrix. In conclusion, our results demonstrate that 14-3-3 proteins participate in integrin-activated signaling pathways through their interaction with Cas, which, in turn, may contribute to important biological responses regulated by cell adhesion to the extracellular matrix.


Tonton videonya: c-myc gene (November 2022).