Informasi

Apa perbedaan radius girasi protein yang dapat dianggap signifikan?

Apa perbedaan radius girasi protein yang dapat dianggap signifikan?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dalam simulasi dinamika molekul protein, radius girasi sering digunakan untuk menilai kekompakan protein.
Ketika membandingkan dua radius girasi protein, perbedaan apa yang dapat dianggap signifikan 1 angstrom, 5 angstrom, 10 angstrom? Arti penting: ya pasti lebih kompak atau tidak pasti lebih kompak. Saya telah mencari melalui tetapi tidak dapat menemukan referensi yang terkait dengan itu.


Apa perbedaan radius girasi protein yang dapat dianggap signifikan? - Biologi

Papiloma terbalik (IP) adalah jenis tumor di mana sel-sel epitel permukaan tumbuh ke bawah ke jaringan pendukung di bawahnya. Kandung kemih, pelvis ginjal, ureter, uretra, hidung, dan sinus paranasal adalah semua area yang mungkin untuk terjadinya IP [1]. Epistaksis dan sumbatan hidung dengan nyeri wajah atau sakit kepala menyerang saat mukosa hidung atau sinus menanggung IP [2]. Meskipun IP yang berasal dari membran pernapasan termasuk neoplasma epitel jinak, invasif lokal, tingkat kekambuhan yang lebih tinggi, dan transformasi ganas membuat sulit untuk diobati [ 3 ]. Tingkat transformasi keganasan adalah 5�% dan banyak dari mereka yang sinkron dengan karsinoma sel skuamosa [4]. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) bertindak sebagai ekspresi antigen dalam inti sel pada fase sintesis DNA selama siklus sel dan mempertimbangkan prognosis kanker, tetapi hubungannya dengan IP masih kontroversial [5].

Cyclin dan cyclin dependent kinase (CDK) mengambil peran penting dalam siklus sel selama proliferasi dan mempengaruhi fase siklus sel yang berbeda [ 6 – 9 ]. CDK1 adalah inisiator yang sangat penting untuk proliferasi sel dan faktor transformasi maligna [10]. Sebaliknya, penghambat p21, P27, dan CDK, membatasi CDK dan menghentikan siklus sel [ 8 ]. P21 adalah penghambat CDK fase sel G1 yang menahan masuknya sel ke fase S. P27 juga dapat mengikat CDK dan bertindak sebagai CDKI sebagai p21. P27 berinteraksi dengan kompleks cyclin E-CDK2, cyclin A-CDK2, dan cyclin D1-CDK4, mempengaruhi proliferasi sel dan apoptosis [6, 7].

Penanda proliferasi antigen Ki-67, dideteksi dengan antibodi monoklonal MIB-1, diekspresikan di semua fase sel G1, S, G2, dan M kecuali G0 [8]. Ekspresi Ki-67 juga berkorelasi dengan perilaku tumor, derajat tumor patologis, dan kekambuhan dini pada berbagai karsinoma [11 – 15].

Mengenai IP yang diubah atau disinkronkan dengan kanker, kami juga melakukan studi IHC p16, p53, Ki-67, dan PLUNC (langit-langit, paru-paru, dan epitel hidung). P16 adalah protein supresor tumor yang memperlambat fase sel G1 ke S dan mencegah transformasi maligna [8]. PLUNC adalah bahan imun bawaan yang memiliki efek antikanker untuk kanker nasofaring tetapi tidak ada penelitian yang mengungkapkan relevansinya dengan IP sinonasal [16].

Survei PCNA, p53, p21, p27, dan Ki-67 dilakukan untuk melihat apakah mereka berkorelasi dengan luas tumor dan hasil pengobatan IP sinonasal [8].

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki peran pengatur siklus sel p53, p21, p27, penanda proliferasi Ki-67, p16, PCNA, dan bahan imun bawaan PLUNC dalam kekambuhan dan transformasi ganas untuk IP sinonasal. Kami juga telah mensurvei apakah kemungkinan faktor prediksi Ki-67, PCNA, dan p27 berkorelasi dengan CDK dengan simulasi komputasi akhirnya untuk memberikan penjelasan yang mungkin tentang mekanisme Ki-67, PCNA, dan p27 terhadap CDK dalam prognosis IP.

Dari Departemen Rumah Sakit Universitas Kedokteran China dari Januari 2000 hingga Juni 2010, 60 kasus IP sinonasal dan 10 kasus IP dengan transformasi karsinoma sel skuamosa dikumpulkan dan ditinjau dari catatan medis secara retrospektif. Semua jaringan yang difiksasi dalam formalin 10 & 25 dan disiapkan dalam parafin digunakan untuk studi IHC dengan metode kompleks avidin-biotin-peroksidase. Antibodi monoklonal tikus (mAb), anti-p16 (Neomarker, DCS-50, 200 mg/L), anti-p21 (Neomarker, MS 387-P, 200 mg/L), anti-p27 (Neomarker, MS 256 -P, 200 mg/L), anti-p53 (Neomarker, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarker RM 9106-S) PCNA, dan PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) digunakan untuk imunohistokimia melalui metode streptavidin-biotin peroksidase [ 11 ]. Xilena digunakan untuk deparafinisasi semua bagian jaringan dan kemudian direhidrasi dengan seri alkohol, dan akhirnya dijenuhkan dalam air suling. Kemudian jaringan digeser ke dalam phosphate-buffered saline dengan menambahkan larutan hidrogen peroksidase 0,3% untuk menghambat aktivitas endogen peroksidase pada suhu kamar selama 10 min, kemudian buffer Tris dibilas. Bagian kemudian direbus dengan oven microwave selama 15 min dalam larutan buffer sitrat (pH 10 mmol/L, 6.0). Antibodi primer p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67, dan PLUNC diaplikasikan satu per satu selama 60  menit pada suhu kamar [11].

Kemudian kami menambahkan antibodi penghubung dan kompleks streptavidin peroksidase (DAKO LSAB Kit, K-0675 Carpinteria, CA) selama 15  menit pada suhu kamar. Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 0,05% digunakan selama 15 min untuk pewarnaan jaringan dan akhirnya dicuci dua kali oleh buffer Tris [8, 11].

Bagian-bagian tersebut diwarnai dengan hematoxylin Mayer setelah dicuci dengan air deionisasi. Inti yang diimunisasi dikuantifikasi dalam setiap kasus. Semua penghitungan dilakukan di bawah mikroskop cahaya standar di bidang 1000x untuk mengevaluasi inti positif / jumlah sel. Sepuluh bidang atau setidaknya 500 sel dihitung pada setiap bagian. Bagian tumor dianggap negatif jika pewarnaan tidak ada atau ada di 㰐% sel tumor. Skor 1+ diberikan ketika 10�% sel positif terhadap reaksi. Skor 2+ diberikan ketika 30�% sel positif terhadap reaksi. Skor 3+ diberikan ketika > 50% sel masing-masing positif terhadap reaksi (Tabel 1 dan 2) [ 17 ]. Signifikansi statistik dianalisis menggunakan uji chi-kuadrat Pearson atau uji eksak Fisher untuk analisis univariat dan uji regresi logistik ganda digunakan untuk analisis multivariat. Hasil dianggap signifikan secara statistik ketika nilai P adalah < 0,05.

Korelasi hasil IHC dengan kekambuhan berganda secara univarian dengan Pearson Xi square dan analisis regresi multivarian logistik.

Korelasi hasil IHC dengan transformasi maligna secara univarian dengan Pearson Xi square dan analisis regresi multivarian logistik.

Docking protein-protein dilakukan oleh program ZDOCK [18] untuk menganalisis tiga faktor prognostik yang mungkin untuk transformasi ganas yang terikat pada CDK1. Untuk membuat mekanisme yang mungkin untuk apa yang kami temukan dalam penelitian ini, kami menghitung interaksi Ki-67, p27, dan PCNA ke CDK1 dengan biologi komputasi. Kami selanjutnya menggunakan program GROMACS 4.5.5 [19] untuk mengamati stabilitas kompleks setelah predikasi pengikatan ZDOCK. Lingkungan sistem MD diatur dalam pemodelan air TIP3P dengan kotak air jarak 1,2 nm yang berisi ion Na dan Cl dalam konsentrasi 0,145 M NaCl untuk netralisasi sistem. Pertama, kami menetapkan 5.000 langkah siklus dalam algoritme penurunan paling curam untuk minimalisasi energi. Kedua, kondisi dinamika suhu konstan (tipe NVT) digunakan untuk menyediakan simulasi MD untuk ekuilibrasi dan dilakukan dalam periode waktu 1 ns. Pada langkah terakhir, dinamika tekanan dan suhu konstan (tipe NPT) ditetapkan untuk proses produksi dalam periode waktu 5000 ps. Suhu sistem selama proses simulasi ditetapkan sebagai 310 K. Untuk analisis lintasan, kami menggunakan perangkat lunak GROMACS 4.5.5 untuk menghitung deviasi kuadrat rata-rata akar (RMSD) dan radius girasi (Rg), masing-masing. Serangkaian data konformasi MD disurvei setiap 20 ps dari semua proses produksi.

Ada total 55 laki-laki dan 15 perempuan termasuk dalam penelitian ini. Enam puluh di antaranya adalah IP dan 10 lainnya adalah IP sinonasal yang dikumpulkan dengan transformasi maligna. Usia 45,64 ± 14,45 tahun berkisar antara 25 sampai 78 tahun. Pewarnaan menunjukkan peningkatan kadar PLUNC secara signifikan, tetapi menurunkan kadar Ki-67, p53, p21, dan p27 pada pasien dengan beberapa kekambuhan IP (Tabel 1). Kami juga menemukan peningkatan PCNA, Ki-67, dan p27 pada IP sinonasal dengan transformasi karsinoma sel skuamosa dibandingkan dengan IP sinonasal saja tanpa keganasan sinkron (Tabel 2). Ekspresi PLUNC yang meningkat berkorelasi dengan beberapa operasi sinus pada pasien dengan IP sinonasal. Namun, tingkat ekspresi PLUNC tidak berkorelasi dengan transformasi ganas IP menjadi SCC. Kami juga menunjukkan ekspresi IHC dari level yang berbeda untuk PCNA, Ki-67, p27, dan PLUNC pada Gambar 1 , 2 , 3 , dan 4 . MRI atau CT scan pra operasi semuanya dilakukan untuk semua pasien seperti pada Gambar 5 dan 6 .

Ekspresi PCNA IHC (a) +++ dan (b) 0 dalam IP.

Ekspresi Ki67 IHC (a) +++ dan (b) 0 dalam IP.

Ekspresi p27 IHC (a) +++ dan (b) 0 dalam IP.

Ekspresi PLUNC IHC (a) +++ dan (b) 0 dalam IP.

Tampilan sinoskopik papiloma terbalik sinonasal dengan transformasi keganasan.

Sinus MRI (tampilan koroner) dan CT scan sinus (tampilan aksial) papiloma terbalik sinonasal dengan transformasi ganas.

Pewarnaan imunohistokimia Ki-67 yang meningkat ditemukan di kedua IP sinonasal dengan beberapa kekambuhan dan transformasi ganas dalam analisis univarian dan multivarian kami dengan uji chi-kuadrat Pearson dan uji regresi logistik ganda seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan 2 dan Gambar 2 (a ) . Oleh karena itu, indeks Ki-67 yang tinggi dapat dianggap sebagai faktor penting untuk prognosis dan penanda prediksi keganasan. Kami bahkan dapat menggabungkan survei tingkat ekspresi Ki-67 dan PCNA IHC yang meningkat secara signifikan dan tingkat p27 yang lebih rendah untuk memprediksi tren transformasi ganas yang lebih tinggi pada pasien dengan IP sinonasal dalam survei kami.

Oleh karena itu, kami melakukan beberapa analisis docking dengan studi dinamika molekuler akhir antara apa yang kami temukan sebagai faktor prognosis PCNA dan CDK1, Ki-67 dan CDK1, serta p27 dan CDK1 yang semuanya menunjukkan docking yang stabil pada Gambar 7 dan skor dockingnya juga ditunjukkan oleh program ZDOCK. ZDOCK menghasilkan 10 pose docking teratas dari CDK1 dan Ki-67, CDK1-p27, dan CDK1-PCNA. Kami memilih skor docking terbaik untuk menganalisis stabilitas interaksi protein-protein. Ki-67, p27, dan PCNA ke skor pengikatan CDK1 masing-masing adalah 20,92, 21,72, dan 24,32 oleh program ZDOCK. Residu utama adalah Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15 yang merupakan domain pengikat utama untuk Ki-67 dan p27 ke CDK1 yang ditunjukkan dalam pita merah (Gambar 7). Kami selanjutnya melakukan analisis MD untuk residu utama ini untuk melihat interaksi ketiga protein ini dengan CDK1. Setelah simulasi MD kompleks CDK1 dengan Ki-67, p27, dan PCNA, kami melakukan analisis RMSD untuk waktu simulasi 5000 ps. Ketiga protein (Ki-67, p27, dan PCNA) dinyatakan memiliki fluktuasi yang stabil setelah waktu simulasi 1000 ps (Gambar 8 ).

Pose docking terbaik CDK1 (hijau) dengan protein target (biru): (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA. Sepuluh kompleks protein-protein teratas dengan skor ZDOCK dihasilkan oleh program ZDOCK. Skor ZDOCK tertinggi pada Ki-67, p27, dan PCNA masing-masing adalah 20,92, 21,72, dan 24,32. Residu pengikat utama Ki-67 dan p27 diwarnai dengan warna merah, dan residu utama termasuk Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15.

Analisis RMSD dari semua atom kompleks CDK1 dengan (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps. Semua kompleks cenderung berfluktuasi stabil setelah waktu simulasi 1000 ps.

Pada Gambar 9, kami menghitung rotasi radius protein untuk periode waktu simulasi 5000 ps. Ketiga kompleks tersebut cenderung memiliki nilai radius girasi yang rendah dan fluktuasi yang stabil pada semua simulasi MD, yang menunjukkan adanya kompleks yang dipadatkan antara masing-masing struktur protein. Metode SASA (area of ​​solvent) digunakan untuk sifat hidrofobik ketiga kompleks, ketiganya menjadi stabil fluktuasi dan juga menunjukkan perubahan hidrofobik yang stabil antara setiap interaksi protein-protein (Gambar 10). Selain perhitungan energi total sistem MD untuk masing-masing dari tiga kompleks selama waktu simulasi 5000 ps, mereka semua memiliki variasi energi yang stabil dalam kisaran 𢄩.27 × 10 5 , 𢄩.30 × 10 5 , dan 𢄡.66 × 10 6 , masing-masing (Gambar 11 ). Hasil analisis energi menunjukkan bahwa semua sistem simulasi stabil selama 5000 ps. Dalam analisis fluktuasi residu, kami mengukur nilai RMSF dari semua residu untuk ketiga kompleks (Gambar 12). Dalam validasi RMSF kompleks CDK1-Ki67, ada fluktuasi signifikan yang diamati pada residu dari 38 hingga 43 CDK1, yang memiliki perubahan besar selama simulasi MD (Gambar 12(a) ). Ada juga variasi signifikan yang diamati pada residu dari 25 hingga 40 pada struktur protein p27 selama simulasi MD yang menunjukkan perubahan besar di wilayah ini. Sebaliknya, ada variasi RMSF yang lebih sedikit dalam residu dari 100 hingga 200 pada struktur protein PCNA selama simulasi MD. Oleh karena itu, ada lebih sedikit perubahan RMSF selama simulasi MD di PCNA daripada Ki-67 dan p27.

Jari-jari girasi kompleks CDK1 dengan (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps. Nilai radius girasi yang rendah menunjukkan kompleks yang dipadatkan antara dua struktur protein.

Analisis SASA (area of ​​solvent) dari semua konformasi kompleks untuk definisi hidrofobik selama 5000 ps fluktuasi stabil menunjukkan tidak ada perubahan yang jelas antara interaksi protein-protein.

Perhitungan energi total sistem MD (a) Ki-67, (b) p27 dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps, masing-masing fluktuasi rata-rata adalah 𢄩.27 × 10 5 , 𢄩. 30 × 10 5 , dan 𢄡.66 × 10 5 , masing-masing.

Analisis RMSF residu protein pada (a) CDK1 dan Ki-67, (b) CDK1 dan p27, dan (c) CDK1 dan PCNA selama waktu simulasi 5000 ps. Nilai fluktuasi RMSF yang tinggi menunjukkan variasi struktur protein yang kuat pada semua simulasi MD.

Namun, analisis migrasi mengungkapkan bahwa PCNA memiliki jarak yang jauh antara CDK1 dibandingkan dengan Ki-67 dan p27 selama survei simulasi MD 5000 ps. Meskipun kami menemukan jarak terbesar antara PCNA dan CDK1 (Gambar 13(a) ), tetapi ikatannya yang stabil ditunjukkan pada Gambar 12 dengan analisis RMSF. Selain itu, mean square displacement (MSD) PCNA memiliki migrasi yang lebih kecil (Gambar 13(b) ). Kami selanjutnya menganalisis residu utama CDK1 untuk pengikatan Ki-67 dan p27. Residu pengikat utama meliputi Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15 pada sudut dihedral struktur protein Ki67-CDK1 selama waktu simulasi 5000 ps. Semua residu pengikat stabil selama simulasi MD keseluruhan. Namun, hanya ada sudut dihedral yang stabil di Gly9, Ser10, Leu12, dan Val15 pada kompleks protein p27-CDK1 selama semua waktu simulasi MD. Akhirnya, kami menemukan bahwa semua residu pengikat utama termasuk Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15 pada struktur protein PCNA-CDK1 memiliki sudut dihedral pengikatan yang stabil selama seluruh simulasi MD tidak ada perubahan yang lebih besar yang ditemukan selama proses PCNA mengikat CDK1 (Gambar 14). Analisis Cluster digunakan untuk memilih struktur perwakilan di antara semua frame MD. Untuk uji perbandingan snapshot, struktur yang diwakili dipilih dari grup pengelompokan terakhir untuk semua bingkai MD kompleks CDK1 dari Ki67, P27, dan PCNA yang dipindahkan masing-masing pada 4860 ps, 2740 ps, dan 3880 ps, selama waktu simulasi 5000& #x2009ps (Gambar 15 ). Studi perbandingan snapshot untuk CDK1 dan protein target untuk Ki-67, p27, dan PCNA ditunjukkan pada Gambar 16. Kami menemukan bahwa residu CDK1 dari 38 menjadi 43 pada CDK1 mendekati Ki-67 dari 0 ps menjadi 4860 ps (Gambar 16(a) ). Hasilnya berkorelasi dengan analisis RMSF karena fluktuasi yang tinggi pada residu dari 38 menjadi 43 ikatan CDK1 untuk Ki-67. Untuk analisis snapshot CDK1-p27, p27 mendekati CDK1 dari 0 ps menjadi 2740 ps. Temuan ini juga berkorelasi dengan analisis RMSF karena variasi yang tinggi pada residu dari 25 hingga 40 ikatan p27 untuk CDK1 (Gambar 16(b)). Kami hanya dapat menemukan perubahan kecil dari satu loop PCNA (biru) menjauh dari CDK1 (hijau) pada 3880 ps pada residu dari 100 menjadi 200 pada interaksi PCNA dan CDK1 (Gambar 16(c) ). Hasil ini juga berkorelasi dengan analisis RMSF untuk fluktuasi kecil pada residu dari 100 hingga 200 ikatan PCNA untuk CDK1.

Analisis migrasi kompleks selama waktu simulasi 5000 ps: (a) jarak antara CDK1 dan protein yang ditambatkan sepanjang waktu MD dan (b) analisis perpindahan kuadrat rata-rata (MSD) untuk semua kompleks CDK1 nilai MSD yang tinggi menunjukkan jarak migrasi protein yang tinggi membentuk posisi awal.

Sudut dihedral residu pengikatan kunci: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14, dan (g) Val15 pada struktur protein CDK1 selama waktu simulasi dari 5000 ps. Sudut dihedral dihitung untuk kompleks CDK1 dengan protein pengikat target: Ki-67, p27, dan PCNA selama semua waktu simulasi MD.

Analisis cluster dari semua CDK1 dan protein pengikat: (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps struktur yang diwakili dipilih dari grup pengelompokan terakhir untuk semua bingkai MD CDK1 kompleks. Struktur yang direpresentasikan dari kompleks Ki-67, p27, dan PCNA dipindahkan masing-masing pada 4860 ps, 2740 ps, dan 3880 ps.

Perbandingan antara snapshot awal (0 ps) dan konformasi yang diwakili untuk semua kompleks CDK1. (a) Salah satu loop CDK1 (hijau) bergerak mendekati Ki-67 (biru) pada 4860 ps. (b) Struktur protein p27 (biru) terikat pada CDK1 (hijau) lebih erat pada 2740 ps. (c) Salah satu loop PCNA (biru) menjauh dari CDK1 (hijau) pada 3880 ps.

Untuk meringkas hasil dalam penelitian dan tinjauan literatur kami, mekanisme molekuler Ki-67, p27, dan PCNA berinteraksi dengan CDK1 untuk proliferasi sel dan transformasi ganas pada pasien dengan IP sinonasal ditunjukkan pada Gambar 17.

Mekanisme molekuler Ki-67, p27, dan PCNA dalam siklus sel.

Walaupun papiloma inverted jarang terjadi pada traktus sinonasal, tetapi sifat mudah rekuren dan transformasi maligna sering mengganggu pasien dan dokter.Tindak lanjut rutin seumur hidup diperlukan untuk deteksi dini kekambuhan atau perubahan ganas dan dapat mengarah pada pengendalian penyakit yang lebih baik untuk pasien IP [9, 20].

Ki-67 mempromosikan inisiasi fase G1 dari G0 dalam sel IP, dan mempertahankan ekspresi untuk siklus sel dalam fase proliferasi. Ki-67 adalah protein yang mempengaruhi siklus sel pada fase proliferasi dari G1-S-G2-M kecuali fase G0 [ 8 , 11 , 14 ]. Dalam literatur yang melaporkan mutasi p53, p63, p21, dan p27 menginduksi IP sinonasal dengan transformasi SCC, masih ada perdebatan [6, 11, 14]. Ki-67 baru-baru ini dilaporkan terjadinya sinonasal neoplasma [21] perilaku tumor agresif berkorelasi dengan indeks Ki-67 yang lebih tinggi dan menyebabkan epitel hidung displasia parah dan bahkan karsinoma sel skuamosa [22]. Ki-67 yang meningkat bahkan dapat ditemukan di IP yang secara serempak mengandung karsinoma sel skuamosa. Ki-67 juga akan mempengaruhi p21, p27, dan CDK [ 8 , 11 , 12 , 14 ]. Namun, kami tidak dapat menyimpulkan apakah penurunan p27 disebabkan oleh peningkatan ekspresi Ki-67 dalam jaringan IP sinonasal. Studi lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan hubungan antara Ki-67 dan P27.

Fungsi penekanan tumor p53 terkait dengan banyak kanker yang dilaporkan oleh Katori et al. dan Gujrathi dkk. [ 22 , 23 ]. Mereka menyarankan bahwa pengujian untuk p53 dapat membantu untuk menyaring lesi papiloma dengan potensi displasia atau karsinoma, namun kami tidak menemukannya signifikan dalam analisis multivariat. Ini karena jumlah pasien yang terbatas dalam penelitian kami. Namun, tidak hanya p53 tetapi juga p63 meningkat diekspresikan dalam IP dengan transformasi maligna [11].

Peningkatan aktivitas proliferatif dengan peningkatan ekspresi Ki-67 sel tumor dilaporkan sebagai penanda prognostik penting pada banyak tumor manusia, juga penting dalam kekambuhan IP dan kanker. Khususnya, suspek Ki-67 secara langsung mempengaruhi siklus sel selama fase proliferasi dan dapat berinteraksi dengan gen supresor tumor p53, p21, dan p27 dan memodulasi siklus sel dengan mempengaruhi pos pemeriksaan fase G1 [8, 24, 25]. Ki-67 baru-baru ini ditemukan memiliki interaksi antara CDK1 dalam struktur alam dan biologi molekuler [26] dan CDK1 mengambil peran utama dalam proliferasi sel dan bahkan transformasi ganas [10]. Kami menduga bahwa Ki-67 tidak hanya memprakarsai pintu masuk sel IP ke fase G1 dari siklus sel tetapi juga menyebabkan transformasi ganas dalam inti sel dengan mempengaruhi CDK1.

Peran klinis p21 dan p27 terhadap kanker SCC kepala dan leher masih diperdebatkan, tetapi kami menemukan bahwa tingkat p27 yang lebih rendah juga terungkap dalam IP sinonasal dengan transformasi ganas dalam penelitian kami. Meskipun ada beberapa penelitian p21 dan p27 yang melaporkan korelasi IP manusia dengan kanker, perdebatan masih tetap ada. Beberapa dengan Oncel et al. [ 11 , 27 ] dan beberapa menentang [ 25 , 28 ] diamati.

Selain Ki-67, kami juga menemukan PCNA, prediktor untuk transformasi ganas IP dalam kolaborasi dengan CDK1. Dalam IP kami dengan transformasi ganas, PCNA dan Ki-67 ditingkatkan oleh pewarnaan IHC.

Seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ekspresi PCNA dalam IP dengan transformasi ganas dari survei kami, kami menduga PCNA menjadi faktor penting untuk menginduksi kanker pada pasien dengan IP sinonasal. Baru-baru ini, juga ditemukan peningkatan PCNA pada IP dibandingkan dengan polip sinonasal oleh Mumbuc et al. [ 3 ]. PCNA dapat berinteraksi dengan CDK1 dan mendorong masuknya sel ke dalam siklus sel yang mengakibatkan proliferasi dan kanker.

Akhirnya, kami mensurvei PLUNC ke IP sinonasal dengan kanker karena sering dilaporkan menyebabkan pembentukan kanker nasofaring. Dalam penelitian kami sebelumnya, ekspresi PLUNC menurun pada sinusitis pseudomonas dalam status penyakit kronis [29]. PLUNC juga berkorelasi dengan rinosinusitis kronis dengan beberapa kolonisasi bakteri [17]. Selain itu, PLUNC juga diharapkan memiliki fungsi anti infeksi dan antibiofilm [ 30 , 31 ]. Karena seharusnya memiliki antikankerisasi karsinoma nasofaring [32], tetapi kami tidak menemukan korelasi IP sinonasal dengan transformasi SCC. Sebaliknya, kami hanya dapat menemukan peningkatan ekspresi PLUNC pada pasien dengan IP sinonasal dengan beberapa rekurensi dan operasi revisi sinus. Mekanisme lebih lanjut dan alasan peningkatan ekspresi PLUNC dan kekambuhan ganda harus disurvei lebih lanjut di masa mendatang.

Desain Computer-Aided Drug (CADD) dapat digunakan untuk menyelidiki lebih lanjut penelitian klinis atau penyakit, termasuk penelitian penyakit [33], studi faktor risiko [34], laporan kasus, dan mekanisme molekuler. Dalam hasil docking dan dinamika molekuler PCNA, Ki-67, dan p27 ke CDK1, kami menemukan bahwa ketiganya memiliki docking yang stabil ke CDK1. Dan p27 seharusnya memiliki interaksi yang lebih stabil dengan CDK1 untuk bekerja sebagai penghambat IP sinonasal dengan kanker. PCNA dan Ki67 dianggap sebagai promotor dan mempromosikan proliferasi sel dan kanker pada IP sinonasal.

Kesimpulannya, ini adalah studi pertama yang menunjukkan bahwa Ki-67, PCNA, dan p27 semuanya penting dalam kekambuhan IP dan kanker melalui CDK1. Dan kami juga yang pertama menemukan ekspresi PLUNC yang meningkat dalam beberapa IP sinonasal berulang. Namun, mekanisme survei lebih lanjut masih diperlukan di masa mendatang. Studi komputasi saat ini semuanya kompatibel dengan studi lab basah kami yang membuat penelitian kami lebih dapat dipercaya dan dapat diterapkan pada pengobatan masa depan terhadap pasien dengan penyakit tersebut. Oleh karena itu, pasien dengan IP sinonasal dan menunjukkan peningkatan Ki-67, PCNA, dan penurunan p27 harus dianggap memiliki kemungkinan transformasi ganas yang lebih tinggi dan harus diikuti lebih dekat dalam praktik klinis [35].


Kloning Molekul dan Karakterisasi a (Lys)6-Tagged Hemoglobin I Sulfida-Reaktif dari Lucina pectinata

Tag poli-Lys digabungkan ke Lucina pectinata urutan pengkodean hemoglobin I (HbI) dan dimurnikan menggunakan proses yang efisien dan cepat. HbI adalah hemeprotein yang mengikat hidrogen sulfida (H2S) dengan afinitas tinggi dan telah digunakan untuk memahami reaksi fisiologis yang relevan dari molekul pensinyalan ini. (Lis)6konstruksi rHbI yang ditandai diekspresikan dalam E. coli dan dimurnikan dengan imobilisasi pada matriks penukar kation, diikuti dengan kromatografi eksklusi ukuran. Identitas, struktur, dan fungsi (Lys)6-tag rHbI dinilai dengan spektrometri massa, hamburan sinar-X kecil dan lebar, spektroskopi optik, dan analisis kinetik. Hasil hamburan dan spektroskopi menunjukkan bahwa (Lys)6-tag rHbI secara struktural dan fungsional analog dengan protein asli serta (His)6-tag rHbI. Studi kinetika dengan H2S menunjukkan bahwa asosiasi (k pada) dan disosiasi (k mati) konstanta laju masing-masing adalah 1,4 × 10 5 /M/s dan 0,1 × 10 3 /s. Hasil ini menegaskan bahwa (Lys)6rHbI yang ditandai mengikat H2S dengan afinitas tinggi yang sama dengan homolognya.

Ini adalah pratinjau konten langganan, akses melalui institusi Anda.


Hasil

Pencernaan tripsin memberikan peptida tahan pencernaan (DRPs) yang stabil untuk semua isoform konglutin

Isoform konglutin kacang, Ara h 2.02, Ara h 2.01 dan Ara h 6, dicerna dengan inkubasi dengan tripsin. Gambar Tambahan. S1 menunjukkan perjalanan waktu pencernaan seperti yang divisualisasikan oleh elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE) di bawah kondisi pereduksi. Peptida yang berasal dari pencernaan tetap stabil hingga titik akhir penelitian kami selama 180 menit untuk semua isoform konglutin. DRP dari isoform Ara h 2.02 terdiri dari dua kelompok, dengan massa molekul sekitar 12 kDa, dan 10 kDa. DRP dari Ara h 2.01 menunjukkan berat molekul yang nyata sekitar 10 kDa dan pemeriksaan yang cermat pada area ini mengungkapkan dua pita yang bermigrasi bersama. DRP dari Ara h 6 bermigrasi sebagai sekitar 9 kDa dan 5 kDa band. Untuk karakterisasi lebih lanjut, digunakan DRP yang dibuat dengan destruksi selama 90 menit. Dalam kondisi fisiologis menggunakan pepsin pada pH rendah diikuti oleh tripsin/kimotripsin pada pH netral, konglutin kacang juga tahan terhadap proteolisis. DRP yang dihasilkan memiliki berat molekul yang sama dengan yang dianalisis dalam penelitian kami, dan masih dapat mengikat IgE (data tidak ditampilkan), sesuai dengan penelitian lain 13,22 .

Identifikasi urutan DRP dari isoform konglutin kacang tanah

Spektrum massa resolusi tinggi direkam untuk DRP yang tidak tereduksi dan tereduksi dan teralkilasi dari isoform Ara h 2, Ara h 2.02 dan Ara h 2.01, dan Ara h 6. Spektrum ESI-MS dari DRP yang tidak tereduksi dan tereduksi serta teralkilasi ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2, masing-masing. Untuk DRP yang tidak tereduksi, rentang luas ion m/z dengan status muatan lebih tinggi (dari +8 hingga +17) diamati, yang mewakili massa dengan massa molekul >13 kDa. Spektrum massa untuk DRP yang tidak tereduksi ini juga mengandung ion m/z dengan status muatan yang lebih rendah (dari +2 hingga +6), yang mewakili massa <5 kDa. DRP tereduksi dan teralkilasi memberikan rentang status muatan dari +4 hingga +12, mewakili massa dari 2,2–10 kDa. Dalam spektrum DRP tereduksi dan teralkilasi, dapat diamati bahwa satu ion keadaan muatan memberikan beberapa massa m/z, menyimpang 57 Da satu sama lain. Ini berhubungan dengan alkilasi parsial sistein. Tabel Tambahan S1 merangkum massa yang ditemukan untuk DRP, baik dari bentuk tidak tereduksi maupun tereduksi dan teralkilasi. Tripsinolisis Ara h 2.02 dan 2.01 menyebabkan DRP massa molekul dari 16,2-17,6 kDa, serta beberapa peptida kecil dari 2-4 kDa (lihat Tabel Tambahan S1). Ara h 6 menunjukkan DRPs massa molekul dari 13,5-14,1 kDa. Mempertimbangkan modifikasi pasca-translasi yang diketahui, pemrosesan pasca-translasi dan penggabungan massa DRP utuh dan tereduksi dan teralkilasi menggunakan pemetaan ikatan disulfida 19 , massa eksperimental dikaitkan dengan massa teoretis (lihat Tabel Tambahan S1).

DRP yang tidak tereduksi menjadi sasaran ESI-MS untuk menentukan massa peptida individu. Peptida dapat dihubungkan oleh ikatan disulfida. Panel a: DRPs Ara h 2.02 Panel b: DRPs Ara h 2.01 Panel c: DRPs Ara h 6.

DRP tereduksi dan alkylatd menjadi sasaran ESI-MS untuk menentukan massa peptida individu. Panel a: DRPs Ara h 2.02 Panel b: DRPs Ara h 2.01 Panel c: DRPs Ara h 6.

Profil elektroforesis (2-DE) dua dimensi DRP dari isoform konglutin individu (lihat Gambar Tambahan. S2) digunakan untuk menetapkan titik, di mana nilai pI DRP yang berbeda memberikan arahan tambahan untuk verifikasi peptida. Gambar 3 memberikan gambaran umum tentang urutan peptida yang ditemukan dalam DRP dari tiga konglutin kacang. Setelah pencernaan, kami telah mendeteksi protein dengan satu ikatan peptida yang dihidrolisis pada Arg59/71 untuk Ara h 2 dan Arg50 untuk Ara h 6 (Gbr. 3. Panel a - Ara h 2.02, peptida a, dan b Panel b - Ara h 2.01, peptida b, c, d, dan e Panel c - Ara h 6, peptida a, dan b) , yang setelah reduksi menghasilkan dua peptida dengan berat molekul dari 7,2–9,7 kDa untuk Ara h 2 dan 4,8-9,4 kDa untuk Ara h 6. Dalam DRP utuh dari Ara h 2, pemrosesan proteolitik terminal-C dari fragmen Y/RY diamati 29 , tetapi juga pembelahan di situs pembelahan tripsin Arg149/137-Asp150/138. Selain itu, peptida dengan segmen pendek internal yang dihapus (S48TR50 di Ara h 6 dan D61PYSPSPYDRR71 di Ara h 2.02) terdeteksi. Dalam DRP dari Ara h 2, segmen internal terdeteksi mulai dari Asp35 atau Asp42 (Gbr. 3. Panel a – Ara h 2.02 peptida f, g dan h, Panel b – Ara h 2.01 peptida f). Peptida pendek ini tidak mengandung residu sistein dan tidak tetap terkait dengan inti protein yang stabil. N-terminus dari Ara h 6 setelah pencernaan menunjukkan beberapa keragaman N-terminus (proteolisis di Arg5 atau Arg7, Gbr. 3. Panel c – Ara h 6 peptida a–d). Untuk ketiga conglutin, bagian yang paling rentan terhadap pencernaan adalah terminal N dan C, dan pada tingkat lebih rendah bagian internal yang terbatas. Jelas bahwa dalam ketiga isoform konglutin, situs internal utama serangan tripsin secara struktural identik (R59|R60|D61PYSPSPYDRR71|G72 di Ara h 2.02, R58|R59|G60 di Ara h 2.01 dan R47|S48TR50|S51 di Ara h 6), terletak di loop yang tidak memiliki struktur lokal yang ditentukan. Gambar Tambahan. S3 berisi penyelarasan urutan isoform konglutin dengan penugasan elemen struktur sekunder dan diagram topologi 2D yang menunjukkan jembatan disulfida.

Menggunakan urutan conglutin utuh (baris atas setiap panel), peptida yang diidentifikasi ditunjukkan oleh baris berikutnya (ditunjukkan dengan huruf). Setiap baris mewakili peptida unik yang ditemukan. Garis yang ditandai dengan 'R' mewakili peptida yang dilepaskan dari inti protein saat pencernaan. Panel a: Urutan DRP dari spesies protein Ara h 2.02 Panel b: Urutan DRP dari spesies protein Ara h 2.01 Panel c: Urutan DRP dari spesies protein Ara h 6.

Struktur sekunder isoform konglutin kacang tidak terpengaruh oleh pencernaan dan simulasi dinamis molekul mengungkapkan struktur DRP yang stabil secara konformasi

Spektra UV Circular dichroism (CD) diperoleh pada pH 8 dan pH 1,2, pada 37 °C, untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik tentang sifat struktural DRPs Ara h 2.02, Ara h 2.01 dan Ara h 6. Spektrum tiga isoform asli menunjukkan eliptisitas positif yang kuat dari 200 hingga 190 nm, biasanya menunjukkan adanya struktur -heliks (plot garis pada Gambar. 4). Bentuk spektrum CD UV jauh dari DRP mirip dengan protein asli (garis putus-putus pada Gambar 4). Penyilangan nol, yaitu panjang gelombang pada eliptisitas 0 mdeg, adalah sama untuk DRP dan isoform asli, menegaskan bahwa tidak ada perubahan penting dalam struktur sekunder yang terjadi sebagai akibat dari degradasi protein utuh menjadi fragmen yang lebih kecil. Conglutins asli dan DRP mereka memiliki spektrum CD UV jauh yang sangat sebanding pada pH netral dan pH rendah, menunjukkan bahwa tidak ada denaturasi yang terjadi di perut.

Conglutins asli dan DRP mereka dianalisis dengan spektroskopi CD UV jauh untuk menyelidiki kandungan struktur sekunder, baik pada pH netral dan pH rendah untuk meniru kondisi lambung dan duodenum. Garis padat mewakili konglutin kacang asli garis putus-putus mewakili DRP dari masing-masing konglutin. Panel atas (a,b,c) pada pH = 8,0, panel bawah (d,e,f) pada pH=1,2. Panel kiri (a,d): Ara h 2.02 Panel tengah (b,e): Ara h 2.01 Panel kanan (c,f): Ara h 6.

Untuk menganalisis konsekuensi aksi proteolitik untuk ketiga isoform, simulasi dinamika molekuler dilakukan pada protein utuh dan yang dicerna selama 500 ns untuk Ara h 2 dan 800 ns untuk Ara h 6. Menurut fluktuasi akar tulang punggung rata-rata kuadrat (RMSF ), dapat diketahui bahwa kedua isoform Ara h 2 memiliki tiga wilayah dengan mobilitas tinggi: bagian terminal-N yang mengapit hingga Cys pertama, bagian terminal-C dari residu Cys terakhir hingga akhir deret, dan suatu wilayah yang hampir merupakan seluruh loop tidak terstruktur antara residu Cys kedua dan ketiga (Gbr. 5a,b). Mobilitas daerah Ara h 6 serupa, kecuali bahwa bagian terminal-C tidak bergerak karena adanya disulfida yang terletak di ujung-C protein (Gbr. 5c). Situs pembelahan tripsin ditandai dengan panah pada Gambar. 5 untuk DRPs dan ini dipertimbangkan untuk analisis dinamika molekul lebih lanjut. Selanjutnya, Gambar 5d-f menunjukkan situs pembelahan sensitif tripsin untuk semua DRP yang diidentifikasi dalam penelitian ini (Gbr. 3). Dapat diamati bahwa nilai RMSF dari hampir semua situs sensitif tripsin yang ditemukan dalam penelitian ini lebih tinggi dari 0,60 , (Gbr. 5d-f), sementara situs yang resisten tripsin hampir semuanya menunjukkan nilai RMSF lebih kecil dari 0,70 . Faktanya, nilai prediksi positif untuk kerentanan situs pemotongan target dalam conglutins kacang untuk trypsinolysis adalah 83%, untuk resistensi terhadap aksi proteolitik adalah 87%, jika nilai RMSF potongan ditetapkan pada 0,65 .

Panel atas (a,b,c): Konglutin utuh, panel bawah (d,e,f): Situs yang terpengaruh tripsin di DRP. Panel kiri (a,d): Ara h 2.02 Panel tengah (b,e): Ara h 2.01 Panel kanan (c,f): Ara h 6.Panah menunjukkan tempat yang dipengaruhi tripsin Garis biru mewakili urutan protein Garis hijau merupakan bagian dari sekuens protein yang mengandung -helix sebagai struktur sekunder C mewakili sistein yang terlibat dalam pembentukan ikatan disulfida.

Empat minima RMSF lokal dapat dilihat dengan <0,5 , sesuai dengan daerah heliks (Gbr. 6), yaitu inti protein yang sangat terstruktur. Menurut Gambar. 6, yang mewakili nilai RMSF yang tumpang tindih dari protein utuh dengan DRP yang sesuai, mobilitas lokal DRP menunjukkan pola yang serupa, termasuk daerah heliks dengan minima RMSF. Gambar 7 mewakili struktur 3D protein utuh yang tumpang tindih dengan DRP yang sesuai. Dalam DRP, hanya perubahan konformasi kecil yang dapat diamati, untuk Ara h 2 di loop tidak terstruktur dan wilayah terminal-C, dan untuk Ara h 6 penyimpangan diamati di loop tidak terstruktur dan wilayah terminal-N , sementara daerah -heliks tetap dalam struktur heliksnya tanpa gerakan heliks dan penataan ulang untuk semua isoform konglutin (Gbr. 7), dan bahkan menjadi sedikit kurang dinamis. Hasil ini menunjukkan bahwa proteolisis tidak secara substansial mengubah stabilitas konformasi protein.

Panel a: Perbandingan Ara h 2.02 dan DRP-nya (Gbr. 3a, peptide d) Panel b: Perbandingan Ara h 6 dan DRP-nya (Gbr. 3c, peptide d). Panah mewakili minimum RMSF yang posisinya terletak di wilayah -heliks protein. Garis hijau mewakili bagian dari sekuens protein, yang mengandung -helix sebagai struktur sekunder.

Panel a: Ara h 2.02 Panel b: Ara h 6. Struktur merah mewakili konformasi protein utuh dan struktur biru mewakili DRP (peptida d dari Gambar 3a,c). Panah menunjukkan situs pembelahan, menunjukkan bahwa bagian yang tidak terstruktur terpengaruh.

Root mean square deviasi (RMSD) dan radius girasi DRP dihitung dengan mengevaluasi deviasi spasial dalam struktur. Analisis ini selanjutnya mengkonfirmasi kekompakan DRP (lihat Gambar Tambahan S4 dan S5). Selama seluruh waktu simulasi, DRP dari Ara h 2 dan Ara h 6 menunjukkan profil RMSD yang lebih rendah, menunjukkan bahwa mereka lebih stabil daripada protein utuh yang sesuai.

Nilai radius gyration (Rg) mengungkapkan plot DRP yang lebih rendah selama seluruh waktu simulasi dan menyiratkan bahwa DRP memiliki konformasi yang lebih kompak dibandingkan dengan protein utuh. Struktur DRP yang lebih kompak daripada protein utuh yang sesuai (dengan efek yang lebih nyata dalam kasus Ara h 2), serta kekompakan yang lebih tinggi dari Ara h 6 daripada Ara h 2, sesuai dengan perubahan elemen struktur sekunder protein selama simulasi (lihat Gambar Tambahan. S6) mis kandungan heliks yang lebih tinggi dalam DRP dibandingkan dengan protein Ara h 2 yang utuh dan kandungan heliks yang lebih tinggi di Ara h 6 daripada di Ara h 2.Hal ini dapat dijelaskan dengan hilangnya urutan asam amino yang tidak terstruktur yang menghasilkan fraksi yang lebih tinggi dari elemen terstruktur dalam produk pencernaan.

Peptida tahan pencernaan menunjukkan sifat pengikatan IgE seperti isoform konglutin asli

Pengikatan IgE DRPs dari Ara h 2 dan Ara h 6 dinilai dengan elektroforesis gel 2D yang dikombinasikan dengan imunoblotting. Gambar 8a menunjukkan bahwa ketiga isoform memunculkan tempat pengikatan IgE. DRP dari Ara h 6 memiliki pI yang lebih asam daripada DRP dari isoform Ara h 2. IgE-imunoblotting juga mengungkapkan bintik-bintik tambahan dengan berat molekul yang lebih tinggi. Ini mewakili sebagian kecil dari Ara h 6 utuh, yang tersisa setelah 90 menit pencernaan, seperti yang dicatat pada SDS-PAGE dan 2-DE. Bintik-bintik yang tidak mengikat IgE (pada <10 kDa dan dengan pI asam) tampaknya berasal dari Ara h 6 (Gbr. 8a dan Gambar Tambahan S2).

Panel a: Elektroforesis 2-D (kiri) dan elektroforesis 2-D dengan IgE Immunoblot DRPs dari campuran Ara h 2/ h 6. M: Penanda molekuler Panel b-d: Potensi pengikatan IgE sebagaimana ditentukan oleh IgE-ELISA dari peptida tahan pencernaan (garis putus-putus) dan conglutin asli (garis padat). Contoh tipikal ditampilkan (Panel b: Ara h 2.02 Panel c: Ara h 2.01 Panel d: Ara h 6). Potensi pengikatan IgE dari DRP serupa dengan conglutin utuh.

Selain itu, potensi pengikatan IgE dari DRPs dibandingkan dengan konglutin kacang utuh dinilai pada tingkat kuantitatif oleh IgE-ELISA. Gambar 8 (panel b-d) menunjukkan plot inhibisi Ara h 2.02, Ara h 2.01, dan Ara h 6 dan DRP mereka. Untuk Ara h 2.02 dan Ara h 6, plot penghambatan DRP hampir tumpang tindih dengan plot protein utuh. Untuk Ara h 2.01, ada sedikit pergeseran ke konsentrasi yang lebih tinggi, menunjukkan potensi pengikatan IgE yang sedikit lebih rendah. Dari tiga percobaan independen, rata-rata IC50 nilai (konsentrasi yang dibutuhkan untuk menghambat 50% dari sinyal) diperoleh dan peningkatan lipat dalam IC50 nilai antara DRPs dan protein utuh ditentukan. Untuk Ara h 2.02, Ara h 2.01, dan Ara h 6, peningkatan lipat ini berturut-turut adalah 0,8 (±0,4), 1,4 (±1,4), dan 1,5 (±0,6). Karena angka-angka ini mendekati 1, dapat disimpulkan bahwa potensi pengikatan IgE dari ketiga isoform konglutin kacang tidak dipengaruhi oleh trypsinolysis.


Hasil

Untuk menjelaskan dinamika protein membran perifer, kami telah menggunakan dinamika partikel disipatif (DPD), teknik simulasi berbutir kasar yang biasa digunakan untuk mensimulasikan membran pada skala mesoscopic [30]. Dalam pendekatan ini, kelompok atom digabungkan menjadi manik-manik efektif yang merupakan blok bangunan dari konstruksi yang lebih kompleks, mis. lipid dan protein. Manik-manik berinteraksi melalui potensi efektif dan tunduk pada termostat (lihat Metode untuk detailnya).

(a) Model lipid L dengan kepala hidrofilik tunggal (abu-abu) dan tiga manik-manik ekor hidrofobik (kuning). (b) Sebuah model protein dengan jari-jari terdiri dari satu lapisan heksagonal (manik-manik diameter) dari manik-manik hidrofilik (merah) dan tiga lapisan manik-manik ekor hidrofobik (biru). (c) Cuplikan membran lipid L dan lima salinan tertanam (air tidak ditampilkan untuk visibilitas yang lebih baik).

Untuk memodelkan sistem air, lipid, dan protein membran perifer, kami telah menggunakan tiga jenis manik yang mewakili gugus hidrofilik, gugus hidrofobik, dan air. Lipid (dilambangkan sebagai ) dibangun sebagai polimer linier yang terdiri dari kelompok kepala hidrofilik tunggal dan manik-manik ekor hidrofobik (Gambar 1 a). Sebagai lipid standar yang kami gunakan. Protein membran perifer (dilambangkan sebagai ) dimodelkan sebagai silinder dengan penampang heksagonal, terdiri dari satu lapisan manik hidrofilik dan hidrofobik yang membentuk jangkar membran (Gambar 1 b). Manik-manik di dalam silinder dihubungkan dengan pegas harmonik untuk mendapatkan struktur protein yang cukup kaku dan kompak mirip dengan yang terlihat di alam sebagai konsekuensi dari interaksi kovalen dan non-kovalen dari rantai polipeptida. Jari-jari protein ditentukan oleh jumlah manik-manik di sepanjang penampang heksagonal protein, . Kami telah berkonsentrasi pada PMP dengan panjang jangkar membran. Dalam semua simulasi, protein dimasukkan ke dalam lapisan ganda lipid yang telah dirakit sebelumnya dengan ukuran tambalan (Gambar 1 c). Di sini, skala panjang DPD intrinsik sesuai dengan . Sebelum merekam posisi semua manik-manik sebagai fungsi waktu, sistem diseimbangkan dengan barostat ke keadaan bebas tegangan (lih. Metode).

Gangguan lapisan ganda lipid oleh protein membran perifer

Kami pertama-tama mengkarakterisasi lipid bilayer yang terdiri dari lipid tanpa protein tertanam. Ketebalan lapisan ganda ini adalah (jarak rata-rata antara pusat kelompok kepala lipid dari selebaran yang berlawanan lih. Gambar 2). Ketebalan satu selebaran adalah (jarak rata-rata antara pusat kelompok kepala dan pusat manik-manik ekor terminal dalam selebaran lihat Gambar 2). Jarak antara selebaran adalah (jarak rata-rata antara pusat manik-manik ekor terminal di selebaran yang berlawanan lih. Gambar 2). Parameter orde orientasi lipid, , dengan sudut rata-rata antara lipid dan normal bilayer, diasumsikan nilai . Mengingat ekstrem (ketika lipid berorientasi sejajar dengan bilayer normal, untuk orientasi acak), nilai yang diamati menunjukkan bilayer lipid cukup teratur namun cair.

Saat menanamkan PMP ke dalam lapisan ganda lipid, kedua selebaran terganggu dengan cara yang khas. Daerah antara posisi rata-rata kepala lipid dan manik-manik ekor terminal di dua selebaran ditampilkan sebagai garis-garis berwarna. Bidang tengah netral yang tidak terganggu ditunjukkan sebagai garis putus-putus. PMP tunggal dimasukkan ke dalam selebaran bawah (bentuk ditunjukkan di wilayah ). Membran tidak terganggu dan ketebalan daun, dan , diindikasikan jauh dari protein. ( a ) Saat memasukkan protein pendek (yaitu dan ) selebaran atas menekuk ke arah bidang tengah yang tidak terganggu sementara selebaran bawah tetap hampir tidak terganggu. (b) Untuk jangkar membran yang lebih panjang ( ), selebaran atas tertekuk menjauh dari bidang tengah karena interferensi sterik lipid dengan bagian hidrofobik protein yang berlawanan. Selebaran bawah hanya sedikit menekuk ke dalam, sehingga menghasilkan penebalan lokal membran. Juga, ketebalan selebaran atas, , sedikit berkurang karena kompresi sterik.

Untuk menyelidiki perubahan bentuk bilayer dan konfigurasi lipid setelah menanamkan protein membran perifer ke dalam membran, kami memasukkan satu dengan radius dan meningkatkan panjang hidrofobik ( ) ke dalam bilayer. Setelah ekuilibrasi, kemiringan protein terhadap normal bilayer sangat sederhana ( ). Hanya protein terpendek, , yang menunjukkan kemiringan yang agak meningkat ( ) dengan fluktuasi yang ditingkatkan. Yang terakhir ini juga tercermin dalam distribusi sudut kemiringan protein yang sedikit lebih lebar daripada untuk semua PMP lainnya (data tidak ditampilkan). Pengamatan ini menunjukkan bahwa mengasumsikan konfigurasi yang sedikit kurang stabil di dalam membran dibandingkan dengan protein dengan gugus hidrofobik yang lebih panjang.

Selanjutnya, kami memantau profil penampang membran yang terganggu, yaitu posisi rata-rata pusat kelompok kepala lipid dan pusat manik ekor lipid terminal. Secara umum, gangguan yang nyata terlihat di daerah membran yang dekat dengan protein (Gambar 2 a). Ketika bagian hidrofobik protein tidak mencapai selebaran yang berlawanan ( dan , Gambar 2 a), selebaran yang berlawanan sebagian ditekuk ke arah bidang tengah yang tidak terganggu. Selebaran di mana protein tertanam tetap hampir tidak terganggu dan karenanya membran lebih tipis di dekat protein, yaitu . Gangguan paling sedikit terlihat dimana panjang bagian hidrofobik ( ) cocok dengan ketebalan selebaran yang tidak terganggu ( ). Untuk PMP dengan bagian hidrofobik yang lebih panjang ( ) selebaran yang berlawanan ditekuk menjauh dari bidang tengah (Gambar 2 b). Defleksi mutlak dari bidang tengah pada batas PMP tumbuh hampir linier dengan panjang bagian hidrofobik, yaitu untuk . Selebaran di mana PMP tertanam hanya sedikit ditekuk ke arah yang sama (Gambar 2 b), yaitu peningkatan bersih dalam ketebalan membran ( ) di dekat protein muncul.

Kami selanjutnya menentukan ketebalan selebaran membran, yaitu jarak rata-rata kepala lipid dan ujung ekor dalam selebaran. Selebaran di mana PMP tertanam mengubah ketebalannya hanya sedikit protein apa pun yang dimasukkan (data tidak ditampilkan). Selebaran yang berlawanan dengan PMP, bagaimanapun, menunjukkan perubahan yang signifikan tergantung pada panjang bagian hidrofobik (Gambar 3 a). Secara khusus, for dan kompresi kuat dari selebaran muncul sementara panjang bagian hidrofobik hanya memiliki efek yang dapat diabaikan karena bagian hidrofobik terlalu pendek untuk menembus kuat ke dalam selebaran yang berlawanan. Temuan ini untuk dan dikuatkan oleh pengamatan bahwa lipid menunjukkan penurunan parameter orientasi , yaitu mereka kurang selaras dengan bilayer normal, ketika terletak tepat berlawanan dengan protein ini (Gambar 3 b). Namun, juga protein yang lebih pendek menyebabkan perubahan orientasi lipid pada selebaran yang berlawanan: Di sini, lipid lebih selaras dengan normal bilayer, yaitu meningkat. Di dalam selebaran tempat protein tertanam, orientasi lipid juga terpengaruh di dekat PMP. Dekat dengan , lipid dimiringkan lebih kuat, sedangkan mereka lebih selaras di sepanjang permukaan normal untuk protein dengan bagian hidrofobik yang lebih panjang. Jadi, dalam semua kasus kebebasan lipid dibatasi, yaitu menyimpang dari nilai tidak terganggu, yang secara entropis tidak menguntungkan.

(a) Saat memasukkan konstruksi, ketebalan selebaran yang berlawanan diubah secara signifikan di dekat protein sehubungan dengan nilai tidak terganggu . Kompresi selebaran meningkat ketika panjang bagian hidrofobik meningkat. (b) Parameter urutan orientasi lipid (dengan menjadi sudut rata-rata lipid terhadap normal bilayer) di selebaran atas dan bawah juga terpengaruh di sekitar PMP. Hanya jauh dari protein, konvergensi menuju nilai yang tidak terganggu diamati. Sesuai dengan kompresi lokal selebaran atas, kemiringan lipid yang lebih kuat diamati secara langsung berlawanan dengan PMP. Legenda seperti pada (a).

Untuk melengkapi hasil di atas, kami juga menganalisis jarak rata-rata antara selebaran, yaitu jarak rata-rata pusat manik-manik lipid terminal di setiap selebaran (lihat juga Gambar 2). Akibatnya, kami menemukan jarak yang berkurang ( ) dekat dengan protein terpendek, , sedangkan untuk tidak ada perubahan sehubungan dengan yang diamati. Untuk protein yang lebih panjang ( ) jaraknya meningkat masing-masing sebesar , , dan .

Singkatnya, hasil kami pada kemiringan lipid dan ketebalan bilayer sesuai dengan pengamatan sebelumnya [31]. Melampaui hasil ini, kami juga telah menghitung gangguan dari setiap lapisan tunggal dan panjang sambungan yang diubah dari lapisan tunggal.

Difusi protein membran perifer

Setelah mengukur gangguan membran lokal yang diinduksi dengan menanamkan protein membran perifer ke dalam lapisan ganda lipid, kami selanjutnya bertanya bagaimana protein ini berdifusi di dalam membran. Untuk protein transmembran, hubungan Saffman-Delbruck yang terkenal [32] memprediksi ketergantungan ukuran logaritmik untuk jari-jari kecil ( ) (1) Di sini, dan adalah ketebalan dan viskositas membran, adalah jari-jari protein, adalah konstanta Euler, dan adalah jumlah viskositas cairan di atas ( ) dan di bawah ( ) membran [33]. Validitas Persamaan. (1) telah dikonfirmasi oleh simulasi [34] dan eksperimen [35]–[37].

Untuk menyelidiki apakah difusi yang bergantung pada ukuran protein membran perifer juga dijelaskan oleh Persamaan. (1) , kami menyematkan PMP tunggal ( ) dengan berbagai radius ( ) ke dalam lapisan ganda lipid ( ). Karena penggunaan potensi inti lunak di DPD, momentum dan transportasi massal terjadi pada skala waktu yang sama, sehingga memungkinkan kuantifikasi yang baik dari sifat transportasi bahkan dalam sistem yang cukup kecil. Setelah kesetimbangan, posisi protein dilacak untuk langkah-langkah. Selama periode ini, protein bergerak rata-rata sejauh . Dari deret waktu posisi, kami menentukan perpindahan kuadrat rata-rata protein (waktu rata-rata). Koefisien difusi diperoleh kemudian dengan memasang rata-rata perpindahan kuadrat. Ketidakpastian dalam menentukan koefisien difusi kurang dari yang dinilai dari beberapa putaran untuk pengaturan parameter yang sama. Sebagai referensi kami juga menentukan koefisien difusi protein transmembran dengan 5 lapisan manik hidrofobik dan lipid tunggal. Yang terakhir menghasilkan koefisien difusi yang semua koefisien difusi protein dibandingkan.

Sama halnya dengan kasus membran yang memisahkan dua cairan dengan viskositas berbeda, kami mengantisipasi PMP karena bagian atas protein merasakan air di sekitarnya sementara bagian bawahnya terkubur di inti bilayer. Oleh karena itu, diharapkan bervariasi dengan kedalaman penetrasi protein. Akibatnya, digunakan sebagai parameter fit terbuka dalam Persamaan. (1) . Parameter kecocokan kedua adalah .

Sebagai hasilnya, kami menemukan bahwa Persamaan. (1) memberikan kecocokan yang sangat baik dengan koefisien difusi yang bergantung pada ukuran dari semua protein yang disimulasikan (Gambar 4 a). Berbeda dengan harapan kami, tidak menunjukkan variasi yang signifikan ketika kedalaman penetrasi protein ditingkatkan dengan memperpanjang panjang bagian hidrofobik (Gambar 4 b). Namun, perubahan sebanding dengan panjang bagian hidrofobik protein, (Gambar 4 b). Hasil ini mencerminkan bahwa protein tidak mengalami gaya hambat penuh ( ) dari protein transmembran tetapi hanya sebagian kecil karena kedalaman penetrasi yang lebih kecil. Khususnya, koefisien difusi untuk hampir bertepatan dengan protein transmembran. Dalam simulasi kami, kami tidak mengamati anulus signifikan lipid yang bepergian dengan protein. Kemungkinan besar, butiran kasar dan penggunaan potensi lunak (yaitu rasio momentum yang rendah terhadap propagasi massa yang melekat pada DPD) melunakkan munculnya rakitan dinamika jarak pendek yang diantisipasi ini.

(a) Ketergantungan koefisien difusi protein membran perifer pada jari-jarinya dijelaskan dengan baik oleh Persamaan. (1) menunjukkan koefisien difusi lipid, adalah ukuran manik simulasi. Protein dengan dilambangkan dengan lingkaran penuh, berlian, kotak, dan lingkaran terbuka, kotak, masing-masing. Bilah kesalahan lebih kecil dari ukuran simbol. Harap diperhatikan: Untuk visibilitas yang lebih baik, kurva yang terkait telah digeser oleh faktor kurva yang tidak bergeser kira-kira bertepatan dengan kurva paling atas. (b) Viskositas dalam Persamaan. (1) (ditampilkan di sini sebagai kuantitas tak berdimensi ) tidak bervariasi secara sistematis ketika meningkatkan kedalaman penetrasi protein. Sebaliknya, viskositas permukaan (ditunjukkan sebagai kuantitas tak berdimensi) menunjukkan peningkatan linier dengan kedalaman penetrasi.

Saat membedah , yaitu mengekstraksi kontribusi membran, perlu dicatat bahwa meskipun keduanya muncul dari gesekan dengan lipid. Kami mengaitkan perbedaan ini dengan kontak berbeda yang dibuat PMP dengan lipid: Sementara bagian bawah protein terutama bersentuhan dengan manik-manik ekor lipid, permukaan lateral terbenam dalam rantai lipid yang memanjang. Membandingkan koefisien difusi PMPs, kami menemukan bahwa mereka bervariasi secara maksimum antara yang terendah ( ) dan kedalaman penetrasi terbesar ( ). Oleh karena itu, mirip dengan protein transmembran dengan ketidakcocokan hidrofobik [38], [39] variasi mobilitas difusi sangat moderat.

Pengelompokan protein membran perifer dalam selebaran yang sama

Mengingat bahwa protein membran perifer mengganggu lapisan ganda lipid dan mengurangi derajat kebebasan lipid, orang mungkin mengharapkan pengelompokan protein dinamis yang digerakkan oleh entropi dalam analogi dengan pengamatan yang dilakukan untuk protein transmembran [10]. Oleh karena itu kami mempelajari sebagai langkah pertama perilaku pengelompokan dua protein membran perifer yang berada di selebaran yang sama.

Untuk menyelidiki dan mengkarakterisasi interaksi yang dimediasi membran dari protein membran perifer, kami menentukan energi bebas dari hubungan antara dua PMP. Untuk tujuan ini, kami menghitung potensi gaya rata-rata (PMF), melalui sampling payung dari distribusi jarak antar-protein (lihat [40], [41] untuk pengenalan rinci). Di sini, kami telah membatasi analisis kami pada pasangan protein identik dan memvariasikan jari-jari protein ( ) dan panjang bagian hidrofobik ( ).

Akibatnya, kami menemukan bahwa PMF untuk semua pasangan PMP dalam selebaran yang sama memiliki minimum yang dalam pada jarak antar-protein yang kecil (Gambar 5 a), yaitu ketika protein terletak berdampingan. Fitur ini menunjukkan keadaan terikat, yaitu pembentukan dimer (sementara). Di luar minimum di PMF, 2-3 minima sisi lemah muncul yang kemungkinan besar mencerminkan konfigurasi metastabil dengan 1-2 lipid di antara PMP. Untuk jarak antar-protein yang besar, PMF konvergen ke konstan, yaitu PMP tidak berinteraksi pada jarak yang lebih besar.

(a) Potensi perwakilan kekuatan rata-rata, , dari dua PMP ( ) yang berada di selebaran yang sama. Minimum terletak pada jarak yang diantisipasi di mana protein saling bersentuhan (garis putus-putus). Energi ikat meningkat dengan bertambahnya panjang hidrofobik protein ( , masing-masing ditunjukkan dalam warna hitam, merah dan hijau). Snapshot representatif menunjukkan konfigurasi protein dalam keadaan terikat dan tidak terikat. Gugus hidrofilik dan hidrofobik masing-masing ditunjukkan dalam warna merah/abu-abu dan biru/kuning. (b) Energi ikat meningkat dengan panjang bagian hidrofobik, . Sementara satu mengamati untuk jari-jari kecil ( ) hanya peningkatan yang sangat kecil dalam energi dimerisasi, peningkatan yang kuat terlihat untuk jari-jari yang lebih besar ( ).

Kedalaman minimum utama dibandingkan dengan nilai PMF yang jauh dari protein, yaitu, mencerminkan kekuatan pengikatan dan karenanya menentukan stabilitas dimer. Tergantung pada panjang bagian hidrofobik dan radius protein, kami mengamati nilai dalam kisaran (Gambar 5 b). Nilai eksperimental yang sebanding dilaporkan untuk asosiasi heliks transmembran yang dimediasi membran ( ) [42]. Kami mengamati energi ikat terlemah untuk dan ikat terkuat untuk (Gambar 5 b). Untuk panjang tertentu dari bagian hidrofobik, meningkat dengan jari-jari protein. Menariknya, lebar minimum utama hampir tidak berubah dengan radius protein ketika PMPs cukup pendek ( : lebar ). Untuk gugus hidrofobik yang lebih panjang ( ), lebarnya meningkat secara bertahap dengan jari-jari (hingga ).

Untuk menghubungkan PMF dengan stabilitas aktual dimer, selanjutnya kami menghitung rata-rata waktu lintasan pertama dari energi minimum ke keadaan tidak terikat. Memecahkan masalah Kramers untuk sumur potensial persegi, prediksinya adalah bergantung secara kuadrat pada lebar potensial dan secara eksponensial pada kedalaman potensial ( ). Oleh karena itu, kontribusi dominan untuk stabilitas dimer adalah . Sebagai hasil dari integrasi penuh, kami menemukan s ms (lih. Tabel S1, S2).Sebagai perbandingan, kami juga memantau masa pakai dimer yang telah terbentuk sebelumnya yang mungkin terdisosiasi karena gerakan difusi. Masa hidup yang dapat diakses dari pendekatan ini sangat sesuai dengan rata-rata waktu perjalanan pertama yang dihitung di atas.

Singkatnya, kami telah menemukan daya tarik yang dimediasi membran antara PMP dalam selebaran yang sama yang ditingkatkan untuk meningkatkan panjang dan jari-jari bagian hidrofobik. Secara khusus, kami mengamati bahwa kedalaman potensial agak kecil ( ) ketika jangkar hidrofobik protein tidak menembus selebaran yang berlawanan. Untuk protein dengan panjang dan jari-jari hidrofobik, kami menemukan nilai yang lebih besar yang menyoroti kecenderungan signifikan protein untuk dimerisasi. Perlu dicatat di sini bahwa pengelompokan PMP dalam selebaran yang sama juga diselidiki dalam studi simulasi terkait [31], namun PMF tidak ditentukan. Para penulis mengamati peningkatan ukuran cluster ketika protein menembus juga selebaran yang berlawanan sedangkan hampir tidak ada pengelompokan yang diamati untuk protein yang terbatas pada selebaran tunggal. Pengamatan ini konsisten dengan nilai energi yang ditemukan di sini.

Pengelompokan protein membran perifer dalam selebaran yang berlawanan

Untuk menjelaskan apakah protein membran perifer juga berinteraksi dan berpotensi dimerisasi ketika ditempatkan di selebaran yang berlawanan dari bilayer, kami memasukkan satu protein di masing-masing dari dua selebaran ( dan ) dan menentukan lagi potensi gaya rata-rata (PMF). Seperti di atas, kami secara sistematis memvariasikan jari-jari protein ( ) dan panjang bagian hidrofobik ( ).

Mirip dengan hasil kami di atas, semua PMF menunjukkan minimum yang dalam pada jarak antar-protein kecil yang menunjukkan keadaan dimerisasi metastabil (Gambar 6 a). Berbeda dengan PMP dalam selebaran yang sama, minimum PMF di sini biasanya terletak pada jarak yang sangat kecil ( ), yaitu PMP membentuk dimer selebaran silang di mana protein individu mengasumsikan konfigurasi bertumpuk (lih. snapshot pada Gambar 6 a) . Minimum global terkadang diikuti oleh penghalang tolak kecil pada jarak menengah yang harus diatasi untuk mencapai keadaan dimerisasi. Energi ikat, , bergantung pada radius protein dan kombinasi panjang hidrofobik , (Gambar 6 b). Pengikatan terkuat ditemukan untuk kombinasi PMP yang sangat pendek dan panjang ( dan ). Kombinasi yang melibatkan PMP yang paling cocok menjadi satu lapisan tunggal ( ) menunjukkan nilai sedang (dengan ). Pengikatan terlemah terlihat untuk , , dan kombinasi dan . Untuk meningkatkan jari-jari protein, bentuk karakteristik PMF dipertahankan, namun kedalaman sumur potensial ( ) meningkat, yaitu dimer menjadi lebih stabil. Perlu dicatat di sini bahwa ikatan kuat yang luar biasa, , muncul untuk radius terbesar ( , yaitu diameter protein 3-4 nm). Mengingat kesederhanaan model kami dan efek ukuran hingga yang tidak dapat dihindari yang dapat menekan bagian dari undulasi yang relevan dan mode bilayer peristaltik, nilai ini mungkin terlalu tinggi. Terlepas dari beberapa koreksi numerik yang mungkin diantisipasi untuk kasus ekstrem ini, kecenderungan keseluruhan untuk menstabilkan dimer untuk meningkatkan jari-jari adalah hasil yang konsisten dari simulasi kami.

(a) Potensi perwakilan kekuatan rata-rata, , dari dua PMP ( ) yang berada di selebaran yang berlawanan. Untuk kombinasi protein yang cukup pendek ( , kurva hitam , kurva merah) minimum muncul pada jarak hilang. Untuk sedikit peningkatan diamati sebagai akibat dari konstruksi PMP melalui manik-manik terbatas, yaitu konfigurasi (i) secara energetik kurang menguntungkan daripada pengaturan (ii). Untuk protein yang lebih panjang ( , kurva hijau), pengaturan PMP yang berdampingan diamati, dan minimum karenanya digeser ke jarak yang lebih besar. Cuplikan representatif menunjukkan pengaturan yang dibahas kelompok hidrofilik dan hidrofobik masing-masing ditunjukkan dalam warna merah/abu-abu dan biru/kuning. (b) Diagram fase untuk kemampuan dimerisasi saat mengubah panjang jangkar membran dan sepasang PMP. Nilai kode warna menunjukkan kekuatan pengikatan. Harap perhatikan skala logaritmik dari nilai kode warna yang ditandai dengan warna hitam.

Bentuk dimer bergantung secara signifikan pada panjang bagian hidrofobik dari PMP yang terlibat (lih. snapshot pada Gambar 6 a). Ketika panjang hidrofobik dari dua PMP cukup kecil ( atau ), protein membentuk dimer seperti tumpukan (susunan bawah ke bawah), dan lebar minimum global dalam PMF kira-kira diameter protein. Oleh karena itu, protein menarik satu sama lain selama mereka tumpang tindih. Untuk jarak yang lebih jauh, bagian tolakan kecil muncul di PMF, mencerminkan pekerjaan yang harus dilakukan untuk mengatur ulang lipid dan protein sebelum dimer dapat terbentuk. Ketinggian penghalang tolak ini terbesar ketika kedua protein sangat pendek ( , ) atau, pada tingkat lebih rendah, ketika salah satu sangat panjang ( , ). Secara khusus, kombinasi dua protein yang sangat pendek ( ) menghasilkan penghalang energi sehingga dimerisasi spontan dari protein ini sangat tidak mungkin. Ketika jangkar hidrofobik dari kedua protein menembus selebaran berlawanan ( dan ), mitra dimerisasi terletak berdampingan (lih. snapshot pada Gambar 6 a). Cekungan PMF yang menarik dalam kasus ini sangat mirip dengan hasil untuk PMP dalam selebaran yang sama, yaitu di luar jarak antar-protein hampir tidak ada daya tarik yang dapat diamati.

Seperti sebelumnya, kami juga menghitung rata-rata waktu lintas pertama sebagai ukuran untuk masa pakai dimer (lih. Tabel S3,S4). Dibandingkan dengan PMP yang berada di leaflet yang sama, dimer cross-leaflet umumnya lebih stabil karena minima yang lebih dalam dan lebih luas di PMF. Waktu pelepasan berkisar dari s hingga 100 mdtk dan seterusnya, yang menunjukkan bahwa rentang yang luas dari dimer selebaran yang cukup stabil dapat terbentuk. Sekali lagi, menyelidiki stabilitas dimer yang telah terbentuk sebelumnya dengan memantau disosiasi protein yang didorong secara difusi menghasilkan masa hidup yang serupa.

Meringkas hasil kami, kami telah menemukan bahwa mengubah radius dan/atau panjang hidrofobik dari sepasang protein membran perifer menyediakan sarana untuk menginduksi pengelompokan selebaran silang dari protein yang awalnya independen. Peristiwa dimerisasi semacam itu dapat dianggap sebagai pembentukan protein transmembran yang efektif dan metastabil. Pengamatan kami lebih lanjut menunjukkan bahwa kecenderungan dua protein untuk membentuk dimer rentang membran seperti itu tergantung pada dua parameter: (a) pada gangguan membran oleh setiap protein individu ketika protein lebih panjang atau lebih pendek dari ketebalan inang. monolayer, dan (b) pada pencocokan hidrofobik dari domain transmembran efektif dari dimer selebaran silang. Sesuai dengan pernyataan ini, kami menemukan bahwa kombinasi protein dengan menunjukkan dimerisasi yang kuat sudah pada jari-jari terkecil ( ). Sementara panjang masing-masing protein ini sangat cocok dengan ketebalan lapisan tunggal, dimer yang dihasilkan hanya memiliki ketidakcocokan hidrofobik yang sangat kecil ( dan , masing-masing). Sebaliknya, kombinasi protein menunjukkan waktu lepas yang lebih lama hanya untuk jari-jari besar ( ), karena menghasilkan kecocokan terbaik dengan ketebalan lapisan tunggal. Dalam kasus ketidakcocokan yang sangat kuat dari dimer ( ) dimerisasi yang signifikan dengan waktu lepas yang lama hanya terlihat untuk jari - jari yang sangat besar .

Membangun rakitan protein yang lebih besar

Untuk memeriksa apakah sejumlah besar protein membran perifer dalam selebaran yang berlawanan dapat menunjukkan oligomerisasi tingkat tinggi, kami memasukkan 5 PMP radius di setiap selebaran pada posisi acak. Protein bebas berdifusi dan beragregasi secara spontan. Untuk jari-jari yang lebih besar ( ), kami hanya menyematkan 3 protein di setiap selebaran untuk menghindari efek ukuran yang terbatas. Sekali lagi, panjang gugus hidrofobik, dari PMP divariasikan secara sistematis.

Sebagai hasilnya, kami menemukan dalam contoh pertama lagi pembentukan spontan dimer lintas-leaflet PMP yang telah kami amati sebelumnya (lih. Gambar 6). Selanjutnya, bagaimanapun, dimer ini menunjukkan kemampuan untuk membentuk rakitan yang lebih besar ketika dimer cukup lama untuk bertemu satu sama lain melalui difusi (Gambar 7 a). Secara khusus, kami mengamati pembentukan trimer dimer pra-rakitan untuk kombinasi dan . Dari kursus waktu simulasi, kami menentukan masa pakai trimer ini. Mereka meningkat dengan meningkatnya jari-jari dari ( ), ke ( ), dan ( ).

Dimer cross-leaflet (lih. Gambar 6) menunjukkan kemampuan untuk membentuk oligomer yang lebih besar, mis. trimer dimer untuk (kiri) atau cluster berdampingan yang besar untuk (kanan).

Untuk kombinasi dan kami mengamati pembentukan dimer cross-leaflet untuk radius terkecil ( ) tanpa pengelompokan berikutnya. Untuk jari-jari yang lebih besar ( ), bagaimanapun, sekali lagi muncul trimer dimer cross-leaflet dengan stabilitas yang meningkat. Dalam kasus yang dijelaskan, dimer selebaran silang memiliki panjang (jarak rata-rata kelompok kepala di protein atas dan bawah). Oleh karena itu, bagian transmembran efektif dari dimer selebaran silang menginduksi ketidakcocokan hidrofobik penggerak perakitan kecil ( ) dengan lapisan ganda yang tidak terganggu.

Kami juga mengamati dimerisasi/trimerisasi dimer untuk jari-jari besar ( ) ketika dimer yang terbentuk sebelumnya memiliki ketidakcocokan hidrofobik negatif, yaitu untuk dan ( ), untuk dan ( ), dan untuk dan ( ). Tidak ada oligomerisasi dimer yang lebih tinggi yang terlihat untuk dan , di mana dimer yang dibentuk sebelumnya memiliki ketidakcocokan yang hilang ( ). Kami menyimpulkan dari temuan ini bahwa ketidakcocokan hidrofobik absolut dari dimer (meta) stabil dari dua PMP menghasilkan daya tarik yang dimediasi membran yang dapat menyebabkan oligomerisasi dimer yang lebih tinggi. Hasil ini sesuai dengan gagasan bahwa bahkan ketidakcocokan hidrofobik kecil dari protein transmembran menghasilkan interaksi yang dimediasi membran yang menarik yang dapat mendorong pengelompokan sementara [10], [14]. Dimer cross-leaflet karenanya bertindak dalam hal ini mirip dengan protein transmembran.

Pembentukan tipe varian cluster besar diamati ketika PMP di selebaran yang berbeda menembus selebaran yang berlawanan ( , ) (Gambar 7 b). Cluster ini tidak terdiri dari entitas transmembran yang efektif seperti sebelumnya, melainkan merupakan perakitan protein yang berdampingan. Jumlah rata-rata protein dalam cluster adalah 3-6 dan masa hidup cluster adalah (sebagaimana ditentukan dari kursus waktu simulasi). Keduanya, ukuran dan stabilitas cluster meningkat lagi dengan meningkatnya panjang hidrofobik dan radius PMP yang terlibat. Pengelompokan terkuat diamati untuk radius terbesar ( ). Di sini, semua protein dalam membran dirakit menjadi hanya satu cluster besar yang stabil untuk seluruh simulasi ( ).

Untuk melengkapi hasil kami, kami juga melakukan simulasi di mana satu protein dengan jari-jari besar ( ) tertanam di selebaran membran bawah sementara 5 protein dengan jari-jari kecil ( ) terletak di selebaran atas. Akibatnya, kami mengamati bahwa protein kecil menunjukkan kecenderungan untuk berkumpul di atas protein besar yang terletak di selebaran yang berlawanan (Gambar 8 a). Derajat perakitan, yaitu jumlah protein kecil yang teroligomerisasi secara stabil dengan protein besar, bergantung pada kombinasi panjang gugus hidrofobik protein. Oligomerisasi kuat dengan masa hidup diamati, misalnya, untuk (protein besar) dan (protein kecil). Untuk kasus ini, biasanya dua protein kecil berkumpul di atas satu protein besar. Efek terkuat terlihat untuk dan : Empat protein kecil berkumpul di atas protein besar dan tinggal di sana selama seluruh waktu simulasi ( ). Memang, untuk alasan sterik paling baik empat protein kecil ( ) dapat ditempatkan di bawah satu protein besar ( ). Ketika protein kecil dan besar keduanya cukup panjang untuk mencapai selebaran yang berlawanan, yaitu dan , kami menemukan bahwa protein kecil tidak terletak di atas melainkan di tepi protein besar (lih. Gambar 8 a). Kami menemukan kluster yang sangat besar dengan , , di mana hingga empat protein kecil mengelilingi protein besar, sehingga membentuk oligomer pentamer (seumur hidup) yang lebih kecil dengan konfigurasi panjang protein yang sama stabil di seluruh simulasi ( ).

(a) Menggunakan protein dengan jari-jari yang berbeda, seseorang sering mengamati pengelompokan PMP kecil di bawah protein besar di selebaran yang berlawanan. Di selebaran bawah, satu PMP dengan jari-jari dan panjang bagian hidrofobik disematkan, sedangkan selebaran yang berlawanan menampung empat PMP dengan radius dan panjang bagian hidrofobik. Tergantung pada panjang gugus hidrofobik hingga empat PMP kecil yang dipasang secara stabil di atas satu PMP yang lebih besar di selebaran yang berlawanan (tingkat pengisian lingkaran yang mengkode jumlah PMP kecil). Dua potret representatif menggambarkan fenotipe yang representatif. (b) Pada membran yang tidak homogen, PMP juga sering berkumpul di bawah atau di sebelah mikrodomain lipid (tebal) di selebaran yang berlawanan.

Akhirnya, kami menyelidiki apakah perakitan protein yang dijelaskan di atas dalam selebaran yang berlawanan juga terjadi ketika salah satu protein digantikan oleh mikrodomain lipid. Untuk tujuan ini, kami membuat bilayer asimetris yang terdiri dari dua jenis lipid, dan , di mana 10% lipid di selebaran atas adalah lipid panjang, . Karena parameter yang dikenakan (lih. Metode) lipid panjang membentuk mikrodomain tebal (, jarak rata-rata kepala lipid ke ekor lipid) di selebaran atas. Satu PMP kemudian dimasukkan ke dalam selebaran homogen yang berlawanan. Sekali lagi, kami secara sistematis memvariasikan radius protein ( ) dan panjang hidrofobik ( ). Akibatnya, kami mengamati ko-lokalisasi lipid dan PMP dengan konformasi yang tepat tergantung pada parameter protein. Secara umum, protein dengan panjang pendek dan menengah ( ) berkumpul di atas mikrodomain lipid (Gambar 8 b). Sebaliknya, untuk dan kami mengamati bahwa lipid panjang lebih disukai terlokalisasi ke tepi protein, kadang-kadang bahkan mengelilinginya. Dengan demikian, juga pengelompokan PMP dan mikrodomain lipid (tebal) dalam selebaran yang berlawanan merupakan sarana pembentukan struktur pada membran.


Diskusi

Pembentukan nanocluster K-Ras, yang berfungsi sebagai sakelar digital skala nano sementara dalam aktivasi MAPK, sangat penting untuk transduksi sinyal Ras (5). Bagaimana nanocluster K-Ras.GTP terbentuk dan mekanisme apa yang beroperasi untuk mempertahankan fraksi cluster K-Ras pada tingkat yang konstan pada rentang konsentrasi K-Ras.GTP yang luas masih belum terpecahkan. Kami mengatasi masalah ini di sini menggunakan pemodelan in silico untuk menunjukkan bahwa interaksi antara K-Ras dan kumpulan sitosol Gal3 memainkan peran sentral dalam mendorong nanoclustering K-Ras pada membran plasma. Kami mengembangkan model matematika untuk mensimulasikan dinamika nanoclustering K-Ras pada membran plasma. Kami menerapkan algoritme genetika untuk mencari parameter model yang mungkin mampu mewujudkan pengamatan eksperimental dan untuk memvalidasi estimasi parameter optimal yang mewakili mekanisme tumbukan. Selain itu, metode komputasi dirancang untuk menghitung laju tumbukan protein berdasarkan laju difusi protein dan mekanisme difusi yang ditentukan secara eksperimental. Laju tumbukan yang dihitung adalah konstan pada rentang jumlah protein yang luas, mendukung penggunaan sistem reaksi homogen kami untuk menggambarkan difusi protein Ras dua dimensi pada membran plasma. Model berhasil mewujudkan fraksi konstan Ras berkerumun berdasarkan biokimia Gal3 yang diketahui dan, penting untuk dicatat, memprediksi bahwa mekanisme kunci untuk fraksi konstan ini adalah ketersediaan protein Gal3 dalam sitosol untuk perekrutan ke membran plasma. Lebih lanjut, simulasi kami menunjukkan bahwa kemungkinan pembentukan kompleks protein adalah parameter yang berguna untuk digunakan dalam kombinasi dengan laju tumbukan konstan untuk menentukan laju pengikatan yang mewujudkan data eksperimen.

Berdasarkan hasil EM kuantitatif dan pencitraan FLIM-FRET kami yang dipublikasikan (13), model in silico mengusulkan bahwa protein Gal3 direkrut ke membran plasma sebagai hasil tumbukan molekul dengan monomer K-Ras.GTP yang berdifusi bebas. Kompleks K-Ras.GTP-Gal3 yang dihasilkan dengan cepat berkumpul menjadi kompleks pentamerik yang didorong oleh interaksi molekuler antara protein penyusun Gal3. Nanocluster pentameric dapat mengakumulasi kompleks K-Ras.GTP atau K-Ras.GTP-Gal3 tambahan. Namun, simulasi kami menunjukkan bahwa kemungkinan keberhasilan penggabungan protein K-Ras tambahan setelah tumbukan dengan pentamer K-Ras.Gal3 harus jauh lebih rendah daripada selama perakitan pentamer, mungkin mencerminkan mekanisme retensi biofisik yang berbeda. Satu kemungkinan adalah bahwa kompleks yang relatif stabil dari lima protein K-Ras yang ditambatkan ke membran oleh domain polibasik dan pentamer Gal3 merombak lingkungan lipid skala nano dari cluster. Dengan analogi dengan pengikatan substrat C kinase kaya alanin yang dimirtoilasi ke membran plasma (36), remodeling akan melibatkan peningkatan konsentrasi lokal fosfolipid asam termasuk PS dan PIP2, memungkinkan perekrutan lebih lanjut dari protein K-Ras bermuatan positif, tetapi dengan afinitas yang lebih rendah daripada yang diwujudkan oleh interaksi protein-protein Gal3 langsung.

Apa pun mekanisme tepatnya, model yang telah kami rumuskan dengan tepat memberikan hasil penting dari pembentukan nanocluster K-Ras.GTP yang tidak bergantung konsentrasi dengan stoikiometri K-Ras yang diamati sebelumnya dan masa pakai nanocluster (8�). Model ini juga merekapitulasi hasil eksperimen kami yang baru-baru ini diterbitkan yang menunjukkan bahwa ketersediaan Gal3 dalam sitosol adalah penentu penting dari fraksi berkerumun K-Ras.GTP (13). Dengan demikian, mengubah ekspresi Gal3 secara langsung memodulasi transmisi sinyal melalui K-Ras (14,37). Temuan ini signifikan karena ekspresi Gal3 dan lokalisasi subselularnya berubah pada sejumlah tipe tumor (38). Mengingat bahwa fraksi berkerumun merupakan penentu penting dari sensitivitas sel terhadap aktivasi kaskade MAPK yang bergantung pada EGF (5), data baru melibatkan kumpulan sitosolik Gal3 sebagai modulator aktivasi MAPK oleh EGF serta output sinyal dari K-RasG12V mutan onkogenik. Secara keseluruhan, data ini mengimplikasikan perubahan ekspresi Gal3 dalam tumorigenesis yang dimediasi K-Ras.

Untuk sistem persamaan diferensial biasa yang memiliki solusi keadaan tunak, laju kinetik dalam model harus dibatasi oleh kondisi kesetimbangan sistem. Namun, simulasi kami menunjukkan bahwa sistem ini mungkin tidak sepenuhnya seimbang misalnya, ketika kami mengubah nilai pasangan parameter, seperti A1 dan D1, secara simultan dan proporsional, sifat kesetimbangan sistem diubah. Selain itu, distribusi ukuran nanocluster yang disimulasikan tidak menjadi eksponensial atau memiliki agregat besar yang ukurannya diskalakan dengan jumlah total molekul.Pengamatan ini menunjukkan bahwa pembentukan nanocluster diatur oleh proses nonquilibrium kunci tertentu. Memang, sistem mencakup sejumlah reaksi searah, seperti pembongkaran nanocluster dan pemisahan kompleks Ras-Gal3 dalam nanocluster. Selain itu, pembentukan cepat pentamer Gal3 menghasilkan tingkat pengikatan yang sangat berbeda untuk rakitan pentamer Ras-Gal3 versus pertumbuhan nanocluster sebagai akibat dari tumbukan Ras dan Ras-Gal3 tambahan. Analisis yang lebih rinci tentang interaksi antara reaksi seimbang dan tidak seimbang melalui solusi kondisi tunak akan menarik untuk diikuti. Namun, ini bukan latihan sepele, karena sistem model kami mencakup 27 persamaan dan persamaan yang melibatkan spesies K-Ras.GTP, Gal3, dan Ras-Gal3ꂠ adalah kompleks. Di masa depan, pendekatan teoretis lainnya, seperti metode persamaan utama, dapat digunakan untuk menganalisis kinetika kluster nano dan memberikan wawasan yang lebih dalam tentang fisika yang mendasari pembentukan kluster nano.

Sejumlah protein berlabuh lipid telah terbukti beroperasi dalam nanocluster yang berbeda pada selebaran bagian dalam dan luar membran plasma, termasuk isoform Ras dan protein berlabuh GPI lainnya (7𠄹,39,40). Semua protein ini menunjukkan fraksi cluster yang tidak tergantung konsentrasi dan kelebihan monomer di atas protein cluster, meskipun dengan jumlah protein yang berbeda di setiap nanocluster. Meskipun model yang kami kembangkan khusus untuk nanoclustering K-Ras, inti dari model tersebut adalah mekanisme yang secara cepat mendorong interaksi kooperatif antara monomer dan dimer. Untuk K-Ras, kooperatifitas ini disediakan oleh ikatan protein-protein. Dalam upaya untuk menggeneralisasi model, kami berspekulasi bahwa mekanisme inti serupa mungkin beroperasi untuk protein nanoclustered lainnya, mungkin didorong oleh interaksi protein-protein atau protein-lipid. Hipotesis semacam itu mudah ditelaah dengan simulasi dan eksperimen dan memungkinkan definisi prinsip biofisik umum untuk organisasi non-acak protein berlabuh lipid pada membran plasma.


Evaluasi Korelasi Protein Siklus Sel dan Interaksi Ki-67 Pada Sinus Paranasal Prognosis Inverted Papilloma dan Transformasi Karsinoma Sel Skuamosa

Papiloma terbalik sinonasal (IP) berulang dapat diubah menjadi karsinoma sel skuamosa sinonasal. Kami menggunakan pola ekspresi protein dengan metode imunohistokimia untuk melihat apakah ekspresi p53, p16, p21, dan p27 milik regulator siklus sel dan PCNA (proliferating cell nuclear antigen) dan Ki-67 penanda proliferasi pada enam puluh pasien dengan sinonasal inverted papiloma, dan 10 di antaranya dengan transformasi karsinoma sel skuamosa. Peningkatan kadar Ki-67, p27, dan PCNA secara signifikan dalam IP dengan transformasi karsinoma sel skuamosa saluran sinonasal dibandingkan dengan papiloma terbalik terungkap. Tidak ada variasi p16, p21, PLUNC (langit-langit, paru-paru, dan protein klon epitel hidung) dan ekspresi p53 yang berkorelasi dengan transformasi maligna IP sinonasal dengan survei multivariat. Namun, kami menemukan peningkatan ekspresi PLUNC dalam IP dengan beberapa pengulangan. Akhirnya, kami menemukan bahwa PCNA, p27 dapat berinteraksi dengan CDK1 yang mendorong proliferasi sel IP dan berkorelasi dengan karsinoma sel skuamosa sinonasal. Ki-67 dapat bekerja sepanjang siklus sel untuk menyebabkan transformasi ganas. Kesimpulannya, ini adalah studi pertama yang menunjukkan korelasi Ki-67, PCNA berinteraksi dengan CDK1 dapat menyebabkan transformasi ganas. Peningkatan ekspresi PLUNC dalam IP sinonasal terkait dengan beberapa kekambuhan pada manusia.

1. Perkenalan

Papiloma terbalik (IP) adalah jenis tumor di mana sel-sel epitel permukaan tumbuh ke bawah ke jaringan pendukung di bawahnya. Kandung kemih, pelvis ginjal, ureter, uretra, hidung, dan sinus paranasal merupakan area yang memungkinkan terjadinya IP [1]. Epistaksis dan sumbatan hidung disertai nyeri wajah atau sakit kepala menyerang saat mukosa hidung atau sinus menyandang IP [2]. Meskipun IP yang berasal dari membran pernapasan termasuk neoplasma epitel jinak, invasif lokal, tingkat kekambuhan yang lebih tinggi, dan transformasi ganas membuatnya sulit untuk diobati [3]. Tingkat transformasi keganasan adalah 5-10% dan banyak dari mereka yang sinkron dengan karsinoma sel skuamosa [4]. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) bertindak sebagai ekspresi antigen dalam inti sel pada fase sintesis DNA selama siklus sel dan mempertimbangkan prognosis kanker, tetapi hubungannya dengan IP masih kontroversial [5].

Cyclin dan cyclin dependent kinase (CDK) mengambil peran penting dalam siklus sel selama proliferasi dan mempengaruhi fase siklus sel yang berbeda [6-9]. CDK1 adalah inisiator yang sangat penting untuk proliferasi sel dan faktor transformasi maligna [10]. Sebaliknya, penghambat p21, P27, dan CDK, membatasi CDK dan menghentikan siklus sel [8]. P21 adalah penghambat CDK fase sel G1 yang menahan masuknya sel ke fase S. P27 juga dapat mengikat CDK dan bertindak sebagai CDKI sebagai p21. P27 berinteraksi dengan kompleks cyclin E-CDK2, cyclin A-CDK2, dan cyclin D1-CDK4, mempengaruhi proliferasi sel dan apoptosis [6, 7].

Penanda proliferasi antigen Ki-67, dideteksi dengan antibodi monoklonal MIB-1, diekspresikan di semua fase sel G1, S, G2, dan M kecuali G0 [8]. Ekspresi Ki-67 juga berkorelasi dengan perilaku tumor, derajat tumor patologis, dan kekambuhan dini pada berbagai karsinoma [11-15].

Mengenai IP yang diubah atau disinkronkan dengan kanker, kami juga melakukan studi IHC p16, p53, Ki-67, dan PLUNC (langit-langit, paru-paru, dan epitel hidung). P16 adalah protein supresor tumor yang memperlambat fase sel G1 ke S dan mencegah transformasi keganasan [8]. PLUNC adalah bahan imun bawaan yang memiliki efek antikanker untuk kanker nasofaring tetapi tidak ada penelitian yang mengungkapkan relevansinya dengan IP sinonasal [16].

Survei PCNA, p53, p21, p27, dan Ki-67 dilakukan untuk melihat apakah mereka berkorelasi dengan luas tumor dan hasil pengobatan IP sinonasal [8].

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki peran pengatur siklus sel p53, p21, p27, penanda proliferasi Ki-67, p16, PCNA, dan bahan imun bawaan PLUNC dalam kekambuhan dan transformasi ganas untuk IP sinonasal. Kami juga telah mensurvei apakah kemungkinan faktor prediksi Ki-67, PCNA, dan p27 berkorelasi dengan CDK dengan simulasi komputasi akhirnya untuk memberikan penjelasan yang mungkin tentang mekanisme Ki-67, PCNA, dan p27 terhadap CDK dalam prognosis IP.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

Dari Departemen Rumah Sakit Universitas Kedokteran China dari Januari 2000 hingga Juni 2010, 60 kasus IP sinonasal dan 10 kasus IP dengan transformasi karsinoma sel skuamosa dikumpulkan dan ditinjau dari catatan medis secara retrospektif. Semua jaringan yang difiksasi dalam formalin 10% dan disiapkan dalam parafin digunakan untuk studi IHC dengan metode kompleks avidin-biotin-peroksidase. Antibodi monoklonal tikus (mAb), anti-p16 (Neomarker, DCS-50, 200 mg/L), anti-p21 (Neomarker, MS 387-P, 200 mg/L), anti-p27 (Neomarker, MS 256-P , 200 mg/L), anti-p53 (Neomarker, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarker RM 9106-S) PCNA, dan PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) digunakan untuk imunohistokimia melalui metode streptavidin-biotin peroksidase [11]. Xilena digunakan untuk deparafinisasi semua bagian jaringan dan kemudian direhidrasi dengan seri alkohol, dan akhirnya dijenuhkan dalam air suling. Kemudian jaringan digeser ke dalam phosphate-buffered saline dengan menambahkan larutan hidrogen peroksidase 0,3% untuk memblokir aktivitas endogen peroksidase pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian buffer Tris dibilas setelahnya. Bagian kemudian direbus dengan oven microwave selama 15 menit dalam larutan buffer sitrat (pH 10 mmol/L, 6,0). Antibodi primer p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67, dan PLUNC diaplikasikan satu per satu selama 60 menit pada suhu kamar [11].

Kemudian ditambahkan antibodi penghubung dan kompleks streptavidin peroksidase (DAKO LSAB Kit, K-0675 Carpinteria, CA) selama 15 menit pada suhu kamar. Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 0,05% digunakan selama 15 menit untuk pewarnaan jaringan dan akhirnya dicuci dua kali oleh buffer Tris [8, 11].

Bagian-bagian itu diwarnai dengan hematoxylin Mayer setelah dicuci dengan air deionisasi. Inti yang diimunisasi dikuantifikasi dalam setiap kasus. Semua penghitungan dilakukan di bawah mikroskop cahaya standar di bidang 1000x untuk mengevaluasi inti positif / jumlah sel. Sepuluh bidang atau setidaknya 500 sel dihitung pada setiap bagian. Bagian tumor dianggap negatif jika pewarnaan tidak ada atau ada pada <10% sel tumor. Skor 1+ diberikan ketika 10-30% sel positif terhadap reaksi. Skor 2+ diberikan ketika 30-50% sel positif terhadap reaksi. Skor 3+ diberikan ketika >50% dari sel-sel positif terhadap reaksi, masing-masing (Tabel 1 dan 2) [17]. Signifikansi statistik dianalisis menggunakan uji chi-kuadrat Pearson atau uji eksak Fisher untuk analisis univariat dan uji regresi logistik ganda digunakan untuk analisis multivariat. Hasil dianggap signifikan secara statistik ketika

Docking protein-protein dilakukan oleh program ZDOCK [18] untuk menganalisis tiga faktor prognostik yang mungkin untuk transformasi ganas yang terikat pada CDK1. Untuk membuat mekanisme yang mungkin untuk apa yang kami temukan dalam penelitian ini, kami menghitung interaksi Ki-67, p27, dan PCNA ke CDK1 dengan biologi komputasi. Kami selanjutnya menggunakan program GROMACS 4.5.5 [19] untuk mengamati stabilitas kompleks setelah predikasi pengikatan ZDOCK. Lingkungan sistem MD diatur dalam pemodelan air TIP3P dengan kotak air jarak 1,2 nm yang berisi ion Na dan Cl dalam konsentrasi 0,145 M NaCl untuk netralisasi sistem. Pertama, kami menetapkan 5.000 langkah siklus dalam algoritme penurunan paling curam untuk minimalisasi energi. Kedua, kondisi dinamika suhu konstan (tipe NVT) digunakan untuk menyediakan simulasi MD untuk ekuilibrasi dan dilakukan dalam periode waktu 1 ns. Pada langkah terakhir, dinamika tekanan dan suhu konstan (tipe NPT) ditetapkan untuk proses produksi dalam periode waktu 5000 ps. Suhu sistem selama proses simulasi ditetapkan sebagai 310 K. Untuk analisis lintasan, kami menggunakan perangkat lunak GROMACS 4.5.5 untuk menghitung deviasi kuadrat rata-rata akar (RMSD) dan radius girasi (Rg), masing-masing. Serangkaian data konformasi MD disurvei setiap 20 ps dari semua proses produksi.

3. Hasil

Ada total 55 laki-laki dan 15 perempuan termasuk dalam penelitian ini. Enam puluh di antaranya adalah IP dan 10 lainnya adalah IP sinonasal yang dikumpulkan dengan transformasi maligna. Umurnya adalah

tahun berkisar antara 25 sampai 78 tahun. Pewarnaan menunjukkan peningkatan kadar PLUNC secara signifikan, tetapi menurunkan kadar Ki-67, p53, p21, dan p27 pada pasien dengan beberapa kekambuhan IP (Tabel 1). Kami juga menemukan peningkatan PCNA, Ki-67, dan p27 pada IP sinonasal dengan transformasi karsinoma sel skuamosa dibandingkan dengan IP sinonasal saja tanpa keganasan sinkron (Tabel 2). Ekspresi PLUNC yang meningkat berkorelasi dengan beberapa operasi sinus pada pasien dengan IP sinonasal. Namun, tingkat ekspresi PLUNC tidak berkorelasi dengan transformasi ganas IP menjadi SCC. Kami juga menunjukkan ekspresi IHC tingkat yang berbeda untuk PCNA, Ki-67, p27, dan PLUNC pada Gambar 1, 2, 3, dan 4. MRI atau CT scan pra operasi semuanya dilakukan untuk semua pasien seperti pada Gambar 5 dan 6 .


(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B)
(A)
(B) Sinus MRI (tampilan koroner) dan CT scan sinus (tampilan aksial) papiloma terbalik sinonasal dengan transformasi ganas.

Pewarnaan imunohistokimia Ki-67 yang meningkat ditemukan di kedua IP sinonasal dengan kekambuhan ganda dan transformasi ganas dalam analisis univarian dan multivarian kami dengan uji chi-kuadrat Pearson dan uji regresi logistik ganda seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan 2 dan Gambar 2 (a). Oleh karena itu, indeks Ki-67 yang tinggi dapat dianggap sebagai faktor penting untuk prognosis dan penanda prediksi keganasan. Kami bahkan dapat menggabungkan survei tingkat ekspresi Ki-67 dan PCNA IHC yang meningkat secara signifikan dan tingkat p27 yang lebih rendah untuk memprediksi tren transformasi ganas yang lebih tinggi pada pasien dengan IP sinonasal dalam survei kami.

Oleh karena itu, kami melakukan beberapa analisis docking dengan studi dinamika molekuler akhir antara apa yang kami temukan sebagai faktor prognosis PCNA dan CDK1, Ki-67 dan CDK1, serta p27 dan CDK1 yang semuanya menunjukkan docking yang stabil pada Gambar 7 dan skor dockingnya juga ditunjukkan oleh program ZDOCK. ZDOCK menghasilkan 10 pose docking teratas dari CDK1 dan Ki-67, CDK1-p27, dan CDK1-PCNA. Kami memilih skor docking terbaik untuk menganalisis stabilitas interaksi protein-protein. Ki-67, p27, dan PCNA ke skor pengikatan CDK1 masing-masing adalah 20,92, 21,72, dan 24,32 oleh program ZDOCK. Residu utama adalah Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15 yang merupakan domain pengikat utama untuk Ki-67 dan p27 ke CDK1 yang ditunjukkan dalam pita merah (Gambar 7). Kami selanjutnya melakukan analisis MD untuk residu utama ini untuk melihat interaksi ketiga protein ini dengan CDK1. Setelah simulasi MD kompleks CDK1 dengan Ki-67, p27, dan PCNA, kami melakukan analisis RMSD untuk waktu simulasi 5000 ps. Ketiga protein (Ki-67, p27, dan PCNA) dinyatakan memiliki fluktuasi yang stabil setelah waktu simulasi 1000 ps (Gambar 8).


(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Pose docking terbaik CDK1 (hijau) dengan protein target (biru): (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA. Sepuluh kompleks protein-protein teratas dengan skor ZDOCK dihasilkan oleh program ZDOCK. Skor ZDOCK tertinggi pada Ki-67, p27, dan PCNA masing-masing adalah 20,92, 21,72, dan 24,32. Residu pengikat utama Ki-67 dan p27 diwarnai dengan warna merah, dan residu utama termasuk Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15.

(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Analisis RMSD dari semua atom kompleks CDK1 dengan (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps. Semua kompleks cenderung berfluktuasi stabil setelah waktu simulasi 1000 ps.

Pada Gambar 9, kami menghitung rotasi radius protein untuk periode waktu simulasi 5000 ps. Ketiga kompleks tersebut cenderung memiliki nilai radius girasi yang rendah dan fluktuasi yang stabil pada semua simulasi MD, yang menunjukkan adanya kompleks yang dipadatkan antara masing-masing struktur protein. Metode SASA (area of ​​solvent) digunakan untuk sifat hidrofobik ketiga kompleks, ketiganya menjadi stabil fluktuasi dan juga menunjukkan perubahan hidrofobik yang stabil antara setiap interaksi protein-protein (Gambar 10). Selain perhitungan energi total sistem MD untuk masing-masing dari tiga kompleks selama waktu simulasi 5000 ps, ​​mereka semua memiliki variasi energi yang stabil dalam kisaran 9,27 × 10 5 , 9,30 × 10 5 , dan 1,66 × 106 , masing-masing (Gambar 11). Hasil analisis energi menunjukkan bahwa semua sistem simulasi stabil selama 5000 ps. Dalam analisis fluktuasi residu, kami mengukur nilai RMSF dari semua residu untuk ketiga kompleks (Gambar 12). Dalam validasi RMSF kompleks CDK1-Ki67, ada fluktuasi signifikan yang diamati pada residu dari 38 hingga 43 CDK1, yang memiliki perubahan besar selama simulasi MD (Gambar 12(a)). Ada juga variasi signifikan yang diamati pada residu dari 25 hingga 40 pada struktur protein p27 selama simulasi MD yang menunjukkan perubahan besar di wilayah ini. Sebaliknya, ada variasi RMSF yang lebih sedikit dalam residu dari 100 hingga 200 pada struktur protein PCNA selama simulasi MD. Oleh karena itu, ada lebih sedikit perubahan RMSF selama simulasi MD di PCNA daripada Ki-67 dan p27.


(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Jari-jari girasi kompleks CDK1 dengan (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps. Nilai radius girasi yang rendah menunjukkan kompleks yang dipadatkan antara dua struktur protein.


Analisis SASA (area of ​​solvent) dari semua konformasi kompleks untuk definisi hidrofobik selama 5000 ps fluktuasi stabil menunjukkan tidak ada perubahan yang jelas antara interaksi protein-protein.

(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Perhitungan energi total sistem MD (a) Ki-67, (b) p27 dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps, ​​masing-masing fluktuasi rata-rata adalah 9,27 × 10 5 , 9,30 × 10 5 , dan 1,66 × 10 5 , masing-masing.

(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Analisis RMSF residu protein pada (a) CDK1 dan Ki-67, (b) CDK1 dan p27, dan (c) CDK1 dan PCNA selama waktu simulasi 5000 ps. Nilai fluktuasi RMSF yang tinggi menunjukkan variasi struktur protein yang kuat pada semua simulasi MD.

Namun, analisis migrasi mengungkapkan bahwa PCNA memiliki jarak yang jauh antara CDK1 dibandingkan dengan Ki-67 dan p27 selama survei simulasi MD 5000 ps. Meskipun kami menemukan jarak terbesar antara PCNA dan CDK1 (Gambar 13(a)), tetapi ikatannya yang stabil ditunjukkan pada Gambar 12 dengan analisis RMSF. Selain itu, mean square displacement (MSD) PCNA memiliki migrasi yang lebih kecil (Gambar 13(b)). Kami selanjutnya menganalisis residu utama CDK1 untuk pengikatan Ki-67 dan p27. Residu pengikat utama meliputi Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15 pada sudut dihedral struktur protein Ki67-CDK1 selama waktu simulasi 5000 ps. Semua residu pengikat stabil selama simulasi MD keseluruhan. Namun, hanya ada sudut dihedral yang stabil di Gly9, Ser10, Leu12, dan Val15 pada kompleks protein p27-CDK1 selama semua waktu simulasi MD. Akhirnya, kami menemukan bahwa semua residu pengikat utama termasuk Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14, dan Val15 pada struktur protein PCNA-CDK1 memiliki sudut dihedral pengikatan yang stabil selama seluruh simulasi MD tidak ada perubahan yang lebih besar yang ditemukan selama proses PCNA mengikat CDK1 (Gambar 14). Analisis Cluster digunakan untuk memilih struktur perwakilan di antara semua frame MD. Untuk uji perbandingan snapshot, struktur yang diwakili dipilih dari grup pengelompokan terakhir untuk semua bingkai MD dari kompleks CDK1 Ki67, P27, dan PCNA yang dipindahkan masing-masing pada 4860 ps, ​​2740 ps, ​​dan 3880 ps, ​​selama waktu simulasi 5000 ps (Gambar 15). Studi perbandingan snapshot untuk CDK1 dan protein target untuk Ki-67, p27, dan PCNA ditunjukkan pada Gambar 16.Kami menemukan bahwa residu CDK1 dari 38 hingga 43 pada CDK1 mendekati Ki-67 dari 0 ps hingga 4860 ps (Gambar 16(a)). Hasilnya berkorelasi dengan analisis RMSF karena fluktuasi yang tinggi pada residu dari 38 menjadi 43 ikatan CDK1 untuk Ki-67. Untuk analisis snapshot CDK1-p27, p27 mendekati CDK1 dari 0 ps hingga 2740 ps. Temuan ini juga berkorelasi dengan analisis RMSF karena variasi yang tinggi pada residu dari 25 hingga 40 ikatan p27 untuk CDK1 (Gambar 16(b)). Kami hanya dapat menemukan perubahan kecil dari satu loop PCNA (biru) menjauh dari CDK1 (hijau) pada 3880 ps pada residu dari 100 hingga 200 pada interaksi PCNA dan CDK1 (Gambar 16(c)). Hasil ini juga berkorelasi dengan analisis RMSF untuk fluktuasi kecil pada residu dari 100 hingga 200 ikatan PCNA untuk CDK1.


(A)
(B)
(A)
(B) Analisis migrasi kompleks selama waktu simulasi 5000 ps: (a) jarak antara CDK1 dan protein yang ditambatkan sepanjang waktu MD dan (b) analisis mean square displacement (MSD) untuk semua kompleks CDK1 nilai MSD yang tinggi menunjukkan jarak migrasi protein yang tinggi membentuk posisi awal.


Sudut dihedral residu pengikatan kunci: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14, dan (g) Val15 pada struktur protein CDK1 selama waktu simulasi dari 5000 ps. Sudut dihedral dihitung untuk kompleks CDK1 dengan protein pengikat target: Ki-67, p27, dan PCNA selama semua waktu simulasi MD.

(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Analisis cluster dari semua CDK1 dan protein pengikat: (a) Ki-67, (b) p27, dan (c) PCNA selama waktu simulasi 5000 ps, ​​struktur yang diwakili dipilih dari grup pengelompokan terakhir untuk semua bingkai MD dari kompleks CDK1 . Struktur terwakili dari kompleks Ki-67, p27, dan PCNA dipindahkan masing-masing pada 4860 ps, ​​2740 ps, ​​dan 3880 ps.

(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C) Perbandingan antara snapshot awal (0 ps) dan konformasi yang diwakili untuk semua kompleks CDK1. (a) Salah satu loop CDK1 (hijau) bergerak mendekati Ki-67 (biru) pada 4860 ps. (b) Struktur protein p27 (biru) terikat pada CDK1 (hijau) lebih erat pada 2740 ps. (c) Salah satu loop PCNA (biru) menjauh dari CDK1 (hijau) pada 3880 ps.

Untuk meringkas hasil dalam penelitian dan tinjauan literatur kami, mekanisme molekuler Ki-67, p27, dan PCNA berinteraksi dengan CDK1 untuk proliferasi sel dan transformasi ganas pada pasien dengan IP sinonasal ditunjukkan pada Gambar 17.


4. Diskusi

Walaupun papiloma inverted jarang terjadi pada traktus sinonasal, tetapi sifat mudah rekuren dan transformasi maligna sering mengganggu pasien dan dokter. Tindak lanjut rutin seumur hidup diperlukan untuk deteksi dini kekambuhan atau perubahan ganas dan dapat mengarah pada pengendalian penyakit yang lebih baik untuk pasien IP [9, 20].

Ki-67 mempromosikan inisiasi fase G1 dari G0 dalam sel IP, dan mempertahankan ekspresi untuk siklus sel dalam fase proliferasi. Ki-67 merupakan protein yang mempengaruhi siklus sel pada fase proliferasi dari G1-S-G2-M kecuali fase G0 [8, 11, 14]. Dalam literatur yang melaporkan mutasi p53, p63, p21, dan p27 menginduksi IP sinonasal dengan transformasi SCC, masih ada perdebatan [6, 11, 14]. Ki-67 baru-baru ini dilaporkan terjadinya sinonasal neoplasma [21] perilaku tumor agresif berkorelasi dengan indeks Ki-67 yang lebih tinggi dan menyebabkan epitel hidung displasia parah dan bahkan karsinoma sel skuamosa [22]. Ki-67 yang meningkat bahkan dapat ditemukan di IP yang secara serempak mengandung karsinoma sel skuamosa. Ki-67 juga akan mempengaruhi p21, p27, dan CDK [8, 11, 12, 14]. Namun, kami tidak dapat menyimpulkan apakah penurunan p27 disebabkan oleh peningkatan ekspresi Ki-67 dalam jaringan IP sinonasal. Studi lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan hubungan antara Ki-67 dan P27.

Fungsi penekanan tumor p53 terkait dengan banyak kanker yang dilaporkan oleh Katori et al. dan Gujrathi dkk. [22, 23]. Mereka menyarankan bahwa pengujian untuk p53 dapat membantu untuk menyaring lesi papiloma dengan potensi displasia atau karsinoma, namun kami tidak menemukannya signifikan dalam analisis multivariat. Ini karena jumlah pasien yang terbatas dalam penelitian kami. Namun, tidak hanya p53 tetapi juga p63 yang diekspresikan dalam IP dengan transformasi maligna [11].

Peningkatan aktivitas proliferatif dengan peningkatan ekspresi Ki-67 sel tumor dilaporkan sebagai penanda prognostik penting pada banyak tumor manusia, juga penting dalam kekambuhan IP dan kanker. Khususnya, suspek Ki-67 secara langsung mempengaruhi siklus sel selama fase proliferasi dan dapat berinteraksi dengan gen supresor tumor p53, p21, dan p27 dan memodulasi siklus sel dengan mempengaruhi pos pemeriksaan fase G1 [8, 24, 25]. Ki-67 baru-baru ini ditemukan memiliki interaksi antara CDK1 dalam struktur alam dan biologi molekuler [26] dan CDK1 mengambil peran utama dalam proliferasi sel dan bahkan transformasi ganas [10]. Kami menduga bahwa Ki-67 tidak hanya memprakarsai pintu masuk sel IP ke fase G1 dari siklus sel tetapi juga menyebabkan transformasi ganas dalam inti sel dengan mempengaruhi CDK1.

Peran klinis p21 dan p27 terhadap kanker SCC kepala dan leher masih diperdebatkan, tetapi kami menemukan bahwa tingkat p27 yang lebih rendah juga terungkap dalam IP sinonasal dengan transformasi ganas dalam penelitian kami. Meskipun ada beberapa penelitian p21 dan p27 yang melaporkan korelasi IP manusia dengan kanker, perdebatan masih tetap ada. Beberapa dengan Oncel et al. [11, 27] dan beberapa menentang [25, 28] diamati.

Selain Ki-67, kami juga menemukan PCNA, prediktor untuk transformasi ganas IP dalam kolaborasi dengan CDK1. Dalam IP kami dengan transformasi ganas, PCNA dan Ki-67 ditingkatkan oleh pewarnaan IHC.

Seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ekspresi PCNA dalam IP dengan transformasi ganas dari survei kami, kami menduga PCNA menjadi faktor penting untuk menginduksi kanker pada pasien dengan IP sinonasal. Baru-baru ini, juga ditemukan peningkatan PCNA pada IP dibandingkan dengan polip sinonasal oleh Mumbuc et al. [3]. PCNA dapat berinteraksi dengan CDK1 dan mendorong masuknya sel ke dalam siklus sel yang mengakibatkan proliferasi dan kanker.

Akhirnya, kami mensurvei PLUNC ke IP sinonasal dengan kanker karena sering dilaporkan menyebabkan pembentukan kanker nasofaring. Dalam penelitian kami sebelumnya, ekspresi PLUNC menurun pada sinusitis pseudomonas dalam status penyakit kronis [29]. PLUNC juga berkorelasi dengan rinosinusitis kronis dengan beberapa kolonisasi bakteri [17]. Selain itu, PLUNC juga diharapkan memiliki fungsi antiinfeksi dan antibiofilm [30, 31]. Karena seharusnya memiliki antikankerisasi karsinoma nasofaring [32], tetapi kami tidak menemukan korelasi IP sinonasal dengan transformasi SCC. Sebaliknya, kami hanya dapat menemukan peningkatan ekspresi PLUNC pada pasien dengan IP sinonasal dengan beberapa rekurensi dan operasi revisi sinus. Mekanisme lebih lanjut dan alasan peningkatan ekspresi PLUNC dan kekambuhan ganda harus disurvei lebih lanjut di masa mendatang.

Desain Obat Berbantuan Komputer (CADD) dapat digunakan untuk menyelidiki lebih lanjut penelitian klinis atau penyakit, termasuk penelitian penyakit [33], studi faktor risiko [34], laporan kasus, dan mekanisme molekuler. Dalam hasil docking dan dinamika molekuler PCNA, Ki-67, dan p27 ke CDK1, kami menemukan bahwa ketiganya memiliki docking yang stabil ke CDK1. Dan p27 seharusnya memiliki interaksi yang lebih stabil dengan CDK1 untuk bekerja sebagai penghambat IP sinonasal dengan kanker. PCNA dan Ki67 dianggap sebagai promotor dan mempromosikan proliferasi sel dan kanker pada IP sinonasal.

Kesimpulannya, ini adalah studi pertama yang menunjukkan bahwa Ki-67, PCNA, dan p27 semuanya penting dalam kekambuhan IP dan kanker melalui CDK1. Dan kami juga yang pertama menemukan ekspresi PLUNC yang meningkat dalam beberapa IP sinonasal berulang. Namun, mekanisme survei lebih lanjut masih diperlukan di masa mendatang. Studi komputasi saat ini semuanya kompatibel dengan studi lab basah kami yang membuat penelitian kami lebih dapat dipercaya dan dapat diterapkan pada pengobatan masa depan terhadap pasien dengan penyakit tersebut. Oleh karena itu, pasien dengan IP sinonasal dan menunjukkan peningkatan Ki-67, PCNA, dan penurunan p27 harus dianggap memiliki kemungkinan transformasi ganas yang lebih tinggi dan harus diikuti lebih dekat dalam praktik klinis [35].

Konflik kepentingan

Para penulis menyatakan bahwa tidak ada konflik kepentingan sehubungan dengan penerbitan makalah ini.

Ucapan Terima Kasih

Penelitian ini didukung oleh hibah dari National Science Council of Taiwan (NSC101-2314-B-039-013-MY3, NSC102-2325-B039-001, NSC102-2221-E-468-027), dari China Medical University ( CMU102-BC-3), dari Asia University (ASIA100-CMU-2, ASIA101-CMU-2, dan 102-ASIA-07), dan dari China Medical University Hospital (DMR-102-001, DMR-103-025, DMR-103-058, DMR-103-001, dan DMR-103-096). Studi ini juga didukung sebagian oleh Taiwan Department of Health Clinical Trial and Research Center of Excellence (DOH102-TD-B-111-004) dan Taiwan Department of Health Cancer Research Center of Excellence (MOHW103-TD-B-111-03 ), dan CMU di bawah target Top University Plan Kementerian Pendidikan Taiwan.

Referensi

  1. W. Lawson dan Z. M. Patel, "Evolusi manajemen untuk papiloma terbalik: analisis 200 kasus," Otolaringologi—Operasi Kepala dan Leher, jilid. 140, tidak. 3, hlm. 330–335, 2009. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  2. K. C. Chen, S. S. Chang, H. J. Huang, T. Lin, Y. Wu, dan C. Y. Chen, “Three-in-one agonis untuk PPAR-α, PPAR-γ, dan PPAR-δ dari pengobatan tradisional Tiongkok,” Jurnal Struktur dan Dinamika Biomolekuler, jilid. 30, tidak. 6, hlm. 662–683, 2012. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  3. S. Mumbuc, M. Karakok, T. Baglam, E. Karatas, C. Durucu, dan Y. Kibar, “Analisis imunohistokimia PCNA, Ki67 dan p53 pada polip hidung dan papiloma terbalik sinonasal,” Jurnal Penelitian Medis Internasional, jilid. 35, tidak. 2, hlm. 237–241, 2007. Lihat di: Google Cendekia
  4. P. Strojan, A. Ferlito, V. J. Lund et al., "Papiloma terbalik sinonasal yang terkait dengan keganasan: peran infeksi human papillomavirus dan implikasinya untuk radioterapi," Onkologi Lisan, jilid. 48, tidak. 3, hlm. 216–218, 2012. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  5. E. Giotakis, I. P. Gomatos, L. Alevizos et al., “Status apoptosis dan proliferatif pada pasien HPV (+) dan HPV (-) inverted papilloma. Korelasi dengan kekambuhan lokal dan variabel klinikopatologis, ” Penelitian dan Praktik Patologi, jilid. 208, tidak. 6, hlm. 338–343, 2012. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  6. M. Saegusa, H. Nitta, M. Hashimura, dan I. Okayasu, “Pengaturan turun ekspresi p27(Kip1) berkorelasi dengan peningkatan proliferasi sel tetapi tidak pada ekspresi p21(waf1) dan p53, dan infeksi human papillomavirus pada tumor jinak dan tumor ganas di daerah sinonasal,” Histopatologi, jilid. 35, tidak. 1, hlm. 55–64, 1999. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  7. M. J. Schwerer, A. Sailer, K. Kraft, K. Baczako, dan H. Maier, “Pola ekspresi p21waf1/cip1 pada mukosa hidung non-papilomatous, papiloma sinonasal endofit, dan karsinoma terkait,” Jurnal Patologi Klinis, jilid. 54, tidak. 11, hlm. 871–876, 2001. Lihat di: Google Cendekia
  8. G. Altavilla, A. Staffieri, G. Busatto, A. Canesso, L. Giacomelli, dan G. Marioni, “Ekspresi p53, p16INK4A, pRb, p21WAF1/CIP1, p27KIP1, cyclin D1, Ki-67 dan DNA HPV di papiloma Schneiderian (terbalik) endofit sinonasal,” Acta Oto-Laryngologica, jilid. 129, tidak. 11, hlm. 1242–1249, 2009. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  9. G. Buiret, X. Montbarbon, B. Fleury et al., "Papiloma terbalik dengan karsinoma terkait rongga hidung dan sinus paranasal: hasil pengobatan," Acta Oto-Laryngologica, jilid. 132, tidak. 1, hlm. 80–85, 2012. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  10. D. Santamar໚, C. Barrière, A. Cerqueira et al., “Cdk1 cukup untuk menggerakkan siklus sel mamalia,” Alam, jilid. 448, tidak. 7155, hlm. 811–815, 2007. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  11. S. Oncel, T. Cosgul, A. Calli, C. Calli, dan E. Pinar, “Evaluasi P53, P63, P21, P27, Ki-67 pada Karsinoma Sel Skuamosa Sinus Paranasal dan Papiloma Terbalik,” Jurnal Otolaringologi India dan Bedah Kepala dan Leher, jilid. 63, tidak. 2, hlm. 172–177, 2011. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  12. T. Masubuchi, Y. Tada, S. I. Maruya et al., “Kepentingan klinis dari reseptor androgen, ekspresi HER2, Ki-67 dan EGFR dalam karsinoma saluran saliva,” Jurnal Internasional Onkologi Klinis, 2014. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  13. M. Ekholm, S. Beglerbegovic, D. Grabau et al., “Penilaian imunohistokimia Ki67 dengan antibodi SP6 dan MIB1 pada kanker payudara primer: perbandingan nilai prognostik dan reproduktifitas,” Histopatologi, 2014. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  14. K. Hellman, D. Lindquist, C. Ranhem, E. Wilander, dan S. Andersson, "Human papillomavirus, p16, dan Ki-67 dalam kaitannya dengan variabel klinikopatologis dan kelangsungan hidup pada karsinoma primer vagina," Jurnal Kanker Inggris, jilid. 110, tidak. 6, hlm. 1561–1570, 2014. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  15. IY Shin, NY Sung, YS Lee et al., “Ekspresi beberapa protein sebagai faktor prognostik pada kanker kolorektal: cathepsin D, p53, COX-2, reseptor faktor pertumbuhan epidermal, C-erbB-2, dan Ki-67, ” hati usus, jilid. 8, tidak. 1, hlm. 13–23, 2014. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  16. Y. He, G. Zhou, Y. Zhai et al., “Asosiasi polimorfisme gen PLUNC dengan kerentanan terhadap karsinoma nasofaring pada populasi Cina,” Jurnal Genetika Medis, jilid. 42, tidak. 2, hlm. 172–176, 2005. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  17. Y. A. Tsou, M. T. Peng, Y. F. Wu et al., “Penurunan ekspresi PLUNC pada polip hidung dikaitkan dengan kolonisasi multibakteri pada pasien rinosinusitis kronis,” Arsip Eropa Oto-Rhino-Laryngology, jilid. 271, tidak. 2, hlm. 299–304, 2014. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  18. Percepatan, Klien Discovery Studio v2.5, Accelrys, Inc., San Diego, California, AS, 2009.
  19. S. Pronk, S. Páll, R. Schulz et al., “GROMACS 4.5: perangkat simulasi molekuler open source dengan throughput tinggi dan sangat paralel,” Bioinformatika, jilid. 29, tidak. 7, hlm. 845–854, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  20. V. Sciarretta, I. J. Fernandez, P. Farneti, dan E. Pasquini, “Pendekatan endoskopik dan gabungan endoskopi eksternal-transnasal untuk pengobatan papiloma terbalik: analisis 110 kasus,” Arsip Eropa Oto-Rhino-Laryngology, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  21. M. J. Schwerer, A. Sailer, K. Kraft, dan H. Maier, “Proliferasi sel dan ekspresi p27Kip1 pada papiloma schneiderian endofit,” Laringoskop, jilid. 112, tidak. 5, hlm. 852–857, 2002. Lihat di: Google Cendekia
  22. H. Katori, A. Nozawa, dan M. Tsukuda, "Hubungan antara ekspresi p21 dan p53, infeksi virus papiloma manusia dan transformasi ganas pada papiloma terbalik sinonasal," Onkologi Klinis, jilid. 18, tidak. 4, hlm. 300–305, 2006. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  23. C. Gujrathi, I. Pathak, J. Freeman, dan S. Asa, "Ekspresi p53 pada papiloma terbalik dan keganasan yang terkait dengan papiloma terbalik," Jurnal Otolaringologi, jilid. 32, tidak. 1, hlm. 48–50, 2003. Lihat di: Google Cendekia
  24. S. Gunia, F. Fritzsche, M. May, D. Liebe, dan S. Koch, "Apakah gangguan yang berbeda dalam akun regulasi siklus sel untuk perilaku biologis yang berbeda dari papiloma terbalik urothelial dan sinonasal?" Patobiologi, jilid. 75, tidak. 1, hlm. 34–41, 2008. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  25. A. Affolter, S. Helmbrecht, S. Finger, K. Hörmann, dan K. Götte, “Ekspresi yang diubah dari regulator siklus sel p21, p27, dan p53 pada tumor kelenjar ludah dan sinus paranasal,” Laporan Onkologi, jilid. 13, tidak. 6, hlm. 1089–1094, 2005. Lihat di: Google Cendekia
  26. I. J. Byeon, H. Li, H. Song, A. M. Gronenborn, dan M. D. Tsai, “Fosforilasi berurutan dan interaksi multisitus mencirikan pengenalan target spesifik oleh domain FHA Ki67,” Alam Struktural dan Biologi Molekuler, jilid. 12, tidak. 11, hlm. 987–993, 2005. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  27. H. R. Choi, S. A. Tucker, Z. Huang et al., “Ekspresi diferensial dari inhibitor kinase yang bergantung pada cyclin (p27 dan p21) dan hubungannya dengan p53 dan Ki-67 dalam tumorigenesis skuamosa oral,” Jurnal Internasional Onkologi, vol. 22, tidak. 2, hlm. 409–414, 2003. Lihat di: Google Cendekia
  28. N. Keleş, B. Erdamar, A. Kaur, dan K. DeṾr, “p21, p53, dan p27 Perubahan Kip1 pada tumor jinak dan ganas dari epitel sinonasal,” Otolaringologi—Operasi Kepala dan Leher, jilid. 129, tidak. 1, hlm. 77–84, 2003. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  29. Y. A. Tsou, C. M. Chen, T. C. Lin et al., “Penurunan ekspresi SPLUNC1 dikaitkan dengan infeksi Pseudomonas pada pasien rinosinusitis kronis yang dirawat dengan pembedahan yang mungkin memerlukan operasi sinus berulang,” Laringoskop, vol. 123, tidak. 4, hlm. 845–851, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  30. A. Balakrishnan, S. A. Marathe, M. Joglekar, dan D. Chakravortty, “Protein peningkat bakterisida/permeabilitas: protein multifaset dengan fungsi di luar netralisasi LPS,” Imunitas bawaan, vol. 19, tidak. 4, hlm. 339–347, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  31. L. Gakhar, J. A. Bartlett, J. Penterman et al., "PLUNC adalah protein surfaktan saluran napas baru dengan aktivitas anti-biofilm," PLoS SATU, vol. 5, tidak. 2, ID Artikel e9098, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  32. Y.Zhou, Z.Zeng, W.Zhang et al., "Identifikasi calon penanda molekuler karsinoma nasofaring dengan analisis microarray dari pustaka cDNA yang dikurangkan yang dibangun dengan hibridisasi subtraktif supresi," Jurnal Pencegahan Kanker Eropa, vol. 17, tidak. 6, hlm. 561–571, ​​2008. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  33. S.-C. Hsu, J.-H. Lin, S.W. Weng et al., “Ekstrak kasar Rheum palmatum menghambat migrasi dan invasi sel osteosarkoma manusia OS U-2 dengan menekan matriks metalloproteinase-2 dan -9,” BioKedokteran, vol. 3, tidak. 3, hlm. 120–129, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  34. W.-Y. Lin, H.-P. Liu, J.S. Chang et al., “Variasi genetik dalam wilayah PSORS1 mempengaruhi perkembangan penyakit Kawasaki dan pembentukan aneurisma arteri koroner,” BioKedokteran, vol. 3, tidak. 2, hlm. 73–81, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  35. W.-L. Liao dan F.-J. Tsai, "Pengobatan yang dipersonalisasi: perubahan paradigma dalam perawatan kesehatan," BioKedokteran, vol. 3, tidak. 2, hlm. 66–72, 2013. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google

Hak cipta

Hak Cipta © 2014 Yung-An Tsou dkk. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan karya aslinya dikutip dengan benar.


Tonton videonya: Storm Tips - Understanding Ball Layouts (November 2022).