Informasi

Bagaimana saya bisa menemukan urutan mRNA untuk gen prokariotik tertentu?

Bagaimana saya bisa menemukan urutan mRNA untuk gen prokariotik tertentu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Yang ingin saya ketahui adalah awal dari transkripsi untuk gen tertentu, berapa lama UTR sebelum urutan pengkodean yang sebenarnya dimulai.

Saya telah melihat berbagai database seperti NCBI Gene, Refseq atau yang khusus seperti PRODORIC. Tetapi tidak satu pun dari mereka yang benar-benar mengandung urutan mRNA atau informasi apa pun tentang bagian mRNA yang tidak diterjemahkan. Hanya urutan pengkodean itu sendiri.

Apakah informasi semacam itu tidak dijelaskan untuk banyak bakteri? Saya tidak melihat organisme model seperti E. Coli atau B. subtilis, tetapi saya mengharapkan beberapa informasi tersedia.

Apakah ada database di mana saya dapat menemukan urutan transkrip aktual untuk gen prokariotik?


Pertanyaan spesifik mRNA

Tambahkan ini ke kueri NCBI Anda:DAN mrna[filter]

Jika tidak tersedia di database utama mungkin tidak diketahui.

Namun data mRNA dapat tidak jelas ditemukan bahkan di database utama itu, tetapi itu Sebaiknya berada di sana. Saya akan terkejut jika itu masalahnya, namun karena Anda tidak bekerja dengan organisme model, mungkin tidak ada yang tersedia.

Saat mencari gen transkrip, NCBI memiliki beberapa tips yang dapat Anda lihat di sini untuk mencari database mereka. #8 mungkin relevan bagi Anda karena ini adalah cara untuk memfilter catatan mRNA secara eksklusif.

Jika tidak ada klaster UniGene untuk gen dan organisme ini, lakukan pencarian di database Nukleotida dengan nama gen, nama produk, atau simbol. Sertakan organisme dalam pencarian untuk menemukan hasil yang paling relevan dan filter untuk urutan transkrip, misalnya:Sitokrom c DAN kodok[orgn] DAN mrna[filter].

Memprediksi mRNA

Dasar: Alat terjemahan DNA ExPasy

Canggih: regrna 2

Dengan asumsi bahwa kueri lanjutan tidak mengungkapkan apa yang Anda butuhkan, Anda mungkin dapat membuat beberapa prediksi yang berguna sebelum membawanya ke lab. Ada beberapa alat prediksi lain yang mungkin dapat membantu Anda jika itu satu-satunya pilihan yang tersedia. Saya tidak dapat memahami informasi apa yang Anda miliki sebagai masukan. Dengan asumsi Anda memiliki urutan DNA, saya akan mulai dengan pilihan yang jelas: alat terjemahan DNA ExPasy.

Saya kemudian akan mengatakan bahwa regrna 2 mungkin dapat mengarahkan Anda ke arah yang benar mengenai elemen translasi yang lebih halus.


Mengapa transkripsi dan translasi prokariotik dapat terjadi secara bersamaan?

Ini karena tidak ada nukleus di prokariota yang memisahkan transkripsi dan terjemahan proses. Oleh karena itu, ketika gen bakteri ditranskripsikan kemudian transkrip mulai menerjemahkan langsung. Transkripsi prokariotik terjadi di sitoplasma bersama terjemahan dan kedua proses itu terjadi serentak.

Kedua, dapatkah sel eukariotik menjalani transkripsi dan translasi secara bersamaan? Dalam prokariotik sel, transkripsi dan terjemahan digabungkan yaitu terjemahan dimulai saat mRNA masih disintesis. Di sebuah sel eukariotik, transkripsi terjadi di dalam nukleus, dan terjemahan terjadi di sitoplasma.

Demikian juga, orang bertanya, mengapa transkripsi dan translasi dapat dilakukan secara bersamaan pada prokariota tetapi tidak pada eukariota?

Transkripsi prokariotik terjadi di sitoplasma bersama terjemahan. Transkripsi dan translasi prokariotik dapat terjadi serentak. Ini adalah tidak mungkin di eukariota, di mana transkripsi terjadi dalam nukleus yang terikat membran sementara terjemahan terjadi di luar nukleus di dalam sitoplasma.

Bisakah sel mentranskripsi semua gen secara bersamaan?

Apakah mungkin bahwa sel akan transkripsikan semua NS gen di dalam nukleusnya serentak? Mengapa atau mengapa tidak? Tidak, sel hanya transkripsi gen untuk protein tertentu pada suatu waktu. Tidak, pasti gen akan diaktifkan/dinonaktifkan secara spesifik sel, tergantung lokasi dan fungsinya.


Modifikasi mRNA baru dapat memengaruhi ekspresi gen


Para peneliti di CCR mengidentifikasi modifikasi baru pada human messenger RNA (mRNA). NAT10, enzim yang ditemukan bertanggung jawab untuk modifikasi, sebelumnya telah terlibat dalam kanker dan penuaan. Ini adalah salah satu contoh pertama modifikasi kimia unik pada mRNA (faktor kunci dalam menguraikan kode genetik) yang menyebabkan peningkatan produksi protein. Penelitian yang dilakukan oleh Shalini Oberdoerffer, Ph.D., Investigator di Laboratory of Receptor Biology and Gene Expression, dan rekannya, muncul pada 15 November 2018, di Sel.

Menguraikan kode genetik adalah proses multi-langkah yang dimulai dengan menyalin informasi yang terkandung dalam DNA ke RNA pembawa pesan, mRNA yang dihasilkan kemudian diterjemahkan ke dalam protein yang terdiri dari komponen kunci sel. Diketahui bahwa RNA dapat dimodifikasi mengikuti proses transkripsi sebagai sarana untuk mengatur fungsi. Studi ini memberikan contoh pertama dari modifikasi kimia mRNA yang meningkatkan produksi protein. Para peneliti menyarankan modifikasi mengubah tingkat dimana kode genetik dibaca dalam setiap untai mRNA.

Para peneliti berfokus pada modifikasi kimia spesifik untuk mRNA, N4-acetylcytidine (ac4C). Mereka pertama kali memetakan keberadaan ac4C ke ribuan mRNA manusia. Di laboratorium, para ilmuwan selanjutnya menentukan bahwa kehadiran ac4C dalam mRNA secara kuat meningkatkan kemampuan mereka untuk diterjemahkan menjadi protein. Mereka lebih lanjut menunjukkan bahwa ac4C memengaruhi proliferasi sel, ciri khas sel kanker.

“Kami berharap suatu hari dapat memanfaatkan penemuan ini untuk secara khusus mengarahkan modifikasi ke mRNA kunci, sehingga menciptakan terapi baru,” kata Dr. Oberdoerffer.

Langkah selanjutnya para peneliti adalah memetakan bagaimana modifikasi secara khusus berfungsi untuk mengubah ekspresi gen serta untuk menentukan apakah misregulasi merupakan akar penyebab penyakit tertentu.

Judul dan teks artikel ini telah diedit untuk lebih mencerminkan bahwa enzim NAT10 mempengaruhi ekspresi gen dengan mengubah mRNA sehingga mengarah pada produksi protein yang lebih besar. Modifikasi kimiawi pada mRNA ini tidak mengubah DNA.


Apa itu Ekspresi Gen Eukariotik

Ekspresi gen eukariotik adalah proses produksi produk gen berdasarkan informasi dalam gen eukariotik. Itu juga terjadi melalui transkripsi dan translasi. Di sini, karena DNA eukariotik terjadi di dalam nukleus, transkripsi juga terjadi di dalam nukleus. Tiga RNA polimerase bertanggung jawab untuk transkripsi berbagai jenis RNA: RNA polimerase 1, yang mensintesis rRNA, RNA polimerase 2, yang mensintesis mRNA, dan RNA polimerase 3, yang mensintesis tRNA. Selain itu, setiap gen eukariotik berada di bawah kendali promotor individu. Oleh karena itu, transkripsi menghasilkan mRNA monokistronik.

Gambar 2: Ekspresi Gen Prokariotik dan Eukariotik

Di sisi lain, transkrip utama mRNA mengalami modifikasi pasca-transkripsi termasuk penambahan tutup 5 'dan ekor poli A 3'. Selain itu, intron yang mengganggu daerah pengkodean protein mRNA eukariotik disambungkan dalam proses yang disebut penyambungan RNA. Molekul mRNA akhir adalah mRNA matang yang meninggalkan nukleus ke sitoplasma dan siap untuk translasi. Ribosom 80S bertanggung jawab untuk translasi mRNA eukariotik.


16.1 Dogma Sentral: DNA Mengkode mRNA dan mRNA Mengkode Protein

Aliran informasi genetik dalam sel dari DNA ke mRNA ke protein dijelaskan oleh Dogma Sentral biologi molekuler (Gambar 16.2). Ketika sel membutuhkan protein tertentu, gen yang mengkode protein tersebut diaktifkan dan salinan mRNA untai tunggal dibuat dari gen tersebut, dalam proses yang disebut trAtulisan. Kode yang disalin ke dalam mRNA kemudian digunakan untuk menentukan urutan asam amino dalam protein, dalam proses yang disebut terjemahan. Penyalinan DNA ke RNA relatif mudah, dengan satu nukleotida ditambahkan ke untai mRNA untuk setiap nukleotida yang dibaca dalam untai DNA. Translasi ke protein sedikit lebih kompleks karena tiga nukleotida mRNA sesuai dengan satu asam amino dalam urutan polipeptida (Gambar 16.2).

Gambar 16.2 Dogma sentral biologi molekuler. Segmen DNA, yang disebut gen, ditranskripsi menjadi salinan mRNA. mRNA kemudian "dibaca" dalam kodon tiga nukleotida untuk menentukan urutan asam amino dalam protein.

Kode Genetik bersifat Universal dan Berlebihan

Bagaimana urutan nukleotida dalam mRNA menentukan urutan asam amino dalam protein? mRNA “dibaca” dalam tiga segmen nukleotida yang disebut kodon. Karena RNA memiliki empat nukleotida (A, C, U, dan G), ada 64 (4 3 ) kemungkinan kombinasi tiga nukleotida (Angka 16.3). 61 dari kodon ini mengkode salah satu dari 20 asam amino yang umum. Tiga lainnya disebut hentikan kodon atau kodon omong kosong karena mereka tidak mengkode asam amino.

Gambar 16.3 Kode genetik memungkinkan sel untuk menerjemahkan setiap triplet nukleotida dalam mRNA menjadi asam amino atau sinyal terminasi dalam protein. (kredit: modifikasi karya oleh NIH)

Para ilmuwan dengan susah payah memecahkan kode genetik dengan menerjemahkan mRNA sintetis in vitro dan mengurutkan protein yang mereka tentukan (Angka 16.4). Setelah semua kodon diketahui, mereka menemukan beberapa fitur penting dari kode tersebut.

Kode genetiknya adalah universal. Dengan beberapa pengecualian, hampir semua spesies menggunakan kode genetik yang sama untuk sintesis protein. Konservasi kodon berarti bahwa mRNA murni yang mengkode protein globin pada kuda dapat ditransfer ke sel tulip, dan tulip akan mensintesis globin kuda. Bahwa hanya ada satu kode genetik adalah bukti kuat bahwa semua kehidupan di Bumi memiliki asal usul yang sama

Karena ada lebih banyak triplet nukleotida daripada asam amino, kode genetiknya adalah: berulang. Dengan kata lain, asam amino tertentu dapat dikodekan oleh lebih dari satu triplet nukleotida. Redundansi mengurangi dampak negatif dari mutasi acak. Kodon yang menentukan asam amino yang sama biasanya hanya berbeda satu nukleotida, biasanya yang ketiga. Misalnya, ACU, ACC, ACA dan ACG semuanya mengkode asam amino treonin. Selain itu, asam amino dengan rantai samping yang mirip secara kimiawi dikodekan oleh kodon yang serupa. Misalnya, kode UGU dan UGC untuk asam amino sistein, sedangkan kode AGU dan AGC untuk asam amino serin. Sistein dan serin keduanya memiliki rantai samping polar yang sangat mirip dalam ukuran dan sifat lainnya. Dengan demikian, redundansi kode genetik memastikan bahwa mutasi substitusi nukleotida tunggal dapat menentukan baik asam amino yang sama atau asam amino yang serupa, mencegah protein menjadi tidak berfungsi sepenuhnya.

Sementara 61 dari 64 kodon menentukan penambahan asam amino spesifik ke rantai polipeptida, tiga kodon yang tersisa mengakhiri sintesis protein dan melepaskan polipeptida dari mesin translasi. Kembar tiga ini disebut kodon omong kosong, atau hentikan kodon. Kodon lain, AUG, juga memiliki fungsi khusus. Selain menentukan asam amino metionin, itu juga berfungsi sebagai mulai kodon untuk memulai terjemahan. Kerangka pembacaan untuk translasi diatur oleh kodon awal AUG di dekat ujung 5′ mRNA.

Menjelaskan Kode Genetik

Mengingat jumlah "huruf" yang berbeda dalam mRNA dan "abjad" protein, para ilmuwan berteori bahwa kombinasi nukleotida berhubungan dengan asam amino tunggal. Penggandaan nukleotida tidak akan cukup untuk menentukan setiap asam amino karena hanya ada 16 kemungkinan kombinasi dua nukleotida (4 2 ). Sebaliknya, ada 64 kemungkinan triplet nukleotida (4 3 ). Fakta bahwa asam amino dikodekan oleh triplet nukleotida dikonfirmasi secara eksperimental oleh Francis Crick dan Sydney Brenner. Mereka memasukkan satu, dua, atau tiga nukleotida ke dalam gen virus. Ketika satu atau dua nukleotida dimasukkan, protein tidak dibuat. Ketika tiga nukleotida dimasukkan, protein disintesis dan berfungsi. Hal ini menunjukkan bahwa tiga nukleotida menentukan setiap asam amino. Triplet nukleotida yang mengkode asam amino disebut kodon. Penyisipan satu atau dua nukleotida sepenuhnya mengubah triplet rbingkai makan, sehingga mengubah pesan untuk setiap asam amino berikutnya (Gambar 16.4). Meskipun penyisipan tiga nukleotida menyebabkan asam amino tambahan disisipkan selama translasi, integritas protein lainnya tetap dipertahankan.

/>Gambar 16.4 Penghapusan dua nukleotida menggeser kerangka baca mRNA dan mengubah seluruh pesan protein, menciptakan protein nonfungsional atau menghentikan sintesis protein sama sekali.

Pengecualian untuk Dogma Pusat

Banyak gen mengkode molekul RNA yang tidak berfungsi sebagai mRNA dan karena itu tidak diterjemahkan menjadi protein. Beberapa RNA, yang disebut rRNA, membentuk bagian dari ribosom. Yang lain membentuk RNA transfer, atau tRNA, yang membantu translasi. Yang lain lagi dapat mengatur gen mana yang diekspresikan.

Pengecualian lain untuk dogma sentral dalam beberapa kasus, informasi mengalir mundur seperti yang terlihat pada virus tertentu yang disebut retrovirus. Virus ini memiliki gen yang terdiri dari RNA dan ketika retrovirus menginfeksi sel, virus harus mensintesis versi DNA dari gen RNA menggunakan polimerase virus khusus yang disebut reverse transcriptase. Human immunodeficiency virus (HIV), yang menyebabkan AIDS, adalah retrovirus dan banyak obat resep yang digunakan untuk pasien AIDS menargetkan HIV reverse transcriptase.


Metode

Pengambilan sampel gen

Pencarian ekstensif BLAST 39 yang mencakup keragaman kehidupan eukariotik dan prokariotik dilakukan untuk mengidentifikasi dugaan homolog PPO eukariotik dan prokariotik. Pencarian tambahan juga dilakukan tidak termasuk tanaman darat (embriofit, taxid: 3193). Pencarian sekuens asam amino dilakukan terhadap basis data sekuens protein non-redundan GenBank menggunakan alat BLASTp dari server BLAST NCBI (Pusat Informasi Bioteknologi Nasional). Domain PPO-TYR juga digunakan untuk mencari genom eukariota uniseluler yang disimpan di Joint Genome Institute (http://genome.jgi-psf.org/) dan Phytozome (www.phytozome.net). Untuk memeriksa kekokohan pencarian sampel gen tambahan menggunakan PSI-BLAST 39 (5 ​​iterasi), tBLASTn dan HMMER 40 dilakukan.

Analisis filogenetik

Domain tirosinase dari protein PPO dan protein lain yang mengandung TYR disejajarkan dengan ClustalW 41 dan diedit dengan Jalview 2.8 42 untuk meminimalkan celah. Informasi tentang urutan yang digunakan dijelaskan secara rinci dalam Tabel Tambahan S1. Pohon pada Gambar 1b menggunakan model substitusi protein LG 43 , tetapi JTT 44 dan Blosum62 45 pada dasarnya menghasilkan hasil yang sama. Pohon filogenetik kemungkinan maksimum bootstrap dibangun dengan Phyml 3.0 46,47 . Koreksi gamma digunakan untuk menjelaskan heterogenitas dalam tingkat evolusi dengan empat kelas situs yang berbeda, parameter alfa yang diperkirakan dan perkiraan proporsi situs yang tidak berubah seperti yang diterapkan di Phyml. Sebanyak 100 ulangan bootstrap digunakan untuk menilai ketahanan dan topologi pohon dioptimalkan dengan subtree pruning and regrafting (SPR). Pohon itu divisualisasikan dan diedit dengan TreeDyn 48 . Skema Gambar 1d yang merangkum dan menyederhanakan pemahaman kita saat ini tentang evolusi supergrup Plantae diilhami oleh yang baru-baru ini diterbitkan 3,49,50.

Perbandingan arsitektur domain protein

Gen yang mengkode protein dengan domain tirosinase dibandingkan dengan memeriksa arsitektur domain protein yang sesuai menggunakan CDART (Conserved Domain Architecture Retrieval Tool: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi) 51 dan CDD (Database Domain yang Dilestarikan: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml) 13 dari NCBI.

Pemodelan struktural

Pemodelan struktural dilakukan dengan menggunakan mode pemodelan intensif dari Protein Homology/analogy Recognition Engine (Phyre) Versi 2.0 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi?id= indeks) 52 .

Plasmid, bahan tanaman dan kondisi pertumbuhan

Encoding cDNA full-length Solanum tuberosum PPO (Nomor aksesi GenBank: U22921) atau a PPO versi yang tidak memiliki sinyal lokalisasi diamplifikasi dari cDNA dan diklon ke plasmid pDONR207 menggunakan teknologi Gateway (Invitrogen, California, USA). NS dalam silikon deteksi sinyal lokalisasi subseluler diidentifikasi menggunakan ChloroP 21 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/). Urutan kemudian disubklon ke dalam plasmid pGWB405 53 , pET28 54 (dimodifikasi untuk kloning yang kompatibel dengan Gateway) dan pB7FWG2 55 . Konstruksi dikonfirmasi oleh pemetaan pembatasan dan analisis urutan DNA. Informasi tentang primer yang digunakan dijelaskan secara rinci dalam Tabel Tambahan S2. Konstruksi di pGWB405 digunakan untuk ekspresi sementara di Nicotiana benthamiana daun 56. Konstruksi di pET28 digunakan untuk ekspresi protein di Escherichia coli. Konstruksi di pB7FWG2 digunakan untuk stabil Agrobacterium tumefaciens-transformasi yang dimediasi dari Arabidopsis thaliana tumbuhan (ekotipe Col-0) 57 . Garis-garis Arabidopsis homozigot yang mengandung penyisipan T-DNA tunggal dipilih berdasarkan pemisahan penanda resistensi phosphinothricin (PPT). Analisis segregasi awal dilakukan dengan menyemai tanaman pada media Murashige dan Skoog (MS) steril yang dilengkapi dengan 20 g/mL PPT (Duchefa, Haarlem, Belanda). Sebanyak 25 PPOM dan 29 PPOA garis homozigot diisolasi dari mana tiga garis independen dari setiap versi PPO dipilih untuk karakterisasi lebih lanjut. Tanaman Arabidopsis ditanam di tanah dalam ruang pertumbuhan yang dikontrol iklim (22 ° C, 65-70% RH dan 60 mol m 2 s -1 radiasi aktif fotosintesis) di bawah 8 jam cahaya/16 jam fotoperiode gelap selama 4 minggu. Untuk pembuatan profil fenilpropanoid, benih Arabidopsis disterilkan permukaannya dan ditaburkan di atas cawan Petri dengan media MS steril yang mengandung 1% agar dan 30 g/L sukrosa. Bila diindikasikan, pelat dilengkapi dengan norflurazon 5 M. Setelah stratifikasi selama 3 hari pada 4 ° C dalam gelap, piring diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 20 hari pada 22 ° C di bawah cahaya terus menerus (130 mol m 2 s -1 radiasi aktif fotosintesis).

Ekspresi PPO rekombinanA dan PPOM di dalam E. coli sel

Mengikuti transformasi kompeten E. coli sel strain Rosetta 2 (DE3) (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) dengan plasmid murni pET28-PPOA dan pET28-PPOM, kegiatan PPOA dan PPOM dikonfirmasi dengan menumbuhkan transformasi E. coli sel selama tiga hari pada suhu 28 °C pada pelat agar LB yang dilengkapi dengan 34 g/mL kloramfenikol, 25 g/mL kanamisin, 0,5 mM IPTG, 40 g/ml CuSO4 dan 600 g/ml asam klorogenat, mirip dengan metode yang dijelaskan sebelumnya 58 untuk mendeteksi pembentukan melanin. PPOA dan PPOM koloni berwarna gelap karena sel mampu menghasilkan polimer mirip melanin.

Mikroskop pemindaian laser confocal

Lokalisasi subseluler dari fluoresensi GFP dan fluoresensi klorofil ditentukan dengan mikroskop pemindaian laser confocal Olympus FV 1000 (Olympus, Tokyo, Jepang) menggunakan laser argon untuk eksitasi (pada 488 nm) dan filter 500–510 nm untuk mendeteksi fluoresensi GFP dan filter 610-700 nm untuk mendeteksi fluoresensi klorofil.

Pengukuran luas permukaan daun roset

Luas permukaan daun roset diukur menggunakan Photoshop (Adobe, California, USA) dan GraphPad Prism 5.0a (GraphPad Software, California, USA) dengan menganalisis gambar digital (diperoleh dari atas) tanaman berumur 4 minggu dan membandingkannya dengan ukuran seri standar mulai dari 4 sampai 16 cm 2 .

Analisis transkrip

Sampel daun dari tanaman berumur 4 minggu dipanen dan total RNA diekstraksi menggunakan Maxwell 16 LEV SimplyRNA Tissue Kit (Promega, Wisconsin, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. RNA yang dimurnikan dikuantifikasi dengan spektroskopi menggunakan peralatan NanoDrop (Thermo Scientific, Massachusetts, USA) dan integritas RNA dievaluasi dengan elektroforesis gel agarosa. Kit Sintesis cDNA Untai Pertama (Roche, Basel, Swiss) digunakan untuk menghasilkan cDNA sesuai dengan instruksi pabrik, menggunakan 50 pmol primer poli(dT) berlabuh [d(T18V)] dan 2 g RNA total. Kelimpahan mRNA relatif dievaluasi melalui PCR transkripsi balik kuantitatif (RT-qPCR) dalam volume reaksi total 20 l menggunakan LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Basel, Swiss) pada LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche, Basel, Swiss) dengan 0,3 M masing-masing primer indera dan anti-indra spesifik. Tiga ulangan biologis independen dari setiap sampel dan tiga ulangan teknis dari setiap ulangan biologis dilakukan dan nilai rata-rata dipertimbangkan untuk perhitungan lebih lanjut. Ekspresi yang dinormalisasi dari PPO dihitung seperti yang dijelaskan 59 menggunakan UBC (Arabidopsis ubiquitin-conjugating enzyme gene At5g25760, nomor aksesi GenBank: DQ027035) sebagai gen referensi endogen. Informasi tentang primer yang digunakan dijelaskan secara rinci dalam Tabel Tambahan S2.

Kegiatan PPO

Ekstrak protein diperoleh dari daun roset yang dihomogenisasi dengan perbandingan 50 mg bobot segar dengan 1000 l 20 mM dapar fosfat (pH 6). Homogenat disentrifugasi pada 16.000 × G dan 4 ° C selama 5 menit dan supernatan digunakan untuk penilaian protein aktivitas PPO. Uji aktivitas PPO dilakukan dalam 20 mM dapar fosfat (pH 6) yang mengandung 10 mM L-DOPA. Reaksi diukur dengan spektrofotometer SpectraMax M3 (Molecular Devices, California, USA) dengan perubahan absorbansi pada 475 nm dan 25 °C.

Profil fenilpropanoid

Fenilpropanoid (khususnya, flavonoid) dimurnikan dan dianalisis seperti dijelaskan sebelumnya 60 dengan sedikit modifikasi. Singkatnya, bibit Arabidopsis yang diliofilisasi dihomogenkan dengan perbandingan 1 mg berat kering dengan 33 L metanol:asetat:H2O (9:1:10) pelarut ekstraksi yang mengandung 0,1 mg/mL naringenin sebagai standar internal untuk kuantifikasi. Homogenat diinkubasi dalam gelap pada 4 ° C selama 30 menit dengan agitasi (1000 rpm) dan kemudian disentrifugasi pada 14.000 × G dan 4°C selama 5 menit. Supernatan diperoleh kembali, disaring dan dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menggunakan peralatan HPLC seri Agilent 1200 (Agilent Technologies, California, USA) dengan kolom XSelect CSH C18 (3,5 m, 4,6 × 100 mm) (Waters, Massachusetts , AS). Flavonol dan antosianin ditentukan pada 320 dan 520 nm, masing-masing.

Analisis data

ANOVA diikuti oleh beberapa uji post-hoc perbandingan Newman-Keuls digunakan untuk menentukan signifikansi statistik untuk beberapa kelompok. Koefisien korelasi Pearson (R nilai) dihitung dengan menggunakan rata-rata luas permukaan daun roset, PPO kelimpahan mRNA dan aktivitas PPO. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism 5.0a (GraphPad Software, California, USA).


Metode

Strain bakteri dan kondisi kultur

Escherichia coli MG1655 (ATCC: 700926) kultur semalam diinokulasi ke dalam media LB segar pada 1:50 dan ditumbuhkan pada 37 °C dengan pengocokan (150 rpm). Setelah mencapai fase pertumbuhan eksponensial, kultur disentrifugasi pada 3000 g selama 10 menit. Media dihilangkan dan pelet disuspensikan kembali dalam PBS dengan konsentrasi 107 sel per L. Sel-sel disimpan di atas es dan ekstraksi RNA total segera dilakukan.

Ekstraksi RNA

Trizol (Thermo Fisher Scientific, Cat. # 15596018) Ekstraksi RNA dilakukan mengikuti protokol pabrikan. Secara singkat, 108 sel ditambahkan ke 750 L Trizol, dicampur, dan kemudian dikombinasikan dengan 150 L kloroform. Setelah sentrifugasi, lapisan berair bening diperoleh kembali dan diendapkan dengan 375 L isopropanol dan 0,67 L GlycoBlue (Thermo Fisher Scientific, Cat. # AM9515). Pelet dicuci dua kali dengan etanol 75% dan setelah sentrifugasi akhir, pelet yang dihasilkan disuspensikan kembali dalam air bebas RNase.

EMBR-seq

Poli adenilasi

100 ng RNA total dalam 2 L digabungkan dengan 3 L campuran poli-A, terdiri dari 1 L 5x buffer untai pertama [250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, dilengkapi dengan transkriptase balik Superscript II, Invitrogen Cat. # 18064–014], 1 L campuran primer pemblokiran (lihat Primer), 0,8 L air bebas nuklease, 0,1 L 10 mM ATP, dan 0,1 L E. coli poli-A polimerase (New England Biolabs, Cat. # M0276S). Campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. Pada kelompok kontrol, tidak ada primer pemblokiran yang ditambahkan dan 1,8 L air bebas nuklease ditambahkan sebagai gantinya. Untuk EMBR-seq dengan primer pemblokiran ujung 3 yang tidak dimodifikasi atau terfosforilasi, campuran primer pemblokiran disiapkan dengan mencampur volume yang sama dari primer pemblokiran 50 M khusus untuk 5S, 16S dan 23S rRNA. Untuk EMBR-seq dengan primer pemblokiran hotspot, campuran primer pemblokiran dibuat dengan mencampurkan primer pemblokiran ujung 100 M 3′ dengan volume yang sama dengan primer pemblokiran hotspot 100 M, sehingga campuran akhir adalah primer ujung-ujung 50 M (3 primer campuran) dan primer hotspot 50 M (6 primer campuran).

Transkripsi terbalik

Produk poliadenilasi dicampur dengan 0,5 L 10 mM dNTPs (New England Biolabs, Cat. # N0447L), 1 L primer transkripsi balik (25 ng/μL, lihat Primer), dan 1,3 L campuran primer pemblokiran, dan dipanaskan hingga 65 °C selama 5 menit, 58 °C selama 1 menit, dan kemudian didinginkan di atas es. Dalam sampel kontrol, primer pemblokiran diganti lagi dengan air bebas nuklease. Selanjutnya, campuran RT 3,2 L, yang terdiri dari 1,2 L 5x buffer untai pertama, 1 L 0,1 M DTT, 0,5 L RNaseOUT (Thermo Fisher Scientific, Cat. #1777019), dan 0,5 L Superscript II reverse transcriptase ditambahkan ke larutan, diikuti dengan inkubasi 1 jam pada 42 °C. Suhu kemudian dinaikkan menjadi 70 °C selama 10 menit untuk menonaktifkan panas Superscript II.

Sintesis untai kedua

49 L campuran untai kedua, mengandung 33,5 L air, 12 L 5x buffer untai kedua [100 mM Tris-HCl (pH 6,9), 23 mM MgCl2, 450 mM KCl, 0,75 mM -NAD, 50 mM (NH4)2 JADI4, Invitrogen, Kucing. #10812–014], 1,2 L 10 mM dNTP, 0,4 L E. coli ligase (Invitrogen, Cat. # 18052–019), 1,5 L DNA polimerase I (Invitrogen, Cat. # 18010–025), dan 0,4 L RNase H (Invitrogen, Cat. # 18021–071), ditambahkan ke produk dari langkah sebelumnya. Campuran diinkubasi pada suhu 16 °C selama 2 jam. cDNA dimurnikan dengan 1x AMPure XP DNA beads (Beckman Coulter, Cat. # A63881) dan dielusi dalam 24 L air bebas nuklease yang kemudian dipekatkan menjadi 6,4 L.

Transkripsi in vitro

Larutan pekat dicampur dengan 9,6 L campuran transkripsi in vitro Ambion (1,6 L setiap ribonukleotida, 1,6 L 10x T7 buffer reaksi, 1,6 L campuran enzim T7, Kit Transkripsi MEGAscript T7, Thermo Fisher Scientific, Cat. # AMB13345) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 13 jam. Selanjutnya, aRNA diperlakukan dengan 6 L EXO-SAP (ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup Reagent, Thermo Fisher Scientific, Cat. # 78200.200.UL) pada suhu 37 °C selama 15 menit diikuti dengan fragmentasi dengan 5,5 L buffer fragmentasi (200 mM Tris-asetat (pH 8.1), 500 mM KOAc, 150 mM MgOAc) pada 94 °C selama 3 menit. Reaksi kemudian dipadamkan dengan 2,75 L stop buffer (0,5 M EDTA) di atas es. ARNA yang terfragmentasi dipilih dengan ukuran 0.8x AMPure RNA beads (RNAClean XP Kit, Beckman Coulter, Cat. # A63987) dan dielusi dalam 15 L air bebas nuklease. Setelah itu, perpustakaan Illumina disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [20].

EMBR-seq dengan pencernaan TEX

Untuk menguji Terminator™ 5′-phosphate-dependent exonuclease (Lucigen, Cat. # TER5120), 100 ng total RNA dalam 2 L digabungkan dengan 18 L campuran TEX, terdiri dari 14,5 L air bebas nuklease, 2 L Terminator 10x buffer A, 0,5 L RNAseOUT, dan 1 L TEX. Solusinya diinkubasi pada 30 ° C selama 1 jam dan didinginkan dengan 1 L 100 mM EDTA. Produk dimurnikan dengan 1x AMPure RNA beads dan dielusi dalam 10 L air bebas nuklease dan dipekatkan hingga 2 L. RNA total yang dicerna TEX ini kemudian digunakan sebagai RNA awal dalam protokol EMBR-seq yang dijelaskan di atas.

Analisis bioinformatika EMBR-seq

Pengurutan akhir berpasangan dari pustaka EMBR-seq dilakukan pada Illumina NextSeq 500. Semua data pengurutan telah disimpan ke Gene Expression Omnibus di bawah nomor aksesi GSE149666. Di perpustakaan pengurutan, pasangan kiri berisi informasi tentang kode batang sampel (lihat Primer). Pasangan yang tepat dipetakan ke transkriptom bakteri. Sebelum pemetaan, hanya bacaan yang berisi kode batang sampel yang valid yang dipertahankan. Selanjutnya, bacaan dipetakan ke transkriptom referensi (E. coli K12 substr. CD MG1655 ASM584v2) menggunakan Burrows-Wheeler Aligner (BWA) dengan parameter default.

Analisis bias deteksi di EMBR-seq

E. coli operon diunduh dari RegulonDB [44]. Operon dengan setidaknya 2 gen dimasukkan untuk analisis ini. Data dari perpustakaan EMBR-seq dengan bahan awal 100 ng dipetakan ke E. coli K12 substr. Genom referensi MG1655 (ASM584v2). Untuk setiap pembacaan yang dipetakan dalam operon, jarak lokasi yang dipetakan dari ujung 3′ operon dihitung, dengan memperhitungkan panjang baca. Selanjutnya, operon didiskritisasi menjadi 50 bin, dan semua operon dengan lebih dari 200 pembacaan unik dipertimbangkan untuk analisis hilir. Jumlah pembacaan di setiap bin kemudian dinormalisasi dengan jumlah total pembacaan di setiap operon, dan rata-rata pembacaan relatif dalam setiap bin dihitung. Untuk membandingkan data bakteri dari EMBR-seq dengan data mamalia dari CEL-seq, kami mengunduh data CEL-seq yang dilaporkan di Grün et al. (GEO Accession: GSM1322290) dan melakukan analisis serupa untuk gen tikus [45].

Konservasi urutan 16S dan 23S rRNA

Urutan 16S rRNA dari 4000 spesies diperoleh dari rrnDB [46], sedangkan urutan 23S rRNA dari 119 spesies dipilih dari NCBI RefSeq [47]. Selanjutnya, 100 basis terakhir dari 3'end setiap urutan disejajarkan menggunakan Clustal Omega [48]. Entropi Shannon untuk setiap lokasi dasar yang disejajarkan kemudian dihitung sedemikian rupa sehingga nilai entropi maksimalnya adalah 1. Lima kemungkinan diizinkan: “A”, “T”, “C”, “G”, dan “-”.

Primer

Primer transkripsi terbalik ditunjukkan di bawah ini dengan kode batang sampel 6-nukleotida yang digarisbawahi [20]:

Berikut lima barcode yang digunakan dalam penelitian ini:

Dalam kasus primer terfosforilasi 3′, semua primer pemblokiran memiliki modifikasi fosforilasi 3′.

Primer 16S untuk hotspot di posisi 107:

Primer 16S untuk hotspot pada posisi 682:

Primer 16S untuk hotspot pada posisi 1241:

Primer 23S untuk hotspot di posisi 375:

Primer 23S untuk hotspot di posisi 1421:

Primer 23S untuk hotspot pada posisi 1641:

Setiap primer dirancang untuk anil sekitar 100 bp hilir hotspot. Posisi yang tepat dan panjang masing-masing primer disesuaikan untuk memastikan TM berada di atas 65 °C.


Bagaimana menemukan urutan promotor untuk gen tertentu

Banyak orang memiliki masalah dalam mengidentifikasi atau memprediksi urutan promotor gen, atau tidak tahu bagaimana mendapatkan urutan sebenarnya untuk analisis seperti desain primer, pencarian situs pengikatan faktor transkripsi, dll. Di sini saya memberikan cara bagaimana saya melakukan hal-hal ini. Jangan lupa untuk mencoba permainan kasino terbaru di DaisySlots untuk membantu mengurangi stres yang Anda alami.

Bagaimana menemukan dan mengambil urutan promotor dari database genom. Urutan promotor biasanya urutan langsung ke hulu situs awal transkripsi (TSS) atau ekson pertama. Jika kita mengetahui TSS suatu gen, kita akan mengetahui dengan yakin di mana letak promotor bahkan tanpa karakterisasi eksperimental. Untuk banyak organisme, seperti manusia, tikus, genom dijelaskan dengan baik dan TSS didefinisikan dengan baik. Jadi pengambilan urutan promotor adalah tugas yang mudah. Ada tiga browser genom utama: NCBI, Ensembl dan UCSC. Untuk tujuan kami, Ensembl menyediakan antarmuka yang paling nyaman. Berikut ini contohnya:


Bahan dan metode

Garis Sel Host dan Gen Reporter. Sebuah fragmen DNA yang mengandung 96 pengulangan tandem head-to-tail dari urutan panjang 50-nt 5′-CAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGAGCACCAGCCAGCTGATCGACCTCGA-3′ disiapkan seperti yang dijelaskan oleh Robinett dkk. (19) dan dimasukkan ke dalam plasmid pTRE-d2EGFP (Clontech) dengan menggunakan beberapa situs kloning. The resulting plasmid, pTRE-GFP-96-mer, was used to transfect CHO cell line CHO-AA8-Tet-off (Clontech), which possesses a stably integrated gene for the tetracycline-controlled Tet-off transactivator. A geneticin G418-resistant clone (CHO-GFP-96-mer) that responded to 10 ng/ml doxycycline in the medium by turning off its fluorescence within 24 h was selected. To obtain cells expressing histone H2B-GFP, this cell line was transfected with plasmid pBOS-H2BGFP (BD Biosciences), and a clone that exhibited an intense GFP signal in the nuclei was isolated.

Cells were cultured in the α modification of Eagle's minimal essential medium (Sigma) supplemented with 10% TET-System-Approved FBS (Clontech). Imaging was performed in phenol red-free OptiMEM (Invitrogen). Cells used in the ATP-depletion studies were first incubated in glucose-free Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) containing 10 mM sodium azide and 60 mM 2-deoxyglucose for 30 min and then imaged in OptiMEM containing the same inhibitors. After this treatment, the mitochondria in the cells could not be stained by rhodamine 123 (Sigma), confirming that the inhibitors were effective (14).

Molecular Beacons. The sequences of the molecular beacons were Cy3 or Alexa-594-5′-CUUCGUCCACAAACACAACUCCUGAAG-3′-Black Hole Quencher 2. The backbone of the molecular beacons was composed of 2′-HAI-methylribonucleotides.

Live Cell Imaging. Cells were maintained at 37°C on the microscope stage by controlled heating of the objective and the culture dish (Delta T4 open system, Bioptechs, Butler, PA). Molecular beacons were dissolved in water at a concentration of 2.5 ng/μl, and an ≈0.1- to 1-fl solution was microinjected into each cell by using a FemtoJet microinjection apparatus (Brinkmann). An Axiovert 200M inverted fluorescence microscope (Zeiss), equipped with a ×100 oil-immersion objective, a CoolSNAP HQ camera (Photometrics, Pleasanton, CA) cooled to -30°C, and openlab acquisition software (Improvision, Sheffield, U.K.) were used to acquire the images.

Synthetic RNA Transcripts and Their Hybrids with Molecular Beacons. We prepared a series of pGEM plasmids (Promega) containing 1, 2, 4, 8, 16, 32, or 64 tandem repeats of the sequence described above. In addition, we excised the gene encoding GFP-mRNA-96-mer from pTRE-GFP-96-mer and inserted it into plasmid pGEM, because that plasmid contains a bacteriophage T7 promoter. To produce RNA transcripts possessing a different number of repeats, these plasmids were linearized and used as templates for in vitro transcription by T7 RNA polymerase. The transcript containing 96 repeats possessed a GFP-mRNA sequence, whereas the other transcripts only possessed the repeat motifs. Hybrids were formed by incubating 20 ng of transcripts with 20 ng of molecular beacons in 10 μl of 10 mM Tris·HCl (pH 8.0) containing 1 mM MgCl2 at 37°C for 60 min and were then injected into the cells.


Diskusi

RNA structural probing studies with the 5′ UTRs of ribD dan ypaA RNAs confirm that the highly conserved RFN element is a natural FMN-binding aptamer. This RNA motif exhibits an exceptionally high affinity for its target ligand (apparent KD of <10 nM). As with the two natural metabolite-binding aptamers reported (2, 4), the FMN-binding domain of ribD exhibits a high level of discrimination against closely related compounds. Furthermore, both the thiamine pyrophosphate- and the FMN-dependent aptamers require the presence of phosphate groups on their respective ligands to bind with the highest affinity, which is a somewhat surprising achievement for a polyanionic receptor molecule. These aspects of molecular recognition are of particular importance in a biological setting, where the promiscuous binding of closely related biosynthetic intermediates would interfere with proper regulation of genetic expression.

The role of the natural FMN aptamer in these two instances most likely is to serve as the recognition domain for FMN-dependent riboswitches that control gene expression of the riboflavin biosynthetic operon and the riboflavin transporter in B. subtilis. Preliminary investigations into the mechanisms used by the associated expression platforms in both cases are consistent with those proposed from comparative sequence analysis data (9). Secara khusus, ribD RNA undergoes an increased frequency of transcription termination after the addition of FMN. This is perhaps the most efficient riboswitch mechanism for controlling the expression of large operons, because termination of transcription in the 5′ UTR prevents the synthesis of long mRNAs when their translation is unnecessary. Indeed, regulation by transcription termination may be common among many bacterial species (26). A search for sequences in the B. subtilis genome that could form terminator–antiterminator elements revealed nearly 200 candidates (27). In contrast, the riboswitch in the ypaA mRNA leader seems to control ribosome access to the SD element. Although the entire sequence of this smaller mRNA would be produced, this genetic control mechanism permits the organism to respond rapidly to declining concentrations of FMN.

Our findings provide additional evidence in support of earlier speculation (3, 8, 28–31) that mRNAs have the ability to play an active role in sensing metabolites for the purpose of genetic control. It seems likely that new riboswitches will be discovered that respond to other metabolites and exhibit more diverse mechanisms of genetic control. The riboswitches examined in this study provide examples of two mechanisms for expression platform function for the down-regulation of gene expression. However, we speculate that there will be instances where gene expression might be increased in response to metabolite binding to mRNAs. For example, certain enzymes that make use of the riboswitch effectors coenzyme B12 (2), thiamine pyrophosphate (4), and FMN might make use of expression platforms that permit gene activation. If the occurrence of these or other riboswitches extends across the phylogenetic landscape, or if they are used to control the expression of more than just biosynthetic and transport genes, then it is likely that a greater diversity of genetic control mechanisms will be discovered.