Informasi

Koreksi latar belakang saat membaca ELISA dengan substrat TMB

Koreksi latar belakang saat membaca ELISA dengan substrat TMB


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya sedang melakukan beberapa pengembangan ELISA, dan saya ingin beberapa pembenaran/praktik terbaik untuk koreksi latar belakang. Saya menggunakan sistem deteksi horseradish-peroxidase (HRP) bersama dengan substrat TMB dan larutan penghenti berbasis asam, yang cukup umum. Ketika TMB dibelah oleh HRP, menghasilkan warna biru (absorbansi maksimum (Amaksimal) dari 650 nm) produk. Penambahan asam tidak hanya menghentikan reaksi untuk deteksi titik akhir, tetapi juga memperkuat sinyal dua hingga tiga kali lipat, dan mengubah larutan menjadi kuning, sehingga harus dibaca pada A-nya.maksimal dari 450nm. Asam itu sendiri diduga memiliki Amaksimal dari 540 nm, itulah sebabnya Anda harus menggunakan panjang gelombang itu untuk koreksi latar belakang, menguranginya dari A450. Sumber lain mengklaim A540 membaca seharusnya mengoreksi "ketidaksempurnaan optik" di piring.

Menggunakan salah satu dari penjelasan ini, orang akan berasumsi bahwa A540 akan relatif seragam di seluruh pelat, terlepas dari A450 dari sumur yang sama. Namun, dalam pengalaman saya, itu tidak terjadi sama sekali. Kosong dan kontrol negatif saya rata-rata sekitar 0,041 unit absorbansi (AU) pada 540 nm, dengan rata-rata A450 sekitar 0,065. Namun, sebuah A450 dari 0,9 memberikan A540 dari 0,051, 1,4 menghasilkan 0,6, 2,0 menghasilkan 0,73, dan 3,5 menghasilkan 0,14. Spektrum absorbansi (Gbr. 2) substrat tampaknya cukup minimal pada 540 nm, jadi mengapa saya melihat peningkatan yang bergantung pada dosis ini sebagai A450 meningkat?

Lebih praktis, bagaimana saya harus melakukan koreksi latar belakang? Saat ini, saya mengurangi A masing-masing sumur individu540 dari A nya450. Haruskah saya melanjutkan latihan ini, atau haruskah saya menentukan latar belakang pelat rata-rata pada 540 nm menggunakan blanko dan kontrol negatif saya, dan mengurangi nilai itu dari setiap individu A450?


Menggunakan panjang gelombang yang berbeda untuk referensi memberikan beberapa keuntungan. Anda dapat mengukur garis dasar setiap sumur. Semua sumur mungkin tidak memiliki baseline yang sama karena setiap sumur mungkin tidak sama persis dengan sumur lainnya. Selain itu, Anda dapat membuat goresan di atasnya, Anda mungkin menyentuh bagian bawahnya, atau Anda mendapatkan kotoran dari bangku Anda. Dan ini dapat diperbaiki oleh A540 dalam kasus Anda. Jadi, variasi pada kisaran yang lebih rendah tidak terlalu diperhatikan. Kadang-kadang, bahkan jika Anda memilih panjang gelombang di mana absorbansi tampaknya tidak berubah setelah reaksi, mungkin ada perubahan kecil. Ini tidak menyangkut eter, karena kedua absorbansi bergantung pada konsentrasi kecuali keadaan dalam larutan tidak berubah (dari kompleks atau semacamnya).

Tapi tetap saja, Anda mendapatkan latar belakang yang tinggi dari sampel yang menunjukkan 1,4 atau lebih pada A450. Saya tidak memiliki pengalaman untuk substrat ini, tetapi Anda mungkin ingin memikirkan beberapa kemungkinan: 1) Anda mungkin mendapatkan gelembung di bagian atas larutan Anda di dalam sumur, 2) Anda mungkin tidak mendapatkan nilai yang akurat karena OD terlalu tinggi, 3) Solusinya mungkin mendapatkan endapan 4) Ini mungkin sangat kecil kemungkinannya, tetapi beberapa reaksi sekunder terjadi.

Untuk 2), 3), dan 4). Anda mungkin ingin memeriksa linearitas dengan menggambar kurva standar, dan menghindari penggunaan rentang yang menyimpang dari hubungan liner.

PS Saya seharusnya menyebutkan bahwa Anda akan memeriksa spesifikasi pembaca pelat Anda. OD=3 bisa menjadi cara yang tinggi untuk mengukurnya. Karena intensitas cahaya berkurang hingga seperseribu meskipun lintasan cahaya 1 cm pada OD=3. Sangat sulit untuk mengukur lampu lemah seperti itu dengan tepat. Mungkin banyak spesifikasi pembaca pelat mengatakan Anda dapat mengukur OD hingga sekitar 2, tetapi beberapa orang berpikir itu ideal untuk mengukur OD hingga sekitar 1.


Kontrol mana yang digunakan dalam ELISA Assays?

Enzym-linked immunosorbent assays (ELISAs) yang andal untuk kuantifikasi zat target sangat bergantung pada kontrol yang dipilih dengan cermat – ini adalah ABC dari ELISA: semuanya Apertandingan Bmenemukan Ckontrol.

Untuk memahami jenis kontrol dan mana yang harus diterapkan, penting untuk memahami berbagai jenis ELISA terlebih dahulu (lihat Catatan Teknis kami “Apa perbedaan antara jenis pengujian ELISA?” untuk tinjauan yang lebih mendalam). ELISA langsung memiliki kebutuhan kontrol yang berbeda dari sandwich atau ELISA kompetitif, dan cara persiapan atau deteksi sampel yang berbeda memerlukan kontrol yang berbeda juga.

Ada tiga jenis utama prinsip ELISA. Dalam ELISA langsung, sampel dilapisi ke piring dan antigen dalam sampel, juga dikenal sebagai analit, dideteksi oleh antibodi. Sandwich dan ELISA kompetitif keduanya memiliki pelat yang dilapisi dengan antibodi. Dalam sandwich ELISA, pelat dilapisi dengan antibodi penangkap yang mengikat analit dan antibodi deteksi terkonjugasi kedua mengikat analit dan memodulasi reaksi deteksi. ELISA kompetitif menggunakan konjugat, antigen analit yang digabungkan ke reagen deteksi, yang bersaing dengan analit untuk mengikat. Semakin banyak analit yang terkandung dalam sampel, semakin sedikit konjugat yang terikat dan semakin rendah sinyal yang dimediasi enzim.

Meskipun sifat dan nomenklaturnya berbeda tergantung pada jenis ELISA yang digunakan, kontrol dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok: kontrol negatif dan positif.

Kontrol Negatif ditandai dengan tidak adanya reagen atau komponen yang diperlukan untuk deteksi analit yang sukses. Kontrol negatif umumnya bertujuan untuk memperkirakan tingkat pengikatan nonspesifik serta mengidentifikasi sumbernya. Kontrol negatif berikut biasanya digunakan dalam ELISA:

Koreksi panjang gelombang adalah koreksi umum dalam perangkat dari sinyal yang dapat digunakan secara independen dari jenis ELISA yang digunakan. Untuk koreksi panjang gelombang, sinyal densitas optik (OD) substrat dibaca pada panjang gelombang spesifiknya dan dikoreksi terhadap penyerapan tidak spesifik pada panjang gelombang di luar spektrum substrat. Hal ini memungkinkan untuk mengoreksi perubahan dalam penyerapan latar belakang, yang dapat disebabkan oleh barang-barang plastik, kondensasi atau kontaminan seperti yang mungkin terjadi misalnya pada ELISA sel utuh.

Kontrol Kosong adalah tipe kontrol negatif yang paling umum, tetapi mungkin terminologi yang paling tidak konsisten digunakan. Ada beberapa ambiguitas tentang apa sebenarnya kontrol kosong itu. Sumur kosong kosong yang tidak mengandung atau tidak melihat cairan apa pun pada titik mana pun adalah salah satu bentuk umum dari kontrol kosong, tetapi mungkin yang sama umum adalah buffer blank assay, yaitu sumur yang hanya diisi dengan buffer ELISA. Blanko dimaksudkan untuk menganalisis kontribusi absorbansi latar belakang plastik dan/atau buffer terhadap sinyal. Mereka sering dihilangkan demi koreksi panjang gelombang dan/atau kontrol S0 atau NSB (lihat di bawah). Beberapa bentuk blanko atau kontrol latar belakang harus dijalankan bersama standar dan sampel di setiap pengujian, terlepas dari ELISA yang sudah mapan.

Bentuk kosong lain yang sangat berguna dalam pemecahan masalah sinyal latar belakang yang tidak terduga sering disebut sebagai kromogen kosong. Di sini, hanya substrat dan stop solution yang ditambahkan ke sumur. Kontrol ini bertujuan untuk memeriksa kontribusi media ke latar belakang, mis. karena substrat yang terlalu tua.

S0 adalah kontrol negatif yang mengandung nol standar (atau bentuk analit lainnya, misalnya sampel), tetapi semua komponen lain untuk reaksi warna yang berhasil ditambahkan. Dalam ELISA langsung dan sandwich, ini akan mengarah pada pengembangan warna minimal yang menentukan latar belakang maksimal tanpa adanya analit. Sedikit latar belakang yang sering diamati adalah karena ikatan antibodi pendeteksi yang tidak spesifik dan dapat digunakan untuk mengontrol sumber latar belakang tidak spesifik yang tinggi dan cara untuk menghilangkannya (misalnya langkah pencucian, pengenceran antibodi, dll.). Nilai S0 yang diperoleh dapat digunakan untuk koreksi nilai dari semua nilai yang diperoleh lainnya (umumnya dikenal sebagai "blanking"), tetapi lebih umum digunakan untuk menentukan nilai nol dari kurva standar.

Kontrol Non-Specific Binding (NSB) dalam ELISA kompetitif memenuhi fungsi yang sama seperti S0 dalam sandwich ELISA – untuk menentukan latar belakang yang terjadi karena pengikatan enzim terkonjugasi yang tidak spesifik. Seperti pada ELISA kompetitif, enzim dikonjugasikan ke analit dan bukan ke antibodi pendeteksi, pengikatan tidak spesifik perlu dianalisis tanpa adanya antibodi penangkap dan sampel atau analit standar. Latar belakang non-spesifik yang diperoleh sering digunakan untuk menghitung nilai koreksi NSB untuk semua kontrol, sampel, dan standar lainnya. Ini selanjutnya dapat menjadi alat yang berguna untuk menentukan sumber sinyal tinggi yang berubah-ubah. Untuk menguji latar belakang tidak spesifik yang disebabkan oleh antibodi penangkap itu sendiri, inkubasi berurutan dari antibodi penangkap dengan konsentrasi analit standar yang tinggi, diikuti dengan inkubasi berikutnya dengan konjugat, alih-alih inkubasi kompetitif standar dan konjugat, dapat menjadi cara yang membantu untuk mengidentifikasi masalah dengan menangkap antibodi.

Kontrol Antibodi Sekunder/Deteksi adalah kontrol yang sebagian besar digunakan dalam ELISA langsung dan sandwich. Tujuannya adalah untuk menguji pengikatan nonspesifik antibodi sekunder atau deteksi tanpa adanya antibodi primer atau penangkap. Sementara kontrol ini umumnya dapat dihilangkan dalam menjalankan ELISA rutin, mereka mungkin dapat memberikan wawasan yang berharga saat memecahkan masalah sumber latar belakang tinggi atau keadaan kerusakan komponen pengujian.

Kontrol Matriks Negatif adalah sarana untuk menentukan sinyal yang berasal dari efek matriks analit-independen. Matriks sampel adalah keseluruhan dari semua komponen yang terkandung dalam sampel, kecuali analit. Terutama matriks yang kompleks, seperti sampel darah, dapat berisi berbagai macam komponen yang dapat mengganggu sinyal pengujian dalam satu atau lain cara. Pengikatan nonspesifik ke komponen matriks dapat menyebabkan sinyal positif palsu, serta sinyal negatif palsu. Sinyal positif palsu dapat dikontrol dengan mengukur kontrol matriks negatif, yaitu matriks sampel yang dijamin tidak mengandung analit apa pun. Namun, meskipun menjadi kontrol yang berguna, seringkali sangat sulit untuk mendapatkan matriks sampel yang dijamin bebas analit.

Kontrol Positif bertujuan untuk menguji fungsionalitas pengujian serta kelayakannya untuk digunakan dengan jenis sampel dan matriks sampel. Kontrol positif berikut biasanya digunakan dalam ELISA:

B0 adalah denominasi khusus dari nol kontrol standar dalam ELISA kompetitif. Meskipun secara teknis sama dengan S0, yaitu tidak adanya standar atau sampel analit, hal itu akan – berbeda dengan S0 dalam ELISA sandwich – mengarah pada pengembangan warna maksimum, karena analit terkonjugasi tidak menghadapi persaingan pengikatan dan pengikatan konjugat maksimal akan tercapai . Oleh karena itu B0 berbeda dengan S0 kontrol positif yang berguna untuk menentukan perkembangan warna maksimum dalam ELISA kompetitif dan untuk mengontrol fungsionalitas penuh dari semua komponen pengujian. Biasanya akan menghasilkan nilai di atas rentang deteksi maksimum suatu pengujian. Nilai B0 dapat digunakan untuk referensi pengikatan relatif dalam sampel atau standar ke pengikatan maksimum yang mungkin dan bahkan digunakan untuk menganalisis pembacaan pengujian. Rasio ini biasanya disebut sebagai persentase pengikatan, %B, atau B/B0. Oleh karena itu direkomendasikan untuk memasukkan kontrol B0 ke dalam setiap pengujian ELISA kompetitif, bahkan jika kombinasi pengujian dan sampel/matriks sudah mapan.

Kontrol Aktivitas Total (TA) berfungsi untuk memastikan aktivitas enzim dari antibodi terkonjugasi enzim, biotin atau analit. Mereka juga merupakan alat yang berguna untuk menganalisis pembusukan aktivitas enzimatik dengan prosedur inkubasi pengujian yang lama. Untuk menguji aktivitas enzimatik, hanya substrat dan konjugat enzim yang diinkubasi bersama selama waktu pengembangan pengujian dan reaksi warna dihentikan dengan stop buffer. TA umumnya merupakan kontrol kualitatif murni.

Standar umumnya tidak dianggap sebagai kontrol positif, tetapi jumlah analit yang diketahui yang ditambahkan ke buffer uji mungkin merupakan bentuk kontrol positif yang paling murni. Standar tidak hanya merupakan alat yang berguna untuk memastikan fungsionalitas pengujian, tetapi juga merupakan bagian tak terpisahkan dari ELISA kuantitatif sepenuhnya. Serangkaian konsentrasi analit yang diketahui berbeda, paling sering diperoleh dengan pengenceran serial, digunakan untuk menghasilkan kurva standar pengujian. Kurva standar yang akurat merupakan komponen penting dari setiap pengujian untuk menentukan jumlah analit yang terkandung dalam sampel yang tidak diketahui. Sementara standar umumnya disertakan dengan uji untuk kit uji yang tersedia secara komersial, dapat menimbulkan beberapa tantangan untuk sumber standar analit yang sesuai untuk ELISA yang dibuat khusus.


Gambar 2. Kurva standar Sandwich (kiri) dan ELISA Kompetitif (kanan).

Kontrol Protein Endogen hanya digunakan selama pengembangan ELISA untuk target protein. Jika protein rekombinan digunakan sebagai standar, mungkin perlu untuk memastikan bahwa pengikatan dan deteksi protein endogen oleh komponen antibodi uji mengikuti dinamika yang sama seperti protein rekombinan. Untuk tujuan ini, jumlah protein endogen yang diketahui digunakan sebagai kontrol positif.

Kontrol Matriks Positif adalah sampel dari matriks yang sama dengan sampel yang tidak diketahui yang diketahui mengandung analit, idealnya dalam jumlah yang diketahui. Jenis kontrol ini dapat berfungsi baik sebagai kontrol positif umum untuk pengujian, serta kontrol untuk interferensi matriks. Berbeda dengan kontrol matriks negatif, kontrol positif dari jumlah yang diketahui dapat mengontrol gangguan matriks negatif palsu dan positif palsu.

Sampel Matriks Berduri sering merupakan alternatif yang lebih disukai daripada kontrol matriks positif asli. Di sini, sampel yang lebih disukai mengandung sedikit atau tanpa analit, disuplai dengan jumlah analit yang diketahui dalam proses yang disebut "spiking". Sampel matriks berduri tidak hanya sangat berguna sebagai kontrol positif dengan kemampuannya untuk mengkorelasikan nilai terukur dengan nilai yang diharapkan, tetapi juga memiliki beberapa tujuan tambahan dalam validasi ELISA. Jika sampel matriks diekstraksi sebelum analisis ELISA, artinya sampel dimurnikan untuk memperkaya analit dan/atau menghilangkan kandungan matriks yang mengganggu, sampel matriks berduri adalah cara yang cocok untuk menganalisis efisiensi ekstraksi. Karena jumlah input analit sebelum ekstraksi diketahui, jumlah analit yang dipulihkan dan terdeteksi setelah ekstraksi dan analisis ELISA memungkinkan untuk menilai efisiensi protokol ekstraksi dan mengoptimalkannya. Idealnya, protokol ekstraksi mendekati efisiensi 100%, tetapi terkadang tidak mungkin untuk mencapai efisiensi ini. Dalam kasus ini, sampel matriks berduri memungkinkan untuk memperkirakan kandungan analit asli dari sampel yang tidak diketahui juga. Selain itu, sampel matriks berduri mungkin berguna dalam linearitas analisis pengenceran.

Pengenceran Sampel Matriks Seri menyediakan alat yang berharga untuk menganalisis interferensi matriks dan menentukan faktor pengenceran di mana interferensi matriks dapat diabaikan. Untuk tujuan ini sampel yang dipilih dalam matriksnya diencerkan secara serial dan diukur dengan analisis ELISA. Nilai yang diperoleh dalam hubungan linier dengan faktor pengenceran menunjukkan tidak adanya gangguan matriks. Pengujian hanya boleh dijalankan dengan pengenceran sampel matriks yang diketahui berada dalam kisaran yang telah ditentukan sebelumnya dengan linearitas pengenceran yang terbukti, dan linearitas pengenceran perlu divalidasi untuk setiap kombinasi pengujian ELISA, matriks sampel, dan analit secara individual sebagai bagian dari validasi pengujian rutin dan prosedur optimasi. Pengenceran sampel matriks serial dapat dihasilkan dari sampel matriks berduri, tetapi umumnya disarankan untuk menggunakan berbagai sampel yang akan diuji, mengumpulkan dan mencampurnya menjadi satu sampel gabungan dan menghasilkan pengenceran serial dari sampel gabungan ini. Metode ini akan rata-rata interferensi matriks pada berbagai sampel yang lebih luas.


Nilai OD maksimum yang direkomendasikan dalam optimasi ELISA. Apa alasannya? - (23 April 2012 )

Assalamu'alaikum kalian Lore Keepers! Ini adalah postingan pertama saya. Saya seorang mahasiswa pascasarjana di Argentina.
Saya mengoptimalkan ELISA kompetitif tidak langsung untuk mengukur molekul kecil dalam jaringan tanaman. Membaca Buku Panduan ELISA Crowther (diedit dengan sangat buruk) saya telah menemukan bahwa ketika mengoptimalkan ELISA kompetitif, konsentrasi antigen yang direkomendasikan untuk melapisi pelat adalah yang menghasilkan OD (dataran tinggi) maksimum 1-1,5 untuk kelebihan antibodi. Dan pengenceran antibodi yang menghasilkan 70% dari OD maksimum itu (karena ELISA kompetitif terbatas reagen).
Pertanyaan saya adalah: mengapa tidak nilai dataran tinggi OD yang lebih besar mis. 2.0 (asalkan kami memiliki OD latar belakang yang sama)?
Saya menggunakan pembaca pelat Tecan Sunrise.
Ada ide? Terima kasih sebelumnya!

Saran yang Anda terima adalah titik awal yang baik. Masalah OD benar-benar sewenang-wenang, dan lebih bergantung pada kinerja pembaca pelat. Pembaca pelat spektramaks yang saya kenal cenderung mendapatkan beberapa keacakan di atas 3 unit OD dengan TMB yang diasamkan pada 450-650 nm. Yang penting adalah mengetahui rentang pengujian target Anda sebelumnya dan menyesuaikan kondisi untuk menghasilkan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada rentang konsentrasi tersebut. Dengan segala sesuatu yang lain dioptimalkan, 20-80% dari respon dosis sering di mana P+A yang dapat diterima dapat ditemukan.

Saya menduga bahwa pengujian Anda yang dioptimalkan pada 1 unit OD hanya akan memiliki kekuatan statistik yang sedikit lebih sedikit daripada yang dioptimalkan pada 2 unit.

Terima kasih banyak atas balasan cepatnya! Saya menduga itu ada hubungannya dengan keterbatasan instrumental tetapi tidak yakin. Pembaca kami, menurut spesifikasinya, jika saya ingat dengan baik, juga lebih tepat dan akurat hingga 2 OD daripada di kisaran 2-3 OD.
Dalam salah satu tes papan catur optimasi yang telah saya lakukan (gambar di bawah), ketika saya menutupi pelat dengan lebih banyak antigen (garis hijau, pengenceran Ab primer di x axis) Saya mendapatkan dataran tinggi yang lebih tinggi dan kemiringan yang lebih curam dengan latar belakang yang kurang lebih sama, jadi saya pikir itu lebih baik. Padahal, nilai grafik hanyalah sarana sampel duplikat, jadi anggapan saya mungkin dipertanyakan. Tapi, sebagai pendekatan pertama saya pikir itu bisa berguna. Jika Anda ingin menunjukkan sesuatu yang lain, jadilah tamu saya!
Terima kasih banyak lagi! Sungguh mengasyikkan menemukan orang-orang yang mau berbagi pengetahuan mereka.
Data: image / pngbase64, iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAgoAAAG / CAIAAAC2TGhZAAAgAElEQVR4nO2dXXajvBZEPS4PyOPIEDyaPPc8PBj6wTHGILCAkk6B9l691v1up1MpY8OO + JEuHQAAwIRLdAEAAHAEPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQDAkbhAMcabOuQNBgDYxvQoBoVgQwPAkUAP1aiwoR / 362vocr0 / cr8EAJAAPVSj / Ib + vV1uv5P // PalZzk + BwDwCYeFalTd0I / 7deqA6ZeGl0r + AcDZWXUYCdDD4DTH54mO4Rfmjm3d437tv + f3Ns55 / Y3m / MlC2oYfVHFDJwcIi18Sfg7WfgSrpVHsTGm2xbRpscXyDws5N + dkMfzt9XG // h2tfm9DJ3z + vze / t8EheWiK11eff9H / xx4W0jb9oEp6mNt0y19CD4FptsWc02yLadMOpIfu849AD133e7veH / 3 / fPyrxNXV6 / 3x / pe / t + v1OhhsDL7l83fkx / 3a / 8vXYf16v9 / + vvU1avn8ebNpi19aoNKl6Zk6C1 / qOvQQmmZbzDnNtpg2zUgPEwGMZfDtbxJ / pnzq4fn / EqfKx8J4HYj7vx / 8LjwJmfyMv + 95 / df7e9 + // 49 + 4Gza4pcWKK6Hwbm23na9fadf + iyHHuLSbIs5p9kW06a56OHbgb6QHjJHDx8XLKbHt9 / b9f5YGj28b9sZ / bjxf / 0OxhSHGz1MmWzXGdBDYJptMec022LaNBc95PxL + cml94E279pD9zF66I98f5FzlwTW6GH4gw557WEb6CEwzbaYc5ptMW3agfQguzSdHgZk3bk0PIr3p0wmfzO5jLBBD4m04T + eO00zC3oITqPYmdJsi2nTjqIHyD9Vk8R6Q6OHwDTbYs5ptsW0aeihEaw3NHoITLMt5pxmW0ybhh4awXpDo4fANNtizmm2xbRp6KERrDc0egh Msy3mnGZbTJuGHhrBekOjh8A022LOabbFtGnooRGsNzR6CEyzLeacZltMm4YeGqHChv66qMPsU3zoITDNtphzmm0xbRp6aITyG3p5UYf + efDUt6KHwDTbYs5ptsW0aUfRg8ljcWYTeq / 4WVU9PJkL6nG // 07 / evhe / gOAs7PqMLJSD + NpNVb9rD9OMKF3aj7Zr1TUw + w5pNkZBBk9BKbZFnNOsy2mTYstFqyHY07oPf3ROVTSw8J0VehBFaVNsy3mnGZbTJtmooeM2VcTetgwYesJJvSe / ugcKl2aXmyDHmS0UMw5zbaYNs1ED12ZKb0THH9C7 + mPnt2 + A4rrYWG9hxfoQUYLxZzTbItp03z08PVfTllf8CQTeo9 / dAYht4ix3kORKG2abTHnNNti2rSj6EHGqSb0XnEJ3PoOYsnnQPC7w4TT7Gl1otpJsy2mTWtODweGCb2 / hfx0P88 / 6CEkqp0022LaNPTQCNYbGj0EptkWc06zLaZNQw + NYL2hS + jh + R87M0 + zp9WJaifNtpg2DT00gvWGLnHtoVfFHkmcZk + rE9VOmm0xbRp6aATrDV3ozqWhIbZJ4jR7Wp2odtJsi2nT0EMjWG / ooje27pGEZPfglqrzpdkW06ahh0aw3tAVnnsYSSLTEyo9cM38ZGm2xbRpR9GD5pm47kgztr5 + SKLMhh9UQQ9L6z0sN66ghydrJbFz9xhdJ0cPp0mzLaZNO5Aeuu5n + GfjjnaUGVu7 / pA6abLpB5XXw8J6D98aV9NDT6Yk1n6gp / qZ6oFbqk6QZltMm9a0HoxnbJ1bImHpBy1S9eTSqPVc4 + Fg8F8E00O5JGQUOBr27vlZAIdm1WFkcIj /Wf4zo4cv3/X1yGU7Y2u67viv8qdcCl3v4Wvj+qOHIckzTgvnMZd9kFNs/023G15mhah20myLadNii4XrwXbG1nTdcTe/0UPyvNzXxrF66Jk7HdRtVcJ XHmxnbE3UHdRzvPawsN6D37WHBeauFpR4hGJz7GkOAQdNsy2mTTuQHqasL3ikGVvH35yYsdXpzqXl9R5M7lzKJKmHcsWi7riVR7WTZltMm3YUPcARZ2w96noPgl9DJnwttsoQpzkEHDTNtpg2DT00gvWGdtNDibTMqExJnOYQcNA022LaNPTQCNYbGj0MyTnXdJpDwEHTbItp09BDI1hvaPQwZVkSpzkEHDTNtpg2DT00gvWGRg9zzBkivFjjabbFtGnooRGsNzR6WGY0RUfla + akFY1yTkMPjWC9odHDV + ae1wsv1maabTFtWnN6OMyMrdvnP02CHoLTjvhABmkVopzTjqKHS4r1BY8zY + Uo + U + ToIfgtHJ68Jmfo50022LatAPpYbQXCPRgPWPrXGXvOZdmOr2HQsmXiR4ymf5 + tDwZVOUn7NpJsy2mTfPRw / KHPKmHLbvGwWZs3TL / aZIqephZoWI4GVPSHuhBlfZ1lxjuFYLBeHaxk6XZFtOmmejh60e6kB7MZ2zdNv9pkgp6yFmh4uOE2HCb / oMC5O9UvAVQgVUHlOCTS9Yztm6f / zRJtZNLyRHN26 + 3W2KYxOihWtqCHmKLHSvNtpg2LbbYKj1MWV / wMDO27pn / NEmsHj6 + jB5M0tCDQ5Rz2lH0AEeZsXVmhYq / v0sPeNBDSBrXHhyinNPQQyOE6GE63kkPzNBDYNozSvIIRWf8MrVptsW0aeihEUI29FHXeyiRZl5s82MTyTQVtmm2xbRp6KERrDc0eghM66PQQ0iUcxp6aATrDY0eAtOGUfsNYfsytWm2xbRp6KERrDc0eghMm + phjyFsX6Y2zbaYNs22GGhBD8FpRymGHipHOafZFgMt6CE47UDF9hjC9mVq02yLadNsi4EW9BCcdqBie04x2b5MbZptMW2abTHQgh6C045VDD1Ui3JOsy0GWtBDcNrhim0zhO3L1KbZFtOm2RYDLdX0kJ5FdnmWKPQQmLash7WGsH2 Z2jTbYto022KgpYoeZtZ7 + DrHLHoITFuIQg8VopzTbIuBlgp6mF3v4T1N6 + fQYjgf3D + w5GmI6BZwEsofhWAL1U4uzUzo / RxYzEzBxOghMG05au0pJtuXqU2zLaZNsy0GWiL18F7ZaGaNI / QQmPY1Cj0UjXJOsy0GWoL1sLz8KXoITMuJyjeE7cvUptkW06bZFgMtIXroJ / QeLCbKeg9mafl6yDGE7cvUptkW06bZFgMtIc89sN5DkShtWmYUeigU5ZxmWwy0hOghF / QQmJYflWMI25epTbMtpk2zLQZa0ENw2gmK5Zxisn2Z2jTbYto022KgBT0Ep52jGHqQRzmn2RYDLeghOO00xZYNYfsytWm2xbRptsVAC3oITjtNseVTTLYvU5tmW0ybZlsMtJxfD5dP9gd2bexpG6LQg20xbZptMdDShB667uf5Bz2UjpozhO3L1KbZFtOm2RYDLehhCy3saXv0MDWE7cvUptkW06bZFgMt1fSQmDbj / cz0zJoP6CEwbXMUejh9mm0x0FJFD3PrPbx53G + l1nv4vPDw9MReWtjT9kRNDWH7MrVptsW0abbFQEsFPcyv9 / BiNMlGufUe + mGENhZG9KeYoovAMSh / FIItVDu5NK + H9GytXVfqxlbBAEL4gdbuGz7FRgMI25epTbMtpk2zLQZa4vWwMD9fsece9hqihT1tf9TQELYvU5tmW0ybZlsMtITrYWn21sJ62G6IFvY0lR6ehrB9mdo022LaNNtioCVEDwMlLF2SKPrU9C5DtLCnSaLQwynTbIuBlmp6GGKy3sN2Q7Swp6mi5I + sdw1sNPM022KgJUQPuZQ / oGw0RAt7mlAP / Vkmw + dOtGm2xbRptsVAS + N66LYZooU9DT3ERjmn2RYDLeih22CIFvY09BAb5ZxmWwy0oIcn6wzRwp5W4toDejhHmm0x0IIeetBDqagubz3qfBrZaLZptsVAC3oYkmuIFvY0eTGhIdrZaJ5ptsVAC3o YknuKqYU9DT3ERjmn2RYDLehhRJYhWtjT0ENslHOabTHQUk0P6Yn33ks + pJ6dDnqQ6rshWtjTShRTGaKpjWaYZlsMtFTRw9x6DwNlDO1RbkLvTJj3uxDM8g1JahyFYD0V9DC73sPjfr3dbn6jhydLYwjhB1q7b5gXY / RwjjTbYqCl2smlhB5 + b28rJKfmi56lZ9YQLexphYpJDNHaRnNLsy0GWiL18PFXqWn6ovXQzRmihT0NPcRGOafZFgMtkXoYXnCwHD08QQ / KNPRwgjTbYqAlRA / vkUJ / 51Jyhm8PPXRTQ7Swp5Urtt8QDW40qzTbYqClmh6GmKz3kM / 4FFMLexp6iI1yTrMtBlpC9JCLjR66kSFa2NPQQ2yUc5ptMdCCHvL56bofJh + VpO00RJsbzSfNthhoQQ8ruFwu / TACPexJQw + HTrMtBlrQwwrQgzBtjyGa3WgmabbFQAt6WMFEDz / Tq9YhxUqkoYfYKOc022KgBT2sYLLw2c / Mn9rFSqShh9go5zTbYqAFPUjS5jzx3Ra2e1qFYpsN0fJGc0izLQZa0IM8bVkV76Oh + SLM6CE2yjnNthhoqaaH9HoPv7f + 8Jh4Uu6Yehgx6wnzC93oITbKOc22GGipooe59R66x / 2atkLseg / lWNBDdLUYWAEC / qEHVyroYXa9h677vV2vV9P1Hoqnpe6Dsigmj1pI2zaAMHw35VHOabbFQEu1k0szM7a + tGA8Y2uptJn7oOKLyaMW0tDDEdNsi4GWUD0MMV3voXjaICr3Zqe8tL1U22IbDHGEd / PMabbFQEvw6KFXQoOjh1TUXkMc8RCAHg6XZlsMtITo4a2F / s4l7 / UeCqalorZL4oiHAPRwuDTbYqClmh6GHG69h4JpM1EbDXHQQ8BaQxzt3Txbmm0x0BKih1wa1sOT1ZI46CEAPRwrzbYYaEEPwWnfotYZ4qCHAPRwrDTbYqAFPQSn5UXlSuK4h4BVhjj4u3n4NNtioAU9BKd lR2UZ4riHAPRwoDTbYqAFPQSnrYz6IonjHgLQw4HSbIuBFvQQnLY + askQhz4E5BviRO / mIdNsi4EW9BCctjUqLQmDYtvT0MNR0myLgRb0EJy2IyphCI9iG9PQw1HSbIuBlmp6SK / 38CQ9rzd6yOLnOeGr88pC + WmZhjjvu3mMNNtioKWKHmbXe3h / daiHE6 / 3UIIzLR3B8g9tUuMoBOupoIeF9R5eA4eZWTYYPWSSWjoi60bY0sU2pOUMIM79bvqn2RYDLdVOLs0sB / QcUqCHfXzTw9yf2bTAU1XowT / NthhoidTD434dHoaaX + 9hF / MH9ExV / CQFgx6iopzTbIuBltjRwwtGDwFppnroMgzBuxmbZlsMtIToYWID9GCUhh4sopzTbIuBlmp6GMJ6D0WiVGnht8miB / M022KgJUQPuaCHwLRX1NJF7PVpuSwbwn6jnTzNthhoQQ / BafbFfiSGQA9nSrMtBlrQQ3DaEYoJDIEezpRmWwy0oIfgtIMU22uIDcUWDHGQjXbaNNtioAU9BKcdpxh6qBrlnGZbDLSgh + C0QxXbbgj0cKY022KgBT0Epx2q2PZTTNuKzRniUBvthGm2xUALeghOO1qxjYZAD2dKsy0GWqrpIb3ew99U3zOTfaOHwLT5KPRQI8o5zbYYaKmih7n1Ht7K + JAH6z2Y8zREnZ / FChAtUOMoBOupoIfF9R7 + SI8tGD0Epi1GrT7FtLlYcgBxzI12njTbYqBlzfF3NAH3wgJw6W9O / + Pn0IIp + dzSvkWtMwR6OFOabTHQsuL4 + 3tLH8TzWB49pJebRg + BaRlRKwyxp9jUEEfeaGdIsy0GWtbpIX + wMCGlh8HMrejBLS0vCj2UinJOsy0GWtYcf3f5Ib3eQ3 / nUjIZPQSmZUdlGQI9nCnNthhoqXbtYQjrPRSJ0qat1MMXQ + wsNjLE8TfasdNsi4GWatcetoAeAtPWRH03BHo4U5ptMdBS7drDFtBDYNrKqLJ66D4 NcZaNdtQ022KgZeXJpbrDB / QQmLY + askQ6OFMabbFQEv + 8Tdx5WHrtYdc0ENg2lY9pA2BHs6UZlsMtMiOvyVAD4Fpm6JmDSEp1hviXBvteGm2xUALeghOO12xtCHQw5nSbIuBlpXXHg54cmnUeH9g18aetiMKPZw8zbYYaFl359IRb2x9SuH1Bz3UiRobQlWsn8BVkvbEZqMdJs22GGipdmNr8rsH45GUedBDYJpCD29DoIczpdkWAy1rDpeb / fB9vYePbO16DyM97A + EHHpDaGNZ / uGUbDmqQHkq3Nias95D + sslrj1Ixg / CD7R23zAr9h5ACIvNLSG3GbONdoA022KgpdqdS4t6mBmXyO9c6ocRkjQJtnuaKOrPEKpi3GjgkGZbDLTE6 + H3NjsIKXFjq8QQLexpKj1oD + IXY + U5evjpftBDVJptMdASq4fH / bp0fqrQcw + DSxGCtJ3Y7mnC3 / f76xDo4RxptsVAS4ge / ib0fi / 2MHPvUiE9dLsN0cKehh5io5zTbIuBlrwdLHlZevttri7rPWw2RAt7mq0euPYQnmZbDLRk7WDpB + LKPyZXWg / dVkO0sKeVuJgsCey67t / rDldVmiRHG + WcZlsMtOTssXMTeRdfAKKCHrpNhmhhTytQ7Gc62cbmNPQQmGZbDLRk6uG0o4fXD1oniRb2NPQQG + WcZlsMtGQefwMWe + jqzti6yhAt7GllimkM8UxTGcJ + o9ml2RYDLdXuXNpCTT28fmKWIVrY09BDbJRzmm0x0IIepj / 0uyFa2NOKFRMYAj3EptkWAy1rL00PnlUoP7t3iB66DEO0sKf566ETGeIIG80rzbYYaFmlh89bmOZuaNIRpYfumyFa2NNKFttrCPQQm2ZbDLSs0sPoTtZVN7Yu / OPZLwXqoVu8WN3CnoYeYqOc02yLgZZMPfzdqPTxuHP+6GFuvYeZLw3vjvoXytAQsU1OhmopCJZ/OAc5RxGoz4pfz/+O5P1AInfosLD ew5elIGJHD4Ma4zGE8AOt3TeOU2zXAGKYtn8AcZyN5pJmWwy0VLtzaWG9B3c9dBNDtLCnlS + 23RDoITbNthho2XT8 / TIP99z3HFgP3Z8hrOeD06ahh9go5zTbYqBlxbWHFPmSOLweur + LIu9lq / cHdsZ7WpViGw0xSttpiKNttPg022KgJfMY97zu8DqI7x09jCb0Pqoe3Jat1qahh9go5zTbYqBl1RHu9 / a8NL1FD585Hus9rGWqB6t1SbVptYptMQR6iE2zLQZa1h / b3re5FsdND914ORqvdUm1aQfSQ7fPEAfcaMFptsVAS7U7l7ZgqIdp2kgSgSsLadMqFlttCPQQm2ZbDLSgB03aZknY7mnoITbKOc22GGhBD + K0tZKw3dPqFltniGTaZkMcdqOFpdkWAy3ooUha / mDCdk9DD7FRzmm2xUALeiiYliMJ2z2terEVhkAPsWm2xUALeqiRtiAJ2z3tcHrothriyBstJs22GGjJP / 4OFgLacmNretbuV2j6OYjT6OHJZDBhPUVHxBbLNQR6iE2zLQZa8o5Kv7fxEfxxv + YrYm5C79 / menjadi / 7XlCBOpocnyQfr0EPXdejhKGm2xUBLzlFpZmGH3PUeZmftHgR8jC2Gv1P / OylTPUQ3smD / OhCsAHFEMo5CEECOHuZWc1u1WlxaD4NZnBJRpxw99CSn6HAoJo9ak5Y1gFhI2zCAOP5Gq51mWwy0VBg99P86d / TwLnd + PSSm6AgvJo9amfbdEOghNs22GGipcu3h7xu49vAlymoGJ / SwAduPmTbNthhoqXbnUnpC76buXMqJ2jnN31kOAV8MsZy21hBn2Wj10myLgRbZ8XcNR53Qu0RaMmqzJM5yCEAP1mm2xUBLiB5yaVYPTzZI4kSHgCVDoIfYNNtioCX7 + DteUbTR9R7kaV + jVkniRIeA7XroVhriRButUpptMdBS7dL0FtBDT / 0J / gy22Kwh0ENsmm0x0JJz / JXc2LoF9DCi5gR / BlsMPZim2RYDLTnHX8ljcVtAD0nqTPDnscXShshJyzfE6TZa8TTbYqAFPQSnbY4aGcJ5dr8daejBMc22GGhBD8FpO6MOMbvfvrSEIdBDbJptMdCSqYc50EN8FHqY / 84sQ1i9m4dIsy0GWmTH3wXmH41 + 3y2bvMiNHjKZzu63H6ctNjYEeohNsy0GWsrrYX5ipcf92g8 / kieq0EMm5rP77U5DD15ptsVAS3E9LEzLOrwzduiO4XHuH6xneNU6uouGzetAsPzDISh9FIJt1NDD / KIO75NLt1tiHiZGD3vSds7 / arbFPgYQ + Wk5A4hDvJtWabbFQEvk6GHmn71BDzvT9sz / 6rfF3oZAD7FptsVAS + S1h4Ev0gs + oAdJ2jZJ + G0x9OCSZlsMtITcuTRd7yE9rEAPwrS1krDcYn + GWJX21RBHfDdj02yLgZYaepjAeg9FonLSQiZ / 1aWhB4s022KgJUQPuaCHQmmVJ3 + Vpv3dwrTmG9CDOM22GGhBD8FpUcVqTv4qTBs / 35HHsiFO8G5WTrMtBlrQQ3BabLE6k78K0y6Xy + sU0w96iEqzLQZa0ENwmkOxpCEcik1BDw5ptsVAC3oITvMp9jlr0 + oTOOWKDdmmh27REKd8N4um2RYDLeghOM2qmP / 04JvVhR4aeZkgBD0EpxkWO8j8rz9zS40mQQ + NvEwQgh6C0wyLTfVgOf / rOj1084Y497tZIs22GGipoYf59R6WvtShh6C0uenB / Sb40wwgzv1ulkizLQZayuthec6luS89y6GHuLRR1FQSq94c9HCmNNtioKW4HpZmbO2 / 9vkV1ntwZiqJwDJr14Fg + QdPSh + FYBs19DC / 3sPr7NLMFEyMHgLTvkatGkwUe5mCAUQL76Y2zbYYaIkcPbwXEx0uKzoshx7i0jKjMk86lXyZKwyBHtyi5GkgJPLaw9eVgtBDYNraqDlJyJ +wm3TbO4Bo4d3UptkWAy0hdy71E3oPFhNlvQeztM1RE09 UeMhu1wDCYaMdK822GGipoYcJrPdQJEqbtjMKPZw4zbYYaAnRQy7oITBNFYUezpdmWwy0oIfgtNMXqzXB33ZDGG408zTbYqAFPQSntVNMMjlHnzb5O / RQL822GGhBD8FpTRVTGWKmW64h0INPlDwNhKCH4LTWipWc4G / jAMJ / o7ml2RYDLeghOK3BYiXnf90ygDjERrNKsy0GWtBDcFqbxXYaAj3EptkWAy3oITitzWI7TzEtdlttiKNsNJ8022KgpYYe5hZ1eD8zPbPmA3oITCtdrNjqEeiheJptMdBSXg / fFnXouq7rHvcb6z14pVUottkQ37plGQI9OETJ00BIcT18nXevm0yywXoP7VBi0Yj8RSBY / sGE0kch2EYNPSyt99AtWIPRQ2RatWJl1p5bMYA44kaLTbMtBlriRw8L8 / Ohh8C0msXQw7HSbIuBlvBrD0uzt6KHwLTKxVYZIq / bd0NUmQzqhGm2xUBLyJ1LAyXMnHD6K4ce4tJC9JD5hkv0cLlcnqOHn + 4HPURFydNASA09TGC9hyJR2rT6xfINgR5i02yLgZYQPeSCHgLTQoplGiK725Ih0INDlDwNhKCH4DSKjcgxhEoPXHsIj5KngRD0EJxGsSlfDbEm7fsF6n + vByCyM5ei9of4p9kWAy3oITiNYkmWDYEeYtNsi4EW9BCcRrE5RHrovhrimSYxRPhGq5NmWwy0oIfgNIotMGcI9BCbZlsMtKCH4DSKLTB3iml92pIh + rT9hnDYaBXSbIuBFvQQnEaxZZKGQA + xabbFQEsNPcyt99ANl3xIPTuNHgLTfIpNDbEpbdYQw7SdhvDZaEXTbIuBlvJ6WJhzaTBHX3K6PvQQmGZVbGQI9BCbZlsMtBTXw8KMrY / 79Xa7jUYPo4eV / gH8 + / dPsTJE5joQLAJRn9JHIdhGDT3Mrffwe3tbITk1H6OHwDTDYkNDbApIDyBGaXsGEIYbrUSabTHQEj166P9 / apo + 9BCY5ll s30wYWXrodhjCc6PJ02yLgRaXaw + MHtzSPIs9pfD6s + HjkTAEegiMkqeBkJA7l94jhf7OpeQM3 + ghMM2zWB09dFsN4bnR5Gm2xUBLDT1MYL2HIlHaNM9iu / XQTQ2BHgKj5GkgJEQPuaCHwDTPYpcxGzKy9NBtMoTnRpOn2RYDLeghOI1im9NWrT / 6yYch0ENglDwNhKCH4DSK7UkrqoduvSEOsdGsouRpIAQ9BKdRbGfafkOgh8AoeRoIQQ / BaRTbmbb1FFOWHrqVhjjKRvOJkqeBEPQQnEax / Wk7DYEeAqPkaSAEPQSnUUyStskQWXro1hjiWBvNIUqeBkLQQ3AaxVRpmw2BHgKj5GkgpIYeFtZ7eH0p / VX0EJhmW2whba0h8h + gyDTEETdabJQ8DYSU18PCnEvD + fpSoIfANNtiy2n5erhcLq / zSz / oISpKngZCiuthYcbWrvu9Xa9X1nsAKZnLQoz08PXfsw5EOUofhWAbNfQwOyvrYMEHZmx1S7Mt9jUt8xTTqtFD9xpALI8hjrvRoqLkaSAkdvQwgPUezNJsi + Wk5RhiMnnT93NH6EEeJU8DIaHXHgZKYPTglmZbLDMt / zL1v3 // FlaiHrFsiKNvtPpR8jQQEnLn0lsL / Z1LrPfglmZbLD8t0xCvtCxDoAdtlDwNhNTQwwTWeygSpU2zLbYqbb0edhniHButZpQ8DYSE6CEX9BCYZltsbdpXQwzSsgyBHmyLgRb0EJxGsdJpX08xfabtMsRpNlq1KHkaCEEPwWkUq5C2bIhJGnqoFyVPAyHoITiNYnXSFgyRSttoiPCXWSfNthhoQQ / BaRSrljZniHk9LBkCPXimgRD0EJxGsZpp2XrothnC5GWWTrMtBlrQQ3AaxSqnTQ0xn / bFEOjBMA2EoIfgNIpVTpueYlpMWzeA8HmZRdNsi4GWGnpYWO / hydy83ughMM222P60kSG + pa0YQFi9zHJptsVAS3k9LK338PoHTKrhl1w Wj48AAA6gSURBVGZbTJI2NESeHrIM4fYyC6XZFgMtxfXwZcbW55cHs2yw3gPUIf + T1hsi + VXWgdhP6aMQbKOGHmbXe + iFMTMJE6OHwDTbYqq05zTerz9fP2lLY4h + AGH4Mkuk2RYDLZGjh8f9Ovz1rdB6D / nrCefTwp5mW0yVtlIPHXooESVPAyEG1x66sqOHj2OAyBAt7Gm2xVRpIz3kfTS + GMLwZZZIsy0GWkLuXJrYAD34pdkWU6VdxuSsHTR7igk9mKSBkBp6mFB1vYexHhSZLexptsUKpWWvLpc2xFg1umIqGvlsgJAQPeQiv / YwVMWezBb2NNti5dL2GOJyuTwHED / dD3oITAMh59fDk / dHcGiIrfkt7Gm2xYqmZX800IMM9GBLe3p4Re + RRAt7mm2x0mnbDDHSw8J61JuL + aTZFgMtrerh9QO2SaKFPc22WJ20jA / Fxymm0TnMhQVHdxZzSLMtBlra1sPrx6yVRAt7mm2xamlrDTGM6kcSJYqFp9kWAy3o4f3D8iXRwp5mW6xm2lpDDKP2G8J2o9kWAy3oYfwjcyTRwp5mW6xyWsbHIa2HbrchbDeabTHQgh7SP3j5qNDCnmZbrH5aviGmUXsMYbvRbIuBlhp6WFjv4fWl6VSuXRc + Jd + 8JFrY02yLRaUtGuJn4bG4zYaw3Wi2xUBLeT0szLn0nqMvNdd3uB5eJYYPXfNkbMtpC4a4XC79dYjpZ6M3xCpJ2G4022Kgpbgevqz38Mf7S6ND8D8PPubkeP13dCkIoP8ITP7 + Qw / TbxwaokLPY1H6KATbqKGH + fUeuu51fukQ6z2M9LA / SDP + Rcy2WHhacgyxPHroWTWGsN1otsVAi8noIb3ctLseFBP82e5ptsUc0qbXpCYnHn + 6GQfkGyL8ZVaIkqeBkOBrD / 1fHEUPH4cAxQR / tnuabTGTtOSb / 4r6yVld7qshHF5m6Sh5GggJuXPprYX + zqXkuMJND4m03ZKw3dNsi1m ljd75z6glSeQYwudllouSp4GQGnqYUHW9hydlP9A7JGG7p9kWc0tL3tr2 + uIuQ1i9zEJR8jQQEqKHXA6jhyebJGG7p9kWM0yb3tf2 + fVZSSzf8Or2MktEydNACHpQp62UhO2eZlvMM21RD902Qxi + THmUPA2EoIcyadmSsN3TbIt5pk2eikn + q ++ SkBcrkWZbDLSgh5JpGZKw3dNsi3mmTZ + p328Iw5cpj5KngRD0UD5tURK2e5ptMee0PurbbwVZhvB / mYZpIAQ91EqbkUR8sfJR7aQNo74NHdPDiH450slNUMpuPlHyNBCCHuqmJe + CtJyiw2WLHSptGrUoiVlDXD5Xri7UzSFKngZC0ENE2vRGSA4Bp0ibi1orCfQADtTQw / x6D4 / 79fXLc + pBudPqoes6 + wn + DLeYf9py1LwkxoYY6WHnmtU53aKi5GkgpLwestZ7SE / X15Yedk / fpComj2onLScqRxKjE4 / blovY0K1 + lDwNhBTXQ / 6Mrf3XhjvGv / OSuBHy8090QSjI6N1 + / mWOHk65YkTpoxBso4Yeltd76LpZcZx79JCOSnnCohhpBaLmhhGXyyW5esRIEkW71YmSp4GQ + NHD721mpek29dCzyRONHAJs07ZFTd / hOT08mQ4mynUrHSVPAyGh1x66x / 06f76pcT30rPFEI4cA27TNUZN3eKSH8a1N3XpJOLzMCmkgJOTOpb8Jvd + LPczcu4QePsjwRCOHANu0nVHJp2I + 72sa3 + PUZZ9x8nmZRdNASA09TDjdeg + Vo6a / ao6uckcVaz5NEjV9Kub1lSVPfJWE28sslAZCQvSQC3r4Quq + WPQQmKaKmr6lkxFj2hPJM05N / eoAQtBDcJro980vx5KoYq2lSfWwfNtz // YmPDHUw8X7AWx5GghBD8FpxfVgcI9sO2kViq31BHqAzaCH4LQSv28O // bLn29RbgcUebHO8t3MT / vqictkfo79U3TY7k2gBT0Ep1Ut9tUWl0v nPRmUczdt1Ia0pCpGst / zYN3mYjXTQAh6CE6LLDZjCOdDsHM3bdT + tMGNT ++ RRDe5dh37ALY8DYSgh + A0r2JJPey7mLH6VNXij / vebT2nfTe7rkts // QV7KgHsOVpIAQ9BKcZFhsfUPb9WSebjLTV3fJe6f7t1lm + m93kZQ5PPW3zhOfLBDk19DC / 3KP / 9fTMGughMC0rqpAeNndbk29 + nqpO2jZPOL9MEFJeD0tzLvXqQA92aZqopB52s3cmkqS3FNi + mzlpQ1XMeWL1qUJFMYiiuB4WZ2x93O + / 04m + h5 + / f3Bw3N7NzcOa5djRcXNnSWHatqheFSNDXD5vk91TbEjpoxBso4Yevq33MLsOBKOHwDTbYqq08S / Cuy + KCMciwrQvUVkvretm9LCnWA96sCV29ND / E / Rgl2ZbLCZtrR60svGIeiagh3aIvvbQdehBFaVNsy3mmXZgPax8mR9DLgXowZaQO5dGE3qjBxktFPNM0x43C0V5HtDRgy0hzz2w3kORKG2abTHnNNti2jTbYqCFx + KC0yh2pjTbYto022KgBT0Ep1HsTGm2xbRptsVAC3oITqPYmdJsi2nTbIuBFvQQnEaxM6XZFtOm2RYDLeghOI1iZ0qzLaZNsy0GWtBDcBrFzpRmW0ybZlsMtKCH4DSKnSnNtpg2zbYYaEEPwWkUO1OabTFtmm0x0FJDDwvrPSwvBYEeAtNsizmn2RbTptkWAy3l9bAw59K36ZjQQ2CabTHnNNti2jTbYqCluB4WZmyd + 9IFAFqi9FEItlFDD3PrPXxdCkL4udF + BClGWuko5zTbYqDFcfTwLtfAB5piZ0qzLaZNsy0GWlq59mD7gabYmdJsi2nTbIuBlpA7l94Tei / fuQRwOObWRAQ4HCHezl3vQfKjRhfBtu66 / V7 / uF/3JT153K+X269GkH0lhWqfha73u6DY723vZhqlSd8C2SudfMj2dtO9ocqPGTTHuYd1g6sb/V9s3G//jk2 Da + h7JPcqNhxHbU3rv / PvP2YX31tR7HG / Xj5TN1a73G4yRRR5CzSvdDBk2D960L2hyo9ZAQuCO + fWw3RX3byr / UUNdq89h + HpkW5vsed / 7vbDK + 39OjVpiiNJkbdA9Eo / XuvuQY3qDRV + zCbdoAHOrQft6OFyuf12vzfFr679N7 / iJk2zeX / n9HfFTWmjDbR39PA7 / H + 7LKF9C7Sv9FXwer / vPYIq31Ddx2xSDhrg3HoYn8Xd + yvs + 7fgmXuttjfb0atPep0s2fUaPwJ2vswCv2wK3wLlKx1m7n7NyjdU9zGD9ji7HgAAYBPoYTN / v5eJfh8TptkWayftpMUG1 / ElwyQw59x64F4LABWT6w6iE3Jgy7n10HGvBYCI6RXynfdBgTun14PuXovXRT7NPYKy5 / W0D7KpH6RSpmkfsuuUT5 + 93oLfv8R9G02YJv3QjkYLg1NNcE7OrwcRb8u8xiN79jThHbfaB9m0D1LJH8sSPmSnffps9MjDzo2mStN + aP9yOE3bDughk4 + TVL + 36 / 2heCbrze7H4qQPsokepCqSpn3I7vmfkqfP5M8S7k7TfmihOdBDJqPf9x / 36 / XqMnpQPt6lfZBKmqZ9yE749NkBRg / 9 / 93xoYXmQA / ZjE61ah9X2vPbsPjxLu2DVMI09V0GwqfPrK896D60iXBkc2bQAwCs40 + sXJc + O + gas rumah kaca + VNIOq5qWVoixnfa6TF9AYt / cfsb2BzuzH1Ugugh0y0N4EI56bWPvqnnTTb9l6jTrrdbG / Qkr + br1LMzNcG6CGTIncuieemFlBq0myze40mgYpifjdoad / N7l3qjh6aAD1kor0JRDw9uO6XOW0x23uNJon7cL1BS / wxG5fCEGcHPWQjvwlEOT24FFkx43uNxBjfoFXuY2b1DkAB0AN84nwFXjuviexCt / H1fO27iQsaAz0cHe2ladsr8PJuwgvdttfz1ZNqvD9rToNdKAZ6OAH6S9Ov / + N7BV45r4loUg2 / 6 / n lJtVwuyEbioAezoDu0rTzFfhS85rsvtBtez2fSTVgF + gBPnG + Al9oXhPJhW7P6 / n6STX + Il4Tf3CO6cygBwBf7Fazehb6G5bYtQMt6AFaRXhXj3pSDdm9Btqloro / PQxeLno4M + gBjoLtPVraSTVGV813nj4TLhXVZ / 5pxuxpHdCDHuBAeN6jpZ1U46PdvhesXacImgM9wJHwvEdLu4ZSH / o8KbTz4vvnt2sm1YBGQA / QKsq7erRrKH2k7soSLxUFbYEeAM6L / NI0tAR6ALBCvxCF9NI0NAR6AHBDvBAFl6ZhG + gBwA7RFXguTcMu0APAeeHSNOwAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADGLB / UWUAUIMeYDO / t8v1 / vtaUWC69swCn / 945epoqXULHvdrv / LmdFGDVd0AoOs69AA7 + DxMVzsE / 95ut89Fz35vw7HHYGnl / qubl2sGaBf0AGv5O9xebrfE6GEoifd / v77lMljzePylwXdd7 / FX3 / Y819kcLoo5XXlzlD4oCQDZoAdYxfvI + 7hfL1l6GPxVP954 / d17APLxpclfDn / + 9f4Yno / KGbVwcglgPegB1jBdu / irHpKH5r + / HF50eKkgPf54f9 / bHL2mvq6gjB4A1oMeYA0fx + LH / Zqnh7lrxR9H7de / W9LD8AL068wToweAMqAHWEPs6OHTNK9vnv6A1KADPQCsBD3AKga3Bf3eEtceBpcLXg8zDI7Nj9E / nrv2kNbD4379OMb3cnk2ebz / OnHFAj0ArAQ9wFoW71wanAC63u / D4 / eKO5fSehjb4ePKdR / Dcw8AItADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACf4 DElSXvkQP4FMAAAAASUVORK5CYII=

Ups! Kupikir aku bisa menempelkan gambar. Maaf! Semoga penjelasan saya cukup jelas.


Pemecahan Masalah ELISA

Panduan pemecahan masalah ini menyediakan sumber dan solusi potensial untuk masalah umum yang diamati dengan kit ELISA siap pakai atau saat mengembangkan ELISA baru.

Reagen ditambahkan dalam urutan yang salah, atau disiapkan dengan tidak benar

  • Ulangi percobaan, dengan mengikuti protokol persiapan larutan dan urutan penambahan.

Konsentrasi antibodi terlalu rendah

  • Tingkatkan konsentrasi antibodi primer atau sekunder (titrasi dapat membantu). Novus Antibody Concentration Kits dapat digunakan untuk meningkatkan konsentrasi antibodi primer.
  • Tingkatkan waktu inkubasi menjadi 4°C semalaman.

Antibodi primer dan sekunder tidak kompatibel

  • Pastikan antibodi sekunder dibangkitkan terhadap spesies di mana primer dibesarkan (misalnya jika primer dibesarkan pada tikus, maka gunakan antibodi sekunder anti-tikus).

Antibodi penangkap (untuk ELISA sandwich) atau antigen (untuk ELISA tidak langsung) tidak menempel pada pelat

  • Gunakan plat yang divalidasi untuk ELISA, bukan plat kultur jaringan. Verifikasi bahwa kapasitas pengikatan pelat sesuai untuk pengikatan antigen atau antibodi.
  • Tingkatkan durasi langkah pelapisan menjadi 4°C semalaman.

Menangkap dan mendeteksi antibodi mengenali epitop yang sama (untuk sandwich ELISA)

  • Verifikasi bahwa kedua antibodi mengenali epitop yang berbeda. Gunakan pasangan antibodi penangkap dan deteksi yang berbeda dan coba pasangan yang cocok dan tervalidasi, jika tersedia.
  • Jika ketersediaan antibodi primer yang mengenali antigen yang diinginkan terbatas, cobalah jenis ELISA yang berbeda. ELISA tidak langsung atau kompetitif hanya membutuhkan satu antibodi primer.

Standar sudah buruk (jika ada sinyal di sumur sampel)

  • Verifikasi bahwa standar disiapkan sesuai dengan instruksi. Jika standar lyophilized digunakan, sentrifus sebelum rekonstitusi.
  • Gunakan botol baru. Standar mungkin telah terdegradasi jika digunakan melebihi tanggal kedaluwarsa atau jika dibiarkan pada suhu kamar untuk jangka waktu yang lama.

Sampel biologis tidak dalam kisaran yang dapat dideteksi

  • Lakukan pengenceran sampel secara serial dan mulai dengan sampel yang lebih pekat untuk pengujian.
  • Paku sampel dengan konsentrasi antigen yang diketahui untuk memeriksa potensi gangguan.

Buffer mengandung azida

  • Natrium azida (sering digunakan untuk menyimpan antibodi primer) menghambat aktivitas HRP. Pastikan pencucian yang cukup untuk menghilangkan keberadaan natrium azida atau gunakan penyangga bebas natrium azida

Pencucian atau pemblokiran yang tidak memadai

  • Tingkatkan jumlah dan/atau durasi pencucian.
  • Tingkatkan waktu pemblokiran dan/atau konsentrasi pemblokir, (misalnya BSA, Kasein atau gelatin). Penghambat protein mengikat ke situs kosong pada pelat ELISA dan mencegah pengikatan non-spesifik.
  • Tambahkan deterjen ke buffer pencuci untuk mengurangi ikatan non-spesifik. Tween-20, deterjen non-ionik, biasanya digunakan pada konsentrasi antara 0,01-0,1%.

Konsentrasi antibodi terlalu tinggi

Larutan substrat disiapkan terlalu dini dan berubah menjadi biru (untuk deteksi kolorimetri menggunakan substrat tertentu seperti TMB)

Keterlambatan pelat baca (untuk deteksi kolorimetri)

Reagen HRP terlalu pekat

Reservoir, sealer pelat, ujung pipet, atau penyangga yang terkontaminasi HRP

  • Sejumlah kecil HRP mungkin tertinggal dalam plastik bekas dan mengubah larutan substrat, seperti yang mengandung TMB, menjadi biru. Gunakan plastik segar untuk setiap langkah.
  • Siapkan buffer segar.

Variabilitas Tinggi Antar Replika

Dalam percobaan yang sama

Pencampuran larutan yang tidak memadai atau pelapisan pelat yang tidak rata

  • Ulangi percobaan dan pastikan setiap larutan tercampur sempurna sebelum menambahkannya ke pelat ELISA.
  • Pastikan ini bukan kesalahan pipet. Tambahkan volume yang sama dari larutan pelapis ke setiap sumur.
  • Gunakan sealer pelat untuk menghindari penguapan selama langkah pelapisan.
  • Jika menggunakan antibodi penangkap pada konsentrasi jauh di bawah jumlah yang dibutuhkan untuk menjenuhkan semua situs pengikatan di sumur, mungkin perlu untuk meningkatkan durasi langkah pelapisan untuk mencapai keseimbangan pengikatan.

Pencucian sumur yang tidak memadai

  • Pastikan tidak ada larutan residu yang tertinggal di dalam sumur di antara langkah pencucian.
  • Tingkatkan jumlah dan/atau durasi pencucian.

Buffer atau ujung pipet yang terkontaminasi

  • Siapkan buffer segar.
  • Gunakan tip segar saat mengeluarkan solusi atau hindari kontaminasi terbawa.

Piring berisi gelembung, mempengaruhi pembacaan optik

Antara beberapa percobaan

Solusi mungkin sudah tua

  • Siapkan solusi baru untuk setiap percobaan. Endapan mungkin ada dalam buffer atau kapasitas buffer larutan mungkin tidak memadai.

Sampel biologis tidak disiapkan sama

  • Gunakan perlakuan eksperimental yang sama dan buffer ELISA untuk sampel.
  • Batasi pencairan beku.
  • Tambahkan jumlah sampel yang sama dan pengenceran yang sama.

Variasi suhu dan/atau waktu inkubasi

  • Gunakan suhu dan periode inkubasi yang direkomendasikan.
  • Hindari pelat inkubasi di area di mana kondisi lingkungan bervariasi.

Rentang Dinamis yang Buruk antara Sinyal dan Latar Belakang

Konsentrasi HRP terlalu rendah

Pelat baca menggunakan panjang gelombang yang salah

  • Periksa filter/pembaca. Gunakan panjang gelombang yang disediakan dalam protokol untuk substrat chromogen atau fluorochrome.

Waktu pengembangan yang tidak memadai (untuk deteksi kolorimetri)

Pengenceran kurva standar yang tidak tepat

Deteksi Antibodi terlalu encer

Periksa instrumen Anda

  • Pastikan pelat datar di pembaca pelat dan baca lagi.
  • Balikkan pelat 180 derajat dan baca lagi. Jika efek edge/drift masih terlihat pada posisi yang sama, meskipun pelat dibalik, maka instrumen mungkin perlu diperbaiki. Jika efek edge/drift masih terlihat tetapi sekarang berada pada posisi yang sesuai dengan flipping plate Anda, maka salah satu masalah di bawah ini mungkin menjadi penyebabnya.

Suhu laboratorium tidak merata

  • Hindari pelat inkubasi di area di mana kondisi lingkungan bervariasi.
  • Gunakan sealer pelat untuk menghindari penguapan.

Solusi tidak pada suhu kamar

  • Pastikan semua larutan berada pada suhu kamar sebelum dipipet ke dalam sumur, kecuali jika lembar data antibodi menunjukkan sebaliknya.

Interval waktu yang cukup lama berlalu selama penambahan solusi


Panduan Pengembangan ELISA

Saat mengembangkan ELISA baru untuk antigen spesifik, langkah pertama adalah menentukan strategi imobilisasi dan mengoptimalkan kondisi pelapisan pelat untuk antigen atau menangkap antibodi. Meskipun umumnya kita menggunakan pelat sumur Polyvinyl/ Polystyrene 96/384 sebagai fase padat ELISA, sebenarnya ada berbagai bahan fase padat yang dapat digunakan (lihat tabel 1).

Tabel 1. Jenis Fase Padat Immunoassay

bahan Kapasitas Pengikatan Jenis Interaksi
Nitroselulosa Tinggi Hidrofobik, Hidrofilik
Polivinilidena Difluorida (PVDF)
Nilon Tinggi Hidrofobik
Piring dan Tabung
Polistirena Rendah Hidrofobik
polivinil Rendah Hidrofobik
Pelat yang Dimodifikasi Rendah Kovalen, Hidrofobik, Hidrofilik
manik-manik
Polistirena Sedang Hidrofobik
Polistirena yang Dimodifikasi Tinggi Kovalen, Hidrofobik, Hidrofilik
Partikel Mikro Tinggi Kovalen, Hidrofobik

Imobilisasi dapat didefinisikan sebagai pelekatan molekul (antigen dan antibodi) ke permukaan yang mengakibatkan pengurangan atau hilangnya mobilitas. Cara protein diimobilisasi akan menentukan sifat-sifat ELISA. Dalam beberapa kasus, imobilisasi dapat menyebabkan hilangnya sebagian atau seluruh aktivitas protein, karena orientasi acak dan deformasi struktural. Untuk mempertahankan aktivitas biologis sepenuhnya, protein harus melekat pada permukaan tanpa mempengaruhi konformasi dan fungsi. Umumnya, pilihan strategi imobilisasi yang sesuai ditentukan oleh sifat fisikokimia dan kimia permukaan dan protein. Banyak teknik imobilisasi telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir, yang terutama didasarkan pada tiga mekanisme berikut: imobilisasi fisik, kovalen, dan bioafinitas (lihat Gambar 1).

Gambar 1. Perbandingan tiga strategi immobilisasi yang berbeda.

2. Antigen dan Antibodi

Antigen dan antibodi adalah dua faktor utama yang menentukan sensitivitas dan spesifisitas suatu pengujian. Kemurnian dan stabilitas antigen adalah parameter kunci yang mempengaruhi kinerja ELISA. Kemurnian antigen yang tinggi dapat meningkatkan kemampuan menangkap antibodi sehingga meningkatkan sensitivitas pengujian.

Telusuri Semua Produk yang Berkaitan dengan Antigen

Creative Diagnostics adalah perusahaan biotek yang berkembang yang menyediakan protein/antigen rekombinan yang sangat murni di seluruh dunia. Protein/antigen rekombinan diuji secara ketat untuk memenuhi permintaan penelitian dan pengembangan untuk kualitas yang sangat baik, aktivitas biologis tanpa kompromi dengan harga yang kompetitif.

Konfigurasi tiga dimensi dari situs pengikatan antigen yang ditemukan di bagian Fab dari antibodi mengontrol kekuatan dan spesifisitas interaksi dengan antigen. Semakin kuat interaksinya, semakin rendah konsentrasi antigen yang dapat dideteksi. Faktor yang bersaing adalah spesifisitas pengikatan atau reaktivitas silang antibodi terhadap protein serum selain antigen target. Tergantung pada apakah antibodi yang digunakan poliklonal atau monoklonal, reaktivitas silang akan disebabkan oleh kekuatan yang berbeda. Dalam kedua kasus, mendorong uji ke batas sensitivitas dapat mengakibatkan reaktivitas silang, dan seseorang dihadapkan dengan kebutuhan sensitivitas versus spesifisitas yang saling bertentangan.

Antibodi monoklonal atau poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkap dan pendeteksi dalam sistem sandwich ELISA. Antibodi monoklonal memiliki spesifisitas mono yang melekat terhadap epitop tunggal yang memungkinkan deteksi halus dan kuantifikasi perbedaan kecil dalam antigen. Poliklonal sering digunakan sebagai antibodi penangkap untuk menarik antigen sebanyak mungkin. Kemudian monoklonal digunakan sebagai antibodi pendeteksi dalam uji sandwich untuk memberikan spesifisitas yang lebih baik.

Pertimbangan penting dalam merancang sandwich ELISA adalah bahwa antibodi penangkap dan deteksi harus mengenali dua epitop yang tidak tumpang tindih. Ketika antigen mengikat antibodi penangkap, epitop yang dikenali oleh antibodi pendeteksi tidak boleh dikaburkan atau diubah. Menangkap dan mendeteksi antibodi yang tidak saling mengganggu dan dapat mengikat secara bersamaan disebut "pasangan antibodi yang cocok" dan cocok untuk mengembangkan sandwich ELISA.

Telusuri Semua Produk yang Berkaitan dengan Antibodi

Diagnostik Kreatif dapat mengembangkan pasangan yang paling cocok untuk pengujian ELISA Anda. Proyek dapat dimulai bersama dengan layanan pengembangan hibridoma khusus kami atau antibodi dapat dipasok oleh pelanggan untuk evaluasi. Kami memanfaatkan keahlian tim pengembangan ELISA internal kami sendiri yang mendukung berbagai produk ELISA.

3. Strategi Konjugasi

Antibodi berlabel enzim adalah kunci dari keluaran sinyal ELISA. Konjugasi enzim menjadi antibodi melibatkan pembentukan ikatan kovalen yang stabil antara enzim dan antibodi monoklonal atau poliklonal spesifik antigen di mana baik situs penggabungan antigen antibodi maupun situs aktif enzim tidak diubah secara fungsional.

Berbagai enzim reporter, seperti horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP) dan banyak lainnya, dapat dilampirkan ke antibodi dan protein melalui penggunaan kimia kopling yang berbeda untuk memastikan retensi maksimum aktivitas enzim dan protein.

Horse radish peroxidase (HRP) - dapat divisualisasikan dengan reaksi kromogenik seperti diaminobenzidine (DAB) atau chemiluminescence. HRP adalah label enzim glikoprotein 44kDa dan lebih stabil daripada alkaline phosphatase.

Alkaline phosphatase (AP) - adalah enzim hidrolase dan sinyalnya sering diukur melalui pNNP substrat kolorimetrinya.

Detail kimia konjugasi melihat Winston, S. E., Fuller, S. A., Evelegh, M. J. dan Hurrell, J. G. 2001. Konjugasi Enzim menjadi Antibodi. Protokol Saat Ini dalam Biologi Molekuler. 50:I:11.1:11.1.1–11.1.7.

Telusuri Semua Produk yang Terkait dengan Antibodi Sekunder

Diagnostik Kreatif menyediakan layanan konjugasi pelabelan enzim-antibodi untuk molekul penghasil sinyal dengan menggunakan strategi pelabelan enzim milik kami.

4. Enzim dan Kromogen

Tahap terakhir dari ELISA adalah dikte. Intensitas sinyal yang dihasilkan ketika substrat ditambahkan akan berbanding lurus dengan jumlah antigen yang ditangkap pada plate dan diikat oleh reagen pendeteksi. Sistem enzim-substrat yang paling umum digunakan dilakukan di bawah ini:

Tabel 2. Sistem enzim dan substrat/kromofor yang paling umum digunakan dalam ELISA dan perubahan warna dengan zat penghenti yang relevan.

Label enzim Substrat Pewarna Penyangga Menghentikan solusi Perubahan warna Membaca panjang gelombang
tak terhentikan Berhenti tak terhentikan Berhenti
Peroksidase lobak H2O2 (0,004%) OPD Fosfat / sitrat pH 5.0 1,25 M H2SO4 Oranye muda jeruk 450 nm 492 nm
H2O2 (0,004%) TMB Buffer asetat (0,1 M) pH 5,6 1% SDS Biru Kuning 650nm 450 nm
H2O2 (0,002%) ABTS Fosfat/sitrat, pH 4.2 Tidak berhenti Hijau Hijau 414 nm 414 nm
H2O2 (0,006%) 5AS Fosfat (0,2M), pH 6,8 Tidak berhenti Hitam/coklat Hitam/coklat 450 nm 450 nm
H2O2 (0,02%) COLEK Tris atau PBS, pH 7,4 Tidak berhenti cokelat cokelat T/A T/A
fosfatase alkali pnpp pnpp Dietanolamina (10 mM) ditambah MgCl2 (0,5 mM), pH 9,5. 2 M natrium karbonat Kuning hijau Kuning hijau 405 nm 405 nm

Pemecahan Masalah ELISA

Selesaikan masalah ELISA Anda dengan tip pemecahan masalah ini, yang mencakup penyebab umum kurva standar yang buruk, tidak ada sinyal atau sinyal lemah, latar belakang tinggi, koefisien variasi yang besar, dan banyak lagi. Detail lihat CD ELISA TROUBLESHOOTING TIPS

Creative Diagnostics menyediakan layanan kontrak pengembangan ELISA kit untuk komunitas R&D dan IVD. Kami melakukan layanan pengembangan kit ELISA untuk mendukung pengajuan persetujuan peraturan. Diagnostik Kreatif akan melaksanakan proposal persetujuan dan memberikan hasil dan dokumen yang diharapkan dalam waktu dan biaya yang efektif.

Metode Deteksi:
1) Penyerapan cahaya
2) Intensitas atau polarisasi fluoresensi
3) Transfer energi resonansi fluoresensi
4) Pendaran

Tonggak Penilaian:
1) Penilaian kelayakan dan desain pengujian
2) Pengoptimalan pengujian
3) Validasi Pengujian
4) Manufaktur


HASIL DAN DISKUSI

Persiapan Resin dan Pemurnian mAb

Sel Raji B ditumbuhkan hingga mencapai konsentrasi 107 sel/cawan. Sel-sel dikumpulkan, dicerna seperti yang dijelaskan, dan ekstrak dikumpulkan. Meskipun ini menghasilkan antigen ektodomain MHCII yang mudah dideteksi dari permukaan sel (Gbr. 1), langkah persiapan ini dapat dimodifikasi melalui penggunaan sejumlah antigen terlarut yang tersedia secara komersial (misalnya, glutathione S-transferase GST Cat. # G6511 Sigma-Aldrich ).

Kurva deteksi standar laboratorium penelitian. Resin kontrol negatif dan MHCII-Resin diperiksa menggunakan protokol makro-ELISA yang digariskan dengan lima konsentrasi mAb. Supernatan akhir diencerkan 1:5 dan dideteksi menggunakan spektrofotometer tabung reaksi. Data mentah diplot untuk setiap resin dan fit dengan analisis regresi linier. Selain itu, data resin MHCII diskalakan dengan faktor 5 untuk mencerminkan nilai absorbansi aktual sebelum pengenceran. Data ini menunjukkan kelayakan percobaan untuk pengaturan kelas.

Selanjutnya, antigen dikonjugasikan ke resin afinitas yang diaktifkan NHS untuk membuat ikatan kovalen antara molekul yang dilepaskan dan resin (Skema 1). Resin kontrol negatif dibuat dengan mengkonjugasikan resin dengan etanolamin untuk memblokir semua kelompok NHS reaktif. Kedua resin dicuci dengan PBS dan disimpan pada suhu 4 °C (jangan dibekukan) sampai digunakan.

MHCII mAb diproduksi dalam kultur sel hibridoma selama periode 1 minggu. Molekul mAb dimurnikan menggunakan resin Protein A rekombinan seperti yang dijelaskan. Kami memperoleh 3 mg mAb murni menggunakan metode ini (data tidak ditampilkan). Kami memilih MHCII karena ketersediaan mAbs anti-MHCII di laboratorium Cobb di Case Western Reserve University, namun, jika GST digunakan sebagai pengganti MHCII sebagai antigen target, mAbs anti-GST sudah tersedia (Kat. # G7781 Sigma -Aldrich).

Pengujian Laboratorium Protokol

ELISA skala makro pertama kali diuji dalam pengaturan laboratorium penelitian untuk menilai keandalan dan kelayakan protokol untuk siswa sekolah menengah yang tidak berpengalaman. Hanya menggunakan peralatan yang terdaftar di bagian Prosedur Eksperimental, kami melakukan pengujian menggunakan lima jumlah mAb anti-MHCII yang diketahui mulai dari 100 ng hingga 1 pg. Supernatan akhir setelah penambahan HCl diencerkan 1:5 dan kemudian diukur absorbansinya pada 450 nm menggunakan spektrofotometer tabung reaksi. Kami menemukan tingkat linieritas yang tinggi dalam hasil kami (Gbr. 1), yang mengarah ke kurva standar yang sangat dapat direproduksi dari mana kami dapat dengan mudah menghitung konsentrasi sampel mAb yang tidak diketahui.

Implementasi Kelas

Untuk menguji latihan laboratorium ini di bawah kondisi yang diinginkan, percobaan dilakukan oleh total 64 siswa sekolah menengah dalam konteks tiga bagian kursus terpisah dari AP Biologi di Sekolah Menengah Rocky River (Rocky River, OH). Dalam setiap kelas, siswa dibagi menjadi 12 kelompok dengan dua siswa per kelompok. Seperti dijelaskan di bagian Prosedur Eksperimental, setiap kelompok siswa diberi empat tabung mikro 1,5 mL yang berisi resin MHCII-resin atau resin kontrol negatif yang telah disiapkan sebelumnya, pengenceran mAb standar dan pengenceran mAb yang tidak diketahui (lihat Skema 3). Pengenceran standar diberi penunjukan huruf (SA sampai SF) dan dibagi di antara kelompok-kelompok sehingga setiap pengenceran diwakili setidaknya dua kali, meskipun ditekankan kepada siswa bahwa dalam pengaturan penelitian "nyata", semua pengenceran standar akan dilakukan oleh penyelidik individu daripada mengumpulkan data dari orang lain. Demikian juga, pengenceran yang tidak diketahui diberi penunjukan huruf (UA sampai UD) dan dibagi sedemikian rupa sehingga setiap pengenceran diwakili setidaknya tiga kali. Pengenceran dan konsentrasi yang sebenarnya dicatat oleh instruktur untuk referensi nanti.

Setiap kelompok siswa melewati protokol, akhirnya menghasilkan empat nilai absorbansi per kelompok (dua kontrol negatif, satu standar, dan satu tidak diketahui). Para siswa mengurangi nilai kontrol negatif dari nilai eksperimen dan kemudian mengumpulkan dua titik data mereka, satu standar yang dikoreksi latar belakang dan satu dikoreksi latar belakang yang tidak diketahui, dengan kelompok siswa lainnya. Data yang diperoleh dari enam standar diplot dengan konsentrasi mAb dan sesuai dengan algoritma regresi linier (Gbr. 2A). Persamaan garis dihitung dari fit dan interval kepercayaan 95% ditampilkan. Dengan menggunakan persamaan ini, para siswa menghitung konsentrasi mAb dari sampel mereka yang tidak diketahui menggunakan data absorbansi eksperimental mereka. Nilai-nilai ini dikumpulkan dan dibandingkan dengan konsentrasi mAb yang sebenarnya (Gbr. 2B). Perlu dicatat bahwa beberapa titik data dihilangkan karena resin secara tidak sengaja dibuang daripada supernatan selama salah satu langkah pencucian. Namun, siswa secara keseluruhan menghasilkan hasil yang sangat akurat yang sangat cocok dengan konsentrasi mAb yang sebenarnya.

Data siswa dari pelaksanaan kelas. (A) Data kurva standar dan regresi linier fit menggunakan data siswa dengan garis putus-putus mewakili selang kepercayaan 95%. (B) Nilai konsentrasi mAb siswa untuk sampel yang tidak diketahui dibandingkan dengan nilai yang dihitung berdasarkan konsentrasi yang diketahui sebenarnya dari setiap sampel yang tidak diketahui. Data ini tidak hanya menunjukkan kelayakan percobaan ini, tetapi juga menunjukkan bahwa prosedurnya cukup kuat untuk memastikan hasil yang cukup akurat dalam pengaturan ruang kelas sekolah menengah.

Mencapai Tujuan Pembelajaran

Sebagai bagian dari latihan laboratorium ini, siswa diharapkan memahami konsep dan prosedur ELISA, cara mengembangkan kurva standar menggunakan Microsoft Excel, cara menentukan yang tidak diketahui dari kurva standar, mengembangkan keterampilan laboratorium baru (mis. mikropipet), dan untuk mengembangkan apresiasi atas penggunaan praktis ELISA di masyarakat saat ini. Setiap siswa diminta untuk menyelesaikan lembar kerja pada percobaan (Tabel I) bersama dengan laporan laboratorium yang mencakup data mentah mereka, nilai yang dihitung untuk sampel yang tidak diketahui, dan grafik kurva standar menggunakan data kelas yang dikumpulkan. Kami menemukan bahwa sebagian besar siswa memahami konsep molekul dasar yang berpusat di sekitar antibodi yang mengikat antigennya dan penggunaan reaksi enzimatik yang mengubah warna sebagai metode deteksi. Namun, meskipun konsep-konsep ini dipahami secara umum, beberapa siswa memang mengalami kesulitan dengan kimia yang mendasarinya, terutama peran HCl, dan kesulitan ini bergantung pada paparan mereka terhadap kimia sekolah menengah. Meskipun demikian, banyak siswa mampu menarik hubungan antara latihan laboratorium dan penggunaan teknologi ini di klinik, terutama dalam contoh HIV. Awalnya, para siswa tampaknya tidak sepenuhnya menghargai pentingnya kontrol dan pencucian hati-hati selama prosedur, tetapi pada akhir percobaan, mereka dapat melihat secara langsung perlunya resin kontrol sebagai latar belakang dan potensi positif palsu dan palsu. -hasil negatif. Secara keseluruhan, tampak bahwa siswa memperoleh apresiasi yang kuat untuk konsep dan aplikasi mereka untuk penelitian "dunia nyata" dan pengujian klinis, sambil mendapatkan pemahaman yang lebih besar tentang kontrol dan masalah desain eksperimental mendasar lainnya.

1. Mengapa resin kontrol diperlukan?
2. Identifikasi reagen berikut dengan nama:
(a) antibodi primer, (b) antibodi sekunder, (c) enzim, dan (d) substrat
3. Mengapa setiap standar dan setiap yang tidak diketahui diuji beberapa kali di semua kelas?
4. Apa tujuan mencuci resin sebelum menambahkan setiap reagen?
5. Apa tujuan penambahan HCl 1 M pada akhir Hari ke-3? Menjelaskan.
6. Jelaskan apa yang dimaksud dengan hasil positif palsu. Sebutkan satu kesalahan yang akan menghasilkan positif palsu.
7. Jelaskan apa yang dimaksud dengan hasil negatif palsu. Sebutkan satu kesalahan yang akan menghasilkan negatif palsu.
8.Dengan menggunakan pengetahuan ELISA Anda, buku teks, dan internet jika diperlukan, jelaskan bagaimana jenis pengujian khusus ini digunakan untuk mendiagnosis HIV, virus yang terkait dengan AIDS.

Kesalahan Umum Siswa

Kesalahan utama yang harus diwaspadai adalah membuang pelet resin secara tidak sengaja selama beberapa langkah pencucian. Akurasi pengujian ini juga tergantung pada siswa yang mendekantasi supernatan dengan hati-hati, agar tidak menghilangkan resin setiap kali resin dicuci atau diinkubasi. Terakhir, penting untuk memastikan bahwa siswa mengetahui perbedaan antara volume mikroliter dan mililiter, karena hal ini dapat menyebabkan hasil yang sangat tidak akurat dan pemborosan reagen.


ELISA Assays: Tidak Langsung, Sandwich, dan Kompetitif

Sumber: Whitney Swanson 1,2 , Frances V. Sjaastad 2,3 , dan Thomas S. Griffith 1,2,3,4
1 Departemen Urologi, Universitas Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Pusat Imunologi, Universitas Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Program Pascasarjana Mikrobiologi, Imunologi, dan Biologi Kanker, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Pusat Kanker Masonik, Universitas Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sering digunakan untuk mengukur keberadaan dan/atau konsentrasi antigen, antibodi, peptida, protein, hormon, atau biomolekul lain dalam sampel biologis. Ini sangat sensitif, mampu mendeteksi konsentrasi antigen yang rendah. Sensitivitas ELISA dikaitkan dengan kemampuannya untuk mendeteksi interaksi antara kompleks antigen-antibodi tunggal (1). Selain itu, dimasukkannya antibodi spesifik antigen terkonjugasi enzim memungkinkan konversi substrat tidak berwarna menjadi produk kromogenik atau fluoresen yang dapat dideteksi dan dengan mudah diukur oleh pembaca pelat. Jika dibandingkan dengan nilai yang dihasilkan oleh jumlah titrasi antigen yang diketahui, konsentrasi antigen yang sama dalam sampel eksperimental dapat ditentukan. Protokol ELISA yang berbeda telah diadaptasi untuk mengukur konsentrasi antigen dalam berbagai sampel eksperimental, tetapi semuanya memiliki konsep dasar yang sama (2). Memilih jenis ELISA untuk dilakukan, tidak langsung, sandwich, atau kompetitif, tergantung pada sejumlah faktor, termasuk kompleksitas sampel yang akan diuji dan antibodi spesifik antigen yang tersedia untuk digunakan. ELISA tidak langsung sering digunakan untuk menentukan hasil respons imunologis, seperti mengukur konsentrasi antibodi dalam sampel. Sandwich ELISA paling cocok untuk menganalisis sampel kompleks, seperti supernatan kultur jaringan atau lisat jaringan, di mana analit, atau antigen yang diinginkan, merupakan bagian dari sampel campuran. Akhirnya, ELISA kompetitif paling sering digunakan ketika hanya ada satu antibodi yang tersedia untuk mendeteksi antigen yang diinginkan. ELISA kompetitif juga berguna untuk mendeteksi antigen kecil dengan hanya satu epitop antibodi yang tidak dapat mengakomodasi dua antibodi berbeda karena hambatan sterik. Protokol akan menjelaskan prosedur dasar untuk pengujian ELISA tidak langsung, sandwich, dan kompetitif.

Uji ELISA tidak langsung biasanya digunakan untuk mengukur jumlah antibodi dalam serum atau supernatan dari kultur hibridoma. Prosedur umum untuk uji ELISA tidak langsung adalah:

  1. Lapisi sumur dengan antigen
  2. Tambahkan supernatan serum atau kultur hibridoma yang mengandung antibodi (antibodi primer atau 1°)
  3. Inkubasi dan cuci
  4. Tambahkan antibodi terkonjugasi enzim sekunder (atau 2°)
  5. Inkubasi dan cuci
  6. Tambahkan substrat

Uji sandwich ELISA berbeda dari uji ELISA tidak langsung dalam metode yang tidak melibatkan pelapisan pelat dengan antigen murni. Sebaliknya, antibodi "capture" digunakan untuk melapisi lubang pelat. Antigen 'terjepit' antara antibodi penangkap dan antibodi terkonjugasi enzim "deteksi" kedua - di mana kedua antibodi spesifik untuk antigen yang sama, tetapi pada epitop yang berbeda (3). Dengan mengikat kompleks antibodi/antigen penangkap, antibodi pendeteksi tetap berada di piring. Antibodi monoklonal atau antiserum poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkap dan pendeteksi. Keuntungan utama dari sandwich ELISA adalah sampel tidak harus dimurnikan sebelum dianalisis. Selain itu, pengujian bisa sangat sensitif (4). Banyak kit ELISA yang tersedia secara komersial adalah dari jenis sandwich dan menggunakan pasangan antibodi yang diuji dan cocok. Prosedur umum untuk uji sandwich ELISA adalah:

  1. Lapisi sumur dengan antibodi penangkap
  2. Tambahkan sampel uji yang mengandung antigen
  3. Inkubasi dan cuci
  4. Tambahkan antibodi deteksi terkonjugasi enzim.
  5. Inkubasi dan cuci
  6. Tambahkan substrat

Sebagian besar kit ELISA sandwich yang tersedia secara komersial dilengkapi dengan antibodi deteksi terkonjugasi enzim. Dalam kasus di mana antibodi deteksi terkonjugasi enzim tidak tersedia, antibodi terkonjugasi enzim sekunder yang spesifik untuk antibodi deteksi dapat digunakan. Enzim pada antibodi sekunder melakukan peran yang sama, yaitu mengubah substrat tidak berwarna menjadi produk kromogenik atau fluoresen. Antibodi terkonjugasi enzim sekunder yang disebutkan di atas lebih suka digunakan dalam ELISA sandwich "homemade" yang dikembangkan oleh penyelidik yang telah menghasilkan antibodi monoklonal mereka sendiri, misalnya. Salah satu kelemahan penggunaan antibodi terkonjugasi enzim sekunder adalah memastikan antibodi tersebut hanya berikatan dengan antibodi pendeteksi, dan bukan antibodi penangkap yang terikat pada pelat. Ini akan menghasilkan produk yang terukur di semua sumur, terlepas dari ada atau tidaknya antigen atau antibodi pendeteksi.

Akhirnya, uji ELISA kompetitif digunakan untuk mendeteksi antigen terlarut. Ini sederhana untuk dilakukan, tetapi hanya cocok jika antigen yang dimurnikan tersedia dalam jumlah yang relatif besar. Prosedur umum untuk uji ELISA kompetitif adalah:

  1. Lapisi sumur dengan antigen
  2. Inkubasi dan cuci
  3. Sampel uji prainkubasi dengan antibodi primer terkonjugasi enzim
  4. Tambahkan campuran ke dalam sumur
  5. Inkubasi dan bersihkan antibodi primer terkonjugasi enzim yang tidak terikat
  6. Tambahkan substrat

'Persaingan' dalam pengujian ini berasal dari fakta bahwa lebih banyak antigen dalam sampel uji yang digunakan pada langkah 3 akan menghasilkan lebih sedikit antibodi yang tersedia untuk mengikat antigen yang melapisi sumur. Dengan demikian, intensitas produk kromogenik/fluorogenik di dalam sumur pada akhir pengujian berbanding terbalik dengan jumlah antigen yang ada dalam sampel uji.

Komponen kunci dalam semua jenis ELISA adalah standar titrasi dari konsentrasi yang diketahui yang akan memungkinkan pengguna untuk menentukan konsentrasi antigen yang ada dalam sampel uji. Biasanya, serangkaian sumur dirancang untuk membuat kurva standar, di mana sejumlah protein rekombinan murni yang diketahui ditambahkan ke sumur dalam jumlah yang berkurang. Ketika sumur-sumur ini diproses pada saat yang sama dengan sampel uji, pengguna kemudian dapat memiliki set referensi nilai absorbansi yang diperoleh dari pembaca lempeng mikro untuk konsentrasi protein yang diketahui agar sejalan dengan nilai absorbansi untuk sampel uji. Pengguna kemudian dapat menghitung kurva standar di mana sampel uji dapat dibandingkan untuk menentukan jumlah protein yang diinginkan. Kurva standar juga dapat menentukan tingkat presisi pembuatan pengenceran pengguna.

Akhirnya, langkah terakhir di setiap jenis ELISA yang tercantum di atas memerlukan penambahan substrat. Derajat konversi substrat menjadi produk berhubungan langsung dengan jumlah enzim yang ada di dalam sumur. Horseradish peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase (AP) adalah enzim yang paling umum ditemukan terkonjugasi dengan antibodi. Seperti yang diharapkan, ada sejumlah substrat yang tersedia khusus untuk enzim yang menghasilkan produk kromogenik atau fluoresen. Selain itu, substrat tersedia dalam berbagai sensitivitas yang dapat meningkatkan sensitivitas pengujian secara keseluruhan. Pengguna juga harus mempertimbangkan jenis instrumentasi yang tersedia untuk membaca pelat di akhir percobaan saat memilih jenis substrat yang akan digunakan, bersama dengan antibodi terkonjugasi enzim yang sesuai.

Substrat kromogenik yang umum digunakan untuk HRP termasuk 2,2'Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-asam sulfonat]-garam diamonium (ABTS) dan 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB), sedangkan P-Nitrofenil Fosfat (PNPP) digunakan untuk AP. ABTS dan TMB masing-masing menghasilkan produk reaksi berwarna hijau dan biru yang larut dalam air. Produk ABTS hijau memiliki dua puncak absorbansi utama, 410 dan 650 nm, sedangkan produk TMB biru paling baik dideteksi pada 370 dan 652 nm. Warna ABTS dan TMB berubah menjadi kuning pada penambahan larutan stop asam, yang paling baik dibaca pada 450 nm. Perkembangan warna untuk ABTS lambat, sedangkan untuk TMB cepat. TMB lebih sensitif daripada ABTS, dan dapat menghasilkan sinyal latar belakang yang lebih tinggi jika reaksi enzimatik berlangsung terlalu lama. PNPP menghasilkan produk yang larut dalam air berwarna kuning setelah konversi AP yang menyerap cahaya pada 405 nm.

Prosedur

1. ELISA Tidak Langsung

ELISA tidak langsung adalah ELISA di mana antibodi spesifik antigen primer dikenali oleh antibodi terkonjugasi sekunder. Protokol berikut adalah contoh metode ELISA tidak langsung, di mana sampel serum tikus yang terinfeksi virus influenza A (IAV) diuji keberadaan antibodi IgG spesifik-IAV. Salah satu kekuatan dari contoh ini adalah bahwa antibodi sekunder yang berbeda dapat digunakan untuk mengenali semua isotipe antibodi atau isotipe spesifik (misalnya, IgG).

Melapisi antigen ke lempeng mikro

  1. Lapisi lubang pelat ELISA 96-sumur dengan antigen yang dimurnikan dengan memipet 50 µL antigen yang dimurnikan (2 mg/mL virus A/PR/8 Influenza A yang dimurnikan dalam buffer Tris-HCl 0,05M (pH 9,5)) ke dalam masing-masing sumur piring.
  2. Tutup pelat dengan penutup perekat dan inkubasi semalaman pada suhu 4 & 176C untuk memungkinkan antigen mengikat pelat.
  3. Setelah inkubasi selesai, keluarkan larutan pelapis dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.
  1. Blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur berlapis dengan menambahkan 200 µL buffer pemblokiran, serum keledai 5% dalam 1X PBS digunakan di sini, per sumur. Reagen pemblokiran alternatif termasuk 5% susu kering non-lemak atau BSA dalam PBS atau serum normal dari hewan di mana antibodi sekunder dihasilkan.
  2. Inkubasi setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar atau semalaman pada suhu 4°C.
  3. Setelah inkubasi, lepaskan buffer pemblokiran dengan menjentikkan pelat dan kemudian mencuci pelat dengan PBS yang mengandung 1% Tween-20.

Inkubasi dengan antibodi primer

  1. Siapkan pengenceran serial sampel serum, yang mengandung antibodi primer, untuk mendapatkan kisaran pengenceran 1 hingga 204.800, menggunakan 1X PBS. Untuk melakukan ini, pertama-tama encerkan serum 1:12,5 dan kemudian lakukan pengenceran 4X (kisaran pengenceran - 1:12,5 hingga 1:204.800).
  2. Tambahkan 100 µL sampel serum yang diencerkan secara serial ke dalam sumur.
  3. Tutup piring dengan penutup perekat dan inkubasi pada suhu kamar selama 1-2 jam.
  4. Setelah inkubasi, jentikkan pelat di atas bak cuci dan cuci piring dengan PBS yang mengandung 1% Tween-20.

Inkubasi dengan antibodi sekunder

  1. Tambahkan 100 µL antibodi sekunder terkonjugasi enzim, horseradish peroxidase, sekunder anti-tikus keledai terkonjugasi HRP dalam percobaan ini, ke setiap sumur.
  2. Inkubasi piring selama 1 jam pada suhu kamar.
  3. Setelah inkubasi, jentikkan piring di atas bak cuci dan cuci piring dengan PBS yang mengandung 1% Tween-20.
  1. Tambahkan 100 µL substrat indikator (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) dengan konsentrasi 1 mg/mL ke setiap sumur.
  2. Inkubasi piring dengan substrat selama 5-10 menit pada suhu kamar.
  3. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatis dengan menambahkan 100 µL 2N Asam Sulfat (H .)2JADI4).
    Dalam waktu 30 menit setelah menambahkan stop solution, baca pelat menggunakan pembaca pelat mikro pada 405 nm untuk menentukan absorbansi sumur.

2. Sandwich ELISA

Dalam versi ELISA ini, sampel eksperimental "terjepit" antara antibodi penangkap tak terkonjugasi dan antibodi deteksi terkonjugasi, keduanya spesifik untuk protein yang sama tetapi pada epitop yang berbeda. Dalam contoh ELISA sandwich berikut, konsentrasi TNFα manusia ditentukan dalam sampel yang tidak diketahui menggunakan kurva standar yang dihasilkan dari pengenceran serial 2.5X dari standar yang diketahui, TNFα manusia rekombinan (dinyatakan pada konsentrasi 75 pg/mL).

Melapisi antibodi penangkap ke lempeng mikro

  1. Lapisi lubang pelat ELISA 96-sumur dengan antibodi penangkap yang dimurnikan dengan menambahkan 100 µL antibodi penangkap (rentang 1-10 µg/mL) ke setiap lubang pelat.
  2. Tutup pelat dengan penutup pelat berperekat dan inkubasi semalaman pada suhu 4°C.
  3. Setelah inkubasi, keluarkan larutan pelapis dari piring dengan menjentikkan piring di atas bak cuci.
  1. Blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi antibodi dengan menambahkan 200 µL larutan penghambat, 5% susu kering tanpa lemak yang mengandung PBS, ke dalam sumur.
  2. Inkubasi setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar atau semalaman pada suhu 4°C.
  3. Setelah inkubasi, lepaskan buffer pemblokiran dengan menjentikkan pelat dan kemudian mencuci pelat dengan PBS yang mengandung 1% Tween-20.

Tambahkan sampel uji yang mengandung antigen

  1. Tambahkan 100 µL sampel uji ke dalam sumur. Tutup piring dengan penutup perekat.
  2. Inkubasi selama 1-2 jam pada suhu kamar atau semalaman pada suhu 4°C.
  3. Setelah inkubasi, keluarkan sampel dengan cara menjentikkan pelat di atas bak cuci lalu cuci sumuran dengan 200 µL 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20.

Tambahkan antibodi deteksi terkonjugasi enzim

  1. Tambahkan 100 µL antibodi deteksi terkonjugasi enzim ke sumur pada konsentrasi yang telah dioptimalkan sebelumnya.
  2. Tutup pelat dengan penutup perekat dan inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam.
  3. Lepaskan antibodi pendeteksi yang tidak terikat dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci dan cuci sumur dengan 200 µL 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20.
  1. Tambahkan 100 µL substrat indikator pada konsentrasi 1 mg/mL. Setiap antibodi deteksi terkonjugasi enzim terikat akan mengubah substrat menjadi sinyal yang dapat dideteksi.
  2. Inkubasi piring selama 5-10 menit pada suhu kamar.
  3. Setelah 5-10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 µL 2N H2JADI4 ke sumur. Dalam waktu 30 menit setelah menambahkan stop solution, baca pelat menggunakan pembaca pelat mikro untuk menentukan absorbansi sumur.

3. ELISA Kompetitif

Langkah-langkah ELISA kompetitif berbeda dari yang digunakan dalam ELISA tidak langsung dan sandwich, dengan perbedaan utama adalah langkah pengikatan kompetitif antara antigen sampel dan antigen "add-in". Antigen sampel diinkubasi dengan antibodi primer yang tidak berlabel. Kompleks antibodi-antigen ini kemudian ditambahkan ke pelat ELISA, yang telah dilapisi sebelumnya dengan antigen yang sama. Setelah masa inkubasi, antibodi yang tidak terikat dibersihkan. Ada korelasi terbalik antara jumlah antibodi bebas yang tersedia untuk mengikat antigen di sumur dan jumlah antigen dalam sampel asli. Misalnya, sampel dengan antigen yang melimpah akan memiliki lebih banyak kompleks antibodi primer antigen, meninggalkan sedikit antibodi yang tidak terikat untuk berikatan dengan pelat ELISA. Antibodi sekunder terkonjugasi enzim yang spesifik untuk antibodi primer kemudian ditambahkan ke sumur, diikuti oleh substrat.

Melapisi antigen ke lempeng mikro

  1. Lapisi lubang pelat ELISA 96 lubang dengan 100 μL antigen murni pada konsentrasi 1-10 μg/mL.
  2. Tutup pelat dengan penutup pelat berperekat dan inkubasikan pelat semalaman pada suhu 4&176C.
  3. Setelah inkubasi, keluarkan larutan antigen yang tidak terikat dari sumur dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.
  1. Blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 μL buffer pemblokiran ke setiap sumur, yang dapat berupa susu kering tanpa lemak 5% atau BSA dalam PBS.
  2. Inkubasi piring setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar atau semalaman pada suhu 4°C.

Sampel inkubasi (antigen) dengan antibodi primer

  1. Saat memblokir sumur, siapkan campuran antigen-antibodi dengan mencampur 150 μL sampel antigen dan 150 μL antibodi primer untuk setiap sumur dalam pengujian.
  2. Inkubasi campuran ini selama 1 jam pada 37°C.

Tambahkan campuran antigen-antibodi ke dalam sumur

  1. Sekarang, lepaskan buffer pemblokiran dari sumur dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.
  2. Kemudian, cuci sumuran dengan 1X PBS yang mengandung Tween-20.
  3. Tambahkan 100 μL sampel campuran antigen-antibodi primer.
  4. Inkubasi piring pada 37 & 176C selama 1 jam.
  5. Keluarkan campuran sampel dengan menjentikkan piring di atas bak cuci.
  6. Kemudian, cuci sumur dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat.

Tambahkan antibodi sekunder

  1. Tambahkan 100 μL antibodi sekunder terkonjugasi enzim, yang dalam hal ini adalah antibodi terkonjugasi AP, ke setiap sumur.
  2. Inkubasi plate selama 1 jam pada suhu 37°C.
  3. Setelah inkubasi, cuci piring dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20.
  1. Tambahkan 100 μL larutan substrat ke setiap sumur.
  2. Tunggu 5-10 menit.
  3. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 μL 2N asam sulfat ke dalam sumur. Kemudian, ukur absorbansi dalam pembaca pelat mikro dalam waktu 30 menit setelah menambahkan larutan penghenti

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, atau ELISA adalah uji kuantitatif yang sangat sensitif yang biasa digunakan untuk mengukur konsentrasi analit seperti sitokin dan antibodi dalam sampel biologis. Prinsip umum pengujian ini melibatkan tiga langkah: dimulai dengan penangkapan, atau imobilisasi, analit target pada pelat mikro, diikuti dengan deteksi analit oleh protein deteksi spesifik target, dan terakhir, reaksi enzim, di mana enzim terkonjugasi mengubah substratnya menjadi produk berwarna. Berdasarkan metode penangkapan dan deteksi yang berbeda, ELISA dapat terdiri dari empat jenis: langsung, tidak langsung, sandwich, dan kompetitif.

Untuk ELISA langsung, antigen target pertama-tama terikat pada pelat, dan kemudian dideteksi oleh antibodi deteksi spesifik. Metode ini biasanya digunakan untuk menyaring antibodi untuk antigen tertentu. ELISA tidak langsung digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam sampel untuk mengukur respons imun. Pelat pertama-tama dilapisi dengan antigen penangkap spesifik, yang melumpuhkan antibodi target, dan kompleks antigen-antibodi ini kemudian dideteksi menggunakan antibodi kedua.

Dalam kasus sandwich ELISA, analit target adalah antigen, yang ditangkap di piring menggunakan antibodi penangkap dan kemudian dideteksi oleh antibodi pendeteksi, sehingga membentuk sandwich antibodi-antigen-antibodi. Metode ini berguna untuk mengukur konsentrasi antigen dalam sampel campuran.

ELISA kompetitif digunakan ketika hanya satu antibodi yang tersedia untuk antigen target yang diinginkan. Pelat pertama-tama dilapisi dengan antigen yang dimurnikan. Sementara itu, sampel yang mengandung antigen diinkubasi sebelumnya dengan antibodi dan kemudian ditambahkan ke piring, untuk memungkinkan molekul antibodi bebas mengikat antigen yang tidak bergerak. Semakin tinggi sinyal dari pelat, semakin rendah konsentrasi antigen dalam sampel. Dalam keempat jenis ELISA, langsung, tidak langsung, sandwich, dan kompetitif, antibodi pendeteksi terkonjugasi secara langsung ke enzim atau dapat secara tidak langsung dihubungkan dengannya melalui antibodi atau protein lain.

Enzim yang biasa digunakan untuk reaksi adalah horseradish peroxidase atau alkaline phosphatase dengan substratnya masing-masing, keduanya menghasilkan produk berwarna yang dapat larut yang dapat diukur dan diukur menggunakan pembaca pelat. Dalam video ini, Anda akan mengamati cara melakukan ELISA tidak langsung, ELISA sandwich, dan ELISA kompetitif, diikuti dengan contoh kuantifikasi analit target dari metode ELISA tidak langsung dan sandwich.

Eksperimen pertama akan mendemonstrasikan cara menggunakan ELISA tidak langsung untuk menentukan adanya antibodi anti virus influenza dalam serum yang diperoleh dari mencit yang terinfeksi influenza.

Untuk memulai, tambahkan 50 mikroliter antigen murni - dalam hal ini, 2 miligram per mililiter virus A/PR/8 Influenza A murni- ke setiap lubang pelat ELISA 96 lubang. Selanjutnya, tutup pelat dengan penutup perekat dan inkubasi semalaman pada suhu 4 derajat celsius untuk memungkinkan antigen mengikat pelat. Keesokan harinya, keluarkan larutan pelapis dengan menjentikkan piring di atas bak cuci. Selanjutnya, blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 mikroliter buffer pemblokiran - di sini, serum keledai 5% dalam 1X PBS - ke setiap sumur. Biarkan piring diinkubasi setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah inkubasi, lepaskan buffer pemblokiran dan kemudian cuci piring dengan menambahkan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Jentikkan piring di atas bak cuci sekali lagi untuk menghapus cucian.

Kemudian, siapkan sampel uji dengan menambahkan 460 mikroliter PBS ke tabung baru, dan kemudian menambahkan 40 mikroliter serum untuk membuat pengenceran 1 hingga 12,5. Kemudian, tambahkan 300 mikroliter PBS ke tabung kedua, lalu tambahkan 100 mikroliter pengenceran pertama. Lanjutkan rentang pengenceran serial ini hingga diperoleh sampel akhir dengan pengenceran 1 hingga 204.800. Tambahkan sampel serum yang diencerkan secara serial dalam rangkap tiga ke sumur. Tutup piring dengan penutup perekat dan inkubasi pada suhu kamar selama satu jam. Selanjutnya, keluarkan sampel dengan cara menjentikkan pelat ke dalam bak cuci piring kemudian cuci piring dengan menambahkan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Sekali lagi, jentikkan piring untuk menghapus cucian.

Sekarang, tambahkan 100 mikroliter antibodi sekunder terkonjugasi enzim, yang dalam percobaan ini adalah horseradish peroxidase, atau HRP, sekunder anti-tikus keledai terkonjugasi, ke setiap sumur. Inkubasi piring selama satu jam pada suhu kamar, dan jentik piring untuk menghilangkan kelebihan cairan. Cuci piring dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 dan kemudian aplikasikan 100 mikroliter substrat indikator dengan konsentrasi satu miligram per mililiter ke setiap sumur. Inkubasi piring dengan substrat selama 5 sampai 10 menit pada suhu kamar. Dalam contoh ini, substrat tak berwarna 3,3', 5,5' - tetramethylbenzidine, atau TMB, berubah menjadi warna biru ketika ada HRP. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 mikroliter asam sulfat 2N. Sampel akan berubah warna menjadi kuning.

Dalam waktu 30 menit setelah menambahkan stop solution, masukkan pelat ke dalam pembaca pelat mikro dan baca pelat pada panjang gelombang yang sesuai untuk substrat untuk menentukan absorbansi sumur.

Untuk memulai ELISA sandwich, pelat harus dilapisi dengan antibodi penangkap yang dimurnikan. Untuk melakukan ini, tambahkan 100 mikroliter antibodi penangkap pada konsentrasi dalam kisaran 1-10 mikrogram per mililiter, ke setiap lubang pelat ELISA 96 lubang. Selanjutnya, tutup pelat dengan penutup pelat perekat lalu inkubasi pelat semalaman pada suhu 4 derajat celsius. Setelah inkubasi, keluarkan larutan pelapis dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.

Sekarang, blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 mikroliter susu kering tanpa lemak 5% ke dalam sumur. Inkubasi piring pada suhu kamar selama minimal 2 jam. Selanjutnya, lepaskan buffer pemblokiran, lalu cuci sumur dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Hapus cucian dengan menjentikkan piring di atas bak cuci. Sekarang, tambahkan 100 mikroliter sampel uji ke dalam sumur, tutup pelat dengan penutup perekat, dan kemudian inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. Setelah inkubasi, keluarkan sampel dengan cara menjentikkan pelat di atas bak cuci lalu cuci sumur dengan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Jentik piring di atas bak cuci untuk menghapus cucian dan kemudian tambahkan 100 mikroliter antibodi deteksi terkonjugasi enzim ke sumur.

Tutup piring dengan penutup perekat. Biarkan piring untuk diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. Setelah inkubasi, lepaskan antibodi deteksi yang tidak terikat dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci dan cuci sumur dengan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Selanjutnya, tambahkan 100 mikroliter substrat indikator pada konsentrasi 1 miligram per mililiter, dan inkubasi pelat selama 5 sampai 10 menit pada suhu kamar. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 mikroliter asam sulfat 2N ke dalam sumur dan kemudian baca pelat dalam waktu 30 menit setelah menambahkan larutan penghenti dalam pembaca pelat mikro.

Untuk melakukan ELISA kompetitif, pertama-tama lapisi lubang pelat ELISA 96-sumur dengan 100 mikroliter antigen murni pada konsentrasi 1-10 mikrogram per mililiter. Tutup pelat dengan penutup pelat perekat lalu inkubasi semalaman pada suhu 4 derajat celsius. Setelah ini, keluarkan larutan antigen yang tidak terikat dari sumur dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.

Selanjutnya, blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 mikroliter buffer pemblokiran ke setiap sumur- di sini, susu kering tanpa lemak 5% di PBS. Inkubasi piring setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar. Saat memblokir sumur, siapkan campuran antigen-antibodi dalam tabung 1,5 mililiter dengan menambahkan 150 mikroliter antigen sampel ke 150 mikroliter antibodi primer untuk setiap sumur dalam pengujian. Inkubasi campuran ini selama 1 jam pada suhu 37 derajat celsius. Sekarang, lepaskan buffer pemblokiran dari sumur dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci. Kemudian, cuci sumuran dengan 1X PBS yang mengandung Tween 20 lalu tambahkan 100 mikroliter sampel campuran antigen-antibodi primer.

Biarkan piring diinkubasi pada suhu 37 derajat celsius selama satu jam. Selanjutnya, keluarkan campuran sampel dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci dan kemudian cuci sumur dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Tambahkan 100 mikroliter antibodi sekunder terkonjugasi enzim ke setiap sumur dan inkubasi pelat selama satu jam pada suhu 37 derajat celsius. Setelah ini, cuci piring dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 dan kemudian tambahkan 100 mikroliter larutan substrat ke masing-masing sumur. Tunggu 5-10 menit. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 mikroliter asam sulfat 2N dan kemudian ukur absorbansinya dalam pembaca pelat mikro dalam waktu 30 menit setelah penambahan stop solution.

Untuk uji ELISA tidak langsung semi-kuantitatif, keberadaan antibodi virus influenza A dalam sampel serum yang diencerkan secara serial dari tikus yang terinfeksi influenza A ditentukan dengan membaca absorbansi masing-masing sumur pada 405 nanometer di pembaca pelat. Data mentah ini diekspor ke spreadsheet untuk tujuan perhitungan. Dalam percobaan ini, sampel serum yang diencerkan secara serial, yang berkisar dari 1 - 12,5, hingga 1 - 204.800, diulang dalam rangkap tiga.

Untuk menganalisis data, nilai absorbansi rata-rata dihitung untuk setiap rangkaian rangkap tiga dengan menambahkan semua nilai untuk setiap pengenceran dan membagi jumlahnya dengan 3. Setelah rata-rata untuk setiap rangkaian rangkap tiga ditentukan, pembacaan OD450 rata-rata diplot terhadap pengenceran serial. Pembacaan OD menurun saat serum diencerkan, menunjukkan bahwa lebih sedikit antibodi ditemukan pada sampel yang lebih encer. Dalam sandwich kuantitatif ELISA, pengenceran standar yang diketahui, dalam hal ini TNFalpha Manusia rekombinasi, ditambahkan ke pelat 96-sumur dan dibaca bersama dengan sampel yang tidak diketahui.

Untuk membuat kurva standar, nilai absorbansi rata-rata untuk setiap rangkaian bacaan dari konsentrasi yang diketahui dihitung. Kemudian, nilai absorbansi rata-rata diplot pada sumbu y, terhadap konsentrasi protein yang diketahui pada sumbu x. Kurva yang paling cocok ditambahkan melalui titik-titik dalam grafik.

Setelah kurva standar dihasilkan, jumlah protein TNFalpha dalam sampel uji dapat ditentukan dengan terlebih dahulu menghitung nilai absorbansi rata-rata untuk sampel uji. Dalam contoh ini, sampel uji memberikan pembacaan OD450 sebesar 0,636 dan 0, 681. Menambahkan nilai-nilai ini dan membagi jumlah dengan 2 menghasilkan rata-rata 0,659. Dari sumbu y pada grafik kurva standar, perpanjang garis horizontal dari nilai absorbansi ini ke kurva standar. Pada titik perpotongan, perpanjang garis vertikal ke sumbu x dan baca konsentrasi yang sesuai yang, dalam sampel uji ini, sesuai dengan konsentrasi TNFalpha 38,72 pikogram per mililiter.

Berlangganan Diperlukan. Tolong rekomendasikan JoVE ke pustakawan Anda.

Hasil

Dalam contoh ELISA tidak langsung berikut, keberadaan IgG spesifik virus influenza A (IAV) dalam serum tikus yang terinfeksi IAV ditentukan. Tikus C57Bl/6 terinfeksi virus influenza A (A/PR/8 10 5 PFU dalam 100 µL PBS ip) dan serum dikumpulkan 28 hari kemudian. Untuk menghitung jumlah IgG spesifik IAV dalam serum, pelat ELISA 96 sumur dilapisi dengan virus A/PR/8 Influenza A yang dimurnikan (50 µL/sumur virus PBS 2 mg/ml) semalaman pada suhu 4°C . Pelat berlapis diblokir selama 1 jam pada suhu kamar dengan 5% serum keledai normal di PBS, diikuti oleh inkubasi dengan sampel serum yang diencerkan dari tikus yang ditantang IAV semalaman pada suhu 4 & 176C. Serum awalnya diencerkan 1:12,5, diikuti dengan pengenceran 1:4 (kisaran pengenceran - 1:12,5 hingga 1:204.800). Setelah dicuci, piring diinkubasi dengan IgG anti-tikus keledai terkonjugasi alkaline phosphatase (AP) selama 1 jam. Piring dicuci, dan kemudian P-Nitrofenil Fosfat (PNPP 1 mg/mL, 100 µL/sumur) ditambahkan. Solusi PNPP tidak berwarna berubah menjadi warna kuning ketika AP hadir. Setelah 5-10 menit, reaksi enzimatik dihentikan dengan menambahkan 100 µL/well 2N H2JADI4. Pelat dibaca pada pembaca lempeng mikro pada 405 nm. Hasil yang diperoleh ditunjukkan pada Tabel 1 dan Gambar 1.

Sampel sumur OD405 Berarti
Serum 1:12.5 A1 2.163 2.194
B1 2.214
C1 2.204
Serum 1:50 A1 1.712 1.894
B1 2.345
C1 1.624
Serum 1:200 A1 1.437 1.541
B1 1.73
C1 1.456
Serum 1:800 A1 1.036 0.957
B1 0.912
C1 0.923
Serum 1:3200 A1 0.579 0.48
B1 0.431
C1 0.429
Serum 1:12800 A1 0.296 0.281
B1 0.312
C1 0.236
Serum 1:51200 A1 0.308 0.283
B1 0.299
C1 0.243
Serum 1:204800 A1 0.315 0.303
B1 0.298
C1 0.297

Tabel 1: Data uji ELISA tidak langsung. Pengenceran serum (dari 1:12,5 hingga 1:204,800), tikus yang terinfeksi virus influenza A (IAV) yang mengandung IgG spesifik IAV, nilai densitas optik (OD) (405 nm) dan OD rata-rata405 nilai-nilai.


Gambar 1: Plot pencar uji ELISA tidak langsung dari rata-rata OD405 nilai(+ S. D.) dan pengenceran serum (dari 1:12,5 hingga 1:204,800), IgG spesifik virus influenza A (IAV) dalam serum tikus yang terinfeksi IAV. OD405 nilai dapat berbanding terbalik dengan pengenceran serum.

Dalam contoh sandwich ELISA berikut, pengenceran 1:2,5 standar TNFα manusia rekombinan (mulai dari konsentrasi 75 pg/mL) ditambahkan ke sumur yang ditunjukkan dari pelat alas datar 96-sumur. Standar ini menyebabkan perubahan 2,5 kali lipat dalam pembacaan absorbansi.

Sampel Konsentrasi (pg/mL) sumur Nilai Nilai Rata-rata Perhitungan Konsentrasi Kembali Rata-rata
Standar 1 75 A1 1.187 1.169 76.376 75.01
A2 1.152 73.644
Standar 2 30 B1 0.534 0.52 30.827 29.962
B2 0.506 29.098
Standar 3 12 C1 0.23 0.217 12.838 12.105
C2 0.204 11.372
Standar 4 4.8 D1 0.09 0.084 5.055 4.726
D2 0.078 4.398
Standar 5 1.92 E1 0.033 0.031 1.941 1.86
E2 0.03 1.778
Standar 6 0.768 F1 0.009 0.011 0.626 0.764
F2 0.014 0.901
Standar 7 0.307 G1 0.002 0.004 0.238 0.377
G2 0.007 0.516

Tabel 2: Data kurva standar Sandwich ELISA TNFα. Pengenceran 1:2,5 standar TNFα manusia rekombinan (75 hingga 0,3 pg/mL), nilai OD (450 nm), rata-rata OD450 nilai, perhitungan konsentrasi kembali dan rata-ratanya.


Gambar 2: Kurva Standar untuk ELISA sandwich TNFα. Pengenceran 1:2,5 standar TNFα manusia rekombinan (75 hingga 0,3 pg/mL) dianalisis menggunakan sandwich ELISA.450 nilai dapat langsung berkorelasi dengan konsentrasi pengenceran standar. Jumlah protein TNFα dalam sampel uji ditentukan menggunakan kurva standar, yang sesuai dengan konsentrasi 38,72 pg/mL.

Setelah kurva standar dihasilkan, jumlah protein TNFα dalam sampel uji ditentukan. Dalam contoh ELISA sandwich ini, sampel uji memberikan OD450 pembacaan 0,636 dan 0,681, yang memberikan rata-rata 0,6585. Saat memplot pembacaan OD450 ini pada grafik di atas, ini sesuai dengan konsentrasi TNFα 38,72 pg/ml.

Berlangganan Diperlukan. Tolong rekomendasikan JoVE ke pustakawan Anda.

Aplikasi dan Ringkasan

Seperti yang ditunjukkan, berbagai immunoassays (dengan sedikit variasi dalam protokol) termasuk dalam keluarga teknik ELISA. Menentukan versi ELISA mana yang akan digunakan bergantung pada sejumlah faktor, termasuk antigen apa yang dideteksi, antibodi monoklonal yang tersedia untuk antigen tertentu, dan sensitivitas pengujian yang diinginkan (5). Beberapa kekuatan dan kelemahan dari berbagai ELISA yang dijelaskan di sini adalah:

ELISA Kekuatan Kelemahan
tidak langsung 1) Sensitivitas tinggi karena fakta bahwa beberapa antibodi sekunder terkonjugasi enzim dapat mengikat antibodi primer 1) Sinyal latar belakang yang tinggi dapat terjadi karena pelapisan antigen yang diinginkan pada pelat tidak spesifik (yaitu, semua protein dalam sampel akan melapisi pelat)
2) Banyak antibodi primer yang berbeda dapat dikenali oleh antibodi sekunder terkonjugasi-enzim tunggal yang memberi pengguna fleksibilitas untuk menggunakan antibodi sekunder terkonjugasi-enzim yang sama di banyak ELISA yang berbeda (terlepas dari antigen yang terdeteksi)
3) Pilihan terbaik ketika hanya antibodi tunggal untuk antigen yang diinginkan tersedia
Sandwich 1) Penggunaan antibodi monoklonal penangkap dan deteksi spesifik antigen meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas pengujian (dibandingkan dengan ELISA tidak langsung) 1) Mengoptimalkan konsentrasi penangkapan dan pendeteksian antibodi monoklonal bisa jadi sulit (terutama untuk kit non-komersial)
2) Pilihan terbaik untuk mendeteksi protein besar dengan banyak epitop (seperti sitokin)
Kompetitif 1) Sampel tidak murni dapat digunakan 1) Membutuhkan sejumlah besar antigen yang sangat murni untuk digunakan untuk melapisi pelat
2) Kurang sensitif terhadap efek pengenceran reagen
3) Ideal untuk mendeteksi molekul kecil (seperti hapten)

Tabel 3: Ringkasan. Ringkasan kekuatan dan kelemahan teknik ELISA yang berbeda.

Meskipun merupakan teknik yang sederhana dan berguna, ada juga beberapa kelemahan pada ELISA apa pun. Salah satunya adalah ketidakpastian jumlah protein yang diinginkan dalam sampel uji. Jika jumlahnya terlalu tinggi atau terlalu rendah, nilai absorbansi yang diperoleh oleh pembaca lempeng mikro dapat turun masing-masing di atas atau di bawah batas kurva standar. Ini akan membuat sulit untuk secara akurat menentukan jumlah protein yang ada dalam sampel uji. Jika nilainya terlalu tinggi, sampel uji dapat diencerkan sebelum ditambahkan ke sumur pelat. Nilai akhir kemudian perlu disesuaikan sesuai dengan faktor pengenceran. Seperti disebutkan, kit buatan sendiri seringkali memerlukan optimalisasi konsentrasi antibodi yang digunakan untuk menghasilkan rasio signal-to-noise yang tinggi.

Berlangganan Diperlukan. Tolong rekomendasikan JoVE ke pustakawan Anda.

Referensi

  1. Porstmann, T. dan Kiessig S.T. Teknik immunoassay enzim. Gambaran. Jurnal Metode Imunologi.150 (1-2), 5-21 (1992).
  2. Sulaiman Aydin. Sejarah singkat, prinsip, dan jenis ELISA, dan pengalaman laboratorium kami dengan analisis peptida/protein menggunakan ELISA. Peptida, 72, 4-15 (2015).
  3. Gan. S. D. dan Patel K. R. Enzyme Immunoassay dan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Jurnal Dermatologi Investigasi, 133 (9), 1-3 (2013).
  4. Kohl, T. O. dan Ascoli C.A. Imunometrik Antibodi Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Protokol Pelabuhan Mata Air Dingin, 1 (6), (2017).
  5. Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., dan Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay untuk analisis kuantitatif/kualitatif metabolit sekunder tanaman. Jurnal obat-obatan alami, 72 (1), 32-42 (2018).

Salinan

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, atau ELISA adalah uji kuantitatif yang sangat sensitif yang biasa digunakan untuk mengukur konsentrasi analit seperti sitokin dan antibodi dalam sampel biologis. Prinsip umum pengujian ini melibatkan tiga langkah: dimulai dengan penangkapan, atau imobilisasi, analit target pada pelat mikro, diikuti dengan deteksi analit oleh protein deteksi spesifik target, dan terakhir, reaksi enzim, di mana enzim terkonjugasi mengubah substratnya menjadi produk berwarna. Berdasarkan metode penangkapan dan deteksi yang berbeda, ELISA dapat terdiri dari empat jenis: langsung, tidak langsung, sandwich, dan kompetitif.

Untuk ELISA langsung, antigen target pertama-tama terikat pada pelat, dan kemudian dideteksi oleh antibodi deteksi spesifik. Metode ini biasanya digunakan untuk menyaring antibodi untuk antigen tertentu. ELISA tidak langsung digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam sampel untuk mengukur respons imun. Pelat pertama-tama dilapisi dengan antigen penangkap spesifik, yang melumpuhkan antibodi target, dan kompleks antigen-antibodi ini kemudian dideteksi menggunakan antibodi kedua.

Dalam kasus sandwich ELISA, analit target adalah antigen, yang ditangkap di piring menggunakan antibodi penangkap dan kemudian dideteksi oleh antibodi pendeteksi, sehingga membentuk sandwich antibodi-antigen-antibodi. Metode ini berguna untuk mengukur konsentrasi antigen dalam sampel campuran.

ELISA kompetitif digunakan ketika hanya satu antibodi yang tersedia untuk antigen target yang diinginkan. Pelat pertama-tama dilapisi dengan antigen yang dimurnikan. Sementara itu, sampel yang mengandung antigen diinkubasi sebelumnya dengan antibodi dan kemudian ditambahkan ke piring, untuk memungkinkan molekul antibodi bebas mengikat antigen yang tidak bergerak. Semakin tinggi sinyal dari pelat, semakin rendah konsentrasi antigen dalam sampel. Dalam keempat jenis ELISA, langsung, tidak langsung, sandwich, dan kompetitif, antibodi pendeteksi terkonjugasi secara langsung ke enzim atau dapat secara tidak langsung dihubungkan dengannya melalui antibodi atau protein lain.

Enzim yang umum digunakan untuk reaksi adalah horseradish peroxidase atau alkaline phosphatase dengan substratnya masing-masing, keduanya menghasilkan produk berwarna yang dapat larut yang dapat diukur dan diukur menggunakan pembaca pelat. Dalam video ini, Anda akan mengamati cara melakukan ELISA tidak langsung, ELISA sandwich, dan ELISA kompetitif, diikuti dengan contoh kuantifikasi analit target dari metode ELISA tidak langsung dan sandwich.

Eksperimen pertama akan mendemonstrasikan cara menggunakan ELISA tidak langsung untuk menentukan keberadaan antibodi virus anti-influenza dalam serum yang diperoleh dari tikus yang terinfeksi influenza.

Untuk memulai, tambahkan 50 mikroliter antigen murni - dalam hal ini, 2 miligram per mililiter virus A/PR/8 Influenza A murni- ke setiap lubang pelat ELISA 96 lubang. Selanjutnya, tutup pelat dengan penutup perekat dan inkubasi semalaman pada suhu 4 derajat celsius untuk memungkinkan antigen mengikat pelat. Keesokan harinya, keluarkan larutan pelapis dengan menjentikkan piring di atas bak cuci. Selanjutnya, blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 mikroliter buffer pemblokiran - di sini, serum keledai 5% dalam 1X PBS - ke setiap sumur. Biarkan piring diinkubasi setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar.Setelah inkubasi, lepaskan buffer pemblokiran dan kemudian cuci piring dengan menambahkan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Jentikkan piring di atas bak cuci sekali lagi untuk menghapus cucian.

Kemudian, siapkan sampel uji dengan menambahkan 460 mikroliter PBS ke tabung baru, dan kemudian menambahkan 40 mikroliter serum untuk membuat pengenceran 1 hingga 12,5. Kemudian, tambahkan 300 mikroliter PBS ke tabung kedua, lalu tambahkan 100 mikroliter pengenceran pertama. Lanjutkan rentang pengenceran serial ini hingga diperoleh sampel akhir dengan pengenceran 1 hingga 204.800. Tambahkan sampel serum yang diencerkan secara serial dalam rangkap tiga ke sumur. Tutup piring dengan penutup perekat dan inkubasi pada suhu kamar selama satu jam. Selanjutnya, keluarkan sampel dengan cara menjentikkan pelat ke dalam bak cuci piring kemudian cuci piring dengan menambahkan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Sekali lagi, jentikkan piring untuk menghapus cucian.

Sekarang, tambahkan 100 mikroliter antibodi sekunder terkonjugasi enzim, yang dalam percobaan ini adalah horseradish peroxidase, atau HRP, sekunder anti-tikus keledai terkonjugasi, ke setiap sumur. Inkubasi piring selama satu jam pada suhu kamar, dan jentik piring untuk menghilangkan kelebihan cairan. Cuci piring dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 dan kemudian aplikasikan 100 mikroliter substrat indikator dengan konsentrasi satu miligram per mililiter ke setiap sumur. Inkubasi piring dengan substrat selama 5 sampai 10 menit pada suhu kamar. Dalam contoh ini, substrat tak berwarna 3,3', 5,5' - tetramethylbenzidine, atau TMB, berubah menjadi warna biru ketika HRP hadir. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 mikroliter asam sulfat 2N. Sampel akan berubah warna menjadi kuning.

Dalam waktu 30 menit setelah menambahkan stop solution, masukkan pelat ke dalam pembaca pelat mikro dan baca pelat pada panjang gelombang yang sesuai untuk substrat untuk menentukan absorbansi sumur.

Untuk memulai ELISA sandwich, pelat harus dilapisi dengan antibodi penangkap yang dimurnikan. Untuk melakukan ini, tambahkan 100 mikroliter antibodi penangkap pada konsentrasi dalam kisaran 1-10 mikrogram per mililiter, ke setiap lubang pelat ELISA 96 lubang. Selanjutnya, tutup pelat dengan penutup pelat perekat lalu inkubasi pelat semalaman pada suhu 4 derajat celsius. Setelah inkubasi, keluarkan larutan pelapis dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.

Sekarang, blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 mikroliter susu kering tanpa lemak 5% ke dalam sumur. Inkubasi piring pada suhu kamar selama minimal 2 jam. Selanjutnya, lepaskan buffer pemblokiran, lalu cuci sumur dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Hapus cucian dengan menjentikkan piring di atas bak cuci. Sekarang, tambahkan 100 mikroliter sampel uji ke dalam sumur, tutup pelat dengan penutup perekat, dan kemudian inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. Setelah inkubasi, keluarkan sampel dengan cara menjentikkan pelat di atas bak cuci lalu cuci sumur dengan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Jentik piring di atas bak cuci untuk menghapus cucian dan kemudian tambahkan 100 mikroliter antibodi deteksi terkonjugasi enzim ke sumur.

Tutup piring dengan penutup perekat. Biarkan piring untuk diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. Setelah inkubasi, lepaskan antibodi deteksi yang tidak terikat dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci dan cuci sumur dengan 200 mikroliter 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20. Selanjutnya, tambahkan 100 mikroliter substrat indikator pada konsentrasi 1 miligram per mililiter, dan inkubasi pelat selama 5 sampai 10 menit pada suhu kamar. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 mikroliter asam sulfat 2N ke dalam sumur dan kemudian baca pelat dalam waktu 30 menit setelah menambahkan larutan penghenti dalam pembaca pelat mikro.

Untuk melakukan ELISA kompetitif, pertama-tama lapisi lubang pelat ELISA 96-sumur dengan 100 mikroliter antigen murni pada konsentrasi 1-10 mikrogram per mililiter. Tutup pelat dengan penutup pelat perekat lalu inkubasi semalaman pada suhu 4 derajat celsius. Setelah ini, keluarkan larutan antigen yang tidak terikat dari sumur dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci.

Selanjutnya, blokir situs pengikatan protein yang tersisa di sumur yang dilapisi dengan menambahkan 200 mikroliter buffer pemblokiran ke setiap sumur- di sini, susu kering tanpa lemak 5% di PBS. Inkubasi piring setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar. Saat memblokir sumur, siapkan campuran antigen-antibodi dalam tabung 1,5 mililiter dengan menambahkan 150 mikroliter antigen sampel ke 150 mikroliter antibodi primer untuk setiap sumur dalam pengujian. Inkubasi campuran ini selama 1 jam pada suhu 37 derajat celsius. Sekarang, lepaskan buffer pemblokiran dari sumur dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci. Kemudian, cuci sumuran dengan 1X PBS yang mengandung Tween 20 lalu tambahkan 100 mikroliter sampel campuran antigen-antibodi primer.

Biarkan piring diinkubasi pada suhu 37 derajat celsius selama satu jam. Selanjutnya, keluarkan campuran sampel dengan menjentikkan pelat di atas bak cuci dan kemudian cuci sumur dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Tambahkan 100 mikroliter antibodi sekunder terkonjugasi enzim ke setiap sumur dan inkubasi pelat selama satu jam pada suhu 37 derajat celsius. Setelah ini, cuci piring dengan 1X PBS yang mengandung 1% Tween-20 dan kemudian tambahkan 100 mikroliter larutan substrat ke masing-masing sumur. Tunggu 5-10 menit. Setelah 10 menit, hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 100 mikroliter asam sulfat 2N dan kemudian ukur absorbansinya dalam pembaca pelat mikro dalam waktu 30 menit setelah penambahan stop solution.

Untuk uji ELISA tidak langsung semi-kuantitatif, keberadaan antibodi virus influenza A dalam sampel serum yang diencerkan secara serial dari tikus yang terinfeksi influenza A ditentukan dengan membaca absorbansi masing-masing sumur pada 405 nanometer di pembaca pelat. Data mentah ini diekspor ke spreadsheet untuk tujuan perhitungan. Dalam percobaan ini, sampel serum yang diencerkan secara serial, yang berkisar dari 1 - 12,5, hingga 1 - 204.800, diulang dalam rangkap tiga.

Untuk menganalisis data, nilai absorbansi rata-rata dihitung untuk setiap rangkaian rangkap tiga dengan menambahkan semua nilai untuk setiap pengenceran dan membagi jumlahnya dengan 3. Setelah rata-rata untuk setiap rangkaian rangkap tiga ditentukan, pembacaan OD450 rata-rata diplot terhadap pengenceran serial. Pembacaan OD menurun saat serum diencerkan, menunjukkan bahwa lebih sedikit antibodi ditemukan pada sampel yang lebih encer. Dalam sandwich kuantitatif ELISA, pengenceran standar yang diketahui, dalam hal ini TNFalpha Manusia rekombinasi, ditambahkan ke pelat 96-sumur dan dibaca bersama dengan sampel yang tidak diketahui.

Untuk membuat kurva standar, nilai absorbansi rata-rata untuk setiap rangkaian bacaan dari konsentrasi yang diketahui dihitung. Kemudian, nilai absorbansi rata-rata diplot pada sumbu y, terhadap konsentrasi protein yang diketahui pada sumbu x. Kurva yang paling cocok ditambahkan melalui titik-titik dalam grafik.

Setelah kurva standar dihasilkan, jumlah protein TNFalpha dalam sampel uji dapat ditentukan dengan terlebih dahulu menghitung nilai absorbansi rata-rata untuk sampel uji. Dalam contoh ini, sampel uji memberikan pembacaan OD450 sebesar 0,636 dan 0, 681. Menambahkan nilai-nilai ini dan membagi jumlah dengan 2 menghasilkan rata-rata 0,659. Dari sumbu y pada grafik kurva standar, perpanjang garis horizontal dari nilai absorbansi ini ke kurva standar. Pada titik perpotongan, perpanjang garis vertikal ke sumbu x dan baca konsentrasi yang sesuai yang, dalam sampel uji ini, sesuai dengan konsentrasi TNFalpha 38,72 pikogram per mililiter.


Pengantar

Fascioliasis (= fasciolosis) adalah penyakit zoonosis yang muncul di seluruh dunia yang disebabkan oleh infeksi trematoda dari genus Fasciola. Dua spesies utama dari genus ini, F. hati dan F. raksasa, bersifat patogen bagi manusia dan ternak [1]. Mengingat distribusi di seluruh dunia, F. raksasa adalah satu-satunya spesies yang ada di Afrika Barat, sedangkan F. hati merupakan satu-satunya spesies yang ada di Eropa, Amerika, Australia dan Magreb Afrika [2]. Namun, kedua spesies telah dilaporkan hidup berdampingan di Afrika Timur dan Selatan serta di beberapa wilayah Asia [3]. Keberadaan dua spesies dengan wilayah yang tumpang tindih memiliki implikasi untuk mengembangkan tes diagnostik yang sensitif untuk aplikasi umum.

Biasanya, diagnosis infeksi manusia dan hewan yang disebabkan oleh: Fasciola spesies dilakukan dengan teknik koproskopi atau imunologi, termasuk penentuan antigen yang bersirkulasi dalam serum, pengukuran koproantigen dan deteksi antibodi serum [4, 5]. Meskipun teknik koprologi menguntungkan dalam hal murahnya bahan laboratorium dan deteksi infeksi aktif, teknik ini memakan waktu, memerlukan tenaga ahli dan memiliki sensitivitas yang buruk. Metode serologis memiliki keuntungan memungkinkan otomatisasi yang mudah, yang sangat menarik untuk menangani sampel dalam jumlah besar. Metode ini juga sangat sensitif dan dapat digunakan untuk pemantauan dini Fasciola infeksi pada ternak dengan menggunakan sampel serum atau susu [6]. Namun, teknik ini tidak membedakan antara antibodi yang diinduksi oleh infeksi/reinfeksi saat ini dan yang masih ada pada hewan atau manusia yang berhasil diobati dengan anthelmintik selama masa lalu. Fasciola infeksi. Metode untuk mendeteksi sirkulasi Fasciola antigen dan/atau koproantigen memecahkan masalah yang disebutkan di atas terkait dengan teknik koprologi dan serologi. Namun, deteksi koproantigen lebih disukai karena pengambilan sampel tidak invasif dan keberadaan antigen dalam tinja tidak dibatasi oleh waktu, seperti yang mungkin terjadi pada antigen yang bersirkulasi. Selain itu, metode ini memiliki aplikasi yang luas, karena teknik yang sama dapat digunakan untuk mendeteksi Fasciola coproantigens dalam sampel tinja dari manusia dan spesies hewan.

Dalam beberapa dekade terakhir, beberapa metode ELISA penangkapan yang menggunakan antibodi monoklonal dan/atau poliklonal dilaporkan mampu mendeteksi sejumlah kecil spesies spesifik. Fasciola koproantigen dalam sampel tinja [7-10]. Namun, sejak itu, hanya kit BIO K 201 (BIO X Diagnostics, Belgia), yaitu versi komersial MM3-COPRO ELISA [9], yang telah digunakan secara global. Sejak dikomersialkan (pada 2007), kedua versi tes telah diakui sebagai alat diagnostik yang berharga untuk mendeteksi Fasciola infeksi atau untuk memantau kemanjuran pengobatan dengan anthelmintik dalam beberapa penelitian [9-16]. Namun demikian, selama bertahun-tahun penggunaan tes MM3-ELISA, dua kelemahan juga telah disorot: i) kesulitan dengan tes komersial [17-20], yang menggunakan avidin-horseradish peroxidase (HRP) sebagai konjugat sekunder, dalam mempertahankan sensitivitas tes MM3-COPRO in-house asli, dan ii) ketergantungan tes MM3-COPRO in-house pada batch tertentu antibodi IgG anti-tikus berlabel HRP, untuk menghasilkan sensitivitas dan spesifisitas yang baik. Untuk mencegah kerugian ini dan untuk menjamin produk yang homogen dan sangat sensitif, kami menyelidiki kemungkinan penggantian reagen sekunder di atas dengan sistem deteksi HRP (PolyHRP) terpolimerisasi streptavidin (SA) dan mengevaluasi kondisi penggunaan reagen ini. Kami menemukan bahwa sistem peningkatan ELISA ini merupakan peningkatan pada reagen sekunder klasik karena meningkatkan sensitivitas tes ELISA di atas sambil memungkinkan pengurangan waktu inkubasi yang diperlukan.


1. Perkenalan

Sindrom pernapasan akut yang parah yang disebabkan oleh coronavirus 2 (SARS-CoV-2) telah berdampak parah pada peradaban kita - melintasi negara-negara, mengakibatkan kerugian besar bagi ekonomi dunia, dan nyawa yang berharga. Deteksi dini infeksi melalui skrining massal masyarakat sangat penting dalam membatasi penyebaran virus karena semakin banyak bukti menunjukkan penyebaran infeksi oleh individu tanpa gejala penyebaran infeksi oleh individu tanpa gejala (Hogan et al., 2021 Yu et al., 2020). (Hogan et al., 2021). Informasi tersebut juga penting untuk menentukan kebijakan kesehatan masyarakat yang efektif (Hinchman et al., 2020). Beberapa metode sedang dikembangkan untuk mendeteksi infeksi SARS-CoV-2. Metode ini bergantung pada deteksi asam nukleat virus menggunakan RT-PCR, LAMP, SHERLOCK ( Broughton et al., 2020 Esbin et al., 2020 Park et al., 2020 Shen et al., 2020 ), antigen virus ( Mak et al. al., 2020 Porte et al., 2020 ) atau respon imun pejamu terhadap infeksi (ELISA, tes diagnostik cepat berbasis antibodi) (Kontou et al., 2020 Petherick, 2020 ). Masing-masing tes ini memiliki jendela utilitas dan pemanfaatannya sendiri. Misalnya, asam nukleat dan tes berbasis antigen berguna untuk mendeteksi infeksi aktif sementara tes berbasis antibodi dapat mengidentifikasi paparan virus dan dapat menunjukkan adanya antibodi pelindung (Manners et al., 2020).

Horseradish-peroxidase-mimicking DNAzyme (HRPzyme) adalah sekuens DNA pendek yang terdiri dari sekuens kaya guanin (G), yang terlipat menjadi struktur G-quadruplex yang distabilkan setelah membentuk kompleks dengan hemin (Travascio et al., 1998). HRPzyme mampu mengkatalisis peroksidasi berbagai substrat HRP seperti 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) dan 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ( ABTS) dengan adanya H2HAI2 memberikan pembacaan kolorimetri. Urutan HRPZyme yang pendek memungkinkan kemungkinan integrasi primer sedemikian rupa sehingga urutan HRPZyme fungsional hanya terbentuk setelah amplifikasi yang berhasil dari wilayah genom target. Berbagai uji berbasis HRPZyme dan G-quadruplex ( Xi et al., 2020 ) sebelumnya telah dikembangkan untuk mendeteksi patogen seperti Stafilokokus aureus (Mondal et al., 2018), Salmonella enterica Typhimurium (Kim et al., 2018), norovirus (Batule et al., 2018) dan bahkan coronavirus (Anantharaj et al., 2020) Namun sensitivitasnya yang rendah menghambat aplikasi pada manusia. Di sini kami melaporkan penggunaan urutan HRPZyme yang dimodifikasi ( Li et al., 2016 ) dengan sensitivitas yang ditingkatkan untuk mendeteksi infeksi SARS-CoV-2 pada sampel manusia. HRPZyme Assisted Recognition of Infection by Optical Measurement (HARIOM) menawarkan keuntungan ganda - spesifisitas PCR dan peningkatan sensitivitas reaksi yang dikatalisis enzim. Fitur penting lainnya dari sistem ini termasuk ketahanannya, persyaratan pengetahuan teknis minimal dan penggunaan reagen murah, sehingga ideal untuk digunakan dalam pengaturan sumber daya rendah dan untuk pemutaran massal.

Karena HARIOM memanfaatkan kekuatan aktivitas enzimatik oligo-embedded, ia menawarkan kemungkinan efek aditif dari amplifikasi simultan beberapa transkrip dalam sampel yang sama, sehingga meningkatkan sensitivitas lebih lanjut. Kami menunjukkan hal yang sama dengan menggunakan primer yang menargetkan ORF-1ab dan gen-N dalam reaksi pot tunggal. Pengujian tersebut mampu mendeteksi 102 salinan RNA virus seperti yang ditentukan oleh spiking salinan RNA virus dalam sampel air liur. Selanjutnya, kami memvalidasi metode kami pada sampel pasien COVID-19 dari swab nasofaring atau swab oral. Kami menemukan kesesuaian yang cocok dengan hasil RT-PCR dan TrueNAT 2-gen dan, dengan demikian kami percaya bahwa HARIOM dapat menjadi alat yang berharga untuk mendeteksi infeksi SARS-CoV-2.


Eksperimen ELISA Berbasis Tabung Tes Sederhana untuk Kelas SMA*

Imunologi menjadi terkenal baik di media maupun dalam ujian Penempatan Lanjutan (AP) dalam Biologi. Salah satu tantangan dalam mengajar topik biologi modern seperti imunologi dan biokimia di sekolah menengah adalah meningkatnya ketergantungan pada teknologi mahal di dunia penelitian. Untuk mulai menjembatani kesenjangan yang melebar ini, kami merancang eksperimen menggunakan uji imunosorben terkait-enzim skala makro baru yang cocok untuk kelas biologi sekolah menengah tingkat AP serta laboratorium perguruan tinggi tingkat pemula. Metode baru ini tidak memerlukan pembaca pelat untuk analisis data, melainkan mengandalkan peralatan yang lebih umum dan murah seperti sentrifus tabung uji klinis dan spektrofotometer tabung reaksi sederhana. Rencana eksperimen berfokus pada siswa yang mengukur konsentrasi antibodi dalam sampel ȁtidak diketahui” dan mencakup pengumpulan dan analisis kurva standar menggunakan reagen yang disiapkan oleh instruktur. Siswa akan diperkenalkan dengan tindakan enzim, teknik laboratorium kuantitatif, antibodi, dan sistem kekebalan, dengan tujuan keseluruhan untuk mengeksplorasi dan menyoroti hubungan yang melekat dalam bidang biokimia dan imunologi.

Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) adalah teknik biokimia yang dirancang untuk secara kuantitatif mendeteksi sejumlah kecil molekul termasuk protein, hormon, dan antibodi yang awalnya dikembangkan oleh Perlmann dan rekan kerjanya pada awal 1970-an [1]. Meskipun ada beberapa variasi dalam bagaimana hal ini dilakukan (misalnya, ELISA langsung vs. sandwich ELISA), ELISA tetap menjadi teknik dasar yang sangat umum baik di laboratorium klinis [2𠄵] dan investigasi [6, 7]. Di klinik, dan bahkan di rumah, ELISA adalah dasar untuk sejumlah diagnostik molekuler. Di rumah, ini termasuk strip tes kehamilan yang mendeteksi human chorionic gonadotropin dan strip tes kesuburan yang mendeteksi hormon luteinizing dalam urin. Di dalam klinik, ELISA berperan penting dalam mendeteksi sejumlah biomarker penyakit. Ada ratusan contoh, termasuk antigen spesifik prostat (PSA) yang ditemukan pada pasien kanker prostat [2, 3], antibodi anti-nuklear (ANA) pada pasien Lupus [4], dan glikoprotein 120 (GP120) pada permukaan sel. human immunodeficiency virus pada pasien AIDS [5]. Dengan demikian, metode ELISA ada di mana-mana dalam kehidupan hampir semua orang dan karena itu berfungsi sebagai platform yang luar biasa untuk latihan laboratorium di tingkat sekolah menengah.

Dalam ELISA langsung, antigen target biasanya diimobilisasi ke pelat mikrotiter 96-sumur melalui reaksi kimia yang menghasilkan perlekatan kovalen antigen, paling sering protein, melalui gugus amino bebas. Deteksi kemudian dilakukan dalam tiga langkah sederhana, yang meliputi pemeriksaan sumur tersalut dengan antibodi primer spesifik untuk antigen target, pemeriksaan antibodi terikat menggunakan antibodi sekunder spesifik untuk daerah konstan antibodi primer, dan kemudian deteksi menggunakan sejumlah pilihan. Antibodi sekunder biasanya terkonjugasi ke lobak peroksidase atau alkaline phosphatase. Enzim-enzim ini kemudian mudah dideteksi menggunakan reaksi substrat kolorimetri, sehingga memperkuat sinyal dan memberikan teknik tersebut dengan namanya: enzim-linked. Perubahan warna kemudian dianalisis dalam pembaca pelat yang dilengkapi untuk mendeteksi perubahan absorbansi sebagai ukuran konsentrasi antibodi target atau primer.

ELISA dilakukan di piring untuk memfasilitasi analisis sejumlah besar sampel dan pengenceran antibodi primer. Standar yang diketahui, biasanya dalam rangkap tiga, diperlukan setiap kali pengujian dilakukan untuk menghasilkan kurva standar absorbansi linier versus antigen atau konsentrasi antibodi yang kemudian digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang tidak diketahui berdasarkan nilai absorbansinya. Oleh karena itu, penyelesaian ELISA bergantung pada pemahaman dasar tentang pengikatan dan spesifisitas protein, kerja enzim, kimia dasar, dan fungsi antibodi.

Salah satu variasi dalam ELISA dapat berupa antigen target konstan yang dilapisi pada pelat, tetapi dengan antibodi yang tidak diketahui dari sampel pasien. Tes ANA berfungsi sebagai contoh yang tepat karena tujuannya adalah untuk mendeteksi antibodi spesifik dalam aliran darah pasien daripada target antibodi tersebut [8]. Dengan demikian, antigen yang diimobilisasi pelat tetap konstan, dan faktor yang tidak diketahui menjadi konsentrasi antibodi. Pengaturan ini adalah dasar untuk latihan laboratorium ini.

Keterbatasan paling umum untuk ruang kelas sekolah menengah adalah peralatan untuk melakukan metode eksperimental modern. Dalam kasus ELISA, pembaca piring diperlukan, yang harganya ribuan dolar dan jauh di luar jangkauan sebagian besar anggaran sekolah menengah. Hal ini menyebabkan simulasi berbasis web yang berguna tetapi kurang memuaskan untuk menggambarkan bagaimana ELISA dilakukan. Dalam manuskrip ini, kami menggambarkan ELISA makroskala baru yang hanya mengandalkan sentrifus tabung reaksi gaya klinis dan spektrofotometer bilik tunggal dasar yang mampu membaca absorbansi pada 450 nm. Kompleks histokompatibilitas utama kelas II (MHCII) diimobilisasi ke partikel resin sebagai pengganti pelat ELISA mikrotiter tipikal, yang memungkinkan semua inkubasi dan pengumpulan data berikutnya berlangsung dalam tabung reaksi kaca. Pengenceran standar dan ȁtidak diketahui” dari antibodi monoklonal anti-MHCII (mAb) berfungsi sebagai sampel eksperimental, dan deteksi dilakukan melalui antibodi sekunder terkonjugasi horseradish peroxidase (HRP) standar. Kami melaporkan hasil dari kelas Biologi Penempatan Lanjutan (AP) sekolah menengah, yang menunjukkan efektivitas dan pengampunan protokol di tangan siswa yang tidak berpengalaman. Latihan laboratorium ini berhasil mengintegrasikan keterampilan laboratorium dasar seperti sentrifugasi, teknik mikropipet, dan spektrofotometri dengan pengenalan konsep kunci dalam bidang kurikulum Biologi AP kritis seperti biokimia interaksi molekuler, antibodi, dan aksi enzim dalam konteks respons imun.