Informasi

Intron pengkode protein dalam genom mitokondria

Intron pengkode protein dalam genom mitokondria


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya sedang mempelajari genom mitokondria dan telah membaca bahwa beberapa mengandung intron. Namun, intron ini mengkode protein. Saya tidak bisa benar-benar memahami ini. Bisakah seseorang memberi tahu saya intron apa yang dimaksud dengan genom mitokondria?


Genom mitokondria sangat berbeda dalam ukuran, potensi pengkodean dan bahkan apakah mereka melingkar atau linier. DNA mitokondria mamalia berukuran kecil (11-28 kbp) dan tidak berintron. Namun mitokondria organisme lain tertentu berkisar hingga 1000 kbp dalam ukuran.

Spons tertentu (demosponges) dengan genom mitokondria besar mengandung intron tipe I dan intron tipe II. Meskipun intron pada awalnya dianggap tidak memiliki fungsi lain selain untuk memisahkan ekson, intron dari gen nuklir tertentu ternyata mengandung gen. Ini ternyata juga berlaku untuk beberapa intron mitokondria. Mengutip dari pengantar makalah yang saya temukan melalui pencarian internet:

Sebagian besar intron Grup I mengkode gen endonuklease homing (HEG) dan/atau maturase dari keluarga LAGIDADG , sementara sebagian besar intron Grup II mengkodekan reverse transcriptase (RT).

Intron ini ditemukan dalam gen seperti yang mengkode cytochrome oxidase subunit 1 (COI).


Ini sepertinya salah cetak untuk LAGLMutasi IDAD, yang juga merupakan endonuklease, dan terlibat dalam penyambungan intron tempat mereka berada.


Proposal nomenklatur baru untuk intron dalam gen pengkode protein dalam mitogenom jamur

Gen mitokondria jamur sering diserang oleh intron kelompok I atau II, yang merupakan penanda ideal untuk memahami evolusi jamur. Sebuah nomenklatur standar intron mitokondria diperlukan untuk menghindari kebingungan ketika membandingkan mitogenom jamur yang berbeda. Saat ini, telah ada nomenklatur standar untuk intron yang ada dalam gen rRNA, tetapi ada kekurangan nomenklatur standar untuk intron yang ada dalam gen penyandi protein. Dalam penelitian ini, kami mengusulkan sistem nomenklatur baru untuk intron dalam gen penyandi protein mitokondria jamur berdasarkan (1) singkatan tiga huruf dari nama ilmiah inang, (2) nama gen inang, (3), satu huruf kapital P (untuk intron golongan I), S (untuk intron golongan II), atau U (untuk intron yang jenisnya belum diketahui), dan (4) tempat penyisipan intron pada gen inang menurut jamur penghasil siklosporin Tolypocladium inflatum. Nomenklatur yang disarankan terbukti layak dengan memberi nama intron yang ada dalam mitogenom 16 jamur berbeda filum, termasuk garis keturunan jamur basal dan jamur yang lebih tinggi meskipun penyesuaian kecil dari nomenklatur diperlukan agar sesuai dengan kondisi khusus tertentu. Nomenklatur juga berpotensi untuk menamai intron mitokondria tumbuhan/protista/hewan. Kami berharap studi masa depan mengikuti nomenklatur yang diusulkan untuk memastikan perbandingan langsung di berbagai studi.


Genom

Salah satu fitur yang menentukan dan penting dari kehidupan adalah materi genetik. Sebuah organisme genom adalah set lengkap semua gen dan materi genetik yang ada dalam organisme atau sel individu itu. Seringkali kita memikirkan gen dalam istilah gen penyandi protein, atau gen yang ditranskripsi menjadi mRNA dan kemudian diterjemahkan menjadi protein. Namun, genom terdiri dari lebih dari sekadar gen penyandi protein. Selain itu, fitur genom prokariotik dan eukariotik berbeda dalam hal ukuran dan konten.
Gambar di bawah menunjukkan rentang ukuran genom yang berbeda dalam kelompok taksonomi kehidupan yang berbeda. Perhatikan bahwa, secara umum, genom prokariotik lebih kecil dari genom eukariotik. Namun, ukuran genom eukariotik sangat bervariasi dan tidak terkait dengan “kompleksitas.” organimsal Lihat diagram ini saat Anda membaca tentang perbedaan dan persamaan antara genom prokayotik dan eukariotik.

Ukuran genom, dari Wikipedia

Genom Prokariotik

  • Genom Bakteri dan Archaea kompak pada dasarnya semua DNA mereka “fungsional” (mengandung gen atau elemen pengatur gen).
  • Ukuran genom prokariotik berkisar dari sekitar 1 juta hingga 10 juta pasangan basa DNA, biasanya dalam satu, bundar kromosom
  • Gen dalam jalur biokimia atau jalur pensinyalan sering dikelompokkan bersama dan diatur menjadi operon, di mana mereka ditranskripsi sebagai mRNA tunggal yang diterjemahkan untuk membuat semua protein dalam operon.
  • Ukuran genom prokariotik secara langsung berkaitan dengan kemampuan metabolisme mereka – semakin banyak gen, semakin banyak protein dan enzim yang mereka buat.

Genom Eukariotik

  • Ukuran genom eukariota sangat bervariasi, bahkan dalam kelompok taksonomi (disebut paradoks nilai-C).
  • Genom eukariotik dibagi menjadi beberapa kromosom linier, setiap kromosom mengandung molekul DNA dupleks linier tunggal.
  • Gen eukariotik dalam jalur biokimia atau sinyal tidak diatur menjadi operon satu mRNA membuat satu protein.
  • Banyak gen eukariotik (kebanyakan gen manusia) terbelah intron non-coding harus dihilangkan dan ekson disambung bersama untuk membuat mRNA matang. Intron adalah urutan “intervensi” dalam gen yang tidak mengkode protein. Gambar di bawah menunjukkan wilayah gen yang diperbesar yang menyoroti ekson dan intron bergantian.

Satu gen ditranskripsi, kemudian disambung dengan cara yang berbeda untuk menghasilkan mRNA yang mengkode protein terkait dari kombinasi ekson yang berbeda. http://www.genome.gov/Images/EdKit/bio2j_large.gif

Apa yang menyebabkan variasi dalam ukuran genom?
Tidak ada korelasi yang baik antara ukuran tubuh atau kompleksitas suatu organisme dan ukuran genomnya. Genom eukariotik yang diurutkan sejauh ini memiliki antara

30.000 gen penyandi protein, atau kurang dari 10 kali lipat variasi jumlah gen. Genom manusia memiliki sekitar 21.000 gen penyandi protein (baru-baru ini direvisi menjadi sesedikit

19.000 gen). Oleh karena itu, variasi 10.000 kali lipat dalam ukuran genom eukariotik sebagian besar disebabkan oleh jumlah DNA non-coding yang bervariasi.
Berikut adalah perbandingan cepat ukuran genom dan prediksi jumlah gen untuk pengambilan sampel eukariota:

Sangat menarik untuk dicatat bahwa manusia memiliki jumlah gen yang hampir sama dengan cacing nematoda mikroskopis, C. elegan , dan lebih sedikit gen daripada beras.

Apa yang ada dalam genom manusia?

Isi genom manusia, dari Wikipedia

  • Urutan DNA pengkode protein (ekson) terdiri kurang dari 2% dari genom manusia.
  • Intron membentuk lebih dari 1/4 genom manusia.
  • Elemen transposable dan DNA yang diturunkan darinya membentuk sekitar 1/2 dari genom manusia. Elemen transposable pada dasarnya adalah DNA “parasit” yang berada dalam genom inang, mengambil ruang dalam genom tetapi tidak memberikan kontribusi urutan yang berguna atau fungsional untuk genom. Mereka adalah transposon DNA, retrotransposon LTR, LINE dan SINE.
  • Karena mereka adalah elemen DNA parasit, elemen transposabel sangat berharga untuk mempelajari hubungan evolusioner. Jika elemen transposabel 'menyerang' genom suatu organisme, maka kemungkinan besar akan tetap berada dalam genom itu saat populasi berevolusi dan ketika spesiasi terjadi. Jika elemen transposabel yang sama hadir di lokasi yang sama dalam genom dua spesies berbeda, ini adalah bukti kuat bahwa kedua spesies tersebut memiliki nenek moyang yang sama baru-baru ini yang juga memiliki elemen transposabel dalam genomnya.
  • Satu keluarga SINE, yang disebut elemen Alu, adalah sekuens 300 nukleotida yang ada di lebih dari 1 juta kopi dalam genom manusia dan simpanse.
  • Duplikasi segmen adalah segmen DNA yang relatif panjang (> 1 kb kb = 1.000 bp) yang telah diduplikasi. Duplikasi ini membuat salinan gen yang dapat bermutasi dan memperoleh fungsi baru. Keluarga gen (misalnya, alfa dan beta-hemoglobin, mioglobin) muncul dengan cara ini.

Apakah genom manusia 80% “sampah” atau 80% berfungsi?
Publikasi data dan makalah terbaru dari proyek ENCODE, survei sistematis tentang variasi dan aktivitas genom manusia dari modifikasi kromatin hingga transkripsi, telah mengklaim bahwa, bertentangan dengan kepercayaan sebelumnya, sepenuhnya 80% genom manusia memiliki setidaknya beberapa aktivitas biokimia, seperti transkripsi (The ENCODE Project Consortium, 2012). Memang, banyak RNA kecil, yang disebut microRNAs (miRNAs) dengan peran pengaturan penting ditranskripsi dari daerah intergenik. Namun, miRNA ini dan RNA pengatur lainnya terdiri kurang dari 1% genom manusia, dan penelitian lain menunjukkan bahwa hanya 10% genom yang tampaknya tunduk pada beberapa kendala evolusi (tinjauan oleh Palazzo dan Gregory, 2014).

pengurutan DNA
Proyek genom manusia diselesaikan oleh bank besar pengurutan otomatis yang menggunakan teknologi pengurutan dideoksi Sanger. Namun, dalam beberapa tahun terakhir, teknologi pengurutan paralel yang masif telah menurunkan biaya dan throughput pengurutan DNA jauh lebih cepat daripada peningkatan kecepatan dan daya komputasi (Hukum Moore).

Implikasi untuk dapat memperoleh sekuens DNA dalam jumlah besar dengan cepat dan murah memiliki implikasi yang mengejutkan bagi penelitian biologi di segala bidang, dan bagi kesehatan manusia. TedTalk di bawah ini oleh Richard Resnick membahas beberapa aplikasi:


Hasil dan Diskusi

Keragaman genetik mitokondria di seluruh S. cerevisiae populasi

Kami menjelajahi 1011 S. cerevisiae isolat sequencing [47] untuk menyelidiki keragaman dan evolusi genom mitokondria intraspesifik. Karena genom mitokondria mencakup daerah intergenik panjang yang kaya akan AT yang sulit untuk dibandingkan, pertama-tama kami berfokus pada delapan urutan DNA pengkode mitokondria (CDS). Dari 698 rakitan genom de novo, kami mengumpulkan delapan CDS lengkap. Dari jumlah tersebut, 553 isolat juga memiliki urutan mitokondria yang lengkap atau hampir lengkap. Subset dari 353 urutan genom tidak memiliki basis ambigu di seluruh CDS (File tambahan 1: Gambar S1, File tambahan 2: Tabel S1). Kami memperkirakan keragaman genetik global dengan rata-rata divergensi berpasangan π. Secara keseluruhan, kami mengamati keragaman yang lebih rendah dalam pengkodean nuklir (π

0,003) [47] dibandingkan dengan urutan mitokondria (π

0,0085, File tambahan 2: Tabel S2), yang kontras dengan apa yang sebelumnya diamati untuk spesies ragi lainnya (File tambahan 1: Gambar S2). Tren yang berlawanan ini, lebih mirip dengan pola yang diamati pada hewan daripada pada jamur [19, 48], konsisten dengan S. cerevisiae mengalami evolusi yang cepat dari gen mitokondria setelah seluruh genom duplikasi [49].

Kami mengamati perbedaan perbedaan genetik yang tajam dari genom nuklir dan mitokondria di antara isolat liar dan peliharaan. Dalam clades liar, meskipun divergensi nuklir lebih tinggi (hingga 1,1% pada tingkat CDS), jarak genetik CDS mitokondria mencapai maksimum

0,4% dari divergensi nuklir dan dataran tinggi sesudahnya. Sebaliknya, divergensi urutan mitokondria antara clade peliharaan memiliki peningkatan yang lebih besar, mencapai maksimum pada divergensi nuklir yang lebih rendah (File tambahan 1: Gambar S3). Perbedaan variasi ini diamati di semua CDS mitokondria yang nilainya π secara sistematis lebih tinggi di domestikasi dibandingkan dengan isolat liar.

CDS terpendek, ATP8 dan ATP9, memiliki proporsi situs polimorfik terendah (

2%) dan nilai terendah dari π (0,003 atau kurang) dan tidak memiliki mutasi yang tidak identik. Sebaliknya, COX1 dan COX2 sangat polimorfik. Meskipun COX1 memiliki situs polimorfik tertinggi (8%), COX2 memiliki tertinggi π nilai (0,0163, Tabel 1). Kami menggunakan analisis diskriminan komponen utama (DAPC) [50] untuk mengevaluasi kontribusi gen spesifik untuk mengklasifikasikan 'haplotipe' mitokondria dan pengelompokan populasi. Kami menghitungnya ATP6 dan COX2 masing-masing menyumbang 38% dan 28% dari pengelompokan populasi. Pengamatan ini mendukung meluasnya penggunaan COX2 dalam filogeni mitokondria (Gbr. 1a) [37, 38, 51, 52].

Distribusi alel di seluruh CDS mitokondria. A Distribusi alel mayor (biru) dan minor (merah) untuk 259 posisi polimorfik di 234 S. cerevisiae profil lengkap yang unik (termasuk 353 isolat). Profil diurutkan menurut hubungan filogenetiknya menggunakan pohon filogenetik tetangga yang bergabung (sisi kiri). B Jumlah alel unik untuk setiap CDS mitokondria menunjukkan perbedaan dramatis antara gen

Selanjutnya, kami membuat database alel non-redundan. Kami mengamati sejumlah variabel alel CDS yang berbeda (Gbr. 1b), menghasilkan proporsi profil alel unik yang tinggi (234 dari 353 isolat, File tambahan 1: Gambar S1). Kami menggunakan profil alelik yang tidak berlebihan ini sebagai proksi untuk menyelidiki distribusi genom mitokondria dalam populasi. Secara global, kami mengamati tumpang tindih yang buruk antara garis keturunan filogenetik genom mitokondria dan nuklir [47] dengan beberapa pengecualian yang mencakup garis keturunan genom nuklir dekat-ke-klonal, yang memiliki profil mitokondria spesifik. Pengecualian ini termasuk subclade Sake, dua subclade Wine/Eropa klinis (amplifikasi Y′ dan S. boulardii), Amerika Utara dan clades Malaysia yang terisolasi secara reproduktif [53]. Sebaliknya, clade asal campuran [47], yang memiliki ekologi yang sangat beragam (misalnya toko roti, bir, tanaman, hewan, air, sampel klinis) dan asal geografis (misalnya Eropa, Asia, Timur Tengah, Amerika), menunjukkan intramitokondria yang rendah. -clade perbedaan meskipun variasi genom nuklir substansial (File tambahan 1: Gambar S4). Memang, di seluruh clade asal campuran, hanya profil gen mitokondria yang sangat mirip yang terpisah, dengan varian terbatas pada COX1 dan VAR1, menghasilkan yang sangat rendah π (0,00008) dibandingkan dengan clade lainnya (

0,001, File tambahan 2: Tabel S2).

NS VAR1 gen adalah sangat bervariasi, sangat kaya AT dan rentan terhadap mutasi dan indel yang tidak identik. Indel ini sebagian besar mewakili elemen mirip-byp kaya GC yang dapat menyebabkan lompatan dalam translasi protein pada spesies ragi lainnya [33]. Dua posisi dijelaskan, satu bernama 'umum' dan lainnya hilir dengan GC cluster dalam orientasi terbalik [54]. Kami mengidentifikasi 35 varian alel dari VAR1 gen yang menyimpan dua kelompok ini dalam 117 isolat, terutama milik kelompok mosaik (n = 52) (Berkas tambahan 2: Tabel S1). Sementara sebagian besar kasus yang dilaporkan menyembunyikan cluster GC baik di tempat umum (n = 91, terhitung 18 berbeda VAR1 alel), atau di kedua posisi (n = 6, melintasi 4 VAR1 alel) [54], sebagian besar varian alelik yang diamati di sini hanya menyimpan gugus GC di situs kedua (n = 19, melintasi 13 VAR1 alel). Kami juga menemukan dua varian baru, satu dengan klaster GC pada posisi umum tetapi dalam orientasi terbalik (2 isolat) dan yang kedua dengan klaster GC dalam duplikasi tandem pada posisi kedua (3 isolat).

Selain ORF kanonik, kami mengkarakterisasi empat ORF non-kanonik F-SceIV (AKHIR intron), F-SceI (RF3), RF2 dan F-SceIII (RF1) [31, 32]. F-SceIV relatif jarang pada populasi (198 isolat), sedangkan F-SceI, RF2 dan F-SceIII tersebar lebih banyak (masing-masing 447, 542 dan 477 isolat). Ketiga ORF ini diketahui mengandung cluster GC, yang sering memperkenalkan pergeseran bingkai dalam urutan. Di dalam F-SceIII, kami mengidentifikasi tiga posisi cluster GC. Posisi pertama sangat jarang (43 isolat), dan dalam dua kasus, gugus GC terpotong. Dua kelompok GC lainnya jauh lebih berlimpah (masing-masing pada 277 dan 206 isolat). Kami mengidentifikasi 6 posisi cluster GC yang berbeda di keduanya RF2 dan F-SceI (lihat File tambahan 2: Tabel S1). Secara keseluruhan, hasil ini mengungkap variabilitas tinggi dari urutan mitokondria di seluruh S. cerevisiae populasi alami.

Campuran luas genom mitokondria

Kami menyelidiki struktur populasi genom mitokondria menggunakan delapan CDS gabungan untuk menghitung jaringan filogenetik menggunakan SPLITSTREE [55]. Dataset terdiri dari 239 profil CDS non-redundan, dengan 234 S. cerevisiae isolat dengan urutan CDS lengkap dan lima S. paradoksus perwakilan [56] sebagai kelompok luar. Jaringan terjalin yang dihasilkan menunjukkan interkonektivitas yang kuat dari urutan, yang mendasari seringnya rekombinasi historis (Gbr. 2a). Sebaliknya, pohon filogenetik klasik tidak dapat secara konsisten mengelompokkan isolat (Gbr. 2b). Menggunakan ADMIXTURE [57], kami mengamati bahwa tepi berlawanan dari pohon jatuh dalam populasi yang sama untuk rendah K nilai (K = 2-3), selanjutnya mendasari pengelompokan yang buruk.

Filogeni genom mitokondria kompleks. Hanya S. cerevisiae isolat dengan data CDS lengkap telah digunakan (n = 353) selain lima S. paradoksus isolat yang digunakan sebagai outgroup. A Jaringan filogenetik dari urutan CDS gabungan yang tidak berlebihan (n = 237 profil) menghasilkan jaringan yang sangat terkait yang didorong oleh rekombinasi dengan beberapa kelompok galur yang terkait erat. B Pohon berakar (kiri) menunjukkan topologi yang lemah dengan beberapa node (merah) dengan nilai bootstrap lebih dari 75. Analisis ADMIXTURE komponen genom (kanan) dengan K mulai dari 2 hingga 15 menegaskan tingkat mosaikisme yang tinggi. Garis keturunan Taiwan yang sangat berbeda (titik hijau) tidak berbeda dengan garis keturunan lain berbeda dengan filogeni genom nuklir

Struktur populasi mitokondria tampaknya kurang mencerminkan pengelompokan yang diperoleh dari genom nuklir. Misalnya, garis keturunan Taiwan awal yang berbeda berdasarkan genom nuklir tidak menunjukkan jarak urutan yang lebih tinggi. Namun, isolat yang termasuk dalam kelompok mosaik dari S. cerevisiae populasi menunjukkan tingkat pencampuran tertinggi, menunjukkan bahwa perkawinan sedarah telah berdampak pada genom mitokondria dan nuklir.

Kami kemudian menghitung koefisien konkordansi 'W' menggunakan metrik kesesuaian antara matriks jarak (CADM) [58] menjadi 0,79, dengan 0 menunjukkan ketidaksepakatan lengkap dan 1 kesepakatan lengkap antara matriks jarak. Nilai ini menunjukkan kesesuaian yang relatif baik antara jaringan filogenik genom mitokondria dan nukleus. Hal ini kemungkinan didorong oleh isolat dengan urutan mitokondria yang sangat dekat sering juga memiliki urutan genom nuklir yang sama, sedangkan cabang utama dari pohon mitokondria sumbang. Kami selanjutnya membandingkan pohon filogenetik dan jaringan berdasarkan rangkaian gabungan yang berasal dari 8 CDS mitokondria dan 8 gen nuklir yang sebelumnya digunakan untuk studi filogenetik [59, 60] dalam pilihan 14 isolat (File tambahan 1: Gambar S5).Secara konsisten, urutan mitokondria menghasilkan jaringan yang lebih luas, menyiratkan struktur filogenetik yang kurang jelas dan campuran yang lebih jelas, dengan garis keturunan bercabang awal termasuk dalam garis keturunan non-Cina di seluruh dunia. Secara keseluruhan, hasil kami menyoroti pemisahan yang jelas dalam sejarah evolusi dari dua genom yang hidup berdampingan, dan campuran genom mitokondria yang luas memberikan dukungan tambahan untuk pewarisan mitokondrianya yang membutuhkan replikasi yang digerakkan oleh rekombinasi [34, 61, 62].

Introgresi antarspesies mtDNA jarang terjadi

Kami baru-baru ini menggambarkan empat clade (yaitu Alpechin, Agave Meksiko, Guyana Prancis, dan bioetanol Brasil) dengan S. paradoksus introgresi antarspesies dalam genom nuklir [47]. Kami menganalisis CDS mitokondria untuk mencari alel yang masuk. Empat clade dengan introgresi genom nuklir yang melimpah tidak menunjukkan apapun S. paradoksus alel mitokondria. Namun demikian, dua isolat dari Amerika (CQS, YCL) dan satu dari Afrika (ADE), semuanya secara genetik terkait dengan Guyana Prancis dan Agave Meksiko, memiliki dua pola yang berbeda dari S. paradoksus introgresi mitokondria. Kami mengambil set CDS lengkap untuk dua di antaranya (CQS dan YCL), sedangkan yang ketiga (ADE) tidak lengkap tetapi sangat dekat dengan YCL. Introgresi mitokondria pada strain YCL (YJM1399) telah dilaporkan, tetapi tidak ada analisis lebih lanjut yang disajikan [28]. Kami menghasilkan satu set penanda polimorfik (metode), untuk secara akurat mengidentifikasi batas introgresi. NS S. cerevisiae alel utama diidentifikasi dari 1011 isolat, sedangkan untuk S. paradoksus, mereka berasal dari 23 isolat Amerika Utara yang urutan kromosom lengkapnya tersedia [21, 56]. Indo S. paradoksus isolat tidak dimasukkan karena kesamaannya dengan S. cerevisiae urutan, kemungkinan karena peristiwa introgresi kuno dari S. cerevisiae ke S. paradoksus [21, 56, 63]. Kami menghasilkan katalog 110 posisi polimorfik dan menurunkan alel yang berbeda antara kedua spesies. Beberapa gen dalam dua isolat ini dikatalogkan sebagai introgresi sebagian atau seluruhnya (Gbr. 3a). Karena frekuensi beberapa alel mendekati 50% dan seringkali alel yang kurang umum dari satu spesies adalah alel yang lebih umum dari yang kedua, ada kemungkinan untuk menyebut introgresi positif palsu. Namun demikian, seri panjang berturut-turut dari S. paradoksus penanda di TONGKOL, ATP9, COX1, COX2 dan COX3 gen di YCL, serta gen di TONGKOL, COX1, COX2 dan COX3 gen di CQS, cenderung asli. Tidak adanya jejak introgresi di S. cerevisiae isolat dari Eropa dapat dijelaskan dengan kesamaan urutan yang lebih tinggi dengan Eropa S. paradoksus, yang mencegah deteksi. Namun, introgresi antara S. cerevisiae dan Eropa S. paradoksus isolat juga dapat dicegah dengan non-kolinearitas dalam struktur genom mitokondria mereka yang kemungkinan mengganggu rekombinasi [56].

Langka S. paradoksus introgresi. A Penanda polimorfik antara S. cerevisiae dan S. paradoksus melintasi CDS mitokondria digunakan untuk mengidentifikasi peristiwa introgresi. Batas introgresi ditetapkan sebagai titik tengah antara penanda. Dua baris bawah menunjukkan frekuensi dalam populasi alel mayor atau konsensus (AF), pada posisi dan spesies tertentu. B Jumlah ORF yang diintrogresi dalam genom nukleus tidak berkorelasi dengan persentase penanda genetik S. paradoksus dalam CDS mitokondria. Hanya isolat dengan data CDS lengkap yang tidak ambigu yang dimasukkan (n = 353). Posisi isolat dilaporkan dalam A dilingkari merah

Kami selanjutnya memperluas analisis 110 situs polimorfik menjadi 353 isolat dengan CDS yang dirakit penuh. Kami mengamati kasus potensial tambahan dari introgresi mitokondria. Urutan mitokondria YCL isolat menampung lebih dari 50% S. paradoksus penanda, mungkin menunjukkan genom rekombinan yang berasal dari peristiwa transfer baru-baru ini. Selain itu, sejumlah kecil S. paradoksus penanda ditemukan di masing-masing S. cerevisiae mengisolasi, mungkin karena penyortiran garis keturunan yang tidak lengkap. Secara keseluruhan, jumlah S. paradoksus penanda dalam genom mitokondria tidak berkorelasi dengan jumlah ORF introgressed dalam genom nuklir (Gbr. 3b), menunjukkan bahwa aliran gen antarspesies independen karena asal dan/atau nasib yang berbeda.

Keuntungan dan kerugian intron selama evolusi dan penyebaran

Dua gen penyandi protein mitokondria, TONGKOL dan COX1, menyimpan intron di banyak situs, dan kami menjelajahi pola ada-tidaknya mereka di seluruh koleksi 1011 isolat. COX1 intron ditemukan pada frekuensi yang bervariasi (median 0,48) dengan profil kehadiran-ketidakhadiran yang sangat bervariasi (Gbr. 4a). Pola intron lebih lanjut mendukung variabilitas rendah dalam garis keturunan Amerika Utara, Malaysia, dan asal campuran (File tambahan 1: Gambar S6). Sebaliknya, kelompok-kelompok mosaik yang terkait secara longgar (klaster M1, M2 dan M3) menunjukkan tingkat konservasi intron yang paling rendah, konsisten dengan latar belakang genetik campurannya.

Filogeni intron mendasari peristiwa kerugian dan keuntungan. A Distribusi kehadiran dan ketidakhadiran intron tidak konsisten dengan filogeni pohon mitokondria. Intron langka bi1α dan ai3β disorot (tebal) intron ai4γ tidak ditemukan dalam koleksi yang diurutkan dan tidak ditampilkan. B Hanya 4 sekuens non-redundan yang ditemukan untuk intron cox1 ai3β. Urutan mereka tidak terkait dengan yang lain Saccharomyces spesies, yang tidak dapat digunakan untuk rooting. Keunikan distribusi intron ini dapat menunjukkan peristiwa perolehan khusus garis keturunan. C Pohon berakar TONGKOL intron bi1α menggunakan S. paradoksus dan S. eubayanus urutan sebagai outgroup. Node dengan nilai bootstrap di bawah 0,5 telah diciutkan. Kehadirannya di beberapa garis keturunan Asia yang sangat berbeda dan di tempat lain Saccharomyces spesies konsisten dengan hilangnya intron setelah penyebaran di luar China. Isolat CQS, yang menyimpan introgresi baik dalam genom nuklir maupun mitokondria, juga berasal dari S. paradoksus asal. Ini kompatibel dengan urutan eksonik hilir, yang juga diintrogresi

NS COX1 frekuensi intron dalam populasi konsisten dengan laporan sebelumnya [28], mulai dari 26 hingga 86%. Kami mengidentifikasi total 103 yang berbeda COX1 kombinasi intron dengan dua intron, ai4β dan ai5α, yang tidak pernah ditemukan bersama (ai4β ada di 89 sedangkan ai5α di 85, dari 408 alel). Mengingat hubungan antara posisi intronik yang berjarak dekat ini, mereka dibesarkan dalam dua populasi leluhur atau tidak mungkin disatukan oleh rekombinasi atau keberadaan ganda secara fungsional tidak sesuai. Dua tambahan COX1 intron, ai3β dan ai4γ, sangat jarang di S. cerevisiae populasi. Sementara aI4γ juga tidak ada di sebagian besar terkait Saccharomyces spesies, ai3β intron hadir di semuanya. Satu-satunya kejadian ai3β yang dilaporkan sebelumnya di S. cerevisiae berada di isolat YCL, yang juga mengandung S. paradoksus introgresi di sekitar posisi intron di COX1. Namun, meskipun intron ai3β hadir di S. paradoksus, urutan intron ai3β dari YCL lebih dekat dengan yang ditemukan di Lachancea meyersii [28]. Selain alel YCL, kami menemukan tiga varian ai3β lainnya, semuanya terkait dengan Lachancea urutan. Dua varian hadir dalam isolat YCL dan ADE dengan kelimpahan S. paradoksus introgressions, sedangkan strain CQS memiliki versi terkait. Intron ai3β tambahan terdapat pada dua isolat Asia dan 19 isolat Guyana Prancis, yang cladenya sangat terintrogresi dari S. paradoksus (Gbr. 4b). Kehadiran intron ai3β di antara garis keturunan yang sangat introgresi ini menunjukkan peristiwa transfer lateral yang terpisah dari Lachancea, meskipun tidak dapat dikesampingkan bahwa intron ini awalnya ditransfer dari Lachancea, atau genus terkait, untuk S. paradoksus sebelum introgresi terjadi.

Sebaliknya, enam TONGKOL intron lebih seragam hadir (frekuensi mulai dari 88 hingga 99%, Gambar. 4a) dengan satu-satunya pengecualian dari bi1α yang baru-baru ini dijelaskan [28] terjadi pada frekuensi rendah (

5%). Anehnya, bi1α adalah umum di antara clades Asia bercabang awal [47]. Isolat lain menyimpannya, terutama isolat mosaik, tetapi memisahkan pada frekuensi rendah di clades non-Asia. Kehadirannya di beberapa Saccharomyces spesies outgroup dan dalam S. cerevisiae garis keturunan awal yang berbeda menunjukkan kerugian sebelum atau selama penyebaran di luar Asia. Intron bisa saja diperkenalkan lagi, dari kontak sekunder dengan garis Asia bi1α-positif. Untuk menguji hipotesis ini, kami membangun pohon filogenetik menggunakan semua urutan intron dan kelompok luar bI1α (Gbr. 4c). Pohon filogenetik bi1α menunjukkan lebih banyak varian sekuens Asia dibandingkan dengan yang non-Asia, yang terutama mengelompok dalam dua kelompok yang berasal dari cabang terpisah dari intron Asia, konsisten dengan beberapa peristiwa perolehan kembali yang terpisah pada populasi di seluruh dunia.

Intron self-splicing telah dikaitkan dengan peningkatan frekuensi mutasi pada batas intron/ekson [29]. Kami memindai urutan eksonik di jendela 70 nukleotida baik hulu maupun hilir setiap intron di COX1 dan TONGKOL. Secara konsisten, sangat mobile COX1 intron dikaitkan dengan frekuensi alel alternatif yang lebih tinggi dalam jendela 20-nukleotida yang berdekatan dengan batas penyisipan (File tambahan 1: Gambar S7).

Penataan ulang struktural jarang terjadi pada genom mitokondria

Selanjutnya, kami menyelidiki ukuran dan keberadaan variasi struktural di seluruh genom mitokondria. Mempertimbangkan 250 rakitan sirkular, ukuran genom mitokondria berkisar antara 73.450 hingga 95.658 bp (File tambahan 2: Tabel S3). Karena kandungan gen sepenuhnya dilestarikan di antara isolat-isolat ini, plastisitas ukuran tinggi ini didorong oleh variabilitas wilayah intergenik (berkisar antara 45.254 hingga 69.807 bp) dan kandungan intron (berukuran mulai dari 7748 hingga 20.024 bp) (File tambahan 1: Gambar S8). Kedua faktor tersebut sangat berkorelasi dengan total panjang genom mitokondria (R 2 0,769 dan 0,756, masing-masing terkait korelasi P nilai < 2.0E−04) (File tambahan 1: Gambar S9). Ukuran genom mitokondria bervariasi di antara isolat dari garis keturunan yang sama.

Analisis synteny di 553 isolat dengan genom pada perancah tunggal menyoroti empat inversi genom yang berbeda (Gbr. 5, File tambahan 1: Gambar S10). Dua galur dari garis keturunan bir Anggur/Eropa dan Ale, BKI dan AQT, berbagi inversi wilayah yang berkisar dari trnW ke COX2 gen, sementara tiga galur Anggur/Eropa yang terkait erat (AIM, BNG dan CFB) berbagi inversi yang lebih besar yang juga mencakup gen 15S rRNA (Gbr. 5b, c). Inversi juga ditemukan di BDN (bir Afrika) dan CDN (Ekuador) dan terkait dengan daerah mulai dari 15S rRNA atau COX1 gen, masing-masing, untuk ATP6 gen (Gbr. 5d, e). Semua batas inversi dipetakan ke daerah intergenik kaya AT yang sangat berulang, yang mencegah delimitasi yang tepat. Menariknya, semua inversi ini menyebabkan hilangnya fitur yang dimiliki oleh sebagian besar ragi ascomycetous, yaitu bahwa semua gen penyandi protein mitokondria ditranskripsi dari untai DNA yang sama [64]. Namun, fungsi mitokondria tampaknya tidak terganggu, karena isolat ini mempertahankan kemampuan respirasinya.

Varian struktural dalam genom mitokondria. Skema organisasi genom mitokondria yang dijelaskan untuk gen penyandi protein dan gen rRNA dan tRNA. Perkiraan lokasi breakpoint dari inversi ditunjukkan oleh garis putus-putus. Organisasi genom mitokondria ini terkait dengan isolat yang berbeda. A S288C (dibagi oleh sebagian besar isolat). B AQI dan BKI. C AIM, BNG dan CFB. D CDN. e BDN

Laporan terbaru menunjukkan bahwa perubahan urutan gen dalam genera ragi dapat dikaitkan dengan ukuran genom mitokondria [65]. Selagi Lachancea dan Yarrowia clades, dengan genom mitokondria kurang dari 50 kb, menunjukkan synteny tinggi di seluruh spesies [66, 67], Saccharomyces clade (ukuran genom mitokondria & gt 65 kb) lebih rentan terhadap penataan ulang [65]. Memang penataan ulang struktural juga terdeteksi dalam genom mitokondria dari S. paradoksus [56]. Hasil kami menunjukkan bahwa variasi struktural mtDNA dapat ditoleransi, mungkin terbatas pada peristiwa seimbang yang tidak mengubah nomor salinan CDS.

Variasi dalam jumlah salinan mtDNA mengungkapkan isolat mungil alami

Jumlah salinan mitokondria dapat secara dramatis mempengaruhi fenotipe tetapi sulit diukur dengan metode throughput tinggi. Kami memperkirakan jumlah salinan mtDNA menggunakan cakupan relatif dari ATP6, COX2 dan COX3, yang menyediakan pemetaan yang kuat. Jumlah genom mitokondria umumnya konstan di seluruh clades (File tambahan 1: Gambar S11), tanpa perbedaan signifikan antara garis keturunan jinak dan liar, dengan median 18 genom mitokondria untuk setiap genom nuklir haploid. Namun variasinya sangat tinggi di seluruh populasi, mencapai lebih dari 80 eksemplar. Seperti dilaporkan sebelumnya [68], jumlah salinan mtDNA meningkat dengan ploidi secara linier, dengan strain diploid memiliki sekitar dua kali lipat jumlah genom mitokondria dan triploid memiliki tiga kali jumlah, dibandingkan dengan sel haploid (Gbr. 6a).

Variasi alami dalam jumlah salinan genom mitokondria. A Jumlah salinan genom mitokondria meningkat secara linier dengan konten genom nuklir. Lima belas isolat mungil alami terdeteksi. Jumlah isolat ditunjukkan di atas plot yang sesuai. B Uji bercak pada sumber karbon yang tidak dapat difermentasi (YPEG) mengkonfirmasi isolat mungil alami (sebagian dari isolat yang diuji ditunjukkan). C Aktivitas mitokondria (sebagai potensial membran) sangat diubah oleh kurangnya genom mitokondria (simbol hitam versus abu-abu), sementara volume tetap tidak berubah. D Variasi kurva pertumbuhan galur isogenik dengan mitokondria normal (rho + , red), petite (rho 0 , green) dan petite yang menyimpan mutasi penekan ATP2G1099T (rho 0 ATP2 sup, biru). Di antara petite alami, kami dapat mengidentifikasi isolat dengan waktu penggandaan tinggi (DT, garis hitam solid) dan isolat dengan laju pertumbuhan pulih, sebanding dengan petite dengan mutasi penekan (garis putus-putus hitam). e Waktu generasi untuk isolat dengan CN mitokondria yang berbeda menunjukkan setidaknya dua isolat mungil alami yang tampaknya telah memulihkan tingkat pertumbuhan normal pada media kaya. Kurva pertumbuhan untuk isolat yang dilingkari ditunjukkan pada: D

Kehadiran genom mitokondria diasumsikan sebagai keadaan alami dari S. cerevisiae sel, yang didefinisikan sebagai rho + . Namun, galur dapat kehilangan fungsionalitas mitokondria dalam kondisi yang berbeda baik dengan mengumpulkan mutasi (rho ) atau dengan hilangnya total (rho 0 ) genom mitokondria. Mutan ini didefinisikan sebagai 'petite sitoplasma' (yaitu 'kecil') karena mereka membentuk koloni kecil di media yang dapat difermentasi karena pertumbuhannya yang lambat. Karena produksi ATP yang dimediasi respirasi terganggu pada galur mungil, mereka tidak dapat tumbuh dalam sumber karbon yang tidak dapat difermentasi. Kami mengidentifikasi 15 isolat petites alami yang potensial (File tambahan 2: Tabel S1 dan S4) dari analisis cakupan dan mengkonfirmasi bahwa mereka tidak dapat tumbuh pada media berbasis sumber karbon yang tidak dapat difermentasi (Gbr. 6b). Semua isolat mungil tampak rho 0 , dengan pengecualian dua isolat rho : ABM yang dipertahankan TONGKOL gen dan AHV yang menjaga ATP9 dan VAR1 gen (File tambahan 2: Tabel S4). Isolat rho ini, dengan lima rho 0 petite lainnya, adalah haploid yang diturunkan dari laboratorium (HO dihapus), dan karena manipulasi regangan dapat menyebabkan kondisi mitokondria mereka, mereka dikeluarkan dari analisis lebih lanjut. Kami memeriksa pilihan empat strain untuk aktivitas mitokondria (diukur sebagai potensial membran) dan volume. Kami memasukkan sebagai kontrol strain rho + tipe liar dan dua varian turunan rho 0 dengan satu memakai mutasi tambahan (ATP2 G1099T), yang mengembalikan sebagian pertumbuhan di media kaya (Michael Breitenbach, data tidak dipublikasikan). Seperti yang diharapkan, data aktivitas menunjukkan ketidakmampuan untuk tumbuh pada sumber karbon yang tidak dapat difermentasi (YPEG). Akan tetapi, tidak ada variasi yang signifikan antara volume mitokondria dari isolat tipe liar dan petites, konsisten dengan pentingnya mempertahankan mitokondria juga pada galur mungil (Gbr. 6c, File tambahan 2: Tabel S4). Kami menyelidiki apakah petite alami ini memiliki cacat waktu dua kali lipat dengan mengukur kurva pertumbuhan di media kaya (YPD). Strain mungil menunjukkan tingkat pertumbuhan yang berbeda, dengan dua di antaranya memiliki waktu penggandaan yang mendekati normal (Gbr. 6d, e File tambahan 2: Tabel S4). Strain ini tidak memiliki keduanya ATP2 G1099T juga tidak ATP3 Polimorfisme G348T yang sebagian mengembalikan pertumbuhan di media kaya (Michael Breitenbach, data tidak dipublikasikan) karenanya, mutasi kompensasi lainnya mungkin sebagian memulihkan pertumbuhan pada galur ini. Kami tidak dapat mengesampingkan bahwa fenotipe mungil mungkin telah meningkat selama manipulasi laboratorium, namun, memulihkan pertumbuhan yang mendekati normal pada beberapa isolat ini kemungkinan memerlukan perbanyakan ekstensif dengan ukuran populasi besar yang menunjukkan peristiwa hilangnya mtDNA yang lebih jauh. Sporulasi diketahui terganggu pada isolat mungil [69], dan secara konsisten, semua isolat mungil alami tidak bersporulasi.


Diskusi

Kami mengurutkan genom mitokondria dari Liriodendron tulipifera, yang pertama dari garis keturunan magnoliid besar (>10.000 spesies), untuk mengisi celah filogenetik yang penting dan memberikan kelompok luar untuk perbandingan dengan garis keturunan monokotil dan eudikotil yang dipelajari sebelumnya. Posisi filogenetik dari Liriodendron memungkinkan kami untuk mempolarisasi perubahan pada monokotil dan eudikotil, yang mengarah pada pemahaman yang lebih rinci tentang pola hilangnya pengeditan RNA, perolehan tRNA plastid, dan konservasi kluster gen di seluruh tanaman berbunga. Upaya ini didukung oleh fakta bahwa Liriodendron genom mitokondria berkembang sangat lambat dalam hal urutan gen, isi dan urutan, memungkinkan melihat belum pernah terjadi sebelumnya ke dalam evolusi awal genom mitokondria tanaman. Dengan demikian, dalam banyak cara yang mencolok, Liriodendron memiliki genom mitokondria yang "memfosil", setelah mengalami sedikit perubahan selama 100 juta tahun terakhir.

Wawasan tentang akuisisi tRNA turunan plastid

Bukti yang disajikan di sini menunjukkan sejarah evolusi yang berbeda dari tRNA yang diturunkan dari plastid mitokondria dalam angiospermae daripada yang didalilkan sebelumnya [16, 54], umumnya mendorong kembali asal-usulnya lebih awal dalam evolusi tanaman berbunga (Gambar 2). Sedangkan Wang dkk.[54] mengemukakan asal baru dari trnP(TGG)-cp di cabang yang menuju ke Nicotiana, kehadirannya di monokotil, eudikotil dan sekarang magnoliids (Gambar 2) menunjukkan bahwa akuisisi kemungkinan mendahului nenek moyang dari tiga garis keturunan ini. Demikian pula dengan kehadiran trnD(GTC)-cp di dalam Liriodendron kemungkinan mendorong asal usul tRNA itu kembali dari nenek moyang eudikotil ke suatu waktu setelah divergensi gymnosperma/angiosperma. Perlu dicatat, bagaimanapun, bahwa keuntungan paralel dalam magnoliids dan eudicots dimungkinkan dalam kasus ini juga. Ukuran kecil dan sifat gen tRNA yang dilestarikan sedemikian rupa sehingga hipotesis yang bersaing ini sulit, jika bukan tidak mungkin, untuk diuji dengan analisis filogenetik.

Kita tahu dari genom mitokondria angiosperma lain bahwa transfer sekuens dari genom plastid sering terjadi pada skala waktu evolusi [14, 55] dan kadang-kadang peristiwa transfer ini mengarah pada perolehan tRNA fungsional, berdasarkan konservasi luasnya di seluruh angiosperma [56] . Namun, waktu transfer fungsional belum jelas. Karena tingkat kehilangan gen yang lambat, perubahan urutan dan fragmentasi kluster gen, Liriodendron mungkin telah mempertahankan satu atau lebih daerah DNA plastid yang berasal dari transfer urutan asli yang secara permanen menyemai beberapa tRNA plastid yang ditemukan di seluruh genom mitokondria angiosperma (Gambar 2 dan 3). Namun, interpretasi lain dimungkinkan. Misalnya, itu Liriodendron dan kebanyakan eudicots memiliki trnD(GTC)-cp (Gambar 2 dan 3A) dapat disebabkan oleh perolehan paralel independen, sekali dalam nenek moyang magnoliid dan sekali di awal evolusi eudicot.

Bagian dari alasan kami bahwa urutan turunan plastid pada Gambar 3A, B mungkin merupakan sisa-sisa transfer tRNA plastid fungsional awal adalah bahwa tRNA tampaknya lebih terkonservasi lebih kuat daripada daerah mengapit yang ditransfer secara bersamaan, menunjukkan bahwa seleksi pemurnian telah mempertahankan tRNA sementara urutan noncoding sekitarnya memburuk. Fragmen pada Gambar 3A tampaknya menjadi yang tertua, setelah mengumpulkan 15% divergensi urutan berpasangan. Mengingat tingkat evolusi urutan rendah yang disimpulkan baik dalam genom mitokondria dan plastid dari Liriodendron, transfernya mungkin berasal dari awal evolusi angiosperma. Namun, kami ragu untuk memperkirakan waktu sebenarnya dari peristiwa transfer karena beberapa alasan. Tingkat substitusi rendah saat ini dalam garis keturunan magnoliid mungkin lebih rendah daripada tingkat sebelumnya dalam evolusi angiosperma, menghalangi penggunaan jam molekuler yang ketat. Daerah yang ditransfer mengandung urutan plastid dengan DNA intergenik, serta situs sinonim dan nonsinonim, yang berada di bawah batasan berbeda dalam plastid relatif terhadap genom mitokondria, yang semakin memperumit perkiraan waktu divergensi lebar fragmen. Fragmen turunan plastid yang mengandung trnP(TTG)-cp (Gambar 3B) tampaknya lebih baru ditransfer daripada fragmen pada Gambar 3A, mengingat perbedaan keseluruhan yang lebih rendah dari urutan plastid serumpunnya. Namun, dalam kasus ini, lebih banyak fragmen terdiri dari gen penyandi protein, yang kemungkinan akan menurunkan tingkat keseluruhan divergensi urutan berpasangan setelah peristiwa transfer.

Interpretasi kami tentang waktu sejak transfer mungkin juga diperumit oleh kemungkinan bahwa evolusi bersama menghomogenkan sekuens plastid dan mitokondria homolog [57]. Misalnya, ada kemungkinan bahwa fragmen urutan turunan plastid divergen yang mengandung trnN(GTT)-cp (Gambar 3C) sudah ada di Liriodendron genom mitokondria dari transfer sebelumnya, dan regangan pendek yang mengandung tRNA “diperbarui” melalui konversi gen di antara tRNA dan salinan yang diperkenalkan kembali dari regangan DNA plastid yang sama, memulihkan identitas urutan antara salinan plastid dan mitokondria. Mekanisme evolusi terpadu ini didalilkan untuk menjelaskan pola divergensi urutan dalam rangkaian urutan turunan plastid dalam genom mitokondria Oryza dan Zea, di mana divergensi plastid/mitokondria dalam spesies kurang dari antar spesies di wilayah mitokondria, meskipun diduga berasal dari fragmen yang ditransfer [57]. Jika salinan mitokondria dan plastid berevolusi secara bersamaan, fragmen turunan plastid yang hampir identik pada Gambar 3C bisa jauh lebih tua daripada yang disarankan oleh kesamaan urutan tinggi.

Tingkat substitusi mitokondria dan plastid yang rendah pada magnoliids

Gen mitokondria di Liriodendron berevolusi pada tingkat yang sangat rendah, mengumpulkan hanya 0,035 substitusi nukleotida per situs diam per miliar tahun. Sebagai titik referensi, menggunakan pendekatan komputasi yang sama seperti yang digunakan untuk analisis laju mitokondria tanaman, kami menyelaraskan semua 13 gen pengkode protein dari genom mitokondria lengkap manusia [58], Neanderthal [59], Denisova yang terkait lebih jauh hominin [60], dan simpanse outgroup [61]. Kami menghitung tingkat substitusi diam mutlak 69,5 ssb pada manusia, menggunakan tanggal divergensi yang relevan dari Krause dkk.[60]. Tingkat substitusi mitokondria manusia lebih dari 5.000 kali lebih cepat daripada Magnolia dan 2.000 kali lebih cepat dari Liriodendron. Dengan kata lain, jumlah rata-rata divergensi mitokondria situs diam yang diperoleh selama satu generasi (25 tahun) pada manusia akan memakan waktu sekitar 50.000 tahun Liriodendron dan 130.000 tahun dalam Magnolia.

Mesin pemotong rumput dkk.[10] mengkarakterisasi tingkat substitusi diam mitokondria di sekitar 600 spesies tanaman dengan set data satu hingga lima gen dan juga menemukan bahwa Noctiflora sunyi tercepat [10]. Genom mitokondria yang berkembang paling lambat yang dilaporkan oleh Mower dkk.[10] adalah Cycas pada 0,02 +/− 0,1 ssb, mirip dengan Liriodendron tingkat yang dilaporkan di sini, dan lebih besar dari perkiraan kami untuk Magnolia menggunakan keselarasan gabungan 18-gen. Sepengetahuan kami, perkiraan laju 0,013 ssb dalam Magnolia adalah tingkat substitusi genom-lebar terendah yang dilaporkan dalam organisme mana pun, tetapi kesimpulan ini dipengaruhi oleh kesalahan terkait dalam perkiraan kami. Untuk Magnolia dan Liriodendron, interval kepercayaan kemungkinan 95% tentang estimasi ssb karena kesalahan dalam estimasi substitusi sinonim spesifik cabang masing-masing adalah 0,003 hingga 0,034 dan 0,015 hingga 0,065 (File tambahan 1: Tabel S3). Selain itu, perkiraan kami sangat bergantung pada waktu divergensi terkalibrasi fosil, yang menambahkan sumber kesalahan tambahan (misalnya, lihat [30, 31, 62, 63]). Kami menggunakan dua fosil yang diterima secara luas dalam magnoliids [64, 65], yang bersama-sama harus memberikan perkiraan waktu divergensi yang relatif akurat untuk yang relevan LiriodendronMagnolia membelah. Interval kepadatan probabilitas tertinggi 95% untuk pemisahan ini adalah 94,9 hingga 102,2 jtl, dan nilai median yang kami gunakan untuk perkiraan kami adalah 97,4 jtl (lihat Metode). Oleh karena itu, dalam penelitian kami, kesalahan dalam estimasi tingkat absolut untuk Liriodendron dan Magnolia kurang dipengaruhi oleh ketidakpastian waktu divergensi daripada oleh kesalahan dalam perkiraan kemungkinan tingkat substitusi sinonim khusus cabang.

Kami menemukan bahwa tingkat substitusi mitokondria dan kloroplas secara kasar berkorelasi dalam taksa yang diperiksa di sini (Gambar 4), sebuah pengamatan yang layak untuk studi tindak lanjut yang lebih rinci. Meskipun terlalu dini untuk memperkirakan terlalu banyak, kebiasaan pertumbuhan (tahunan vs abadi, semak vs pohon) mungkin mendasari pola ini [66]. Waktu generasi dan tingkat substitusi sinonim umumnya berkorelasi terbalik pada tanaman (untuk review, lihat [67]). Kekuatan pendorong di balik hubungan ini tidak jelas, bagaimanapun, karena tanaman tidak memiliki garis germinal khusus, sehingga waktu generasi dan jumlah pembelahan sel reproduksi per tahun tidak terkait erat seperti pada hewan. Perbedaan antara tanaman semusim dan tanaman keras, dalam hal tingkat spesiasi dan/atau metabolisme, dapat mendasari hubungan tingkat substitusi waktu generasi [67], dan mungkin diharapkan juga mempengaruhi masing-masing dari tiga genom tanaman. Ketika data genomik nuklir tersedia untuk keragaman tanaman yang lebih luas, akan menarik untuk menentukan apakah korelasi ini meluas di ketiga kompartemen genetik.

Data kami juga memulihkan rasio plastid terhadap tingkat substitusi diam mitokondria yang lebih besar daripada yang ditemukan sebelumnya [9, 13, 51, 52]. Perkiraan kami diuntungkan dari data urutan yang jauh lebih banyak dan pengambilan sampel takson yang jauh lebih luas daripada penelitian sebelumnya, yang mungkin menjelaskan perbedaan tersebut. Selain itu, mengingat kisaran 5.000 kali lipat dan 40 kali lipat dalam tingkat substitusi mitokondria dan plastid, masing-masing, yang kami temukan, tampaknya pengambilan sampel takson dapat memiliki efek besar pada rasio rata-rata yang disimpulkan. Garis keturunan mitokondria dan plastid “tingkat tinggi” tidak selalu memiliki tingkat yang meningkat secara proporsional di kedua genom organel [48], yang mengarah ke hubungan tingkat plastid-mitokondria yang ekstrem (misalnya, 0,08 in kerucut diam) (Gambar 4). Variasi gen-ke-gen dalam mitokondria [10] dan plastid [48, 53] tingkat substitusi diam juga umum, menggarisbawahi kebutuhan untuk mempertimbangkan banyak gen mitokondria dan plastid untuk penentuan tingkat relatif yang akurat.

Retensi situs pengeditan RNA hilang di banyak garis keturunan

Pengeditan RNA C-to-U tingkat tinggi secara keseluruhan di Liriodendron, bersama dengan sejumlah besar situs pengeditan uniknya, menambahkan dukungan lebih lanjut untuk model pengeditan RNA tingkat yang relatif tinggi dalam genom mitokondria angiosperma leluhur (sekitar 700 situs dalam gen pengkode protein), diikuti oleh berbagai tingkat kehilangan berikutnya di berbagai garis keturunan (Gambar 5) [26, 27]. Data pengeditan RNA dari angiosperma dari garis keturunan "divergen awal", seperti Amborella atau Nymphaea, akan membantu mempolarisasi tingkat kehilangan pengeditan dalam Liriodendron, yang terlihat sangat rendah berdasarkan data ini. Tidak ada penjelasan adaptif yang jelas untuk kemunculan dan pemeliharaan pengeditan RNA pada tanaman [25, 68, 69], tetapi mungkin telah muncul melalui proses netral, hanya untuk menjadi penting setelah substitusi pada sitosin yang secara fungsional penting yang memerlukan pengeditan pasca transkripsi untuk menghasilkan asam amino yang dilestarikan [70] – sebuah hipotesis yang termasuk dalam kategori 'evolusi netral konstruktif' [71, 72]. Konsisten dengan model ini, sebagian besar situs edit mengubah urutan asam amino yang diterjemahkan [21, 73], sebuah pola yang digarisbawahi dalam Liriodendron, di mana 82% pengeditan dilakukan di situs yang tidak identik. Sementara munculnya pengeditan RNA mungkin karena proses netral, pekerjaan komparatif telah menemukan dukungan untuk seleksi yang mendukung hilangnya pengeditan dari waktu ke waktu [26, 27], dan kemungkinan seleksi tersebut akan lebih kuat di situs yang tidak identik, di mana pengeditan yang tidak dapat diandalkan akan menjadi yang paling merusak. Konsisten dengan hipotesis ini, kami menemukan rasio kerugian terhadap keuntungan adalah 14:1 di situs nonsynonymous dibandingkan dengan 2:1 di situs diam di seluruh angiosperma (Gambar 5).

Konservasi kluster gen purba

Meskipun urutan gen keseluruhan sangat bervariasi di antara genom mitokondria angiosperma [13], bahkan antara taksa yang terkait erat [15], hasil di sini menggarisbawahi kendala penyeimbang pada kelompok pendek hubungan gen yang beroperasi di seluruh evolusi angiosperma. Sementara beberapa klaster yang dilestarikan (misalnya, rrnS–rrn5 dan rpl2–rps19–rps3–rpl16) berasal dari nenek moyang bakteri asli mitokondria [19], yang lain unik untuk angiospermae, seperti atp8–cox3–sdh4 dan rps13–nad1.x2.x3 cluster. Lima cluster yang dibagikan oleh Liriodendron dan Cycas kemungkinan besar hadir di awal evolusi tumbuhan berbiji, dan kita dapat melihat di luar tumbuhan berbiji untuk menyimpulkan mana yang juga hadir di awal evolusi tumbuhan berpembuluh. Analisis urutan gen komparatif menunjukkan Huperzia telah mengalami lebih sedikit penataan ulang relatif terhadap bryophytes daripada genom mitokondria tanaman vaskular lainnya [74], menjadikannya perbandingan yang berarti untuk konservasi urutan gen tanaman vaskular. Dari lima cluster yang dibagikan oleh Cycas dan Liriodendron, tiga dibagikan dengan Huperzia dan dua tidak. Semua kluster gen yang ditemukan di Liriodendron dengan mengesampingkan Cycas juga kurang Huperzia, menunjukkan kluster seperti itu memang spesifik angiosperma.

Transkripsi kemungkinan merupakan kendala penting, di mana gen yang berdekatan berbagi satu promotor dan ditranskripsi bersama, seperti yang ditunjukkan untuk tiga kluster gen yang dilestarikan di Nicotiana[16]. Ini bisa menjelaskan mengapa semua kelompok yang dilestarikan di seluruh angiospermae melibatkan gen yang dikodekan pada untai yang sama. Menariknya, tiga dari kelompok yang disimpulkan hadir dalam angiosperma leluhur melibatkan fragmen internal dari trans- disambungkan gen (Gambar 6), yang mungkin, setelah pemeriksaan lebih lanjut, memberikan petunjuk tentang regulasi dan rekonstruksi transkrip panjang penuh dari trans-gen yang disambung.

NS Liriodendron genom mitokondria tampaknya telah tunduk pada tingkat substitusi diam yang rendah dan fragmentasi kluster gen yang jarang relatif terhadap genom mitokondria eudikotil dan monokotil yang diurutkan (Gambar 4 dan 6). Namun, tingkat substitusi diam dan fragmentasi klaster gen tidak selalu sama di semua angiospermae dalam penelitian kami. Misalnya, salah satu taksa dengan tingkat substitusi diam yang relatif tinggi (>30 × lebih cepat dari Liriodendron), Cucurbita, memiliki 11 kluster gen yang dilestarikan dibandingkan dengan 12 in Liriodendron, sedangkan Zea, dengan kecepatan yang relatif lebih lambat (10 × lebih cepat dari Liriodendron), hanya memiliki lima. Dalam genom plastid angiosperma, ada dukungan untuk hubungan positif antara tingkat evolusi struktural dan urutan [75], tetapi hubungan ini tidak universal [48, 53]. Di dalam diam, misalnya, meskipun tingkat penataan ulang urutan gen plastid lebih tinggi pada spesies dengan tingkat substitusi yang lebih tinggi, banyak dari substitusi ini terjadi di situs yang tidak identik sehingga tidak mudah dijelaskan oleh model sederhana yang digerakkan oleh mutasi [48].


Isi

Intron pertama kali ditemukan pada gen penyandi protein adenovirus, [8] [9] dan selanjutnya diidentifikasi dalam gen penyandi RNA transfer dan gen RNA ribosom. Intron sekarang diketahui terjadi dalam berbagai gen di seluruh organisme dan virus dalam semua kerajaan biologis.

Fakta bahwa gen dipecah atau diinterupsi oleh intron ditemukan secara independen pada tahun 1977 oleh Phillip Allen Sharp dan Richard J. Roberts, di mana mereka menerima Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Kedokteran pada tahun 1993. [10] Istilah intron diperkenalkan oleh ahli biokimia Amerika Walter Gilbert: [5]

"Gagasan cistron [yaitu, gen] harus diganti dengan unit transkripsi yang mengandung daerah yang akan hilang dari pembawa pesan matang - yang saya sarankan kita sebut intron (untuk daerah intragenik) - bergantian dengan daerah yang akan diekspresikan – ekson.” (Gilbert 1978)

Syarat intron juga mengacu pada intracistron, yaitu, sepotong DNA tambahan yang muncul di dalam cistron. [11]

Meskipun intron kadang-kadang disebut urutan intervensi, [12] istilah "urutan intervensi" dapat merujuk ke salah satu dari beberapa keluarga urutan asam nukleat internal yang tidak ada dalam produk gen akhir, termasuk intein, daerah yang tidak diterjemahkan (UTR), dan nukleotida dihapus oleh pengeditan RNA, sebagai tambahan untuk intron.

Frekuensi intron dalam genom yang berbeda diamati sangat bervariasi di seluruh spektrum organisme biologis. Misalnya, intron sangat umum dalam genom nuklir vertebrata berahang (misalnya manusia dan tikus), di mana gen pengkode protein hampir selalu mengandung beberapa intron, sedangkan intron jarang dalam gen nuklir beberapa mikroorganisme eukariotik, [13] misalnya ragi roti / bir (Saccharomyces cerevisiae). Sebaliknya, genom mitokondria vertebrata sama sekali tidak memiliki intron, sedangkan mikroorganisme eukariotik mungkin mengandung banyak intron. [14]

Kasus yang sangat ekstrim adalah Drosophila dhc7 gen yang mengandung 3.6 megabase (Mb) intron, yang membutuhkan waktu kira-kira tiga hari untuk ditranskripsi. [15] [16] Di sisi lain, penelitian terbaru menunjukkan bahwa panjang intron eukariotik terpendek yang diketahui adalah 30 pasangan basa (bp) milik manusia. MST1L gen. [17]

Penyambungan semua molekul RNA yang mengandung intron sangat mirip, seperti dijelaskan di atas. Namun, berbagai jenis intron diidentifikasi melalui pemeriksaan struktur intron dengan analisis urutan DNA, bersama dengan analisis genetik dan biokimia dari reaksi penyambungan RNA.

Setidaknya empat kelas intron yang berbeda telah diidentifikasi: [1]

    yang dikeluarkan oleh spliceosom (intron spliceosomal)
  • Intron dalam nukleus dan archaeal mentransfer gen RNA yang dikeluarkan oleh protein (intron tRNA)
  • Intron kelompok I self-splicing yang dihilangkan oleh katalisis RNA
  • Intron kelompok II penyambungan diri yang dihilangkan oleh katalisis RNA

Intron kelompok III diusulkan menjadi keluarga kelima, tetapi sedikit yang diketahui tentang aparatus biokimia yang memediasi penyambungan mereka. Mereka tampaknya terkait dengan intron kelompok II, dan mungkin dengan intron spliceosomal. [18]

Intron spliceosomal Sunting

Intron pra-mRNA nuklir (intron spliceosomal) dicirikan oleh urutan intron spesifik yang terletak di batas antara intron dan ekson. [19] Urutan ini dikenali oleh molekul RNA spliceosomal ketika reaksi penyambungan dimulai. [20] Selain itu, mereka mengandung titik cabang, urutan nukleotida tertentu di dekat ujung 3' intron yang menjadi terkait secara kovalen dengan ujung 5' intron selama proses penyambungan, menghasilkan cabang (tali penjerat ternak) intron. Terlepas dari tiga elemen pendek yang dilestarikan ini, sekuens intron pra-mRNA nuklir sangat bervariasi. Intron pra-mRNA nuklir seringkali lebih panjang daripada ekson di sekitarnya.

TRNA intron Sunting

Transfer RNA intron yang bergantung pada protein untuk penghapusan terjadi di lokasi tertentu dalam loop antikodon dari prekursor tRNA yang tidak disambung, dan dikeluarkan oleh tRNA splicing endonuclease. Ekson kemudian dihubungkan bersama oleh protein kedua, tRNA splicing ligase. [21] Perhatikan bahwa intron self-splicing juga kadang-kadang ditemukan dalam gen tRNA. [22]

Grup I dan grup II intron Sunting

Intron grup I dan grup II ditemukan dalam gen yang mengkode protein (messenger RNA), transfer RNA dan RNA ribosom dalam rentang yang sangat luas dari organisme hidup., [23] [24] Setelah transkripsi menjadi RNA, intron grup I dan grup II juga membuat interaksi internal yang luas yang memungkinkan mereka untuk melipat menjadi arsitektur tiga dimensi yang spesifik dan kompleks. Arsitektur kompleks ini memungkinkan beberapa intron grup I dan grup II menjadi penyambungan sendiri, yaitu, molekul RNA yang mengandung intron dapat mengatur ulang struktur kovalennya sendiri sehingga dapat dengan tepat menghilangkan intron dan menghubungkan ekson bersama-sama dalam urutan yang benar. Dalam beberapa kasus, protein pengikat intron tertentu terlibat dalam penyambungan, bertindak sedemikian rupa sehingga membantu intron melipat ke dalam struktur tiga dimensi yang diperlukan untuk aktivitas penyambungan sendiri. Intron grup I dan grup II dibedakan oleh set yang berbeda dari sekuens internal dan struktur terlipat yang berbeda, dan oleh fakta bahwa penyambungan molekul RNA yang mengandung intron grup II menghasilkan intron bercabang (seperti RNA spliceosomal), sedangkan intron grup I menggunakan intron non nukleotida guanosin yang dikodekan (biasanya GTP) untuk memulai penyambungan, menambahkannya ke ujung 5' dari intron yang dipotong.

Sementara intron tidak mengkodekan produk protein, mereka merupakan bagian integral dari regulasi ekspresi gen. Beberapa intron sendiri mengkodekan RNA fungsional melalui pemrosesan lebih lanjut setelah penyambungan untuk menghasilkan molekul RNA noncoding. [25] Penyambungan alternatif banyak digunakan untuk menghasilkan banyak protein dari satu gen. Selain itu, beberapa intron memainkan peran penting dalam berbagai fungsi regulasi ekspresi gen seperti pembusukan yang dimediasi nonsense [26] dan ekspor mRNA. [27]

Asal-usul biologis intron tidak jelas. Setelah penemuan awal intron dalam gen penyandi protein nukleus eukariotik, ada perdebatan yang signifikan mengenai apakah intron pada organisme modern diwarisi dari nenek moyang yang sama (disebut hipotesis intron-awal), atau apakah mereka muncul di gen agak baru dalam proses evolusi (disebut hipotesis introns-late). Teori lain adalah bahwa spliceosome dan struktur intron-ekson gen adalah peninggalan dunia RNA (hipotesis intron-pertama). [28] Masih banyak perdebatan tentang sejauh mana hipotesis ini paling benar. Konsensus populer saat ini adalah bahwa intron muncul dalam garis keturunan eukariota sebagai elemen egois. [29]

Studi awal urutan DNA genom dari berbagai organisme menunjukkan bahwa struktur intron-ekson gen homolog dalam organisme yang berbeda dapat sangat bervariasi. [30] Studi yang lebih baru dari seluruh genom eukariotik kini telah menunjukkan bahwa panjang dan kepadatan (intron / gen) dari intron sangat bervariasi antara spesies terkait. Misalnya, sementara genom manusia mengandung rata-rata 8,4 intron/gen (139,418 dalam genom), jamur uniseluler Cuniculi Encephalitozoon hanya mengandung 0,0075 intron/gen (15 intron dalam genom). [31] Sejak eukariota muncul dari nenek moyang yang sama (keturunan yang sama), pasti ada keuntungan atau kerugian yang luas dari intron selama waktu evolusi. [32] [33] Proses ini dianggap tunduk pada seleksi, dengan kecenderungan perolehan intron pada spesies yang lebih besar karena ukuran populasinya yang lebih kecil, dan sebaliknya pada spesies yang lebih kecil (terutama uniseluler). [34] Faktor biologis juga mempengaruhi gen mana dalam genom yang kehilangan atau mengakumulasi intron. [35] [36] [37]

Penyambungan ekson alternatif dalam gen setelah eksisi intron bertindak untuk memperkenalkan variabilitas yang lebih besar dari sekuens protein yang diterjemahkan dari gen tunggal, memungkinkan beberapa protein terkait dihasilkan dari gen tunggal dan transkrip mRNA prekursor tunggal. Kontrol penyambungan RNA alternatif dilakukan oleh jaringan kompleks molekul pensinyalan yang merespons berbagai sinyal intraseluler dan ekstraseluler.

Intron mengandung beberapa urutan pendek yang penting untuk penyambungan yang efisien, seperti situs akseptor dan donor di kedua ujung intron serta situs titik cabang, yang diperlukan untuk penyambungan yang tepat oleh spliceosome. Beberapa intron diketahui meningkatkan ekspresi gen yang dikandungnya melalui proses yang dikenal sebagai peningkatan yang dimediasi intron (IME).

Daerah DNA yang ditranskripsi secara aktif sering membentuk R-loop yang rentan terhadap kerusakan DNA. Dalam gen ragi yang sangat diekspresikan, intron menghambat pembentukan R-loop dan terjadinya kerusakan DNA. [38] Analisis genom-lebar di kedua ragi dan manusia mengungkapkan bahwa gen yang mengandung intron telah menurunkan tingkat R-loop dan penurunan kerusakan DNA dibandingkan dengan gen intronless ekspresi serupa. [38] Penyisipan intron dalam gen rawan R-loop juga dapat menekan pembentukan dan rekombinasi R-loop. Bonnet dkk. (2017) [38] berspekulasi bahwa fungsi intron dalam menjaga stabilitas genetik dapat menjelaskan pemeliharaan evolusioner mereka di lokasi tertentu, terutama pada gen yang sangat terekspresi.

Adaptasi kelaparan Sunting

Kehadiran fisik intron meningkatkan resistensi seluler terhadap kelaparan melalui peningkatan represi intron gen protein ribosom dari jalur penginderaan nutrisi. [39]

Intron dapat hilang atau diperoleh seiring waktu evolusi, seperti yang ditunjukkan oleh banyak studi perbandingan gen ortologis. Analisis selanjutnya telah mengidentifikasi ribuan contoh peristiwa kehilangan dan perolehan intron, dan telah diusulkan bahwa kemunculan eukariota, atau tahap awal evolusi eukariotik, melibatkan invasi intron. [40] Dua mekanisme definitif kehilangan intron, reverse transcriptase-mediated intron loss (RTMIL) dan penghapusan genom, telah diidentifikasi, dan diketahui terjadi. [41] Mekanisme definitif perolehan intron, bagaimanapun, tetap sulit dipahami dan kontroversial. Setidaknya tujuh mekanisme penguatan intron telah dilaporkan sejauh ini: transposisi intron, penyisipan transposon, duplikasi genom tandem, transfer intron, penguatan intron selama perbaikan untai ganda (DSBR), penyisipan intron grup II, dan intronisasi. Secara teori seharusnya paling mudah untuk menyimpulkan asal usul intron yang baru saja diperoleh karena kurangnya mutasi yang diinduksi inang, namun bahkan intron yang diperoleh baru-baru ini tidak muncul dari mekanisme yang disebutkan di atas. Dengan demikian, temuan ini menimbulkan pertanyaan apakah mekanisme yang diusulkan dari perolehan intron gagal untuk menggambarkan asal mekanistik dari banyak intron baru karena mereka bukan mekanisme yang akurat dari penguatan intron, atau jika ada proses lain yang belum ditemukan, yang menghasilkan proses baru. intron. [42]

Dalam transposisi intron, mekanisme penguatan intron yang paling umum, intron yang disambung dianggap membalikkan sambungan menjadi mRNA sendiri atau mRNA lain pada posisi tanpa intron sebelumnya. MRNA yang mengandung intron ini kemudian ditranskripsi balik dan cDNA yang mengandung intron yang dihasilkan kemudian dapat menyebabkan perolehan intron melalui rekombinasi lengkap atau sebagian dengan lokus genomik aslinya. Penyisipan transposon juga dapat menghasilkan penciptaan intron. Penyisipan semacam itu dapat mengintronisasi transposon tanpa mengganggu urutan pengkodean ketika transposon menyisipkan ke dalam urutan AGGT, mengakibatkan duplikasi urutan ini di setiap sisi transposon. Masih belum dipahami mengapa elemen-elemen ini disambung, baik secara kebetulan, atau oleh beberapa tindakan preferensial oleh transposon. Dalam duplikasi genomik tandem, karena kesamaan antara donor konsensus dan situs sambungan akseptor, yang keduanya sangat mirip dengan AGGT, duplikasi genomik tandem dari segmen eksonik yang menyimpan urutan AGGT menghasilkan dua situs sambungan potensial. Ketika dikenali oleh spliceosome, urutan antara AGGT asli dan duplikat akan disambung, menghasilkan penciptaan intron tanpa mengubah urutan pengkodean gen. Perbaikan break beruntai ganda melalui sambungan akhir non-homolog baru-baru ini diidentifikasi sebagai sumber perolehan intron ketika peneliti mengidentifikasi pengulangan langsung pendek yang mengapit 43% dari intron yang diperoleh di Daphnia. [42] Angka-angka ini harus dibandingkan dengan jumlah intron yang diapit oleh pengulangan pada organisme lain, untuk relevansi statistik. Untuk penyisipan intron grup II, retrohoming intron grup II menjadi gen nuklir diusulkan untuk menyebabkan perolehan intron spliceosomal baru-baru ini.

Transfer intron telah dihipotesiskan untuk menghasilkan perolehan intron ketika paralog atau pseudogen memperoleh intron dan kemudian mentransfer intron ini melalui rekombinasi ke lokasi yang tidak memiliki intron di paralog saudaranya. Intronisasi adalah proses di mana mutasi menciptakan intron baru dari urutan eksonik sebelumnya. Jadi, tidak seperti mekanisme perolehan intron lainnya yang diusulkan, mekanisme ini tidak memerlukan penyisipan atau pembuatan DNA untuk membuat intron baru. [42]

Satu-satunya mekanisme yang dihipotesiskan dari perolehan intron baru-baru ini yang tidak memiliki bukti langsung adalah bahwa penyisipan intron kelompok II, yang ketika ditunjukkan in vivo, menghapus ekspresi gen. [43] Oleh karena itu, intron Grup II kemungkinan dianggap sebagai nenek moyang intron spliceosomal, yang bertindak sebagai elemen retro spesifik lokasi, dan tidak lagi bertanggung jawab atas perolehan intron. [44] [45] Duplikasi genomik tandem adalah satu-satunya mekanisme yang diusulkan dengan mendukung bukti eksperimental in vivo: duplikasi tandem intragenik pendek dapat memasukkan intron baru ke dalam gen pengkode protein, meninggalkan urutan peptida yang sesuai tidak berubah. [46] Mekanisme ini juga memiliki bukti tidak langsung yang luas yang mendukung gagasan bahwa duplikasi genomik tandem adalah mekanisme yang lazim untuk perolehan intron. Pengujian mekanisme lain yang diusulkan in vivo, khususnya penguatan intron selama DSBR, transfer intron, dan intronisasi, dimungkinkan, meskipun mekanisme ini harus ditunjukkan secara in vivo untuk memperkuatnya sebagai mekanisme sebenarnya dari penguatan intron. Analisis genomik lebih lanjut, terutama ketika dieksekusi pada tingkat populasi, kemudian dapat mengukur kontribusi relatif dari setiap mekanisme, mungkin mengidentifikasi bias spesifik spesies yang dapat menjelaskan berbagai tingkat perolehan intron di antara spesies yang berbeda. [42]


METODE

Untuk menetapkan nomenklatur standar untuk intron dalam gen penyandi protein di seluruh kerajaan jamur, perlu untuk menemukan mitogenom referensi yang sesuai. Dengan melihat spesies jamur dengan mitogenom yang tersedia, kami memilih mitogenom jamur penghasil siklosporin Tolypocladium inflatum ARSEF 3280 (nomor aksesi NC_036382) sebagai mitogenom referensi. Mitogenom 25.328-bp dari T. inflasi mengandung semua 15 gen penyandi protein yang biasanya ditemukan dalam mitogenom jamur, dan tidak ada intron dalam gen penyandi protein ini (Zhang et al. 2017d). Kami tidak memilih model yang paling dipahami jamur: 'ragi tukang roti' Saccharomyces cerevisiae, ragi fisi Schizosaccharomyces pombe, jamur patogen oportunistik Candida albicans, euascomycete berfilamen Neurospora crassa, dll. Ini karena ragi Sa. cerevisiae dan Sc. pombe keduanya kekurangan gen yang mengkode dehidrogenase NADH dalam mitogenom mereka (Foury et al. 1998), dan C. albicans dan N. crassa mengandung intron dalam banyak gen penyandi protein yang berbeda (Borkovich et al. 2004 Bartelli et al. 2013). Kami juga tidak memilih genom mitokondria manusia, yang dipilih sebagai referensi untuk nama intron yang ditemukan di nad5 dan cox1 di metazoa tertentu (Emblem et al. 2011). Ini karena mitogenom manusia hanya mengandung 13 gen pengkode protein standar tanpa atp9 dan rps3. Dua gen terakhir diketahui menyimpan intron dalam mitogenom jamur.

Baik basal dan lebih tinggi jamur mungkin mengandung intron dalam mitogenomnya. Kami secara acak memilih spesies perwakilan di setiap filum jamur untuk menemukan dan memberi nama intron yang mungkin (Tabel 1). Penentuan posisi penyisipan intron bergantung pada keselarasan antara sekuens gen inangnya dan sekuens gen yang sesuai dari T. inflasi (Berkas tambahan 1). Meskipun ada banyak program penyelarasan urutan yang tersedia, kami sarankan menggunakan MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), yang cepat ketika menyelaraskan urutan panjang yang mengandung banyak intron dan selalu dapat menghasilkan keselarasan yang memuaskan sesuai dengan pengalaman kami . Pengaturan default MAFFT bekerja dengan baik dalam banyak kasus. Jika batas ekson-intron tidak diidentifikasi dengan benar (mungkin karena gangguan urutan intron atau adanya ekson pendek) di bawah pengaturan default, seseorang dapat mempertimbangkan untuk menyesuaikan parameter penyelarasan (misalnya, coba 'Unalignlevel > 0' dan mungkin 'Biarkan gappy wilayah 'dengan memilih strategi penyelarasan G-INS-1 atau G-INS-i) dan/atau mengimpor sekuens tambahan untuk menyelaraskan dari spesies yang terkait erat dengan spesies uji. Selain itu, selalu disarankan untuk merujuk pada hasil anotasi yang diketahui dan/atau nukleotida karakteristik di lokasi penyambungan intron grup I/II (Cech 1988) untuk memastikan keselarasan dan identifikasi batas ekson-intron yang benar.


Informasi penulis

Afiliasi

Universidade Federal do Espírito Santo, Grupo de Ecologia Bêntica, Departamento de Oceanografia, Av. Fernando Ferrari, 514, Vitória, ES, 29075-910, Brasil

Universitas Auburn, Departemen Ilmu Biologi, Gedung 101 Ilmu Hayati, Auburn, AL, 36849, AS

Yuanning Li & Kenneth M. Halanych

Departemen Oseanografi, SOEST, Universitas Hawaii di Manoa, 1000 Pope Road, Honolulu, HI, 96822, USA

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Kontribusi

Menyusun dan merancang eksperimen: C.R.S., K.M.H. Melakukan percobaan: A.F.B., Y.L., C.R.S., K.M.H. Menganalisis data: A.F.B., Y.L., K.M.H. Reagen/bahan/alat analisis yang dikontribusikan: K.M.H., C.R.S. Menulis makalah: A.F.B., Y.L., C.R.S., K.M.H.

Penulis yang sesuai


Metode

Isolat jamur dan ekstraksi DNA

Enambelas T. fuciformis isolat (TF01-TF16) diperoleh oleh Pusat Pengelolaan Sumber Daya Plasma Nutfah Jamur yang Dapat Dimakan di provinsi Fujian, Fuzhou, Cina. Asal isolat tercantum dalam Tabel Tambahan 3. Di antaranya, TF15 diisolasi dari Taman Nasional Wuyishan, Fujian, Cina, pada tahun 2014, TF11 dan TF14 diperoleh dari Cagar Alam Nasional Wuyishan pada tahun 2015, dan TF01 adalah isolat liar lainnya dari Cagar Alam Nasional Huboliao di Fujian.

Setelah ditumbuhkan pada kaldu dekstrosa kentang pada suhu 25 °C selama 48 jam, sel-sel seperti ragi tunggal dari T. fuciformis dicuci dan dipanen dengan sentrifugasi pada 10.000 g selama 5 menit, dan disimpan pada suhu -20 ° C setelah pengeringan beku. Untuk sekuensing Illumina, DNA genomik total 16 T. fuciformis isolat diekstraksi menggunakan Omega HP Plant DNA Kit sesuai dengan instruksi pabrik, setidaknya diperlukan 500 ng DNA (> 18 ng/ul) untuk setiap sampel. Untuk sekuensing PacBio, sekuensing single molecule real-time (SMRT), fragmen DNA panjang TF02 dan TF15 diisolasi menggunakan metode setil trimetilamonium bromida (CTAB) seperti yang dijelaskan di www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09 / DNA-extraction-chlamy-CTAB-JGI.pdf setidaknya 20 g DNA (OD260/280 antara 1,8 dan 2.0, OD260/230 antara 2.0 dan 2.2, gDNA utuh > 20 kb) diperlukan untuk setiap sampel.

Pengurutan genom, perakitan, dan anotasi gen

Urutan senapan seluruh genom 16 T. fuciformis isolat dilakukan di Beijing Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd. menggunakan platform Illumina HiSeq 2500 dengan pustaka berpasangan, menargetkan data 3–6 Gb per isolat. Data pengurutan Illumina mentah dari T. mesenterika ATCC28783 (aksesi SRX8046622) diunduh dari database SRA NCBI. Bacaan mentah dirakit menggunakan Velvet 1.2.03 [52].

Contigs mitokondria diidentifikasi oleh BLAST terhadap genom mitokondria yang diterbitkan dari Cryptococcus neoformans var. grubii H99 (aksesi NC_004336). Contigs mitokondria diperpanjang langkah demi langkah sesuai dengan hubungan pasangan-akhir bacaan: jika satu bacaan dipetakan di ujung contig, ujung lainnya dapat memperpanjang urutannya. Perpanjangan atau celah yang ambigu dikonfirmasi atau ditutup oleh sekuensing PCR. Contigs digabungkan menjadi sekuens DNA melingkar tunggal berdasarkan tumpang tindih 100%.

Teknologi sekuensing PacBio digunakan untuk memverifikasi akurasi perakitan dua isolat yang diurutkan Illumina, TF13 dan TF15. Ini diurutkan menggunakan PacBio RS II, menargetkan sekitar 2,5 Gb data mentah per isolat. Perakitan genom untuk data sekuensing PacBio dilakukan dengan menggunakan program Canu 1.3 [53]. Contigs tunggal untuk setiap mitogenome diidentifikasi dengan perbandingan dengan genom mitokondria dari isolat yang sesuai yang diperoleh dari data sekuensing Illumina, untuk mendapatkan DNA sirkular lengkap setelah pemangkasan 3′ berakhir.

Prediksi gen dan anotasi gen awalnya dilakukan menggunakan alat online MFannot (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl). tRNA dijelaskan dengan menggabungkan hasil MFannot, tRNAscan-SE [54], dan RNAweasel [55]. Batas-batas gen yang dilestarikan dan titik-titik persimpangan ekson-intron dikonfirmasi dengan perbandingan dengan gen-gen bebas-intron yang sesuai dari isolat-isolat lain yang diuji menggunakan Clustal X [56].

Analisis filogenetik dari T. fuciformis mengisolasi

Untuk menentukan hubungan evolusi antara 16 T. fuciformis isolat, rangkaian asam amino gabungan dari 14 gen yang dilestarikan (atp6, atp8, atp9, tongkol, cox1, cox2, cox3, nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, dan nad6) sebanyak 4252 karakter, digunakan untuk analisis filogenetik, menggunakan T. mesenterika sebagai kelompok luar. Penjajaran asam amino dilakukan menggunakan Clustal W dalam program MEGA 6 [57] dengan penalti pembukaan celah dan nilai penalti ekstensi celah masing-masing 10 dan 3 (sama seperti keberpihakan berpasangan dan berganda). Sebuah pohon filogenetik dibangun menggunakan Kemungkinan Maksimum di MEGA 6, dan diuji dengan analisis Booststrap dengan 500 ulangan. Kesenjangan dan data yang hilang dalam penyelarasan diperlakukan sebagai penghapusan.

Analisis PCR untuk mengkonfirmasi intron prediksi khusus

Analisis PCR digunakan untuk mengkonfirmasi intron yang diprediksi. Primer (Tabel Tambahan 4) dirancang menggunakan alat online ledakan primer dari situs web NCBI. Primer ini menargetkan daerah cDNA dari ekson hulu ke urutan N-terminal, dan dalam kasus khusus, daerah dari duplikasi ekson hulu ke N-terminal. Isolat perwakilan dipilih untuk pekerjaan PCR mtDNA dari isolat ini harus mencakup semua intron, dan urutan bebas intron yang sesuai.

Sel ragi dikumpulkan pada fase logaritmik, dan RNA diekstraksi menggunakan Omega HP Plant RNA Kit.cDNA ditranskripsi terbalik menggunakan PrimeScript™ RT-PCR Kit (Takara, Dalian), dan digunakan sebagai template PCR. Produk PCR diurutkan di Sangon Biotech (Shanghai).


Bahan dan metode

Pengambilan sampel dan ekstraksi DNA

Miselium simtomatik patogen bekas luka licin dari A. politrika dikumpulkan dari Jintang, Provinsi Sichuan, Cina. Isolasi patogen penyebab dilakukan menurut Peng dkk. 1 . Jamur yang dicurigai dikultur terlebih dahulu pada media PDA selama 3 hari, kemudian diinokulasikan ke dalam kantong budidaya dengan kondisi sehat A. politrika miselia. Kantong budidaya yang diinokulasi dikultur pada suhu 25 ° C selama 20 hari. Kemudian jamur patogen diisolasi kembali dari kantong budidaya yang terinfeksi A. politrika, yang menunjukkan gejala bekas luka licin. Strain diidentifikasi sebagai S. auriculariicola berdasarkan postulat Koch, morfologi, dan urutan ITS. miselium dari S. auriculariicola dikultur dalam medium dekstrosa kentang cair selama 4 hari dan kemudian dikumpulkan untuk ekstraksi DNA. DNA total diekstraksi dari miselia menggunakan Kit DNA jamur D3390-00 (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Kualitas DNA yang diekstraksi diperiksa dengan elektroforesis, dan DNA disimpan pada suhu -20 ° C sampai sekuensing. NS S. auriculariicola strain disimpan di Akademi Ilmu Pertanian Sichuan (No. SAAS_Sau), dan tersedia dari Cheng Chen dan Daihua Lu dari Akademi Ilmu Pertanian Sichuan, Cina.

Pengurutan, perakitan, dan anotasi genom mitokondria

DNA yang dimurnikan digunakan untuk membangun perpustakaan sekuensing mengikuti instruksi dari NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB, Beijing, Cina). Pengurutan senapan seluruh genom dilakukan menggunakan Platform Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, USA). Kami melakukan kontrol kualitas dan de novo perakitan mitogenome menurut Bi 52 . Perangkat lunak SPAdes 3.9.0 53 digunakan untuk de novo perakitan mitogenome, dan program MITObim V1.9 54 digunakan untuk mengisi kesenjangan antara contigs.

MFannot (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl) dan alat MITOS 55 digunakan untuk anotasi mitogenom dari S. auriculariicola, keduanya didasarkan pada Kode Genetik 4. Hasil yang tidak pasti disesuaikan secara manual dengan penyelarasan urutan dengan gen ortologis tanpa intron dari spesies yang berkerabat dekat. Gen penyandi protein, rRNA, atau gen tRNA yang awalnya beranotasi S. auriculariicola juga dimodifikasi dengan penyelarasan dengan mitogenom Leotiomycetes yang diterbitkan sebelumnya. ORF dijelaskan secara fungsional oleh perangkat lunak InterProScan 56 . Program tRNAscan-SE 2.0 digunakan untuk memprediksi gen tRNA 57 . Terakhir, kami menggunakan alat OrganellarGenomeDraw (OGDRAW) 58 untuk menggambar peta S. auriculariicola mitogenom lengkap.

Analisis organisasi mitogenomik

Kami menggunakan alat Lasergene v7.1 (DNASTAR http://www.dnastar.com/) dengan pengaturan default untuk menganalisis komposisi dasar mitogenom S. auriculariicola. Asimetri untai mitogenom dinilai menggunakan rumus berikut: AT skew = [A T]/[A + T], dan GC skew = [G C]/[G + C] 59 . Kami menghitung penggunaan kodon menggunakan perangkat lunak Sequence Manipulation Suite 60 berdasarkan kode genetik 4. Kami membandingkan susunan gen dalam S. auriculariicola dengan spesies Leotiomycetes lain yang diterbitkan. Analisis sinteni genom mitogenom dari enam spesies perwakilan dalam Leotiomycetes dilakukan dengan Mauve v2.4.0 61 .

Analisis elemen berulang

Kami mencari seluruh mitogenome dari S. auriculariicola oleh BLASTn mencari melawan dirinya sendiri menggunakan Circoletto 62 (http://tools.bat.infspire.org/circoletto/) dengan nilai-E <10 10 , yang bertujuan untuk mengidentifikasi replikasi sekuens intragenomik yang besar dan pengulangan yang diselingi. Tandem Repeats Finder 63 (http://tandem.bu.edu/trf/trf.advanced.sub-mit.html) dengan pengaturan default digunakan untuk menganalisis pengulangan tandem. Kami mencari urutan berulang termasuk urutan maju, mundur, komplementer, dan komplementer terbalik di S. auriculariicola menggunakan alat REPuter 64 dengan nilai-E <10 5 .

Analisis filogenetik

Untuk analisis filogenetik, kami membangun pohon filogenetik berdasarkan 15 gen mitokondria umum dari S. auriculariicola dan 15 spesies lainnya di Leotiomycetes, 8 spesies di Dothideomycetes, 11 spesies di Eurotiomycetes, dan 3 spesies di Sordariomycetes (outgroup). Algoritme MAFFT dalam platform online TranslatorX 65 digunakan untuk menyelaraskan 15 gen penyandi protein yang dilestarikan. Program Sequence Matrix 1.7.8 66 digunakan untuk menggabungkan gen individu ke dalam matriks gabungan. Kami menggunakan alat Modelgenerator v851 67 untuk menentukan model evolusioner yang paling cocok untuk analisis filogenetik.

Metode inferensi Bayesian (BI) digunakan untuk analisis filogenetik berdasarkan kumpulan data gen gabungan dengan program MrBayes 3.2.6 68. Dua proses independen dilakukan untuk pengambilan sampel 2 × 106 generasi per 100 generasi. Setiap run diambil sampelnya setiap 100 generasi. Stasioneritas diasumsikan telah tercapai ketika perkiraan ukuran sampel (ESS) adalah >100, dan faktor pengurangan skala potensial (PSRF) mendekati 1,0. Setelah analisis stabil, 25% pertama dari pohon yang dihasilkan dibuang sebagai pembakaran, dan 50% pohon konsensus aturan mayoritas dengan nilai probabilitas posterior (PP) dihasilkan dari pohon yang tersisa. Untuk membandingkan filogeni mitokondria dengan filogeni multi-lokus nuklir, kami mengunduh spacer transkripsi internal (NYA), RNA polimerase II subunit terbesar kedua (RPB2), faktor perpanjangan translasi-1 alfa (EF1-α) dan beta-tubulin (-TUB) gen dari 38 spesies dari database NCBI. Pohon filogenetik dibangun menggunakan metode yang sama seperti gen mitokondria. Kami juga menggunakan metode BI untuk menganalisis hubungan filogenetik dari S. auriculariicola dan spesies terkait menggunakan gen mitokondria individu (15 gen pengkode protein inti) yang tujuannya adalah untuk menguji apakah gen ini berguna sebagai penanda molekuler untuk analisis filogenetik spesies Leotiomycetes.


Tonton videonya: Синтез белка: транскрипция. самое простое объяснение (November 2022).