Informasi

Penjelasan protokol dalam percobaan ekstraksi DNA

Penjelasan protokol dalam percobaan ekstraksi DNA


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Di bagian Bahan dan Metode dari makalah ini tentang ekstraksi dan analisis DNA dari rambut Saya tidak mengerti beberapa bagian dari metode protokol mereka. Secara khusus:

“Larutan rambut yang dicerna kemudian diekstraksi dua kali dengan dua volume fenol jenuh oleh buffer Tris-EDTA (TE) (Sigma), dan sekali dengan dua volume kloroform.”

Bagaimana volume fenol dan kloroform berperan? Saya tahu mereka digunakan untuk ekstraksi pelarut organik, tetapi apa prosedur sebenarnya yang digunakan, yaitu, langkah-langkah untuk menambahkan setiap bahan kimia?

Pertanyaan lain yang saya miliki adalah tentang buffer yang mereka gunakan:

"0,01 M Tris-HCL(ph8), 0,005 M EDTA, 0,1 M NaC1, 0,039 M DTT, 2% SDS"

Seluruh kombinasi itu akan menjadi "buffer Tris" lalu ya? Dan proteinase K kemudian akan ditambahkan ke beberapa buffer ini untuk mencerna rambut?


Solusi DNA memiliki volume tetap (misalnya, 0,1 mL). Ke dalam tabung reaksi yang sesuai ditambahkan 0,2 mL fenol jenuh dapar. Setelah menutup tabung reaksi, campuran dicampur dengan baik, biasanya menggunakan mixer vortex, tetapi mungkin dengan hati-hati, inversi berulang. Fase air dan fase organik hampir tidak dapat bercampur. Tabung disentrifugasi untuk mempercepat kesetimbangan, dan memusatkan protein terdenaturasi pada antarmuka. Setelah sentrifugasi lapisan air dengan hati-hati dipindahkan ke tabung reaksi baru.

Itu adalah salah satu ekstraksi organik. Ini diulangi dengan alikuot segar fenol jenuh-buffer (0,2 mL lainnya). Kemudian fasa air dituang kembali dan diekstraksi dengan 0,2 mL CHCl3.

Menurut resep yang Anda berikan, fenol jenuh penyangga dibeli dari vendor (Sigma-Aldrich Chemicals, dari St. Louis, Missouri, AS), sehingga Anda dapat mencari bahan dan komposisi di katalog online mereka (tidak diragukan lagi) .

Resep buffer yang Anda berikan adalah buffer pencernaan proteinase K. Ini biasanya dilakukan pada suhu tinggi.

Protokol ini dirancang untuk mengisolasi DNA dari inti sel rambut. Separuh isi nukleus eukariotik sepenuhnya adalah protein kromosom, berdasarkan massa, sehingga langkah pencernaan proteinase K tidak hanya membuka sel-sel rambut, tetapi juga membantu membuang semua protein seluler dan inti yang tidak diinginkan yang mencemari.


Penjelasan protokol dalam percobaan ekstraksi DNA - Biologi

  • potongan bawang bombay (kurang lebih 10 gram)
  • 2 tabung reaksi besar
  • lesung & alu
  • gelas ukur (10 atau 50 ml)
  • Gelas gelas 500 ml, atau toples mason
  • tusuk sate kabob bambu
  • jaring nilon, atau jaring celup kecil
  • corong
  • pisau dapur kecil (atau pisau cukur bermata satu)
  • etanol dingin
  • mandi es (satu per kelas mungkin cukup)
  • Larutan deterjen = 1 bagian garam meja + 1 bagian konsentrat sampo generik + 8 bagian air
  • Larutan enzim = 1 bagian bubuk pelunak daging + 19 bagian air

Petunjuk : Tulis catatan rinci tentang apa yang Anda lihat dan lakukan pada setiap langkah di bawah ini.

1) Ambil sepotong kecil bawang bombay (sekitar 10 cm 3 ) dan potong menjadi kubus kecil (< 1 mm 3 )

2) Tempatkan bawang cincang ke dalam mortar dan giling secara menyeluruh dengan alu.

3) Tambahkan sekitar 10 ml larutan deterjen dan giling kembali.

4) Saring campuran melalui jaring ke dalam tabung reaksi besar.

5) Tambahkan sekitar 3-4 ml larutan enzim ke dalam tabung reaksi.

6) Biarkan campuran berdiri dalam gelas air panas selama 10 menit.

7) Tempatkan tabung reaksi Anda dalam penangas es untuk mendinginkan selama beberapa menit.

8) Tuang 10 ml etanol dingin dengan hati-hati ke dalam tabung reaksi untuk membentuk lapisan terpisah di atasnya. (Anda akan melihat gumpalan kecil gel terbentuk di perbatasan.)

9) Menggunakan tusuk sate bambu, gulung perlahan DNA yang mengendap. Tunjukkan pada instruktur Anda untuk memverifikasi bahwa Anda memiliki DNA.

Mengapa? DNAnya panjang dan tipis sehingga membungkus tusuk gigi seperti spageti di atas garpu!

10) Satu pertanyaan terakhir untukmu. Mengapa semua penggilingan dan pemotongan itu tidak menghancurkan DNA?

DNA sangat kecil dan digulung begitu erat oleh protein histon sehingga lolos dari sebagian besar perlakuan fisik. Setelah dilepaskan dari histon oleh larutan enzim, ia terurai menjadi untaian panjang dan menjadi jauh lebih rapuh.


Protokol: Ekstraksi DNA

Saya memulai hampir semua eksperimen saya dengan prosedur yang sama: mengekstraksi DNA rekombinan dari E. coli. Dalam penelitian saya, saya mengubah urutan DNA untuk membuat obat yang menargetkan jenis sel tertentu dalam tubuh manusia. Sebagai seorang insinyur biologi, saya menjahit potongan gen menjadi potongan melingkar DNA (plasmid) untuk membuat jalur seluler baru. Meskipun banyak protokol yang saya gunakan di lab membutuhkan waktu lama dan memiliki tingkat kegagalan yang tinggi, ekstraksi DNA sederhana, bekerja 99% dari waktu, dan membutuhkan waktu kurang dari 30 menit.

Membuat plasmid baru adalah proses berulang. Saat saya menambahkan setiap bagian baru ke plasmid saya, saya memindahkan DNA masuk dan keluar dari E. coli sel. Sel bertindak baik sebagai penyimpanan hidup dan mesin Xerox kecil, mereproduksi DNA dan mengisi sel dengan salinan yang akan saya gunakan pada langkah proses selanjutnya. Saya mengekstrak DNA, memotong dan menempelkan gen baru ke dalam plasmid, dan memasukkannya kembali ke dalam set sel baru. Akhirnya saya akan memanen plasmid lengkap dari E. coli dan mentransfernya ke dalam ragi atau sel hewan.

Di bawah ini adalah protokol umum untuk mengekstraksi DNA plasmid dari E. coli sel bakteri. Tujuan keseluruhannya adalah untuk memisahkan plasmid yang diinginkan dari komponen seluler lainnya (RNA, protein, DNA kromosom, dll.).

    Saya bisa mulai dari bakteri yang tumbuh di cawan petri, atau dari botol bakteri yang disimpan pada -80 derajat Celcius. E. coli yang mengandung plasmid rekombinan biasanya disimpan beku dalam gliserol, yang berfungsi sebagai krioprotektan—sama seperti makanan beku, kita tidak ingin bakteri kita terkena freezer burn. Dengan menggunakan tusuk gigi steril, saya mengambil sedikit bakteri beku dan memasukkannya ke dalam tabung reaksi yang berisi Lysogeny Broth (LB sering disebut sebagai kaldu Luria atau kaldu Luria-Bertani, menurut para ilmuwan yang mengembangkan mediumnya). LB adalah makanan yang kaya untuk bakteri yang memberi mereka semua blok bangunan protein yang mereka butuhkan untuk tumbuh.

Devin Burrill adalah rekan postdoctoral di Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering di Harvard University. Penelitiannya saat ini berfokus pada rekayasa obat yang ditargetkan untuk mengobati anemia, penyakit autoimun, dan infeksi virus.


Mengekstraksi DNA Menggunakan Manik-manik Magnetik

Penangkapan manik-manik magnetik adalah metode terbaru untuk mengekstraksi DNA. Isolasi DNA whole blood menggunakan manik-manik magnetik bekerja dengan menangkap DNA pada manik-manik magnetik yang dilapisi dengan matriks silika untuk mengikat asam nukleat.

Seperti metode kimia presipitasi, seluruh sel darah terlebih dahulu harus dilisiskan menggunakan SDS atau deterjen serupa. Langkah selanjutnya melibatkan campuran sel yang lisis dan manik-manik magnetik, memungkinkan DNA untuk mengikat manik-manik.

Beberapa putaran pencucian dengan adanya medan magnet kemudian memisahkan DNA yang ditangkap pada manik-manik magnetik dari kontaminan seluler lain yang tidak terikat. Kemudian, buffer rendah garam mengelusi DNA dari manik-manik.

Beberapa penelitian, termasuk ulasan oleh Carpi dkk., menunjukkan bahwa manik-manik magnetik dapat menjadi metode tercepat. 1 Namun, kecepatan ini ada harganya—baik secara moneter maupun untuk hasil dan kemurnian DNA Anda. 2 Pendekatan manik-manik magnetik dapat menghasilkan pengurangan hingga 20% pada hasil DNA Anda. Selain itu, setiap sisa manik magnetik mencemari sampel DNA Anda dan mengganggu aplikasi hilir. Terakhir, ini adalah metode yang paling mahal karena memerlukan dudukan penangkap magnet, pelat, dan manik-manik magnet.


Tantangan Pengajaran #1: Bagaimana cara mengembangkan rutinitas dan prosedur untuk mendukung siswa bekerja secara mandiri di kelas sains?

Tantangan Pengajaran #2: Bagaimana saya dapat mengembangkan budaya kelas yang mendorong keterlibatan siswa, rasa ingin tahu, dan keinginan untuk memahami dunia melalui eksplorasi ilmiah?

Kedua tantangan yang saling terkait ini mungkin tidak sepenuhnya diselesaikan atau ditaklukkan oleh kegiatan ini, namun kegiatan ini mewakili beberapa langkah sepanjang perjalanan sepanjang tahun (di mana saya bisa menemani siswa) dan melampaui kelas saya. Saya berharap pengalaman ini membangun rasa kemandirian dan rasa ingin tahu yang lebih besar saat mereka dewasa.

Daripada memulai dari awal, yang hanya akan menyebabkan sejumlah tatapan tercengang dan keheningan canggung di antara kelas, saya mengarahkan siswa untuk menggunakan Tempate Lab Ekstraksi DNA dan tautan yang disediakan. Dengan sedikit perancah ini, siswa akan mempelajari protokol (per sumber daya online yang disediakan) dan mendiskusikan prosesnya dalam tim mereka. Dengan kata lain, "apa yang diperlukan bagi mereka untuk benar-benar melakukan ini ketika mereka diberi lampu hijau untuk pergi?"

Dalam benak saya, saya membayangkan mereka sebagai pasukan terjun payung yang menunggu di ambang pintu pesawat kargo C-17 menunggu "lampu hijau" yang memicu respons pertarungan atau penerbangan yang tak terhindarkan. Saya harap persiapan hari ini akan membuat mereka bersemangat untuk mengambil lompatan besok daripada bergegas sejauh mungkin dari pintu! Konsep template lab ini cukup standar di kelas saya dan dapat dieksplorasi sedikit lebih banyak dari salah satu pelajaran saya sebelumnya.

Selanjutnya, siswa akan menyetujui langkah-langkah spesifik yang akan dilakukan setiap anggota untuk kinerja tim yang adil dan seimbang (pada Hari #2). Mereka kemudian akan menulis protokol (berdasarkan tautan web) yang berfokus pada langkah-langkah tertentu dan siswa dalam tim yang akan melakukan langkah-langkah tersebut.


Korelasi dengan Standar Kota New York

S2a- Siswa mendemonstrasikan pemahaman tentang sel.

S4d- Siswa menghasilkan bukti yang menunjukkan pemahaman tentang dampak teknologi seperti kendala dan trade-off umpan balik manfaat dan risiko dan masalah dan solusi.

S5c- Siswa menggunakan bukti dari sumber terpercaya untuk mengembangkan deskripsi, penjelasan, dan model.

S6a- Siswa menggunakan teknologi dan alat untuk mengamati dan mengukur benda, organisme, dan fenomena, secara langsung, tidak langsung, dan jarak jauh, dengan pertimbangan ketelitian dan ketepatan yang tepat.


DNA paling larut dalam fase air

Jadi apa hubungannya ini dengan pemisahan DNA dan protein?

Secara umum, senyawa polar (bermuatan) paling baik larut dalam pelarut polar dan molekul non-polar paling baik larut dalam pelarut yang kurang polar atau non-polar.

DNA adalah molekul polar karena muatan negatif pada tulang punggung fosfatnya, sehingga sangat larut dalam air dan kurang larut dalam fenol. Ini berarti bahwa ketika air(+DNA +protein) dan fenol dicampur dalam protokol, DNA tidak larut dalam fenol, tetapi tetap dalam fase air.


Hasil

Perbandingan dengan Darah

Sampel darah dan feses yang berpasangan menghasilkan genotipe identik untuk kedua ulangan semua sampel dengan pengecualian dua lokus multipleks (AE16 dan MAF65) dari satu individu yang memberikan genotipe yang konsisten, tetapi berbeda untuk kedua ulangan. Dua PCR ulangan tambahan untuk DNA darah dan feses semuanya cocok dengan hasil dari DNA feses pada percobaan pertama, yang menunjukkan bahwa DNA dari darah menghasilkan alel palsu pada percobaan pertama. Salah satunya berasal dari sumur yang menunjukkan kekeringan yang mencolok. Kedua lokus ini sebelumnya telah menunjukkan kecenderungan kadang-kadang untuk mengamplifikasi alel palsu yang merupakan alel yang ada dalam populasi yang diteliti.

Eksperimen Ekstraksi DNA Feses

Bahan pelet luar menghasilkan hasil yang baik secara konsisten. Hanya ketika bahan pelet luar diturunkan menjadi 15 mg, hasil mulai menunjukkan penurunan keberhasilan PCR yang mencolok (Gambar 1). Untuk tiga perlakuan yang menggunakan 60mg bahan pelet luar (dua langkah ekstraksi ekstra dihilangkan), 8 dari 12 sampel menghasilkan skor indeks PCR sempurna empat dan hanya 15 dari 576 total amplifikasi yang tergolong kurang baik. Dari 15 tersebut, 13 adalah puncak terbalik dan dua sisanya berasal dari satu reaksi multipleks yang mungkin disebabkan oleh kondisi reaksi yang tidak tepat daripada jumlah template DNA. Penurunan jumlah bahan pelet luar menghasilkan penurunan keberhasilan PCR yang kecil namun terukur, terutama pada 15 mg, ( Gambar 1 P = 0,022 untuk 60 mg versus 15 mg, P = 0,061 untuk 60 mg versus 30 mg ANOVA dengan amplifikasi yang baik).

Ketinggian puncak menunjukkan pola variasi yang agak berbeda untuk perlakuan yang melibatkan bahan pelet luar (Gambar 2) nilai untuk 30 mg dan 15 mg keduanya lebih rendah dibandingkan dengan 60mg (P < .001), tetapi tidak berbeda satu sama lain (P = 1.000).

Ada perbedaan yang jelas dalam nilai indeks PCR di antara bahan pelet yang berbeda yang digunakan ketika semua perlakuan dibandingkan (Gambar 1) P < .001 untuk semua perbandingan Tes G untuk proses ekstraksi penuh) Keberhasilan amplifikasi PCR berbanding terbalik dengan proporsi bahan pelet bagian dalam yang digunakan. Penggunaan bahan pelet bagian dalam memiliki efek yang sama pada indeks ketinggian puncak ( Gambar 2 P < .001 untuk semua perbandingan untuk proses ekstraksi penuh).

Prosedur ekstraksi yang berbeda untuk bahan pelet luar tidak menghasilkan perbedaan yang signifikan untuk hasil PCR (P = .177 ANOVA dari jumlah hasil yang baik). Indeks ketinggian puncak juga menunjukkan tidak ada efek dari memperpanjang presipitasi etanol (P = 1.000), tetapi menunjukkan penurunan yang mencolok ketika pemukulan manik juga dihilangkan (Gambar 2 P = 0,013 relatif terhadap proses penuh dan 0,021 relatif tanpa perpanjangan presipitasi etanol). Ketika sampel digabungkan untuk setiap perlakuan yang melibatkan bahan pelet utuh, pola tersebut menyarankan perbaikan pada hasil PCR dari langkah ekstraksi tambahan (Gambar 1), dan uji G untuk ketiga perlakuan adalah signifikan (P = .006). Namun, di mana setiap bahan pelet bagian dalam dimasukkan dalam ekstraksi DNA, empat sampel individu menunjukkan pola yang sangat bervariasi untuk perawatan yang berbeda, termasuk satu sampel (INY 1-15) yang langkah ekstraksi tambahannya secara substansial menurunkan keberhasilan PCR, PCR tertinggi keberhasilan untuk sampel itu termasuk pemukulan manik (Gambar 3), menunjukkan efek interaksi antara pemukulan manik dan presipitasi alkohol yang diperpanjang. Karena variasi yang luas di antara sampel, ANOVA jumlah hasil yang baik membandingkan prosedur ekstraksi untuk bahan pelet utuh tidak signifikan (P = 0,474). Sebaliknya, ketinggian puncak menghasilkan perbedaan yang signifikan untuk perbandingan dengan proses ekstraksi penuh untuk bahan pelet utuh (Gambar 2 P = 0,012 untuk proses penuh versus tidak ada perpanjangan presipitasi etanol dan P < 0,001 untuk proses penuh versus tidak ada perpanjangan presipitasi etanol atau pemukulan manik-manik) tetapi dua prosedur ekstraksi yang diubah tidak berbeda satu sama lain (P = .151).

Indeks PCR untuk perawatan yang melibatkan bahan pelet utuh dan dalam dengan sampel. Perlakuan untuk setiap sampel dari kiri ke kanan adalah: pelet utuh, pelet utuh proses penuh, tidak ada perpanjangan pelet presipitasi etanol, tidak ada pemukulan manik atau presipitasi etanol diperpanjang dan pelet dalam, proses penuh.

Indeks PCR untuk perawatan yang melibatkan bahan pelet utuh dan dalam dengan sampel. Perlakuan untuk setiap sampel dari kiri ke kanan adalah: pelet utuh, pelet utuh proses penuh, tidak ada perpanjangan pelet presipitasi etanol, tidak ada pemukulan manik atau presipitasi etanol diperpanjang dan pelet dalam, proses penuh.

Hasil PCR juga menunjukkan variasi yang cukup besar di antara sampel di mana hanya bahan pelet bagian dalam yang digunakan (Gambar 3). Akibatnya, sementara ANOVA hasil PCR yang baik membandingkan tiga bahan pelet yang berbeda adalah signifikan (P = 0,008), satu-satunya perbedaan posthoc yang signifikan adalah pelet luar versus pelet utuh (P = .008).

Nilai indeks PCR yang rendah untuk proses ekstraksi penuh bahan pelet utuh untuk sampel INY 1–15 (Gambar 3) diidentifikasi dalam ANOVA dengan hasil yang baik sebagai outlier statistik. Akibatnya, dua ekstraksi ulangan tambahan dari bahan pelet utuh dilakukan untuk sampel ini bersama dengan PCR yang sama. Kedua replikasi DNA ekstraksi menghasilkan nilai indeks PCR yang mendekati yang pertama (1,54, 1,56, dan 1,62). Pencilan statistik ini tampaknya mewakili informasi penting daripada kebisingan. Selain itu, kedekatan nilai indeks PCR di antara ketiga ulangan tersebut menunjukkan bahwa indeks ini merupakan ukuran keberhasilan PCR yang sensitif dan konsisten.

Pengendapan alkohol yang diperluas yang tergabung dalam proses ekstraksi DNA lengkap kami tidak hanya tidak konsisten dalam pengaruhnya terhadap hasil PCR, tetapi juga meningkatkan varians di antara sampel dalam indeks ketinggian puncak untuk bahan pelet luar dan utuh (Gambar 2). Untuk bahan pelet luar, varians yang meningkat ini disebabkan oleh penurunan yang mencolok dalam indeks tinggi puncak untuk sampel yang berbeda (B76-8) daripada yang terpengaruh untuk bahan pelet utuh. Secara keseluruhan, indeks tinggi puncak menunjukkan hubungan asimtotik dengan indeks PCR (Gambar 2).


Eksperimen Ekstraksi DNA Bawang

Kata pengantar
Dalam percobaan ini digunakan bawang bombay, hal ini dikarenakan bawang bombay memiliki kandungan pati yang rendah sehingga DNA dapat terlihat dengan jelas. Garam melindungi ujung negatif DNA fosfat, memungkinkan ujungnya mendekat sehingga DNA dapat mengendap dari larutan alkohol dingin. Deterjen menyebabkan membran sel rusak dengan melarutkan lipid dan protein dari sel dan mengganggu ikatan yang menyatukan membran sel. Deterjen kemudian membentuk kompleks dengan lipid dan protein, menyebabkan mereka mengendapkan larutan Bawang bombay (alium cepa)

Peralatan dan bahan
etanol 95%.
Termometer
Piring.
Gelas pengukur.
gelas bekaer 1000 ml.
Corong.
Saring
Tabung reaksi
Freezer
Piring panas dengan bak mandi
Es batu.
Sendok
Sabun cuci piring atau sampo
Garam dapur, baik yang beryodium maupun tidak beryodium
Air sulingan
bawang besar
Blender dan pisau untuk memotong bawang.
Timer atau jam

3. Tambahkan air suling ke dalam gelas kimia hingga volume akhir 100 mL. Larutkan garam sambil diaduk perlahan agar tidak berbusa.

4. Potong satu bawang bombay besar dengan pisau lalu blender dan masukkan ke dalam gelas beaker 1000 ml


6. Masukkan gelas 1000 mL larutan DNA ke dalam penangas air panas pada suhu 55-60 ° C, seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah, selama 10-12 menit.

8. Dinginkan campuran dalam penangas air es, sekitar 4 ° C, seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah, selama 5 menit. Dalam proses ini, tekan campuran DNA bawang bombay ke sisi gelas dengan sendok ke belakang. Langkah ini memperlambat kerusakan DNA.



10. Keluarkan larutan DNA bawang merah ke dalam tabung reaksi kurang lebih 5 ml. Solusi dapat disimpan di lemari es selama sekitar satu hari sebelum digunakan dalam langkah-langkah berikut.

11. Ambil larutan etanol 95% dingin dari freezer dan tambahkan ke dalam tabung reaksi untuk membuat lapisan etanol di atas sekitar 1 sentimeter (cm). Untuk hasil terbaik, etanol harus sedingin mungkin. Etanol dapat ditambahkan ke dalam larutan

12. DNA tidak larut dalam etanol. Ketika etanol ditambahkan ke dalam campuran, semua komponen campuran, kecuali DNA, tetap berada dalam larutan sementara DNA mengendap ke dalam lapisan etanol. Larutan didiamkan selama 2-3 menit kemudian DNA putih akan mengendap ke dalam lapisan etanol.



13. DNA yang terbentuk dapat diambil dengan gigi atau pipet atau batang pengaduk bengkok apa yang dapat diambil DNAnya

Alur Kelas: Pengamatan dan Refleksi Lab

1. Siswa akan menetap di tempat yang lebih tenang saat mereka mengamati corong mereka dan menunggu sampel mereka siap untuk diekstraksi. Akan ada tiga fase dasar:

  • Pelapisan campuran stroberi dan alkohol dengan hati-hati
  • Penyisipan pengaduk kaca ke lapisan tengah tempat DNA berada
  • Ekstraksi lambat DNA keluar dari tabung

2. Setelah siswa mulai mengekstraksi DNA mereka, bersiaplah untuk mendorong dan memberi selamat! Anak-anak menyukai jenis umpan balik dari guru mereka terutama selama situasi lab. Ini adalah peluang bagus untuk membangun komunitas dan koneksi saat Anda memiliki minat yang sama dan berkolaborasi untuk menyelesaikan tugas.

3. Saat siswa mulai membersihkan bahan dan kembali ke meja lab untuk mengerjakan soal analisis, ingatkan siswa bahwa mereka dapat mengerjakan soal observasi/analisis lab sebagai tim atau mencari definisi dan diagram nukleotida untuk persiapan pertanyaan terakhir pada dokumen lab.


Tonton videonya: Protocol 2 - PCR Part 1 (Februari 2023).