Informasi

Jika penghambatan S6 kinase menurunkan translasi protein, apakah penghambatan S6 kinase dapat memperlambat potensiasi jangka panjang pada neuron?

Jika penghambatan S6 kinase menurunkan translasi protein, apakah penghambatan S6 kinase dapat memperlambat potensiasi jangka panjang pada neuron?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dari http://en.wikipedia.org/wiki/P70S6_kinase…

Fosforilasi S6 menginduksi sintesis protein di ribosom.

P70S6 kinase berada dalam jalur pensinyalan yang mencakup mTOR (target mamalia rapamycin). mTOR dapat diaktifkan dengan cara yang berbeda, sehingga mengaktifkan p70S6K. Misalnya, asam amino rantai cabang seperti leusin cukup untuk mengaktifkan mTOR, menghasilkan peningkatan fosforilasi p70S6K (dan dengan demikian mengaktifkannya). mTOR juga berada di jalur hilir kinase Akt. Akt biasanya diaktifkan pada stimulasi sel dengan faktor pertumbuhan (seperti IGF-1). Akt kemudian mengaktifkan mTOR (dengan menghambat kompleks Tsc), yang mengarah ke aktivasi p70S6K.

Kami juga menemukan makalah yang menunjukkan bahwa penurunan regulasi S6 kinase juga menghasilkan penurunan terjemahan protein dalam ragi (tapi saya menunggu Matt Kaeberlein mengirimi saya slide dari kemarin).


Saya tidak dapat mengesampingkannya, tetapi kedengarannya sangat mirip dengan mencoba menyetem piano dengan palu godam.

Neuronal LTP bergantung pada translasi protein, tetapi begitu juga semua hal lain di dalam sel. Menghambat sintesis protein di ribosom akan menghalangi pembentukan semua protein, tidak hanya yang bertanggung jawab untuk LTP. Kecuali ada tautan yang saya tidak tahu antara LTP dan total tingkat terjemahan protein, Anda benar-benar akan ingin melihat ke dalam menghambat produksi protein yang secara khusus bertanggung jawab untuk LTP dan bukan sintesis protein secara umum.


Genetika penuaan

Nematoda Caenorhabditis elegans usia dan mati dalam beberapa minggu, tetapi manusia dapat hidup selama 100 tahun atau lebih. Dengan asumsi bahwa nenek moyang kita berbagi dengan nematoda menua dengan cepat, ini berarti bahwa selama evolusi waktu mutasi telah meningkatkan umur lebih dari 2.000 kali lipat. Gen mana yang dapat memperpanjang umur? Bisakah kita meningkatkan aktivitas mereka dan hidup lebih lama? Setelah berabad-abad puisi sedih dan imajinasi liar, kita sekarang mendapatkan jawaban, seringkali jawaban yang tidak terduga, untuk pertanyaan mendasar ini.


Opsi akses

Dapatkan akses jurnal penuh selama 1 tahun

Semua harga adalah harga NETT.
PPN akan ditambahkan kemudian di checkout.
Perhitungan pajak akan diselesaikan saat checkout.

Dapatkan akses artikel terbatas atau penuh waktu di ReadCube.

Semua harga adalah harga NETT.


II. TARGET MEKANISTIK JARINGAN SINYAL RAPAMYCIN

Karena diyakini bahwa DEPTOR berfungsi terutama sebagai modulator pensinyalan mTOR, meninjau dasar-dasar biologi mTOR sangat penting untuk tinjauan ini. Dalam paragraf berikutnya, kami meninjau komposisi protein mTORC1 dan mTORC2, sinyal yang mengatur aktivasi mereka dan proses biologis yang mereka kendalikan.

mTOR adalah kinase yang sangat terkonservasi yang termasuk dalam keluarga kinase terkait fosfoinositida 3-kinase (PI3K). Selain domain kinasenya, protein besar 289 kDa ini mengandung beberapa struktur terkonservasi lainnya. Ikhtisar domain ini dan ringkasan lengkap fungsinya telah ditinjau secara ekstensif dan berada di luar cakupan tinjauan ini (150). Kehadiran domain HEAT di mTOR, domain yang mempromosikan interaksi protein-protein, merupakan indikasi pertama bahwa mTOR dapat berinteraksi dengan protein lain. Mendukung kemungkinan ini, tes filtrasi gel mengungkapkan profil migrasi untuk mTOR yang jauh lebih besar dari ukuran yang diprediksi. Terlepas dari pengamatan ini, upaya konvensional untuk memurnikan protein yang berinteraksi dengan mTOR gagal untuk waktu yang lama, kemungkinan karena ketidakstabilan interaksi dalam kondisi pemurnian standar. Menggunakan berbagai pendekatan untuk menghindari keterbatasan ini, kelompok penelitian independen akhirnya berhasil mengidentifikasi mitra mTOR (92, 105, 120, 121, 135, 136, 199, 200, 202, 218, 219, 251, 263, 271). Studi-studi ini mengungkapkan bahwa mTOR kinase membentuk dua kompleks protein yang berbeda, yaitu mTORC1 dan mTORC2. Sekarang dihargai dengan baik bahwa arsitektur spesifik mTORC1 dan mTORC2 menentukan kemampuan setiap kompleks untuk mengintegrasikan sinyal, untuk menargetkan substrat yang berbeda, dan untuk secara selektif mengontrol proses biologis tertentu. Ikhtisar kompleks ini dan jaringan pensinyalan di mana mereka berpartisipasi disajikan di bagian berikut. Kami merujuk pembaca ke ulasan lain untuk deskripsi lebih lengkap tentang jalur pensinyalan mTOR (150, 224, 308).

A.mTORC1

Kompleks mTOR 1 (mTORC1) terdiri dari: 1) mTOR kinase 2) protein terkait regulasi mTOR (RAPTOR) (105, 135) 3) Dishevelled, Egl-10, dan Pleckstrin (DEP) yang mengandung domain mTOR-interacting protein (DEPTOR) (202) 4) mematikan mamalia dengan protein Sec13 8 (mLST8, juga dikenal sebagai GβL) (136) dan 5) substrat AKT kaya prolin 40 kDa (PRAS40) (218, 251, 263, 271) ( GAMBAR 1A, KIRI). mTORC1 berada di pusat hub pensinyalan yang mengintegrasikan sinyal dari berbagai sumber untuk mengatur anabolisme, pertumbuhan, dan proliferasi. Gambaran umum jaringan pensinyalan mTORC1 disajikan pada GAMBAR 2 . Selain faktor pertumbuhan dan nutrisi, yang merupakan sinyal berkarakteristik terbaik yang mengaktifkan mTORC1, kompleks ini juga dapat diatur oleh input lain, termasuk hipoksia, inflamasi, defisit energi, kolesterol, dan nukleotida ( GAMBAR 1A, BAIK). Saat aktif, mTORC1 meningkatkan metabolisme dan sintesis berbagai blok bangunan untuk mendukung pertumbuhan dan proliferasi sel, termasuk protein, lipid, dan nukleotida (150). Kompleks ini juga menghambat katabolisme dengan menghalangi autophagy dan biogenesis lisosom. Meskipun daftar protein yang memediasi efek mTORC1 pada semua proses ini terus bertambah, substrat dengan karakteristik terbaiknya tetap protein ribosom S6 kinase 1 (S6K1) dan faktor inisiasi translasi eukariotik 4E-binding protein 1 dan 2 (4EBP1/2) . Status fosforilasi protein ini digunakan sebagai standar emas untuk memantau aktivitas mTORC1. Seperti disebutkan secara singkat di atas, rapamycin menghambat mTORC1 dengan membentuk kompleks dengan FKBP12, yang secara langsung mengikat domain FRB mTOR (22, 216). Interaksi ini mempersempit celah katalitik untuk menutup sebagian substrat dari situs aktif (289). Meskipun rapamycin sangat kuat untuk memblokir aktivitas mTORC1 terhadap banyak substrat, beberapa fungsi mTORC1 tidak sensitif terhadap penghambatan oleh rapamycin (253).

Pada aktivasi, mTORC1 memicu beberapa loop umpan balik negatif untuk menghambat pensinyalan faktor pertumbuhan ( GAMBAR 3 ). Aktivasi S6K1 hilir mTORC1 menginduksi fosforilasi insulin receptor substrat-1 (IRS1) pada residu serin tertentu, yang mengacaukan IRS1 dan mengurangi kemampuan faktor pertumbuhan untuk mengaktifkan pensinyalan (106, 261). Selain itu, mTORC1 sendiri dapat secara langsung menargetkan IRS1 untuk meningkatkan degradasinya (260). Loop umpan balik negatif yang dimediasi mTORC1 lainnya melibatkan faktor pertumbuhan yang terikat reseptor 10 (GRB10), inhibitor endogen reseptor tirosin kinase. Studi menunjukkan bahwa mTORC1 secara langsung memfosforilasi dan menstabilkan GRB10, yang, pada gilirannya, membatasi pensinyalan dengan mengikat reseptor tirosin kinase (113, 296). Deskripsi loop umpan balik yang menghubungkan mTORC1 ke pensinyalan PI3K telah ditinjau secara ekstensif oleh orang lain (82, 214). Semua loop umpan balik yang muncul dari mTORC1 diperkirakan telah berevolusi untuk memungkinkan kontrol seluler yang lebih baik atas proses konsumsi energi yang diaktifkan saat anabolisme diaktifkan. Penting untuk menunjukkan bahwa loop umpan balik ini adalah komponen inti dari jaringan pensinyalan mTOR dan bahwa dampak fisiologis dan klinisnya sangat besar, meskipun sering diabaikan.

B.mTORC2

Kompleks mTOR 2 (mTORC2) terdiri dari: 1) mTOR kinase 2) pendamping mTOR yang tidak sensitif terhadap rapamycin (RICTOR) (121, 219) 3) DEPTOR (202) 4) mLST8 (atau GβL) (121) 5) protein yang diamati dengan Rictor-1 dan 2 (PROTOR1/2) (165, 199, 251) dan 6) protein interaksi protein kinase yang diaktifkan stres mamalia (mSin1) (92, 120). Meskipun beberapa protein unik untuk mTORC2, beberapa komponen, termasuk DEPTOR, ditemukan di kedua kompleks ( GAMBAR 1B, KIRI). mTORC2 mengintegrasikan sinyal dari faktor pertumbuhan untuk mengatur proses termasuk metabolisme, kelangsungan hidup, organisasi sitoskeletal, dan mobilitas sel ( GAMBAR 1B, BAIK) (150, 308). Pada aktivasi, mTORC2 memfosforilasi beberapa AGC kinase, termasuk protein kinase 1 (SGK1) yang diinduksi serum dan glukokortikoid (GC), protein kinase C-α (PKC-α), dan protein kinase B/AKT (AKT) . Substrat mTORC2 berkarakter terbaik adalah AKT, yang aktivitasnya diatur secara langsung oleh mTORC2 melalui fosforilasi serin 473 (221). Tidak seperti mTORC1, mTORC2 tidak sensitif terhadap asam amino, dan aktivitasnya tidak dihambat secara akut oleh rapamycin (121, 219). Pengobatan jangka panjang dengan rapamycin menghambat aktivitas mTORC2 di beberapa, tetapi tidak semua, garis sel (203, 220, 289). Penghambatan mTORC2 oleh rapamycin juga diamati pada tikus (148, 225). Gambaran umum jaringan pensinyalan mTORC2 disajikan pada GAMBAR 2 .


Kasus aneh AMPK dan kanker: Dr Jekyll atau Mr Hyde? †

Protein kinase yang diaktifkan AMP (AMPK) bertindak sebagai sensor energi seluler. Setelah diaktifkan oleh peningkatan rasio AMP seluler : ATP, ia bertindak untuk memulihkan homeostasis energi dengan mengaktifkan jalur katabolik sambil mematikan pertumbuhan dan proliferasi sel. Mekanisme aktivasi yang bergantung pada AMP kanonik membutuhkan kinase hulu LKB1, yang diidentifikasi secara genetik sebagai penekan tumor. AMPK juga dapat diaktifkan oleh peningkatan Ca 2+ intraseluler, oleh kelaparan glukosa dan oleh kerusakan DNA melalui jalur AMP-independen non-kanonik. Studi genetik tentang peran AMPK dalam kanker tikus menunjukkan bahwa, sebelum penyakit muncul, AMPK bertindak sebagai penekan tumor yang melindungi terhadap kanker, dengan perlindungan ini ditingkatkan lebih lanjut oleh aktivator AMPK seperti biguanide phenformin. Namun, begitu kanker telah terjadi, AMPK beralih menjadi promotor tumor, meningkatkan kelangsungan hidup sel kanker dengan melindungi terhadap stres metabolik, oksidatif dan genotoksik. Studi tentang perubahan genetik pada kanker manusia juga menunjukkan peran yang berbeda untuk gen yang mengkode subunit isoform, dengan beberapa yang sering diperkuat, sementara yang lain bermutasi.

1. Perkenalan

Protein kinase teraktivasi-AMP (AMPK) paling dikenal sebagai sensor status energi seluler [1–3] dan seluruh tubuh [4,5]. AMPK diaktifkan ketika ATP terikat pada situs kunci pada γ subunit pengatur digantikan oleh AMP dan/atau ADP, menyebabkan perubahan konformasi yang memicu aktivasi alosterik, serta mempromosikan fosforilasi bersih (dan aktivasi konsekuen) dari subunit katalitik oleh kinase hulu. Saat ADP naik dan ATP turun selama situasi stres energi seluler, reaksi yang dikatalisis oleh adenilat kinase (2ADP ATP + AMP) dipindahkan ke kanan, memastikan bahwa AMP naik ke tingkat yang lebih besar daripada ADP [6], sehingga mengaktifkan AMPK di cara yang sangat sensitif. AMPK juga diaktifkan oleh peningkatan Ca2+ intraseluler [7-9], oleh kelaparan glukosa [10] dan oleh kerusakan DNA [11-13] melalui mekanisme non-kanonik, AMP/ADP-independen. Dengan memfosforilasi target hilir yang mengaktifkan jalur katabolik, sementara mematikan jalur anabolik dan proses konsumsi ATP lainnya seperti kemajuan melalui siklus sel, AMPK tidak hanya mendorong sintesis ATP tetapi juga membatasi pertumbuhan dan proliferasi sel dalam upaya untuk memulihkan homeostasis energi dan mempertahankan viabilitas sel.

Mengingat kecenderungan ini untuk mematikan pertumbuhan dan proliferasi sel, dan penemuan bahwa kinase hulu utama memfosforilasi dan mengaktifkan AMPK adalah penekan tumor LKB1 [14-16], tampaknya AMPK akan memainkan peran yang bermanfaat (Dr Jekyll !) pada kanker dan bertindak sebagai penekan tumor. Memang ada bukti yang mendukung hal ini, setidaknya pada beberapa jenis kanker, serta akibat wajar yang jelas bahwa aktivator AMPK harus menunda tumorigenesis pada kanker tersebut. Namun, ada bukti yang kontras bahwa, dalam konteks lain, kehadiran AMPK mungkin memainkan peran jahat (Mr Hyde!) untuk mempromosikan kanker., kemungkinan besar dengan melindungi sel-sel yang berubah terhadap tekanan yang disebabkan baik ketika tingkat pertumbuhan mereka melampaui kemampuan suplai darah mereka untuk memberikan nutrisi dan oksigen atau selama periode stres oksidatif dan/atau kerusakan DNA. Dalam skenario seperti itu, kehadiran AMPK akan meningkatkan kelangsungan hidup sel tumor dan dengan demikian berpotensi menurunkan kelangsungan hidup pasien, dan dalam kasus seperti itu akan menjadi penghambat AMPK daripada aktivator yang mungkin berguna secara terapeutik. Tujuan dari tinjauan ini adalah untuk mencoba mendamaikan dua peran AMPK yang tampaknya saling bertentangan ini, dan untuk membahas berbagai jenis situasi di mana aktivator atau penghambat kinase mungkin berkhasiat.

2. AMPK—struktur dan regulasi

AMPK tampaknya ada secara universal sebagai kompleks heterotrimerik yang terdiri dari subunit katalitik dan subunit dan regulator. Gen yang mengkode ketiga subunit ini ditemukan dalam genom pada dasarnya semua eukariota, menunjukkan bahwa sistem AMPK berevolusi sangat awal selama evolusi eukariotik [2]. Pada mamalia, ada banyak gen yang mengkode setiap subunit, menghasilkan dua (α1, 2), dua (β1, 2) dan tiga subunit (γ1, 2, 3). Paralog ini tampaknya muncul selama dua putaran duplikasi seluruh genom yang diperkirakan terjadi selama perkembangan awal vertebrata [3]. Tujuh produk gen (tidak termasuk varian splice dan/atau start-site) dapat membentuk hingga 12 kombinasi yang menunjukkan perbedaan halus dalam regulasi dan dalam distribusi jaringan dan subselular [3].

Struktur kristal dari tiga kombinasi dari manusia, yaitu 2β1γ1 [17], 1β1γ1 [18] dan 1β2γ1 [19], serta struktur parsial dari mamalia [20,21], ragi tunas [22] dan ragi fisi [23,24] ], sekarang tersedia. Struktur umum dari kompleks AMPK heterotrimerik direpresentasikan dalam bentuk skematis yang tinggi pada gambar 1. Keterbatasan saat ini dari struktur kompleks heterotrimerik yang ada adalah bahwa, dalam setiap kasus, konstruksi dikristalisasi dalam konformasi aktif, dengan subunit katalitik terfosforilasi pada situs aktivasi dan aktivator alosterik terikat pada situs regulasi. Karena kurangnya struktur dalam konformasi tidak aktif, kami masih hanya memiliki sebagian pemahaman tentang perubahan konformasi yang terlibat dalam proses aktivasi.

Gambar 1. Diagram skema struktur heterotrimer AMPK, dengan subunit yang berbeda berkode warna (α, kuning , ungu biru). Berdasarkan struktur kompleks 1β2γ1 manusia [19], meskipun struktur kompleks 2β1γ1 [17] dan 1β1γ1 [18] sangat mirip.

2.1. Struktur subunit

Setiap subunit AMPK-α (berwarna kuning pada gambar 1) memiliki domain N-terminal kinase dengan lobus N-terminal kecil dan lobus C-terminal yang lebih besar yang khas dari semua anggota keluarga protein kinase (ePK) eukariotik, dengan ATP- mengikat situs katalitik di celah antara dua lobus. Seperti banyak ePK lainnya, AMPK hanya aktif secara signifikan setelah fosforilasi dalam apa yang disebut 'loop aktivasi' dari C-lobe. Dalam AMPK, target untuk fosforilasi adalah residu treonin yang sangat terkonservasi, yang secara konvensional disebut sebagai Thr172 [25] meskipun penomoran residu yang tepat bervariasi menurut spesies dan isoform (dalam tampilan gambar 1, Thr172 terletak di sisi jauh dari lobus C). Dalam ePKs lain, fosforilasi dalam loop aktivasi mengubah konformasi untuk reorientasi residu yang terlibat dalam kedua katalisis dan pengikatan substrat protein, sehingga sangat meningkatkan laju reaksi [26]. Utama kinase fosforilasi Thr172 pada AMPK diidentifikasi pada tahun 2003 menjadi kompleks yang mengandung LKB1 dan dua subunit aksesori, STRAD-α atau -β dan MO25-α atau -β [14]. Pengikatan STRAD-α atau -β (yaitu pseudokinase, secara struktural terkait dengan protein kinase tetapi tidak aktif) diperlukan untuk aktivitas kinase LKB1, sedangkan MO25-α atau -β tampaknya memiliki peran struktural untuk menstabilkan kompleks [27]. Gen yang mengkode LKB1 (disebut STK11 pada manusia) sebelumnya telah diidentifikasi terlibat dalam sindrom Peutz-Jeghers, kerentanan kanker bawaan yang langka, manusia dengan sindrom ini hampir selalu heterozigot untuk mutasi kehilangan fungsi pada STK11 [28]. Masalah klinis utama mereka adalah perkembangan polip usus yang sering tetapi jinak, yang tampaknya disebabkan oleh insufisiensi haploinsufisiensi STK11. Namun, mereka juga memiliki peningkatan risiko yang sangat besar untuk mengembangkan kanker ganas di beberapa lokasi karena hilangnya heterozigositas di STK11, dan sering meninggal pada usia yang relatif dini dari keganasan tersebut [28]. Mutasi kehilangan fungsi pada STK11 juga sering terjadi pada banyak kanker sporadis (yaitu tidak diturunkan), terutama pada bentuk paling umum dari kanker paru-paru, adenokarsinoma [3,29,30] (lihat juga 6). Oleh karena itu, LKB1 adalah penekan tumor klasik, dan meskipun urutannya menunjukkan bahwa itu adalah anggota keluarga ePK, target hilir yang difosforilasi sama sekali tidak diketahui sampai ditemukan bahwa ia memfosforilasi dan mengaktifkan AMPK [14-16].

Mengikuti domain kinase pada setiap subunit AMPK-α (gambar 1) adalah bundel kompak dari tiga heliks yang disebut domain autoinhibitor (α-BANTUAN) [18–20,24]. Ketika ATP daripada AMP terikat pada situs regulasi pada subunit (lihat di bawah), -AID diperkirakan berinteraksi dengan domain kinase untuk menjepitnya dalam konformasi yang tidak aktif [24]. -AID terkait dengan domain terminal-C globular dari subunit (α-CTD) oleh -penghubung, ditunjukkan secara skematis sebagai rantai kuning pada Gambar 1. -linker adalah wilayah dalam konformasi diperpanjang yang berisi dua segmen kekal yang disebut -motif interaksi regulasi (α-RIM1 dan -RIM2) [31]. Ini berinteraksi dengan permukaan subunit yang mengandung situs pengikatan nukleotida adenin pengatur utama (lihat 2.3), dan pergerakan penghubung ini diperkirakan mentransmisikan efek pengikatan AMP atau ADP dari subunit pengatur ke subunit katalitik. (lihat 2.4).

2.2. Struktur subunit

Subunit (berwarna ungu pada gambar 1) mengandung dua wilayah yang dilestarikan, modul pengikat karbohidrat pusat (β-CBM) dan domain terminal-C (β-CTD), ini menjadi satu-satunya wilayah dari subunit yang diselesaikan dalam struktur heterotrimer saat ini. -CBM menyebabkan sebagian AMPK dalam sel mamalia untuk mengikat partikel glikogen [32,33]. Salah satu fungsinya mungkin untuk melokalisasi AMPK dengan glikogen sintase, enzim kunci dari sintesis glikogen juga ditemukan pada permukaan partikel glikogen, baik isoform yang difosforilasi dan diinaktivasi oleh AMPK [34,35]. -CBM, bagaimanapun, juga memiliki fungsi lain (lihat 3.2 di bawah). -CTD, di sisi lain, memainkan peran struktural kunci sebagai 'inti' dari kompleks heterotrimerik, yang menghubungkan silang -CTD dan subunit , melalui interaksi yang sangat lestari dari jamur hingga mamalia. [21-23].

2.3. Struktur subunit

Subunit (berwarna biru pada Gambar 1) sangat menarik karena mengandung situs pengikatan nukleotida adenin pengatur. Pada semua spesies, subunit mengandung empat pengulangan tandem dari motif urutan sekitar 60 asam amino yang dikenal sebagai pengulangan CBS, dinamakan demikian oleh Bateman [36] karena mereka juga ada dalam enzim. Cystathione β-Ssintase dan selalu terjadi sebagai pengulangan tandem. Pengulangan CBS telah diidentifikasi di sekitar 75 protein dalam genom manusia [37], dan juga ditemukan di archaea dan bakteri. Protein yang mengandung mereka biasanya hanya memiliki dua pengulangan tandem, tetapi subunit AMPK-γ tidak biasa memiliki empat. Sepasang pengulangan tunggal (dikenal sebagai domain atau modul Bateman) membentuk pseudodimer dengan celah di antara pengulangan yang (karena perkiraan dua kali lipat simetri) dapat menyediakan dua situs pengikatan ligan, meskipun seringkali hanya satu yang digunakan. Modul Bateman biasanya mengikat ligan pengatur yang mengandung adenosin (misalnya AMP, ATP, S-adenosil metionin, NAD, diadenosin polifosfat) atau, lebih jarang, guanosin [37,38]. Konsisten dengan ini, pengulangan CBS di subunit AMPK-γ menyediakan situs pengikatan penting untuk nukleotida pengatur AMP, ADP dan ATP [38]. Empat pengulangan CBS di setiap subunit AMPK-γ membentuk dua modul Bateman yang merakit 'head to head' untuk membentuk piringan pipih dengan situs pengikatan nukleotida adenin yang terletak berdekatan di tengah, melapisi saluran air yang sempit (gambar 1) [ 17–19,21]. Mengingat adanya empat pengulangan, mungkin diharapkan bahwa subunit AMPK-γ akan mengikat empat molekul nukleotida, tetapi semua struktur kristal yang ada menunjukkan bahwa mereka hanya mengikat tiga. Situs-situs ini sekarang diberi nomor sesuai dengan pengulangan dalam urutan linier (CBS1 melalui CBS4) memberikan residu yang mengikat bagian adenosin dari nukleotida [39] (gugus fosfat dapat berinteraksi dengan residu dari lebih dari satu pengulangan). Dengan menggunakan nomenklatur ini, nukleotida adenin terikat pada CBS1, CBS3 dan CBS4, sedangkan situs CBS2 tampaknya selalu kosong. Situs CBS3 terutama dapat diakses oleh pelarut dari satu sisi cakram subunit (menghadap penampil pada gambar 1), dan situs CBS1 dan CBS4 dari sisi lainnya.

2.4. Regulasi kanonik AMPK oleh nukleotida adenin

Protein kinase yang diaktifkan AMP menerima namanya [40] karena diaktifkan secara alosterik oleh 5′-AMP [41]. Ketika pengujian dilakukan pada konsentrasi ATP yang relevan secara fisiologis (5 mM) aktivasi alosterik dapat mencapai 10 kali lipat [42]. Namun, bahkan sebelum LKB1 diidentifikasi sebagai kinase hulu dan Thr172 sebagai situs fosforilasi, disadari bahwa peningkatan rasio AMP : ATP juga mendorong fosforilasi bersih AMPK dalam sel utuh [43]. Hal ini sekarang diketahui terjadi karena AMP meningkatkan fosforilasi oleh LKB1 [44,45] dan menghambat defosforilasi oleh protein fosfatase [46]. Kedua efek tersebut disebabkan oleh pengikatan AMP ke substrat, AMPK, dan bukan untuk kinase hulu atau fosfatase memang kompleks LKB1 tampaknya memiliki aktivitas yang konstan baik dalam kondisi stres energi maupun tanpa tekanan [47]. Untuk meringkas, pengikatan AMP memiliki tiga efek pada AMPK: (i) mempromosikan fosforilasi Thr172 (ii) menghambat defosforilasi Thr172 (iii) memicu aktivasi alosterik kinase yang sudah terfosforilasi pada Thr172. Ketiga mekanisme ini bertindak secara sinergis dan membuat sistem merespons peningkatan kecil AMP dengan cara yang sangat sensitif. Kemudian dilaporkan bahwa efek pengikatan AMP pada fosforilasi Thr172 [48] dan defosforilasi [20], meskipun tidak pada aktivasi alosterik, dapat ditiru oleh ADP, setidaknya dalam pengujian bebas sel. Kelompok kami telah mengkonfirmasi hal ini, tetapi menemukan bahwa efeknya memerlukan konsentrasi ADP hingga 10 kali lipat lebih tinggi daripada AMP, setidaknya untuk kompleks yang mengandung 1 dan 3 (kompleks yang mengandung γ2 lebih sensitif terhadap ADP) [42,45] . Secara keseluruhan, kami percaya bahwa peningkatan rasio AMP : ATP tetap menjadi sinyal pengaktifan yang paling penting in vivo, meskipun peningkatan rasio ADP : ATP mungkin memberikan kontribusi sekunder.

CBS4 biasanya tampaknya mengandung molekul AMP 'tidak dapat ditukar' yang terikat erat [21]. Demikian pula, meskipun CBS1 dapat mengikat AMP dalam tes bebas sel, diperkirakan memiliki afinitas 10 kali lipat lebih tinggi untuk ATP daripada AMP. Sejak ATP biasanya hadir dalam sel hingga 100 kali lipat konsentrasi lebih tinggi dari AMP, ini menunjukkan bahwa, dalam sel utuh, CBS1 akan selalu ditempati oleh ATP [49]. Ini meninggalkan CBS3 sebagai situs di mana ATP dan AMP (atau ADP) dapat saling bertukar.

Mutasi R531G pada subunit AMPK-γ2, salah satu dari hingga 14 mutasi yang menyebabkan penyakit jantung bawaan [50], sepenuhnya memblokir aktivasi alosterik dan meningkatkan fosforilasi Thr172 bersih oleh AMP [38,51]. Meskipun sebenarnya terletak di CBS4, rantai samping bermuatan positif dari Arg531 berinteraksi dengan -fosfat dari AMP yang terikat di CBS3 [21,49] (perhatikan bahwa di [21] situs CBS3 disebut sebagai situs 1 lihat [39] ] untuk nomenklatur situs pengikatan yang direvisi).

Bagaimana pengaruh perpindahan ATP oleh AMP pada CBS3 ditransmisikan ke subunit katalitik (α)? Konsisten dengan gagasan bahwa CBS3 adalah situs penting untuk aktivasi, struktur heterotrimer menunjukkan bahwa, ketika AMP terikat pada CBS3, -linker mengikat wajah subunit itu, dengan -RIM1 mengikat di seluruh situs CBS2 yang tidak terisi dan -RIM2 secara fisik menghubungi AMP yang terikat di CBS3 (gambar 1). Meskipun tidak ada struktur kristal untuk mengkonfirmasi hal ini, pendekatan biofisik lainnya menunjukkan bahwa, ketika ATP menggantikan AMP di CBS3, -linker terdisosiasi dari permukaan subunit yang mengandung situs CBS3 [19,52]. Ini dianggap melepaskan -AID untuk berputar kembali ke posisi penghambatannya di belakang domain kinase, dengan ini dicegah ketika AMP terikat pada CBS3 oleh interaksi -linker dengan situs CBS3. Konsisten dengan model ini, mutasi yang akan mempengaruhi interaksi antara -RIM1/α-RIM2 dan subunit menghapuskan aktivasi alosterik oleh AMP [31].

Sementara model ini dengan baik menjelaskan aktivasi alosterik oleh AMP, perubahan konformasi yang menyertainya juga dapat mengubah paparan Thr172 untuk fosforilasi dan defosforilasi, meskipun aspek itu saat ini kurang dipahami dengan baik. Juga masih belum jelas mengapa pengikatan ADP memiliki efek pada fosforilasi Thr172 meskipun faktanya, tidak seperti AMP, itu tidak menyebabkan aktivasi alosterik. Akhirnya, selain aktivasi 'kanonik' oleh perubahan rasio nukleotida adenin yang dibahas di atas, AMPK juga dapat diaktifkan oleh beberapa mekanisme non-kanonik yang sekarang akan dijelaskan secara singkat.

2.5. Aktivasi non-kanonik dengan peningkatan Ca 2+ intraseluler, dengan kekurangan glukosa dan oleh kerusakan DNA

Selain LKB1, Thr172 juga dapat difosforilasi oleh Ca2+ /calmodulin-dependent protein kinase CaMKK2 [7–9], yang berarti AMPK dapat diaktifkan dengan peningkatan ion Ca 2+ intraseluler bahkan tanpa adanya perubahan. dalam rasio adenin nukleotida. Ini terjadi, misalnya, sebagai respons terhadap hormon dan agonis yang dirasakan oleh reseptor berpasangan protein G yang digabungkan melalui GQ/G11 untuk melepaskan inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) dari membran plasma, yang selanjutnya memicu pelepasan Ca2+ dari retikulum endoplasma. Agonis tersebut termasuk, dalam sel endotel, trombin yang bekerja pada reseptor yang diaktifkan protease dan faktor pertumbuhan sel endotel vaskular yang bekerja pada reseptor VEGF [53,54] serta, pada neuron spesifik hipotalamus, ghrelin yang bekerja pada reseptor GHSR1 [55]. Efek terakhir penting dalam meningkatkan nafsu makan selama puasa [5], dan peran CaMKK2 dalam jalur ini dapat menjelaskan temuan sebelumnya bahwa penghambat CaMKK2 menekan nafsu makan pada tikus tipe liar, meskipun tidak pada KO CaMKK2 [56].

Telah diketahui selama bertahun-tahun bahwa kekurangan glukosa sel mamalia mengaktifkan AMPK [57], dan pengobatan ini sering digunakan untuk mengaktifkan AMPK dalam sel yang dikultur. Faktanya, gen yang mengkode ortolog ragi tunas AMPK (kompleks SNF1) awalnya diidentifikasi melalui mutasi yang mencegah perubahan normal dalam ekspresi gen sebagai respons terhadap kekurangan glukosa [58]. Selama bertahun-tahun, diasumsikan bahwa kekurangan glukosa mengaktifkan AMPK dengan mengganggu produksi katabolik ATP, dan dengan demikian mengaktifkan AMPK melalui mekanisme kanonik yang bergantung pada AMP (§2.4). Ini memang tampaknya menjadi kasus di beberapa garis sel tumor mapan, mungkin karena mereka sangat glikolitik dan memiliki ketergantungan yang tinggi pada glukosa untuk produksi ATP. Namun, pada sel lain seperti imortalized mouse embrio fibroblast (MEFs) telah ditemukan bahwa kekurangan glukosa mengaktifkan AMPK tanpa mengubah rasio AMP : ATP atau ADP : ATP, selama sumber karbon alternatif seperti glutamin tersedia serupa AMP/ADP -aktivasi independen juga diamati pada hati tikus selama kelaparan in vivo [10]. Dalam kasus seperti itu, aktivasi diperkirakan terjadi melalui mekanisme kompleks yang melibatkan penginderaan langsung fruktosa-1,6-bifosfat glikolitik perantara (FBP) oleh FBP aldolase, dan perekrutan AMPK ke 'super-kompleks' pada lisosom. membran yang melibatkan vakuolar-ATPase, kompleks Ragulator, Axin, LKB1 dan AMPK. Meskipun mekanisme ini dapat beroperasi pada sel tumor yang bergantung pada pengambilan glukosa yang cepat, diskusi lengkap tentang hal itu berada di luar cakupan artikel ini dan pembaca yang tertarik dirujuk ke makalah asli [10,59,60] atau ulasan terbaru [2 ].

Jenis ketiga dari aktivasi AMPK non-kanonik terjadi sebagai respons terhadap kerusakan DNA. Ini awalnya dilaporkan terjadi sebagai respons terhadap penghambat topoisomerase II etoposide [12], dan kemudian diamati setelah pengobatan sel dengan radiasi pengion [13]. Kedua perawatan menyebabkan kerusakan untai ganda pada DNA, dan sering digunakan dalam pengobatan kanker. Pemecahan DNA untai ganda diketahui dapat dideteksi oleh ATM, anggota famili phosphatidylinositol 3-kinase-like kinase (PIKK), dan efek etoposide untuk mengaktifkan AMPK awalnya diklaim bergantung pada ATM, karena efek yang muncul dikurangi dalam sel yang kekurangan ATM [12]. Selain itu, ATM diketahui memfosforilasi LKB1 di Thr366 [61], dan dilaporkan bahwa aktivasi AMPK oleh etoposida dalam sel dikurangi dengan knockdown yang dimediasi siRNA baik ATM atau LKB1 [12,62], menunjukkan adanya kinase kaskade dari ATM ke LKB1 ke AMPK. Namun, ini tidak bisa menjadi mekanisme utama, karena baik etoposida [12] dan radiasi pengion [13] masih mengaktifkan AMPK di sel tumor LKB1-null. Selain itu, laboratorium kami menunjukkan bahwa aktivasi AMPK oleh etoposide tidak diblokir oleh inhibitor ATM KU-55993, meskipun faktanya inhibitor tersebut memblokir fosforilasi substrat ATM yang diketahui [11]. Kami melanjutkan untuk menunjukkan bahwa aktivasi AMPK oleh etoposide dalam sel LKB1-null dimediasi oleh fosforilasi Thr172 yang dikatalisis oleh CaMKK2, dan bahwa ini dikaitkan dengan peningkatan Ca 2+ di dalam nukleus. Menariknya, hanya kompleks AMPK di dalam nukleus yang mengandung isoform 1 yang diaktifkan, meskipun 2 juga diekspresikan dalam sel yang diteliti. Mungkin yang paling menarik dari semuanya, mengaktifkan AMPK dalam sel-sel kosong LKB1 (menggunakan Ca 2+ ionophore A23187 untuk mengaktifkan CaMKK2) memberikan perlindungan yang signifikan terhadap kematian sel yang disebabkan oleh etoposide. Mekanisme yang paling mungkin untuk menjelaskan hal ini adalah bahwa A23187 menyebabkan penghentian siklus sel G1, sehingga membatasi masuknya sel ke fase S di mana mereka sangat rentan terhadap kerusakan DNA. Hipotesis ini didukung oleh fakta bahwa G1 cyclin-dependent kinase inhibitor palbociclib menyebabkan tingkat perlindungan yang sangat mirip terhadap kematian sel pada sel-sel yang menyebabkan penangkapan G1, tetapi tidak pada sel yang tidak menyebabkannya [11]. Hasil ini signifikan, karena mereka menyarankan bahwa perawatan genotoksik seperti etoposida dan radiasi pengion mungkin lebih efektif untuk pengobatan kanker jika dikombinasikan dengan inhibitor yang mencegah aktivasi AMPK, dan perlindungan yang dapat diberikan AMPK terhadap stres genotoksik. Poin ini dibahas lebih lanjut dalam 6 di bawah ini.

3. Aktivasi farmakologis dan penghambatan AMPK

Kesadaran bahwa AMPK bertindak sebagai saklar master metabolik, yang mengubah metabolisme seluler dari keadaan anabolik ke keadaan katabolik, awalnya menyarankan bahwa aktivator AMPK mungkin berguna dalam mengobati gangguan keseimbangan energi seperti obesitas dan diabetes tipe 2 [63]. Demikian pula, penemuan bahwa AMPK menghambat pertumbuhan sel dan proliferasi sel menunjukkan bahwa aktivator mungkin juga berguna dalam pengobatan kanker [64]. Selama 20 tahun terakhir, sejumlah senyawa yang secara farmakologis mengaktifkan AMPK telah dijelaskan, beberapa di antaranya ditunjukkan pada gambar 2. Ini dibahas dalam 3.1–3.3 sesuai dengan kemungkinan cara kerjanya. Ada jauh lebih sedikit penekanan pada pengembangan inhibitor, tetapi ini dibahas secara singkat di 3.4.

Gambar 2. Struktur sejumlah aktivator AMPK. Mereka telah diklasifikasikan menurut mekanisme aktivasi AMPK mereka (lihat 3.1–3.3). (A) Pro-obat yang diubah di dalam sel menjadi analog AMP. (B) Senyawa yang mengikat di situs obat dan metabolit alosterik (ADAM). (C) Senyawa yang aktif secara tidak langsung dengan menghambat sintesis ATP mitokondria.

3.1. Pro-obat yang diubah di dalam sel menjadi analog AMP

Senyawa pertama yang ditunjukkan untuk mengaktifkan AMPK dalam sel utuh adalah analog adenosin 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside (AICAR), yang diambil ke dalam sel melalui transporter adenosin [65] dan diubah oleh adenosin kinase menjadi nukleotida monofosforilasi setara, ZMP [66–68] (gambar 2A). ZMP meniru ketiga efek AMP yang dijelaskan dalam 2.4 [66], dan AICAR telah banyak digunakan sebagai alat eksperimental untuk mengaktifkan AMPK dalam sel utuh dan in vivo. Perlu dicatat, bagaimanapun, bahwa ZMP jauh kurang kuat sebagai aktivator AMPK daripada AMP, dan AICAR hanya mengaktifkan AMPK dalam sel utuh karena ZMP intraseluler terakumulasi ke konsentrasi milimolar, bahkan lebih tinggi dari konsentrasi eksternal AICAR [66]. Penggunaan AICAR tidak lagi direkomendasikan oleh penulis saat ini, karena ZMP telah mengetahui efek di luar target (misalnya juga meniru efek AMP untuk mengaktifkan glikogen fosforilase otot rangka [69] dan menghambat fruktosa-1,6-bisfosfatase hati [69] 67,70]), dan karena aktivator yang jauh lebih spesifik sekarang tersedia. Salah satunya adalah C13, turunan dari analog adenosin lain yang disebut C2 yang telah diesterifikasi pada dua atom oksigen dari gugus fosfonatnya untuk membuatnya lebih permeabel sel [71]. C13 memang siap diambil oleh sel, tetapi kemudian diubah menjadi C2 oleh esterase seluler (gambar 2A). Hebatnya, C2 adalah aktivator AMPK yang lebih poten daripada AMP itu sendiri, meskipun perlu dicatat bahwa C2 spesifik untuk kompleks AMPK yang mengandung isoform 1, dan tidak aktif pada kompleks 2 [72]. Afinitas tinggi C2 mungkin timbul karena mengikat, tak terduga, ke subunit AMPK-γ dalam orientasi yang agak berbeda dari AMP [73].

3.2. Senyawa yang mengikat di situs obat dan metabolit alosterik (ADAM)

Dalam struktur heterotrimer AMPK yang mengandung 1 [17,18] atau 2 [19], -CBM berinteraksi dengan lobus-N domain kinase dari subunit melalui permukaan yang berlawanan dengan situs pengikatan glikogennya (gambar 1). Celah antara domain ini membentuk situs pengikatan untuk ligan baru yang bekerja pada AMPK, yang dalam banyak kasus keluar dari layar throughput tinggi yang mencari perpustakaan bahan kimia sintetis untuk aktivator alosterik AMPK. Yang pertama ditemukan adalah thienopiridone A-769662 [74] tetapi setidaknya 10 sekarang telah dilaporkan, termasuk PF-739 [75] dan MK-8722 [76] (gambar 2B). Semua mengaktifkan kompleks 1 dengan potensi lebih tinggi daripada kompleks 2, dan ini membuat beberapa dari mereka (termasuk A-769662 [77]) sangat selektif untuk yang pertama. Selain menyebabkan aktivasi alosterik, pengikatan senyawa ini juga menghambat defosforilasi Thr172 dalam uji bebas sel [78,79], meskipun dalam sel utuh efek dominan tampaknya alosterik, karena perubahan besar dalam fosforilasi target AMPK asetil-KoA karboksilase dalam menanggapi agonis ini biasanya hanya disertai dengan perubahan sederhana dalam fosforilasi Thr172 [78].

Salah satu fitur aneh dari ligan yang saat ini diketahui mengikat di situs ini adalah hampir semuanya adalah bahan kimia sintetis daripada produk alami. Namun, banyak orang di lapangan percaya bahwa senyawa ini mungkin meniru efek beberapa metabolit alami yang mengikat situs ini, itulah sebabnya situs ini disebut situs 'a llosteric d rug a nd m etabolite' (ADAM) [80] . Satu-satunya produk alami yang saat ini diketahui mengikat situs ini adalah salisilat, senyawa yang dibuat oleh tanaman yang bertindak sebagai hormon yang menandakan infeksi oleh patogen [81]. Dalam bentuk ekstrak kulit pohon willow, salisilat telah digunakan oleh manusia sebagai obat sejak zaman kuno, dan masih digunakan secara luas sebagai turunan sintetis asam asetil salisilat (ASA atau aspirin), yang dengan cepat dipecah menjadi salisilat sekali. itu memasuki sirkulasi. Meskipun aspirin sendiri merupakan inhibitor ireversibel kuat dari siklooksigenase yang terlibat dalam biosintesis prostanoid seperti tromboksan [82], salisilat mengaktifkan AMPK dengan mengikat langsung di situs ADaM, yang terjadi pada konsentrasi yang dicapai dalam plasma pasien yang menggunakan aspirin dosis tinggi. dan obat berbasis salisilat lainnya [81]. Menariknya, penggunaan aspirin secara teratur, biasanya digunakan untuk mengurangi pembentukan bekuan darah melalui penghambatan sintesis tromboksan, dikaitkan dengan penurunan insiden kanker [83].Apakah ini dapat dijelaskan sepenuhnya dengan penghambatan siklooksigenase, atau apakah itu melibatkan beberapa target lain seperti AMPK, saat ini masih belum jelas.

3.3. Senyawa, termasuk biguanida, yang mengaktifkan AMPK secara tidak langsung dengan menghambat sintesis ATP mitokondria

Metformin dan phenformin (gambar 2C) adalah biguanida sintetik yang berasal dari galegine (isoprenyl guanidine) [84], produk alami dari tanaman kambing atau Galega officinalis, yang terkenal sebagai obat herbal di Inggris abad ketujuh belas [85]. Kedua biguanida diperkenalkan untuk pengobatan diabetes tipe 2 pada 1950-an, meskipun fenformin ditarik di sebagian besar negara pada 1970-an karena penggunaannya dikaitkan dengan efek samping asidosis laktat yang jarang namun mengancam jiwa. Risiko asidosis laktat jauh lebih rendah dengan metformin, yang kemudian menjadi obat pilihan pertama dalam pengobatan diabetes tipe 2 di seluruh dunia. Meskipun biguanida telah digunakan sejak tahun 1950-an, petunjuk pertama untuk mekanisme kerjanya tidak muncul sampai tahun 2000, ketika mereka dilaporkan menghambat kompleks I dari rantai pernapasan mitokondria, sehingga menjelaskan risiko akumulasi asam laktat [86,87] mereka kemudian juga telah terbukti menghambat mitokondria ATP sintase [88]. Jelas, penghambatan sintesis ATP mitokondria diharapkan dapat meningkatkan rasio seluler ADP : ATP dan AMP : ATP dan dengan demikian mengaktifkan AMPK melalui mekanisme kanonik. Memang, aktivasi AMPK oleh biguanides dalam sel utuh dan in vivo dilaporkan pada tahun 2001 [89], dan kemudian dikonfirmasi bahwa ini disebabkan oleh peningkatan AMP dan/atau ADP [51], meskipun metformin juga dapat mengaktifkan AMPK melalui jalur lisosom non-kanonik [90]. Metformin memiliki dua efek klinis utama: (i) menghambat produksi glukosa oleh hati dan (ii) meningkatkan sensitivitas insulin jaringan seperti hati dan otot rangka. Anehnya, penelitian dengan tikus knockout AMPK ganda spesifik hati (α1 /− 2 /− ) menunjukkan bahwa efek cepat metformin pada produksi glukosa hati adalah AMPK independen, meskipun faktanya mereka disertai dengan peningkatan AMP seluler : ATP rasio [91]. Efek akut metformin ini sekarang tampaknya disebabkan oleh inhibisi alosterik langsung dari enzim glukoneogenik fruktosa-1,6-bisfosfatase oleh AMP [70]. Meskipun demikian, penelitian pada tikus dengan mutasi double knock-in dari residu serin tunggal yang ditargetkan oleh AMPK di ACC1 (S79A) dan ACC2 (S212A) menunjukkan bahwa efek sensitisasi insulin jangka panjang dari metformin memang dimediasi oleh AMPK [92 ]. Tikus-tikus ini, di mana AMPK tidak lagi secara akut menghambat sintesis asam lemak atau mengaktifkan oksidasi asam lemak, mengakumulasi kelebihan di- dan trigliserida di hati dan otot, yang disertai dengan resistensi insulin. Meskipun tikus tipe liar mengembangkan tingkat resistensi insulin yang sama ketika ditempatkan pada diet tinggi lemak, sensitivitas insulin pada tikus knock-in tidak memburuk lebih lanjut, mungkin karena mereka sudah mensintesis begitu banyak lemak. Namun, ketika tikus yang diberi makan tinggi lemak diobati dengan metformin selama enam minggu, ini membalikkan resistensi insulin dari tikus tipe liar tetapi tidak berpengaruh pada tikus knock-in. Dengan demikian, efek jangka panjang metformin pada sensitivitas insulin, meskipun bukan efek jangka pendeknya pada produksi glukosa hati, disebabkan oleh modulasi metabolisme lipid oleh AMPK, kemungkinan besar dengan mengurangi penyimpanan lipid yang berlebihan di jaringan seperti hati dan tulang. otot [92].

Setelah temuan awal bahwa AMPK diaktifkan oleh biguanida [89], dan bahwa penekan tumor LKB1 bertindak di hulu AMPK [14], pertanyaan apakah penggunaan biguanida memiliki pengaruh pada kanker dibahas. Studi retrospektif menyarankan bahwa penggunaan metformin pada pasien dengan diabetes tipe 2 di wilayah Tayside Skotlandia dikaitkan dengan signifikan (sekitar 30%) pengurangan kejadian kanker [93]. Asosiasi ini telah dikonfirmasi dalam studi banyak kohort diabetes lainnya [94-96], meskipun validitasnya telah ditantang karena kemungkinan bias terkait waktu [97] dan tetap hanya korelasi, tanpa bukti penyebab langsung. . Selain itu, bahkan jika asosiasi itu valid, itu tidak selalu menyiratkan bahwa metformin bertindak langsung pada AMPK di dalam tumor itu sendiri, daripada secara tidak langsung melalui efek yang bergantung pada AMPK atau -independen pada jaringan atau organ lain. Misalnya, karena metformin saat ini hanya digunakan untuk mengobati diabetes tipe 2, kami tidak tahu apakah penggunaannya akan dikaitkan dengan penurunan insiden kanker pada subjek tanpa diabetes (walaupun ada uji coba kecil pada pasien dengan kanker payudara atau endometrium, ini adalah hanya uji coba 'jendela peluang' untuk menilai berbagai penanda dalam waktu singkat sebelum operasi [98-101]). Perhatikan juga bahwa insiden kanker yang berbeda pada pasien dengan diabetes tipe 2 yang menggunakan metformin diamati ketika dibandingkan dengan mereka yang menggunakan obat lain [93-96]. Metformin meningkatkan sensitivitas insulin dan dengan demikian mengurangi pelepasan insulin, tetapi banyak obat lain yang umum digunakan, seperti sulfonilurea dan agonis peptida-1 seperti glukagon, bekerja sebagian dengan meningkatkan sekresi insulin, sementara beberapa subjek bahkan diobati langsung dengan insulin. Insulin, tentu saja, merupakan faktor pertumbuhan yang mendorong proliferasi sel dengan mengaktifkan jalur Akt. Salah satu penjelasan tentang efek perlindungan yang jelas dari metformin terhadap kanker pada pasien dengan diabetes karena itu, tidak seperti kebanyakan pengobatan lain, itu mengurangi daripada meningkatkan kadar insulin, dengan kadar insulin yang tinggi bertanggung jawab untuk ditingkatkan kejadian kanker pada pasien pada obat lain [102]. Memang, fenomena terkait terlihat pada pasien dengan kanker yang diobati dengan inhibitor phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3 K), yang sering mengeluarkan insulin ekstra untuk mengkompensasi resistensi insulin yang disebabkan oleh obat, sehingga mengurangi kemanjuran anti-kanker mereka. . Eksperimen dengan model tikus menunjukkan bahwa efek ini dapat diatasi dengan diet tambahan atau perawatan farmakologis yang membalikkan resistensi insulin yang disebabkan oleh obat ini [103].

Ada banyak senyawa lain yang mengaktifkan AMPK dengan menghambat sintesis ATP mitokondria, salah satu contohnya adalah resveratrol [51], yang menghambat sintase ATP mitokondria [104]. Lain adalah sorafenib, awalnya dikembangkan sebagai penghambat reseptor-linked tirosin kinase seperti reseptor VEGF dan platelet-derived growth factor (PDGF) dan digunakan untuk mengobati beberapa kanker hati, ginjal dan tiroid [105]. Namun, juga mengaktifkan AMPK pada konsentrasi terapeutik yang relevan dengan menghambat rantai pernapasan [106]. Hebatnya, lebih dari 100 produk alami yang berasal dari obat-obatan tradisional Asia dalam beberapa tahun terakhir juga telah terbukti mengaktifkan AMPK dalam sel utuh [107], dan efek dari setidaknya dua di antaranya, yaitu berberin [51] dan arctigenin [108] ], tampaknya karena penghambatan kompleks I dari rantai pernapasan mitokondria. Kami menduga bahwa banyak dari yang lain juga dapat bekerja melalui penghambatan baik kompleks I atau ATP sintase, yang keduanya merupakan kompleks besar yang terikat membran yang masing-masing mengandung tidak kurang dari 44 dan 14 subunit protein. Mungkin tidak mengherankan bahwa banyak senyawa hidrofobik mungkin menemukan situs pengikatan penghambatan dalam kompleks ini. Kelas aktivator AMPK ini sangat beragam dalam struktur (misalnya pada gambar 2C), menunjukkan bahwa mereka dapat berinteraksi dengan situs yang berbeda. Banyak produk alami yang mengaktifkan AMPK dapat diproduksi oleh tanaman untuk memberikan pertahanan kimia untuk mencegah penggembalaan oleh serangga atau hewan lain, atau infeksi oleh patogen, dan keracunan kompleks I atau ATP sintase tampaknya merupakan cara yang baik untuk mencapainya. tujuan. Menariknya, banyak dari produk tanaman beracun ini disimpan di dalam tanaman yang mensintesisnya baik di vakuola atau di dinding sel [109], di mana mereka tidak akan bersentuhan dengan mitokondria tanaman itu sendiri.

3.4. Penghambat AMPK

Saat ini, tidak ada inhibitor AMPK spesifik yang tersedia. Satu-satunya inhibitor AMPK yang telah banyak digunakan dalam literatur adalah senyawa C (juga dikenal sebagai dorsomorfin). Meskipun dikembangkan sebagai inhibitor AMPK, klaim bahwa itu spesifik untuk AMPK berasal dari laporan asli bahwa itu tidak menghambat panel hanya lima protein kinase lainnya [89]. Namun, dalam skrining 70 protein kinase, sembilan dihambat lebih besar daripada AMPK [110], sementara pada skrining yang lebih baru dari 120 kinase yang didokumentasikan dalam Database Inhibitor Kinase MRC (www.kinase-screen.mrc.ac. uk/kinase-inhibitors) tidak kurang dari 30 dihambat lebih besar dari AMPK. Oleh karena itu, penggunaan senyawa C tidak dapat direkomendasikan, bahkan sebagai alat percobaan. Penghambat AMPK lainnya telah dilaporkan [111,112], tetapi belum digunakan secara luas.

4. Target hilir AMPK

Setelah diaktifkan, AMPK memfosforilasi banyak protein hilir, dengan setidaknya 60 diidentifikasi sebagai target mapan dalam tinjauan baru-baru ini [113]. Motif pengenalan inti untuk AMPK didefinisikan dengan baik: membutuhkan residu dasar (R, K atau H) baik tiga atau empat residu N-terminal ke serin/treonin terfosforilasi (disebut sebagai posisi P-3 dan P-4) serta residu hidrofobik (L, M, I, F atau V) pada P-5 dan P+4 [113-115]. Isoform ACC1 dari asetil-KoA karboksilase, yang merupakan substrat yang sangat baik untuk AMPK, memiliki determinan spesifisitas tambahan N-terminal untuk motif inti ini, yang tidak ada di semua target hilir. Ini adalah residu dasar lain di P-6, dan -heliks amfipatik berjalan dari P-5 ke P-16 yang mengikat dalam alur hidrofobik pada permukaan C-lobe domain AMPK kinase [116]. Kami membahas beberapa target di bawah ini, dengan fokus pada target yang mungkin sangat relevan dengan peran AMPK dalam kanker.

4.1. Protein dan gen yang terlibat dalam jalur katabolik

Proses katabolik yang diaktifkan oleh AMPK dirangkum dalam gambar 3. Pada banyak jenis sel, tergantung pada ekspresi transporter glukosa spesifik (GLUT), aktivasi AMPK meningkatkan penyerapan glukosa. Pada otot rangka, AMPK secara akut meningkatkan translokasi vesikel yang mengandung GLUT4 dari vesikel intraseluler ke membran plasma, sebagian melalui mekanisme yang melibatkan fosforilasi protein Rab-GAP TBC1D1 [117]. Dalam jangka panjang, AMPK juga meningkatkan ekspresi protein GLUT4 melalui mekanisme yang mungkin melibatkan fosforilasi langsung kelas IIa histone deacetylases (misalnya HDAC5) [118], yang tampaknya menyebabkan pengecualian mereka dari nukleus [119] dan karena itu mendorong asetilasi bersih. dan aktivasi transkripsi pada promotor GLUT4. Aktivasi AMPK juga secara akut mengaktifkan transpor glukosa oleh transporter glukosa yang diekspresikan secara lebih luas GLUT1 [120], sebagian melalui fosforilasi dan degradasi konsekuen dari TXNIP, anggota keluarga -arrestin yang tampaknya mempromosikan internalisasi GLUT1 serta penurunan kadar mRNA-nya. [121]. Dalam beberapa tetapi tidak semua sel, AMPK secara akut merangsang fluks glikolitik melalui mekanisme yang melibatkan fosforilasi langsung 6-fosfofrukto-2-kinase/fruktosa-2,6- bisphosphatase, enzim yang membuat dan memecah fruktosa-2,6-bifosfat melalui domain yang berbeda dari polipeptida bienzim [122]. Fosforilasi oleh AMPK meningkatkan aktivitas kinase, sehingga meningkatkan konsentrasi seluler fruktosa-2,6-bifosfat, aktivator alosterik ampuh dari enzim glikolitik 6-fosfofrukto-1-kinase [122]. Namun, mekanisme ini terbatas pada tipe sel tertentu, karena hanya isoform PFKFB2 [123] dan PFKFB3 [124] yang menjadi target AMPK. PFKFB2 diekspresikan dalam miosit jantung dan beberapa jaringan lain, sementara penyambungan alternatif atau penggunaan promotor diferensial menghasilkan dua isoform utama PFKFB3 yang berbeda dengan urutan terminal-C pendek, inilah yang disebut isoform di mana-mana (atau konstitutif) dan isoform yang dapat diinduksi. 122]. Ekspresi bentuk yang diinduksi sangat rendah di sebagian besar jaringan dewasa, tetapi meningkat oleh rangsangan pro-inflamasi pada monosit dan makrofag [124] dan secara konstitutif diekspresikan dalam banyak sel tumor [125].

Gambar 3. Sebuah 'roda' target hilir dan jalur yang mereka atur, dengan fokus pada proses katabolik yang diaktifkan oleh AMPK.

Meskipun AMPK karenanya dapat secara akut mengaktifkan produksi ATP melalui glikolisis pada beberapa jenis sel, dalam jangka panjang ia cenderung meningkatkan metabolisme oksidatif mitokondria, yang jauh lebih efisien dalam hal produksi ATP per glukosa yang dikonsumsi (≈36 ATP per glukosa oleh metabolisme oksidatif). , sebagai lawan hanya dua dengan glikolisis). Metabolisme oksidatif, bagaimanapun, kurang kompatibel dengan menyediakan prekursor untuk pertumbuhan sel, sehingga cenderung digunakan untuk tingkat yang lebih besar dalam diam daripada sel-sel berkembang biak [126]. Dalam jangka pendek, AMPK mengaktifkan penyerapan asam lemak ke dalam mitokondria melalui fosforilasi dari asetil-KoA karboksilase isoform ACC2 [127]. Sementara ACC1, target AMPK pertama yang diidentifikasi, diperkirakan menghasilkan malonil-KoA sitoplasma yang digunakan dalam sintesis asam lemak, ACC2 melokalisasi ke mitokondria [128] dan diperkirakan menghasilkan malonil-KoA mitokondria yang menghambat penyerapan asam lemak ke dalam mitokondria melalui karnitin: sistem transferase palmitoil. Fosforilasi ACC2 menurunkan malonil-KoA dan oleh karena itu mengurangi penghambatan karnitin: palmitoyl-CoA transferase-1 (CPT1), sehingga menyebabkan promosi akut oksidasi asam lemak mitokondria [127].

Dalam jangka panjang, aktivasi AMPK memiliki beberapa efek pada mitokondria yang meningkatkan kapasitasnya untuk menghasilkan ATP dengan kecepatan tinggi. Pertama, aktivasi AMPK mempromosikan biogenesis mitokondria itu sendiri, yang melibatkan peningkatan replikasi DNA mitokondria serta ekspresi banyak protein mitokondria yang dikodekan dengan nuklear, dengan mengaktifkan ko-aktivator transkripsi PGC-1α [129]. Hal ini dipengaruhi baik oleh fosforilasi langsung PGC-1α [130] atau dengan meningkatkan konsentrasi seluler NAD + , kofaktor yang diperlukan untuk deasetilasi dan aktivasi PGC-1α oleh SIRT1 [131]. Kedua, sebagai tempat utama produksi seluler spesies oksigen reaktif, komponen mitokondria sangat rentan terhadap kerusakan oksidatif, dan jika ini memengaruhi fungsinya, mitokondria perlu dihilangkan dan isinya didaur ulang oleh bentuk autofagi yang ditargetkan yang dikenal sebagai mitofag. Relevan dengan ini, AMPK telah terbukti mempromosikan autophagy dan mitofagy baik dengan fosforilasi protein kinase yang memicu autophagy, ULK1 [132.133], atau dengan fosforilasi DAPK kinase yang bergantung pada Ca 2+ / calmodulin, menghasilkan Ca 2+ /calmodulin-bentuk independen yang memfosforilasi protein kunci autophagy Beclin-1 [134]. Ketiga, mitokondria sekarang diketahui ada, terutama dalam sel diam, bukan sebagai organel kecil yang terpisah, tetapi sebagai jaringan percabangan tubulus yang dapat hampir sepanjang sel yang mengandung mereka [135]. Jika ada wilayah dari jaringan seperti itu yang rusak, mereka harus dipisahkan dari wilayah yang sehat melalui proses pembelahan mitokondria, sehingga menjadi cukup kecil untuk didaur ulang oleh mitofag. Menariknya, aktivasi AMPK telah ditunjukkan untuk mempromosikan pembelahan mitokondria dengan fosforilasi langsung dari faktor pembelahan mitokondria (MFF) [136]. Temuan ini konsisten dengan satu aspek fenotipe KO ganda AMPK spesifik otot rangka (baik 1 dan 2 [137] atau 1 dan 2 [138]), di mana otot terakumulasi secara abnormal berbentuk mitokondria dan tampaknya tidak berfungsi. Secara keseluruhan, AMPK tampaknya memainkan beberapa peran penting dalam homeostasis mitokondria. Karena mitokondria adalah sumber utama ATP seluler di sebagian besar sel, ini sangat masuk akal untuk jalur pensinyalan yang diaktifkan oleh stres energi dan/atau kekurangan glukosa.

4.2. Protein dan gen yang terlibat dalam jalur anabolik

Selain mengaktifkan jalur katabolik yang menghasilkan ATP, AMPK juga mematikan hampir semua jalur anabolik utama (gambar 4). AMPK awalnya didefinisikan melalui kemampuannya untuk memfosforilasi dan menonaktifkan baik asetil-KoA karboksilase (ACC1) dan 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reduktase (HMGR), enzim pengatur utama asam lemak dan sintesis sterol, masing-masing [139.140]. Sintesis asam lemak adalah jalur konsumsi energi yang signifikan dalam membagi sel tumor dengan cepat, menjadi konsumen utama dari kedua ATP (dikonsumsi dalam reaksi ACC1) dan NADPH (dikonsumsi dalam dua langkah reduktif yang dikatalisis oleh kompleks asam lemak sintase). Memang, ACC1 tetap menjadi salah satu substrat terfosforilasi paling cepat untuk AMPK, dan fosforilasi Ser80 (penomoran manusia) pada ACC1, dipantau menggunakan antibodi fosfospesifik, tetap menjadi penanda seluler fungsi AMPK yang paling andal dan banyak digunakan.

Gambar 4. Sebuah 'roda' target hilir dan jalur yang mereka atur, dengan fokus pada proses anabolik dan lainnya yang dihambat oleh AMPK.

Selain menghambat sintesis asam lemak secara akut dengan fosforilasi langsung ACC1 (yang mengkatalisis dua langkah pertama sintesis asam lemak dari asetil-KoA), aktivasi AMPK juga menurunkan regulasi ekspresi gen yang mengkode ACC1 (ACCA) serta gen (FASN) yang mengkode kompleks asam lemak sintase, polipeptida multienzim dimer yang mengkatalisis tujuh reaksi yang tersisa yang mengarah ke asam lemak C16 jenuh (palmitat). Target AMPK yang bertanggung jawab atas efek ini mungkin faktor transkripsi sterol response element binding protein-1c (SREBP1c) [141] dan/atau protein pengikat elemen respon karbohidrat (ChREBP) [142], yang keduanya telah dilaporkan terfosforilasi secara langsung. oleh AMPK.

Serta menghambat de novo sintesis asam lemak, AMPK menghambat sintesis trigliserida dan sintesis fosfolipid dengan menonaktifkan enzim pertama (gliserol fosfat asil transferase, GPAT) yang terlibat dalam sintesis diasilgliserol perantara umum [143], meskipun apakah ini karena fosforilasi langsung enzim masih belum jelas. Dua target langsung AMPK adalah otot (GYS1) [34] dan hati (GYS2) [35] isoform glikogen sintase, yang mengkatalisis transfer glukosa dari UDP-glukosa ke ujung partikel glikogen yang tidak pereduksi. Keduanya diinaktivasi oleh fosforilasi di situs N-terminal setara oleh AMPK, meskipun inaktivasi ini ditunggangi oleh konsentrasi tinggi dari aktivator alosterik feed-forward sintase glikogen, glukosa-6-fosfat [144]. Kebutuhan untuk melokalisasi AMPK dengan glikogen sintase mungkin menjadi salah satu alasan mengapa isoform subunit AMPK-β di semua spesies membawa modul pengikat karbohidrat (β-CBM lihat gambar 1).

Jalur kunci lain dalam pertumbuhan sel adalah biosintesis nukleotida. Komponen ribosa atau deoksiribosa nukleotida berasal dari ribosa-5-fosfat yang dihasilkan dalam jalur pentosa fosfat. Baru-baru ini dilaporkan bahwa PRPS1 dan PRPS2, dua isoform utama dari fosforibosil pirofosfat sintetase yang memetabolisme ribosa-5-fosfat pada langkah pertama biosintesis nukleotida, difosforilasi dan diinaktivasi oleh fosforilasi langsung oleh AMPK [145]. Jalur pentosa fosfat juga menghasilkan NADPH yang digunakan untuk biosintesis asam lemak, serta untuk regenerasi glutathione tereduksi yang digunakan untuk memerangi stres oksidatif. Kebutuhan besar untuk NADPH dan biosintesis nukleotida dalam sel yang berkembang biak dengan cepat mungkin menjadi salah satu alasan mengapa mereka menunjukkan pengambilan glukosa yang cepat untuk memberikan masukan glukosa ke dalam jalur pentosa fosfat.

Nukleotida, tentu saja, merupakan bahan penyusun RNA dan DNA. Dalam timosit yang berkembang biak dengan cepat, penambahan aktinomisin D (penghambat umum sintesis RNA) mengurangi pengambilan oksigen sebanyak 15% [146], menunjukkan bahwa sintesis RNA menyumbang setidaknya persentase dari total pergantian ATP. Karena hingga 80% dari total RNA dalam sel tipikal adalah RNA ribosom (rRNA), sintesis yang terakhir adalah jalur anabolik utama dan konsumen energi dalam sel yang berkembang biak. Konsisten dengan ini, aktivasi AMPK telah ditemukan untuk menghambat sintesis rRNA dengan fosforilasi langsung dari faktor transkripsi untuk RNA polimerase I, TIF-1A (dikodekan oleh RRN3 gen) [147].

Bisa dibilang jalur biosintetik yang paling penting dalam sel yang berproliferasi adalah translasi (sintesis protein). Lebih dari 50% dari berat kering sebagian besar sel adalah protein sementara, dalam sistem thymocyte yang berkembang biak yang disebutkan di atas, penghambatan sintesis protein mengurangi pengambilan oksigen lebih dari 20% [146]. AMPK mematikan terjemahan oleh setidaknya dua mekanisme. Pertama, menginaktivasi target rapamycin complex-1 (TORC1), yang dikenal untuk mempromosikan langkah inisiasi sintesis protein ribosom dengan memicu fosforilasi beberapa protein, termasuk faktor inisiasi eukariotik-4E binding protein-1 (EIF4EBP1) dan ribosomal protein S6 kinase-1 (RPS6KB1) [148]. Fosforilasi EIF4EBP1 mengarah pada terjemahan selektif mRNA yang mengandung sekuens oligopirimidin 5′-terminal (5′-TOP), yang sering mengkode mRNA yang mengkode protein yang diperlukan untuk pertumbuhan sel yang cepat, termasuk sebagian besar protein ribosom serta protein lain yang terlibat dalam translasi [149] . AMPK menonaktifkan mTORC1 dengan setidaknya dua mekanisme, yaitu fosforilasi penghambatan subunit Raptor yang menargetkan kompleks ke target hilir dan ke lisosom tempat ia diaktifkan, dan fosforilasi aktivasi TSC2, yang merupakan bagian penting dari TSC1:TSC2:TBC1D7 kompleks. Yang terakhir memiliki Rheb: protein aktivator GTPase (Reb: GAP) pada TSC2 yang mengubah protein G pengaktif mTORC1 Rheb menjadi bentuk terikat PDB yang tidak aktif [150]. Kedua, AMPK menghambat langkah pemanjangan sintesis protein ribosom dengan mempromosikan fosforilasi faktor pemanjangan-2 di Thr56. Residu ini tidak difosforilasi oleh AMPK itu sendiri tetapi oleh elongasi faktor-2 kinase (EF2 K), anggota keluarga protein kinase (aPK) atipikal yang diaktifkan oleh Ca 2+ /calmodulin. AMPK tampaknya mengaktifkan EF2 K sebagian melalui fosforilasi langsung [151] dan sebagian dengan menonaktifkan mTORC1, dengan EF2 K terfosforilasi dan dinonaktifkan oleh p70S6K1 hilir mTORC1 [152.153].

4.3. Kemajuan melalui siklus sel

Selain menghambat sebagian besar jalur biosintesis utama, aktivasi AMPK juga dapat menyebabkan penghentian siklus sel (gambar 4). Sejak tahun 2001, dilaporkan bahwa aktivator AMPK 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside (AICAR) menyebabkan penghentian fase G1 dari siklus sel dalam sel HepG2, yang dikaitkan dengan fosforilasi faktor transkripsi p53 di Ser15 , dan konsekuen peningkatan ekspresi dari G1 cyclin-dependent kinase inhibitor p21 CIP1 (CDKN1A) [154]. Ini diikuti oleh demonstrasi bahwa AICAR dan glukosa rendah menyebabkan penghentian siklus sel di MEFs [155]. Efek ini setidaknya sebagian tergantung pada p53, karena mereka berkurang pada p53 /− MEFs. Meskipun AICAR dan deprivasi glukosa dapat memiliki efek independen AMPK yang tidak sesuai target, efek glukosa rendah juga tampaknya bergantung pada AMPK karena efek tersebut direduksi oleh ekspresi mutan AMPK negatif dominan (mutan AMPK-α yang tidak aktif kinase yang menghambat subunit AMPK-α endogen dengan bersaing untuk mendapatkan subunit dan yang tersedia). Kelompok ini juga melaporkan bahwa konstruksi domain kinase aktif AMPK dapat langsung memfosforilasi p53 di Ser15 [155]. Namun, urutan di sekitar Ser15 tidak cocok dengan motif pengenalan AMPK, kekurangan residu basa pada P-4 atau P-3 (pada kenyataannya, dengan residu asam pada P-4 sebagai gantinya). Tampaknya lebih mungkin bahwa fosforilasi p53 yang diamati sebagai respons terhadap aktivasi AMPK tidak langsung.

Mekanisme potensial lain di mana AMPK menyebabkan penangkapan G1 melibatkan fosforilasi inhibitor kinase lain yang bergantung pada siklin, p27 WAF1 (CDKN1B). Dalam sel kanker payudara (MCF-7), p27 ditemukan terfosforilasi pada residu terminal-C (Thr198), dan ini tampaknya menstabilkan protein, sehingga meningkatkan ekspresinya dan menyebabkan penghentian siklus sel serta tampaknya mempromosikan autophagy . Fosforilasi Thr198 meningkat sebagai respons terhadap pengobatan AICAR atau kelaparan glukosa sel. Meskipun beberapa bukti disajikan bahwa Thr198 secara langsung terfosforilasi oleh AMPK, situs tersebut tidak sesuai dengan motif pengenalan AMPK (misalnya, menjadi residu terminal-C, tidak ada residu hidrofobik pada P+4), dan mutasi Thr198 hanya memiliki efek sederhana pada fosforilasi oleh AMPK dalam pengujian bebas sel [156]. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi bahwa ini adalah efek langsung dari AMPK.

Meskipun aktivasi AMPK oleh AICAR [14] dan glukosa rendah [60] memerlukan keberadaan LKB1, AMPK masih dapat menyebabkan penangkapan G1 pada tiga garis sel tumor defisiensi LKB1 yang berbeda jika diaktifkan dengan penambahan ionofor Ca2+ ke mengaktifkan kinase hulu alternatif, CaMKK2. Efek ini dihilangkan baik dengan ekspresi mutan AMPK-α2 negatif dominan atau dengan knockout ganda AMPK-α1 dan -α2 [157]. Dengan demikian, AMPK dapat menyebabkan penangkapan G1 bahkan tanpa adanya penekan tumor upstream kinase, LKB1. Menariknya, pengobatan sel dengan Ca2+ ionophore A23187 menyebabkan penangkapan G1 tanpa mempengaruhi ekspresi CDKN1A atau CDKN1B, meskipun fakta bahwa ekspresi keseluruhan keduanya dikurangi dengan ekspresi mutan negatif dominan atau knockout ganda [157]. Jadi, dalam hal ini perubahan ekspresi CDKN1A atau CDKN1B tidak dapat menjadi satu-satunya penjelasan untuk penghentian siklus sel.

5. AMPK dan kanker—bukti dari model tikus

Kami sekarang akan membahas bukti bahwa, tergantung pada konteksnya, AMPK dapat bertindak sebagai penekan tumor atau sebagai promotor tumor pada model tikus.

5.1. AMPK—penekan tumor?

Dengan penemuan bahwa aktivasi AMPK memerlukan penekan tumor LKB1, kesadaran bahwa AMPK menghambat pertumbuhan dan proliferasi sel, dan bukti epidemiologis bahwa aktivator AMPK, metformin, memberikan perlindungan terhadap kanker, tampaknya AMPK juga akan menjadi penekan tumor. . Satu peringatan adalah bahwa, segera setelah penemuan bahwa LKB1 bertindak hulu AMPK, LKB1 ditemukan diperlukan untuk fosforilasi dan aktivasi setidaknya 12 kinase lain yang terkait erat dengan AMPK (sekarang disebut sebagai Kinase terkait AMPK atau TABUT keluarga), yang berbagi urutan yang sangat mirip dalam loop aktivasi mereka [158.159]. Meskipun tidak ada ARK (tidak seperti AMPK) yang diketahui menghambat pertumbuhan dan proliferasi sel, knockdown LKB1 menggunakan RNAi dilaporkan meningkatkan ekspresi SNAIL, protein yang mendorong transisi epitel ke mesenkim, dan karenanya metastasis sel tumor, dengan mengurangi fosforilasi DIXDC1 oleh dua ARK, MARK1 dan MARK4 [160]. Oleh karena itu tetap mungkin bahwa setidaknya beberapa efek penekan tumor LKB1 mungkin dimediasi oleh satu atau lebih ARK, daripada AMPK.

Konfirmasi peran penekan tumor untuk AMPK in vivo diperlukan studi tumorigenesis pada tikus knockout AMPK. Namun, ada dua isoform dari subunit katalitik (α1 dan 2) dan KO ganda global mematikan embrio [161], sehingga memerlukan penggunaan KO ganda spesifik jaringan. Meskipun pendekatan ini sekarang mungkin, itu juga sangat memakan waktu. Namun, jalan pintas muncul dengan kesadaran bahwa sel-sel dari garis keturunan hematopoietik, termasuk limfosit, secara eksklusif mengekspresikan AMPK-α1 [162]. Dengan demikian, untuk mempelajari peran AMPK pada limfoma dan/atau leukemia, hanya perlu melumpuhkan satu gen, yaitu gen PRKA1 pengkodean gen AMPK-α1.

Studi pertama yang menunjukkan bahwa AMPK adalah penekan tumor menggunakan model Eµ-Myc [163], di mana limfoma sel B diinduksi oleh ekspresi berlebih transgenik dari Myco onkogen dari promotor spesifik sel B. Konsisten dengan gagasan bahwa AMPK-α1 adalah penekan tumor, hilangnya kedua alel PRKA1 dalam model ini sangat mempercepat perkembangan limfoma sel B, sedangkan hilangnya satu alel memiliki efek menengah. Sel limfoma Eµ-Myc dan sel tumor lain yang mengekspresikan shRNA yang ditargetkan pada AMPK-α1 juga dipelajari in vitro. Secara umum, sel knockdown AMPK menunjukkan hiper-aktivasi mTORC1 dan peningkatan penyerapan glukosa dan produksi laktat dibandingkan dengan kontrol, dan ini tampaknya disebabkan oleh peningkatan ekspresi faktor transkripsi yang diinduksi hipoksia-1α (HIF-) [163]. The 5′-UTR mRNA encoding HIF-1α berisi 5′-TOP urutan [164] dan terjemahan mereka dengan demikian ditingkatkan dengan aktivasi mTORC1 ([165] lihat 4.2). Dengan demikian, hilangnya AMPK dalam sel progenitor tumor meningkatkan pengambilan glukosa dan glikolisis bahkan dalam kondisi normoksik. Ini adalah contoh dari 'efek Warburg' yang terkenal, di mana sel-sel tumor menunjukkan tingkat konsumsi glukosa yang tinggi untuk menghasilkan prekursor untuk biosintesis yang berasal dari jalur pentosa fosfat dan glikolisis. Misalnya, ribosa-5-fosfat untuk biosintesis nukleotida dan NADPH untuk sintesis lipid dihasilkan melalui jalur pentosa fosfat, sedangkan serin (diperlukan untuk metabolisme satu karbon yang digunakan dalam biosintesis nukleotida purin) dihasilkan oleh jalur yang bercabang dari jalur glikolitik. intermediet 3-fosfogliserat [126].

Kelemahan dengan model limfoma sel B ini adalah bahwa Prakaa1 tersingkir secara global [163], jadi tidak mungkin untuk menyimpulkan bahwa efeknya disebabkan oleh hilangnya AMPK-α1 secara otonom sel pada nenek moyang sel B itu sendiri, daripada efek tidak langsung dari hilangnya AMPK-α1 pada beberapa jenis sel lainnya. Dalam upaya untuk mengatasi hal ini, tikus tipe liar diradiasi untuk menonaktifkan sistem kekebalan endogen mereka, dan kemudian dilarutkan dengan sel induk hematopoietik baik dari Eµ-Myc/Prkaa1 /− atau Eµ-Myc/Prka1 +/+ tikus. Menariknya, semua tikus yang menerima sel KO AMPK mengembangkan limfoma, tetapi hanya 20% dari mereka yang menerima sel tipe liar AMPK [163], sehingga mendukung gagasan bahwa efek hilangnya AMPK setidaknya sebagian otonom sel.

Studi lain melibatkan persilangan tikus dengan KO global dari gen yang mengkode p53 (Trp53) dan AMPK-β1 (PRkab1), yang terakhir menjadi isoform subunit utama yang diekspresikan dalam prekursor sel T di timus [166]. KO PRkab1 menyebabkan timbulnya limfoma sel-T lebih awal pada KO p53 homozigot dan heterozigot, menunjukkan bahwa 1 memiliki peran penekan tumor dalam limfoma sel-T. Namun, sekali lagi KO dari PRkab1 dalam model ini bersifat global daripada spesifik sel T, jadi tidak mungkin untuk menyimpulkan apakah ini adalah efek intrinsik sel pada AMPK dalam sel progenitor tumor itu sendiri.

Kehilangan spesifik AMPK dalam sel progenitor tumor baru-baru ini dicapai dengan menggunakan model leukemia/limfoma limfoblastik akut sel T (T-ALL) [167]. Seperti yang dilaporkan sebelumnya [168], tikus dengan knockout sel-T spesifik PTEN (menggunakan Cre recombinase yang diekspresikan dari Lck promotor) mulai mengembangkan limfoma pada usia sekitar 50 hari, dan pada dasarnya semua tikus telah mengembangkan T-ALL pada 150 hari. Sambil merobohkan PRKA1 gen menggunakan yang sama Lck-Sistem Cre tidak memiliki efek sendiri, ketika dikombinasikan dengan PTEN knockout, limfoma muncul lebih awal dan kelangsungan hidup bebas tumor secara keseluruhan sangat berkurang (gambar 5) [167]. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas AMPK basal dalam mengembangkan sel T cukup untuk memberikan perlindungan terhadap T-ALL. Namun, model ini juga memberikan kesempatan yang sangat baik untuk menguji apakah pengobatan dengan biguanida akan melindungi terhadap jenis kanker ini (lihat 3.3). Karena ekspresi AMPK-α1 tidak akan ada dalam sel limfoma dan progenitornya tetapi normal di tempat lain, juga dimungkinkan untuk menentukan apakah ada efek biguanida yang merupakan efek intrinsik sel untuk mengaktifkan AMPK dalam sel progenitor tumor itu sendiri. Agak mengecewakan, metformin tidak berpengaruh, yang berkorelasi dengan kurangnya aktivasi AMPK dan kegagalan untuk mendeteksi metformin dengan kromatografi cair-spektrometri massa (LC:MS) di timus tikus dengan limfoma. Sebaliknya, phenformin secara signifikan meningkatkan kelangsungan hidup bebas tumor, dan ini berkorelasi dengan aktivasi AMPK, dan deteksi phenformin oleh LC:MS, dalam timus tikus dengan limfoma. Menariknya, perlindungan terhadap T-ALL oleh phenformin hanya diamati ketika tumor mengekspresikan AMPK, tanpa efek pada knockout AMPK (gambar 5). Dengan demikian, perlindungan terhadap T-ALL oleh fenformin bergantung pada ekspresi AMPK dalam sel progenitor tumor, dan bersifat otonom sel, sedangkan kegagalan metformin untuk memberikan perlindungan disebabkan oleh kurangnya penyerapan obat oleh timosit. Phenformin juga telah ditunjukkan baru-baru ini untuk memperlambat pertumbuhan sel kanker payudara murine in vivo dalam model allograft tikus, meskipun peran AMPK tidak diperiksa [169].

Gambar 5. Pengaruh knockout sel T AMPK (AMPK KO) dan phenformin oral pada kelangsungan hidup bebas tumor pada tikus yang mengandung knockout sel T PTEN (PTEN KO). Jika diindikasikan, phenformin diberikan dalam air minum mulai dari usia 30 hari. Data asli dari [167].

Model tikus lain yang menyarankan peran penekan tumor untuk AMPK menggunakan KO spesifik epitel prostat dari Pten dan PRkab1 gen [170]. Meskipun KO dari PRkab1 sebaik Pten tidak mempengaruhi ukuran prostat, hal itu menghasilkan indeks proliferatif dan derajat patologis yang lebih tinggi. Kelemahan dengan model ini adalah bahwa kelenjar prostat juga mengekspresikan AMPK-β2, yang mungkin sebagian mengkompensasi kekurangan 1 dan mungkin mengapa efek pada tumorigenesis relatif sederhana.

Bukti lain yang mendukung gagasan bahwa AMPK adalah penekan tumor berasal dari studi ligase ubiquitin yang terlibat dalam degradasi seluler subunit AMPK. MAGE-A3/-A6 adalah anggota terkait erat dari antigen melanoma keluarga protein, yang biasanya hanya diekspresikan di testis tetapi diekspresikan kembali di banyak tumor, oleh karena itu disebut sebagai antigen tumor [171]. MAGE-A3/-A6 mengikat ke ubiquitin E3 ligase TRIM28, dan layar mengungkapkan AMPK-α1 menjadi target poliubiquitylation oleh kompleks ini, dengan degradasi proteasomal konsekuen. Konsisten dengan ini, knockdown MAGE-A3/A6 atau TRIM28 dalam sel tumor meningkatkan ekspresi AMPK-α1 dan memicu perubahan yang diharapkan dalam metabolisme dan pensinyalan, termasuk penghambatan mTORC1. Akhirnya, berbagai sel tumor manusia yang mengekspresikan MAGE-A3/-A6 telah menurunkan kadar protein AMPK-α1 [171].

Ligase ubiquitin terkait kanker lainnya, UBE2O, menargetkan degradasi 2, isoform subunit katalitik AMPK lainnya [172]. KO Ube2o perkembangan tumor yang dilemahkan pada model tikus dari kanker payudara dan prostat, mendukung gagasan bahwa protein memiliki fungsi mempromosikan tumor. Sebuah pencarian mengidentifikasi AMPK-α2 sebagai protein yang berinteraksi dengan UBE2O yang ditargetkan untuk poliubiquitylation dan degradasi proteasomal, dan kadar 2 tetapi tidak 1 diregulasi dalam jaringan dari Ube2o /− tikus. Garis sel karsinoma usus besar manusia juga tumbuh kurang cepat pada xenograft tikus ketika UBE2O dirobohkan menggunakan shRNA, dan ini dibalik dengan knockdown AMPK-α2 bersamaan tetapi tidak -α1. NS UBE2O gen terletak pada manusia di 17q25, sebuah wilayah yang diperkuat hingga 20% dari kanker payudara, kandung kemih, hati dan paru-paru. Menggunakan imunohistokimia tumor payudara manusia, ada korelasi negatif antara ekspresi UBE2O dan AMPK-α2, tetapi korelasi positif antara ekspresi UBE2O dan fosforilasi S6, penanda jalur mTORC1 [172].

5.2. AMPK—promotor tumor?

Terlepas dari bukti yang dibahas di bagian sebelumnya bahwa AMPK-α1 dan -β1 adalah penekan tumor yang melindungi terhadap perkembangan limfoma sel B dan T serta kanker prostat, penelitian lain menunjukkan bahwa AMPK dapat melindungi sel tumor (daripada pasien), dan dengan demikian memajukan pembentukan tumor, setidaknya ketika penyakit sudah terbentuk. Kelompok Rathmell menggunakan model T-ALL yang berbeda di mana NOTCH1 onkogenik diekspresikan in vitro dalam sel induk hematopoietik murine yang membawa gen AMPK-α1 floxed dan Cre recombinase yang digerakkan oleh promotor yang dapat diinduksi tamoxifen. Ini dikalikan pada tikus yang diiradiasi, dan kemudian disuntikkan ke tikus penerima sekunder yang diiradiasi. Setelah periode 10 hari untuk memungkinkan penyakit menjadi mapan, tikus kemudian diobati dengan tamoxifen untuk menghapus AMPK-α1 secara akut dalam sel T-ALL. Dalam model ini, melumpuhkan AMPK-α1 mengurangi pemulihan sel T-ALL di limpa, kelenjar getah bening dan sumsum tulang, dan meningkatkan kelangsungan hidup tikus [173]. Jadi, begitu sel tumor T-ALL telah berkembang, kehadiran AMPK-α1 tampaknya menambah viabilitas sel T-ALL dan mengurangi kelangsungan hidup tikus. Sementara AMPK karena itu bertindak sebagai penekan tumor selama pengembangan T-ALL [167], sekali tumor telah terjadi tampaknya secara paradoks beralih menjadi promotor tumor sebagai gantinya.

Studi lain menggunakan model tikus leukemia myeloid akut (AML) juga menyimpulkan bahwa AMPK bertindak sebagai promotor tumor [174]. Di sini, tikus yang membawa alel floxed dari Praka1 dan Praka2, serta Cre recombinase yang diekspresikan dari Mx1 promotor, disuntik dengan poli(I:C) untuk menghapus AMPK-α1 dan -α2 dari sel hematopoietik, dengan tikus yang kekurangan MX1-Cre sebagai kontrol.Sel-sel progenitor hematopoietik dari tikus-tikus ini kemudian ditransduksi dengan retrovirus yang mengekspresikan tiga fusi gen pemicu kanker yang berbeda (MLL-AFP, MOZ-TIF2 atau BCR-ABL) dan kemudian ditransplantasikan ke tikus penerima yang diiradiasi. Tidak adanya AMPK dari sel-sel pemicu leukemia baik menunda timbulnya penyakit (BCR-ABL) atau meningkatkan kelangsungan hidup tikus (MLL-AFP atau MOZ-TIF1). Dengan demikian, keberadaan AMPK diperlukan untuk mempertahankan potensi leukaemogenik penuh dari sel-sel dalam model ini. Bukti diberikan bahwa ini karena kurangnya AMPK meningkatkan pemulihan spesies oksigen reaktif (ROS) dalam sel-sel pemicu leukemia dari sumsum tulang, berkorelasi dengan penurunan rasio NADP teroksidasi dan glutathione yang berkurang, dan peningkatan kerusakan DNA. Ini dianggap berasal dari penyerapan glukosa yang berkurang melalui GLUT1, yang diatur oleh AMPK melalui fosforilasi TXNIP (lihat 4.1). Para penulis juga mengusulkan bahwa sel-sel pemicu leukemia yang kekurangan AMPK sangat rentan terhadap stres di sumsum tulang, karena konsentrasi glukosa lebih rendah daripada di darah perifer, terutama dalam kondisi pembatasan diet tikus [174].

Konsisten dengan temuan ini, berkurangnya kelangsungan hidup sel tumor manusia yang kekurangan AMPK yang mengalami stres telah diamati di beberapa in vitro studi. Misalnya, sel tumor LKB1-null, atau sel tumor yang mengekspresikan LKB1 dengan AMPK-α1 yang dirobohkan menggunakan shRNA, lebih rentan terhadap kematian sel yang disebabkan oleh kelaparan glukosa atau detasemen matriks ekstraseluler, menunjukkan bahwa aktivasi AMPK dilindungi terhadap penghinaan ini [175] . Dalam contoh lain, layar siRNA mematikan sintetis dilakukan untuk mendeteksi protein kinase yang diperlukan untuk kelangsungan hidup sel U2OS yang mengekspresikan onkogen Myc secara berlebihan dari promotor yang dapat diinduksi tamoxifen. Salah satu hit teratas adalah AMPK-α1, yang juga terbukti diaktifkan selama ekspresi berlebih Myc [176].

Bukti bahwa AMPK dapat mempromosikan tumor juga diperoleh baru-baru ini menggunakan model tikus kanker paru-paru di mana tumor berkembang di tempat di tempat asalnya, dan di mana penulis telah 'menggigit peluru' dengan melumpuhkan AMPK-α1 dan -α2. Di sini, tikus yang mengekspresikan alel Lox-STOP-Lox dari onkogen KRAS G12D dan luciferase kunang-kunang disilangkan dengan tikus yang mengekspresikan alel floxed dari Tp53 (pengkodean p53) dan/atau Stk11 dan/atau Praka1 plus Prakaa2. Untuk memodelkan karsinoma paru-paru sel non-kecil, Cre-recombinase dikirim ke paru-paru dengan inhalasi hidung vektor lentiviral. Prosedur ini memicu rekombinasi di situs loxP kembar dalam subset kecil sel epitel paru-paru, di mana ekspresi KRAS G12D dan luciferase akan diaktifkan, dan p53 dan/atau LKB1 dan/atau AMPK-α1/-α2 akan tersingkir. luciferase juga memungkinkan tumor dicitrakan oleh bioluminesensi, dan dengan demikian pertumbuhannya dipantau in vivo. Knockout LKB1 meningkatkan pertumbuhan tumor yang mengekspresikan K-Ras mutan seperti yang dilaporkan sebelumnya [177] tetapi, sebaliknya, knockout AMPK-α1 dan -α2 ditemukan menyebabkan pengurangan dalam ukuran dan jumlah tumor paru, terutama pada tumor yang mengekspresikan K-Ras mutan dan kekurangan p53. Secara keseluruhan, hasil ini menegaskan bahwa LKB1 adalah penekan tumor pada kanker paru-paru non-sel kecil seperti yang diharapkan, sementara keberadaan AMPK-α1 atau -α2 dipromosikan pertumbuhan tumor [178].

6. Bukti dari analisis genom kanker manusia

Meskipun sebagian besar bukti yang dibahas dalam 5 diperoleh pada model kanker tikus, perbandingan perubahan genetik pada gen yang mengkode jalur LKB1-AMPK dalam biopsi kanker manusia, dibandingkan dengan jaringan normal, juga dapat memberikan petunjuk yang berguna tentang peran jalur tersebut. pada kanker manusia. Basis data cBioPortal (http://www.cbioportal.org/ [179.180]) menyediakan cara yang sangat mudah digunakan untuk menganalisis banyak penelitian tentang kanker manusia jenis ini yang telah dilakukan hingga saat ini. Gambar 6 merangkum perubahan genetik dalam STK11 gen yang mengkode LKB1, dan ketujuh gen yang mengkode subunit isoform AMPK, diekstraksi dari cBioPortal pada April 2019. Setiap batang vertikal mewakili proyek genom kanker individu, dengan tinggi batang mewakili persentase kasus di mana perubahan genetik terlihat (hanya studi dengan perubahan lebih besar dari atau sama dengan 3% kasus ditampilkan). Karena LKB1 adalah penekan tumor yang diketahui, orang akan berharap untuk mengamati terutama mutasi (batang hijau) atau penghapusan (batang biru) saat menganalisis STK11. Hal ini memang umumnya terjadi (gambar 6A), meskipun ada beberapa studi kanker anomali di mana amplifikasi gen diamati sebagai gantinya (batang merah), terutama pada kanker pankreas dan prostat. Sebaliknya, perubahan dalam PRKAA1 gen, pengkodean AMPK-α1, sebagian besar amplifikasi (perhatikan lebih banyak batang merah pada gambar 6B), yang lebih konsisten dengan gagasan bahwa AMPK-α1 dapat bertindak sebagai promotor tumor. Peringatan penting adalah bahwa amplifikasi gen pada kanker biasanya melibatkan seluruh segmen kromosom daripada gen individu. Oleh karena itu mungkin bahwa PRKAA1 gen terletak dekat dengan onkogen yang amplifikasinya dipilih, dengan PRKAA1 hanya menemaninya sebagai pengamat yang tidak bersalah. Namun, argumen yang menentang kemungkinan itu berasal dari analisis perubahan genetik bersamaan dalam STK11 dan PRKAA1 dalam studi kanker tunggal, seperti 230 kasus adenokarsinoma paru dalam The Cancer Genome Atlas (gambar 7) [181]. Dalam studi tersebut, STK11 gen baik dihapus atau bermutasi (kebanyakan pemotongan atau mutasi missense diprediksi menyebabkan hilangnya fungsi) dalam 43 kasus (19%) dan PRKAA1 diperkuat pada 22 (10%). Namun, perubahan ini tidak pernah bertepatan (P = 0,005), yang diharapkan terjadi secara kebetulan jika mereka terjadi secara independen. Mutasi yang paling sering dalam penelitian adenokarsinoma paru ini adalah pada KRAS (36%) dan TP53 gen (47%), pengkodean K-Ras dan p53. Menariknya, amplifikasi PRKAA1 hampir saling eksklusif dengan mutasi di KRAS (P = 0,005), tetapi terjadi bersamaan dengan mutasi pada TP53 (P < 0,001).

Gambar 6. Ringkasan perubahan genetik pada kanker manusia dalam pengkodean gen (A) LKB1 (STK11), dan (b–h) tujuh gen yang mengkode isoform subunit AMPK. Berdasarkan analisis 'set studi non-redundan yang dikuratori' dalam database cBioPortal pada awal April 2019, menggunakan nama gen yang ditunjukkan.

Gambar 7. Co-kejadian atau pengecualian bersama dari perubahan genetik di PRKAA1 (AMPK-α1), STK11 (LKB1), KRAS (K-Ras) dan TP53 (p53) gen pada adenokarsinoma paru-paru manusia. Hasil dihasilkan menggunakan cBioPortal dari hasil studi tunggal [181]. Setiap kolom batang yang disejajarkan secara vertikal mewakili satu kasus kasus tanpa perubahan pada salah satu gen tidak ditampilkan.

Mengapa amplifikasi gen AMPK-α1 harus saling eksklusif dengan mutasi pada gen LKB1? Jawabannya tampak jelas, karena tidak ada gunanya mengekspresikan AMPK-α1 secara berlebihan jika LKB1 tidak hadir untuk memfosforilasi dan mengaktifkannya. Pertimbangan ini menyarankan bahwa PRKAA1 amplifikasi sedang dipilih, bukan hanya menjadi pengamat yang tidak bersalah. Namun, mengapa amplifikasi gen AMPK-α1 harus terjadi bersamaan dengan mutasi pada p53 masih kurang jelas. Peran klasik p53 [182] adalah menjadi stabil atau diaktifkan sebagai respons terhadap kerusakan DNA, dan menyebabkan penghentian siklus sel G1 untuk memberikan waktu bagi kerusakan untuk diperbaiki, yang dicapai dengan menginduksi transkripsi gen seperti penghambat kinase bergantung-siklin G1 p21 CIP1 (CDKN1A). Menariknya, seperti yang telah dibahas di 2.5, kompleks AMPK yang mengandung 1 juga diaktifkan oleh agen genotoksik seperti etoposida, dan dapat memicu penghentian siklus sel G1 yang serupa [11]. Oleh karena itu tampaknya mungkin bahwa PRKAA1 amplifikasi dapat dipilih untuk tumor p53-null karena ekspresi berlebih AMPK-α1 dapat mengkompensasi sampai batas tertentu untuk kehilangan p53, dan dengan demikian dapat meningkatkan kelangsungan hidup sel tumor p53-null yang mengalami stres genotoksik.

Berbeda sekali dengan amplifikasi yang sering terjadi PRKAA1 gen pada kanker, PRKAA2 pengkodean gen AMPK-α2 jauh lebih sering bermutasi (perhatikan lebih banyak bilah hijau pada gambar 6C). Menariknya, keenam studi kanker di mana gen paling sering bermutasi (10-23% kasus) adalah kanker kulit atau melanoma. Alasan untuk ini tidak jelas, tetapi analisis terpisah menunjukkan bahwa dalam semua studi kanker kulit/melanoma yang terdaftar di cBioPortal ada 80 mutasi yang mempengaruhi AMPK-α2 dan hanya 10 yang mempengaruhi 1. Meskipun belum jelas berapa banyak yang pertama menyebabkan hilangnya fungsi pada kompleks 2, hasil ini menunjukkan bahwa AMPK-α2 mungkin memainkan peran penekan tumor pada kanker kulit dan melanoma.

Ketika datang ke subunit AMPK-β, ada perbedaan mencolok antara perilaku kanker manusia pada PRKAB1 dan PRKAB2 gen, pengkodean 1 dan 2 (gambar 6D,e). Sedangkan perubahan genetik pada PRKAB1 terdeteksi hanya dalam jumlah yang sangat kecil dari studi kanker dan cukup bervariasi dalam tipe genetik, PRKAB2 gen sering diamplifikasi pada berbagai kanker yang berbeda (perhatikan lebih banyak batang merah pada gambar 6e), menyarankan, jika ada, peran promotor tumor. Karena domain terminal-C dari subunit (β-CTD) membentuk 'inti' kompleks AMPK heterotrimerik (lihat 2.2), ekspresi berlebihan 2 mungkin dapat membantu menstabilkan dan meningkatkan ekspresi subunit dan , bahkan ketika gen yang mengkode subunit tersebut tidak memiliki perubahan genetik. Namun, mengapa hanya gen yang mengkode 2, dan bukan 1, yang diamplifikasi masih belum jelas.

Perubahan pada gen yang mengkode tiga subunit cenderung terjadi pada frekuensi yang lebih rendah daripada yang mengkode subunit dan , dan lebih beragam dalam tipe genetik (gambar 6f–h). Namun, ada beberapa temuan menarik, seperti 41% kasus (walaupun hanya lima dari 12) di mana PRKAG1 gen telah dihapus pada kanker payudara kistik adenoid [183].

Melihat perubahan genetik yang terjadi pada gen yang mengkode subunit LKB1 dan AMPK pada kanker manusia, satu pengamatan yang mencolok adalah bahwa kedelapan gen tersebut sering kali diperkuat pada kanker prostat neuroendokrin (berlabel NE prostat pada gambar 6). Ini adalah bagian dari kanker prostat yang telah menjadi resisten terhadap pengobatan anti-androgen [184]. Signifikansi pengamatan yang menarik ini masih belum jelas saat ini.

7. Kesimpulan—apakah AMPK merupakan penekan tumor atau promotor tumor, atau keduanya?

Pada bagian terakhir ini kami akan mencoba untuk mendamaikan laporan yang tampaknya bertentangan bahwa AMPK dapat bertindak untuk mempromosikan atau menekan tumorigenesis. Pandangan kami adalah bahwa AMPK dapat bertindak sebagai penekan tumor atau promotor tumor, tergantung pada konteksnya. Dapat dikatakan bahwa dalam semua studi tikus di mana peran penekan tumor didukung (misalnya dalam model Eµ-Myc limfoma sel-B [163], model p53-null [166] dan PTEN-null [167] limfoma sel T dan model kanker prostat PTEN-null [170]), fungsi AMPK telah dihilangkan sebelum tumorigenesis. Misalnya, dalam model Eµ-Myc [185], hilangnya AMPK-α1 akan terjadi selama embriogenesis sedangkan, meskipun ekspresi berlebihan Myc dalam sel pra-B telah pasti terjadi pada usia 35-50 hari [186], limfoma tidak mulai muncul sampai 50 hari dan onset rata-ratanya adalah 80 hari [187]. Dengan demikian, peristiwa tambahan untuk ekspresi berlebih Myc harus terjadi sebelum limfoma dihasilkan. Hal yang sama berlaku untuk model knockout PTEN dari T-ALL, di mana: Lck KO yang digerakkan oleh promotor PTEN dan/atau AMPK-α1 akan terjadi pada usia 30 hari tetapi limfoma tidak mulai muncul sampai kemudian (gambar 5).

Di sisi lain, pada model tikus kanker di mana AMPK tampaknya bertindak sebagai promotor tumor, dapat dikatakan bahwa knockout AMPK biasanya terjadi bersamaan dengan, atau bahkan setelah, tumorigenesis telah dimulai. Misalnya, dalam studi T-ALL oleh Kishton dkk. [173] (§5.2), transformasi dihasilkan in vitro dengan ekspresi paksa mutan onkogenik Notch1, dan sel T-ALL kemudian dipindahkan ke tikus penerima yang diiradiasi dan penyakit dibiarkan menjadi mapan sebelum AMPK disingkirkan dengan pengobatan dengan tamoxifen. Sangat instruktif untuk membandingkan model ini dengan model T-ALL kami yang baru-baru ini diterbitkan [167], di mana AMPK-α1 telah secara khusus tersingkir pada nenek moyang sel T sebelum limfoma mulai terjadi, di mana AMPK basal jelas melindungi terhadap perkembangan limfoma, dan di mana aktivasi AMPK menggunakan phenformin memberikan perlindungan lebih lanjut.

Datang ke studi tikus lain yang mendukung peran promotor tumor untuk AMPK, dalam model asli kanker paru-paru sel kecil [178], knockout AMPK akan terjadi bersamaan dengan ekspresi K-Ras mutan dan hilangnya p53, yang mungkin telah cukup untuk memicu tumorigenesis sendiri. Satu-satunya studi yang mendukung peran promotor tumor tetapi di mana AMPK telah dihilangkan sebelumnya untuk timbulnya penyakit adalah model AML oleh Saito dkk. [174]. Namun dalam kasus itu (seperti dalam studi T-ALL oleh Kishton dkk. [173]) transformasi telah dicapai dengan ekspresi onkogen yang dipaksakan in vitro dalam sel progenitor hematopoietik, dan ujian sebenarnya dari peran AMPK adalah dalam kelangsungan hidup dan/atau proliferasi sel leukemia in vivo pada tikus penerima yang diiradiasi. Dapat dikatakan bahwa kedua penelitian ini, dengan melakukan transformasi in vitro, mungkin lebih kecil kemungkinannya untuk mendeteksi peran penekan tumor AMPK.

Secara keseluruhan kami mengusulkan bahwa, ketika hilangnya AMPK terjadi sebelum inisiasi tumorigenesis dalam hidup, ini akan menghilangkan hambatan pada jalur mTORC1 dan melepaskan proses biosintesis lainnya dan siklus sel, sehingga mengubah sel menjadi keadaan metabolik dan proliferasi yang siap untuk pembentukan tumor. Dalam keadaan ini, AMPK bertindak sebagai penekan tumor, dan aktivator AMPK dapat memberikan perlindungan tambahan terhadap tumorigenesis, seperti efek phenformin di T-ALL [167]. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivator AMPK suatu hari nanti dapat menemukan tempat dalam memberikan perlindungan terhadap kanker, mungkin pada individu yang berisiko tinggi terkena penyakit ini. Jika biguanida digunakan, mungkin juga masuk akal untuk menggunakan fenformin yang, karena lebih permeabel membran daripada metformin bahkan tanpa transporter, jauh lebih mungkin untuk mengaktifkan AMPK dalam sel progenitor tumor. Meskipun fenformin ditarik untuk pengobatan diabetes tipe 2 karena risiko asidosis laktat yang mengancam jiwa, risiko komplikasi ini sebenarnya cukup rendah (≈64 kasus per 100.000 pasien-tahun [188]), dan mungkin lebih dapat diterima. dalam konteks kanker daripada diabetes. Atau, beberapa aktivator AMPK lain yang dibahas dalam 3 mungkin dikembangkan untuk tujuan ini.

Kami juga mengusulkan bahwa, begitu sel kanker mulai tumbuh in vivo, AMPK beralih dari penekan tumor menjadi promotor tumor (seperti transformasi Dr Jekyll yang baik hati menjadi Dr Hyde yang jahat dalam novel Stevenson!). Dalam keadaan ini, peran AMPK adalah untuk melindungi sel di mana ia diekspresikan, terlepas dari apakah sel itu adalah sel kanker atau sel normal. Dengan melindungi sel kanker terhadap tekanan seperti kekurangan oksigen atau nutrisi, atau stres oksidatif atau genotoksik, AMPK akan meningkatkan kelangsungan hidup mereka dan dengan demikian, dalam jangka panjang, mendorong pertumbuhan tumor. Dalam keadaan ini, AMPK bertindak sebagai promotor tumor, yang menunjukkan bahwa inhibitor AMPK mungkin berkhasiat dalam pengobatan kanker. Mereka mungkin sangat efektif: (i) dalam kasus di mana: PRKAA1 atau PRKAB2 gen diperkuat, menyebabkan ekspresi berlebih AMPK (ii) ketika diberikan dalam kombinasi dengan perawatan genotoksik seperti etoposida atau radioterapi, sehingga mengurangi kelangsungan hidup sel tumor selama terapi tersebut. Saat ini kami tidak memiliki penghambat AMPK yang dicirikan dengan baik dan spesifik (lihat 3.4), tetapi pekerjaan di masa depan dapat diarahkan untuk memperbaiki kekurangan tersebut.

Etika

Studi terbaru di laboratorium kami yang melibatkan hewan hidup telah disetujui oleh Komite Peninjau Etika Universitas Dundee sesuai dengan Undang-Undang Hewan (Prosedur Ilmiah) Inggris tahun 1986.


1. PERKENALAN

Adrenoseptor termasuk dalam keluarga GPCR, keluarga yang dilestarikan dari tujuh reseptor transmembran yang merupakan salah satu kelas protein terbesar yang ditargetkan untuk terapi obat (Sriram & Insel, 2018). Reseptor ini diklasifikasikan sebagai - atau -adrenoseptor, berdasarkan perbedaan respon terhadap berbagai katekolamin seperti adrenalin, noradrenalin dan isoprenalin. -adrenoseptor telah diklasifikasikan menjadi dua keluarga besar:1 dan2 dan -adrenoseptor dibagi lagi menjadi1-,2-, dan3-subtipe. Semua subtipe adrenoseptor memiliki struktur primer umum yang terdiri dari satu domain terminal-N ekstraseluler, tujuh-heliks transmembran mencakup daerah, dan satu ekor C-terminal intraseluler. Studi terbaru menunjukkan bahwa1- dan1-adrenoseptor di jantung,2-adrenoseptor di otot rangka, dan3- adrenoseptor dalam jaringan adiposa coklat (BAT) dapat terhubung ke protein yang disebut target mekanistik rapamycin (mTOR), yang memainkan peran penting dalam respons fisiologis dan metabolik.

mTOR adalah serin/treonin kinase atipikal dengan berat molekul

289 kDa, milik keluarga kinase terkait PI3K. mTOR berinteraksi dengan komponen molekul lain untuk membentuk dua kompleks yang berbeda secara fisik dan fungsional, yaitu, kompleks mTOR 1 (mTORC1) dan kompleks mTOR 2 (mTORC2). Dalam mTORC1, protein mTOR berinteraksi dengan protein terkait regulasi mTOR (Raptor Kim et al., 2002), substrat PKB (Akt) kaya prolin sebesar 40 kDa (PRAS40 Sancak et al., 2007), mamalia mematikan dengan protein SEC13 8 (MLST8 Kim et al., 2003), protein interaksi mTOR yang mengandung domain DEP (DEPTOR Peterson et al., 2009), Tel dua protein yang berinteraksi 1 (Tti1), dan pemeliharaan telomer 2 (Tel2 Kaizuka et al., 2010 ).Di sisi lain, mTORC2 terdiri dari mTOR, protein perancah yang tidak sensitif terhadap rapamycin pendamping mTOR (Rictor Sarbassov et al., 2004) protein mamalia yang diaktifkan stres kinase yang berinteraksi protein 1 (mSIN1, Jacinto et al., 2006) yang diamati dengan Rictor 1 dan 2 (Protor1/2, Pearce et al., 2007) MLST8 (Kim et al., 2003) DEPTOR (Peterson et al., 2009) penghambat faktor nuklir -B kinase (IKK, Xu et al., 2013) Sestrin 3 (Tao, Xiong, Liangpunsakul, & Dong, 2015 ) faktor pertukaran ditemukan di trombosit, leukemia, dan jaringan saraf (Xpln, Khanna, Fang, Yoon, & Chen, 2013 ) tuberous sclerosis complex 2 (TSC2 Huang, Dibble, Matsuzaki , & Manning, 2008 ) dan Tel2 dan Tti1 (Kaizuka et al., 2010).

Sementara kemajuan luar biasa telah dibuat dalam memahami peran mTORC1, kontribusi mTORC2 kurang dipahami dengan baik. Secara kolektif, banyak penelitian telah menunjukkan bahwa mTORC1 memainkan peran penting dalam regulasi homeostasis seluler, pertumbuhan, dan respons terhadap stres. mTORC1 yang diaktifkan dalam kondisi penuh nutrisi mendorong sintesis protein melalui beberapa mekanisme pelengkap. Pertama, mTORC1 mengaktifkan protein ribosom S6 kinase 1 dan protein ribosom S6 kinase 2 (S6K1/2), yang selanjutnya mengaktifkan proses translasi protein (Laplante & Sabatini, 2013 Saxton & Sabatini, 2017). Secara paralel, mTORC1 menghambat faktor inisiasi translasi eukariotik 4E (eIF4E)-binding protein-1 (4E-BP1) dan dengan demikian memungkinkan pembentukan kompleks eIF4F yang memicu translasi yang bergantung pada tutup (Kennedy & Lamming, 2016 Laplante & Sabatini, 2013 Saxton & Sabatini, 2017). Akhirnya, mTORC1 meningkatkan translasi melalui fosforilasi dan menyebabkan inaktivasi protein 1 terkait La target (LARP1 Fonseca et al., 2015). Saat aktif, LARP1 menekan translasi mRNA oligopirimidin terminal yang mengkode protein ribosom dan regulator positif translasi.

mTORC1 memodulasi metabolisme sel, karena meningkatkan glikolisis dengan mempromosikan transkripsi dan translasi faktor 1α yang diinduksi hipoksia (TNFα, Hudson et al., 2002). Ini juga mengaktifkan protein pengikat elemen pengatur sterol faktor transkripsi 1 dan 2 (SREBP1/2), yang mempromosikan lipogenesis (Kennedy & Lamming, 2016 Laplante & Sabatini, 2013 Saxton & Sabatini, 2017 ). Lebih lanjut, mTORC1 berperan dalam biogenesis mitokondria melalui aktivasi yang dimediasi PPAR-γ dari faktor transkripsi Ying-Yang 1 (Cunningham et al., 2007 Laplante & Sabatini, 2012). Ketika sel mengalami stres atau kelaparan nutrisi, mereka menjalani proses katabolik yang diatur yang disebut autophagy. Peran lain mTORC1 yang ditandai dengan baik adalah penghambatan autophagy dalam kondisi penuh nutrisi. mTORC1 memfosforilasi Unc-51 seperti autophagy activating kinase (ULK1), mencegah aktivasinya melalui 5′AMP-activated protein kinase (AMPK), yang pada gilirannya menghambat autophagy (Kim, Kundu, Viollet, & Guan, 2011 ). Fosforilasi dan translokasi nuklir dari faktor transkripsi EB (TFEB), yang mengatur ekspresi protein yang mengatur autophagy dan biogenesis lisosom, dihambat oleh mTORC1 (Settembre et al., 2012 ). Studi terbaru menunjukkan bahwa mTORC1 juga berkontribusi pada pergantian protein melalui sistem ubiquitin-proteasome. Penghambatan akut mTORC1 meningkatkan proteolisis yang bergantung pada proteasome (Rousseau & Bertolotti, 2016 Zhao et al., 2015 a). Menariknya, aktivasi jangka panjang mTORC1 pada fibroblas embrionik tikus karena penghapusan penghambatan Tsc2 juga meningkatkan aktivitas proteasome (Zhang et al., 2014). Temuan ini direplikasi dalam model tikus penghapusan Tsc2 neuronal dan di hati tikus tipe liar yang dipuasakan kemudian diberi makan ulang selama 6 jam. Penulis menyarankan bahwa aktivasi jangka panjang jalur proteasomal oleh mTORC1 adalah respons adaptif yang mendukung sintesis protein dengan mengisi kembali kumpulan asam amino seluler (Zhang et al., 2014). Dua target mTORC1 lebih lanjut telah diidentifikasi: (a) isoform dari fosfatidilinositol-5-fosfat 4-kinase (PIP4K2C) mempertahankan pensinyalan mTORC1 basal selama kelaparan (Mackey, Sarkes, Bettencourt, Asara, & Rameh, 2014) dan (b) ditekan oleh TOR (REPTOR) adalah efektor hilir TORC1 di Drosophila melanogaster (Tiebe et al., 2015). Ketika TORC1 memfosforilasi REPTOR, itu mengarah pada retensi sitoplasma, sebaliknya, pada penghambatan TORC1, REPTOR mengalami defosforilasi, mentranslokasi ke dalam nukleus, dan mengaktifkan transkripsi gen target yang terlibat dalam homeostasis energi dan kelangsungan hidup seluler dalam kondisi kelaparan nutrisi (Tiebe et al. , 2015 ).

Dibandingkan dengan mTORC1, studi dan pengetahuan tentang regulasi dan fungsi mTORC2 masih tertinggal. Salah satu peran mTORC2 yang ditandai dengan baik adalah responsnya terhadap faktor pertumbuhan dan insulin melalui mekanisme yang bergantung pada PI3K (Gan, Wang, Su, & Wu, 2011). mTORC2 secara langsung memfosforilasi Akt pada Ser 473 , yang difasilitasi oleh fosforilasi Thr 308 sebelumnya oleh phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1), sebagai bagian dari kaskade insulin (Sarbassov, Guertin, Ali, & Sabatini, 2005). mTORC2 dapat memodulasi aktivitas PKCα dan dengan demikian berperan dalam remodeling sitoskeleton aktin (Sarbassov et al., 2004). Demikian pula, sebuah studi oleh Jacinto et al. (2004) menunjukkan bahwa mTORC2 mengatur polaritas sel dan organisasi sitoskeletal melalui regulasi anggota keluarga gen homolog PKCα dan Ras A. mTORC2 juga telah ditunjukkan untuk mengatur anggota keluarga PKC lainnya, termasuk PKCδ (Gan et al., 2012) dan PKCζ ( Li & Gao, 2014). Fosforilasi motif hidrofobik dan aktivasi PKCδ memainkan peran penting dalam migrasi fibroblas dan pengembangan fibrosis paru (Gan et al., 2012) sedangkan modulasi mTORC2 dari aktivitas PKCζ terlibat dalam organisasi sitoskeleton aktin (Li & Gao, 2014). Sciarretta dkk. ( 2015 ) melakukan penelitian yang menunjukkan bahwa mTORC2 secara negatif mengatur aktivitas stimulasi makrofag 1 (MST1), karena gangguan Rictor/mTORC2 menyebabkan aktivasi MST1 yang signifikan. Aktivasi MST1 yang ditandai ini mendorong pelebaran jantung, disfungsi jantung, dan gangguan pertumbuhan dan adaptasi jantung sebagai respons terhadap kelebihan tekanan.

Sementara mTORC1 dan mTORC2 keduanya memiliki fungsi yang berbeda, ada bukti bahwa kedua kompleks ini saling berhubungan. S6K1, hilir mTORC1, secara langsung memfosforilasi rictor mTORC2 dan mempromosikan efek regulasi negatif pada fosforilasi Akt-Ser 473 yang bergantung pada mTORC2 (Dibble, Asara, & Manning, 2009). Akt yang diaktifkan mTORC2, sebaliknya, meningkatkan aktivitas mTORC1 melalui inaktivasi kompleks tuberous sclerosis (TSC1/2), sebuah kompleks yang menghambat mTORC1 melalui aktivitas protein pengaktif GTPase menuju homolog Ras yang diperkaya di otak (Dibble et al., 2012) .

Kami akan membahas cara di mana pengetahuan mTOR saat ini terkait dengan penelitian terbaru yang menunjukkan bahwa agonis adrenoseptor meningkatkan aktivasi pertumbuhan sel yang dimediasi mTORC1 dan juga penyerapan glukosa yang dimediasi mTORC2 dan kelangsungan hidup sel in vivo dan in vitro (Olsen et al., 2014 Sato dkk., 2014 Sato dkk., 2018). Kami telah memfokuskan ulasan ini pada interaksi antara adrenoseptor dan mTOR di otot rangka dan jantung serta jaringan adiposa, mengingat keahlian kami sendiri dan kebutuhan untuk mengasimilasi banyak informasi yang sekarang tersedia untuk jaringan ini. Namun, mengingat ekspresi mTOR dan protein mitranya yang ada di mana-mana, serta ekspresi luas dari subtipe adrenoseptor yang berbeda, sangat mungkin bahwa jalur adrenoseptor-mTOR penting dalam tipe sel tambahan. Misalnya, ada sejumlah penelitian yang menghubungkan aktivasi hipokampus -adrenoseptor dengan peningkatan translasi protein yang bergantung pada mTOR (Connor, Wang, & Nguyen, 2011 Gelinas et al., 2007). Mekanisme ini sangat penting untuk potensiasi jangka panjang dan konsolidasi memori.

1.1 Peran2- Aktivasi mTOR yang dimediasi adrenoseptor di otot rangka

Otot rangka terdiri hingga 50% dari total massa tubuh, mengkonsumsi proporsi yang signifikan dari bahan bakar metabolik, dan memiliki peran utama dalam homeostasis metabolik seluruh tubuh, bertanggung jawab untuk 75% dari penyerapan dan pemanfaatan glukosa yang dimediasi insulin dalam keadaan makan. Terdapat bukti yang menunjukkan bahwa sistem saraf simpatis meningkatkan ambilan glukosa pada otot rangka yang aktif (misalnya, selama latihan dan respons melawan atau lari), yang terutama dihasilkan dari pelepasan noradrenalin dari terminal saraf adrenergik, yang bekerja pada -adrenoseptor pada permukaan sel. (Nonogaki, 2000). Otot rangka mengekspresikan banyak -adrenoseptor yang didominasi2-adrenoseptor, dengan 7-10%1-adrenoseptor dan tidak terdeteksi3-adrenoseptor (Nevzorova, Bengtsson, Evans, & Summers, 2002). Stimulasi dengan -adrenoseptor agonis isoprenalin meningkatkan penyerapan glukosa di myoblast L6 dan myotubes, dan otot rangka utuh in vitro dan in vivo (Nevzorova, Evans, Bengtsson, & Summers, 2006 Sato et al., 2014). Khususnya, isoprenalin meningkatkan penyerapan glukosa ke tingkat yang lebih besar daripada insulin in vivo pada tikus tipe liar, tetapi tidak pada1/β2tikus knockout -adrenoseptor (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014 ), konsisten dengan penelitian lain yang menunjukkan bahwa tikus yang kekurangan ketiga -adrenoseptor menunjukkan intoleransi glukosa (Asensio, Jimenez, Kuhne, Rohner-Jeanrenaud, & Muzzin, 2005).

Insulin merangsang pengambilan glukosa otot rangka dengan mengaktifkan langkah-langkah sinyal yang meningkatkan translokasi transporter glukosa 4 (GLUT4) dari vesikel intraseluler ke permukaan sel. Setelah peningkatan aktivitas PI3K yang dimediasi insulin, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3) merekrut PDK1 dan Akt tidak aktif ke membran plasma melalui domain PH terminal-N, memfasilitasi fosforilasi Akt pada Thr 308 oleh PDK1. Secara paralel, mTORC2 difosforilasi melalui mekanisme yang tidak diketahui. Perubahan konformasi Akt yang terkait dengan fosforilasi Thr 308 memungkinkan mTORC2 memfosforilasi Akt di Ser 473 , yang mengarah ke aktivasi penuh. Akt mempromosikan fosforilasi berikutnya dari substrat Akt protein pengaktif Rab GTPase 160 kDa (AS160) di Thr642, yang sangat penting untuk translokasi GLUT4 yang ditingkatkan insulin (Gambar 1). Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa pengambilan glukosa yang distimulasi isoprenalin dalam sel otot L6 sangat berkurang oleh inhibitor PI3K PI-103, wortmannin, dan LY294002 (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014 ), menunjukkan bahwa reseptor insulin dan β2Pengambilan glukosa yang diperantarai adrenoseptor dapat berbagi jalur pensinyalan yang sama. Tidak seperti tanggapan, kami mengamati insulin Namun, tidak ada fosforilasi Akt pada Thr 308 atau Ser 473 , atau fosforilasi AS160 pada Thr 642 pada pengobatan isoprenalin, atau peningkatan PIP3 tingkat, dan penyerapan glukosa tidak dihambat oleh Akt inhibitor X (Nevzorova et al., 2002 Nevzorova et al., 2006 Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014). Studi sebelumnya menunjukkan bahwa PI-103 dan inhibitor PI3K lain yang banyak digunakan termasuk wortmannin dan LY294002 memiliki afinitas substansial untuk kinase terkait termasuk mTOR (Brunn et al., 1996 Knight et al., 2006). Dengan demikian jelas penting untuk mempertimbangkan keterlibatan mTOR serta PI3K ketika menafsirkan efek penghambatan LY294002, wortmannin, atau PI-103 pada output pensinyalan hilir. Mengingat hal ini, kami menemukan bahwa penghambat mTOR yang sangat spesifik KU0063794 (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014) menghambat pengambilan glukosa yang dirangsang oleh isoprenalin dan insulin yang menunjukkan bahwa mTOR terlibat dalam pengambilan glukosa yang distimulasi adrenoseptor. Hasil gabungan menunjukkan bahwa jalur yang digunakan bersama oleh insulin dan isoprenalin tumpang tindih pada titik yang lebih hilir yang mengarah ke aktivasi mTOR, dan2-jalur terkait adrenoseptor tidak termasuk PI3K atau Akt. knockdown siRNA dari mTORC2 (rictor), tetapi bukan mTORC1 (raptor), secara nyata menghambat baik yang dimediasi insulin dan2penyerapan glukosa yang dimediasi adrenoseptor (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014). Selain itu, pada otot yang kekurangan rictor, fosforilasi Akt yang dirangsang insulin pada Ser 473 dan AS160 pada Thr 642 secara dramatis menurun, dan tikus knockout rictor spesifik otot menunjukkan intoleransi glukosa dan penurunan penyerapan glukosa yang distimulasi insulin (Kumar et al., 2008 ) . Ini menegaskan mTORC2 sebagai pengatur utama pengambilan glukosa di otot rangka. Mengkonfirmasi ini, kami menemukan bahwa KU0063794 juga menghambat2serapan glukosa otot rangka yang dimediasi adrenoseptor ex vivo dan in vivo (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014).

The2pasangan -adrenoseptor terutama ke GαS protein, mengaktifkan adenilil siklase untuk meningkatkan kadar cAMP intraseluler, menghasilkan aktivasi PKA. β2Stimulasi adrenoseptor juga dapat menyebabkan efek seluler secara independen dari jalur cAMP-PKA klasik ini. Setelah stimulasi agonis,2-adrenoseptor dengan cepat terfosforilasi oleh reseptor kinase protein G (GRK), memungkinkan perekrutan -arrestin (yang memisahkan reseptor dari mitra protein Gα), internalisasi reseptor, dan aktivasi jalur pensinyalan yang dimediasi -arrestin (Tobin, Butcher, & Kong, 2008 ). Efektor pensinyalan yang menghubungkan2-adrenoseptor dengan aktivasi mTORC2 masih belum diketahui tetapi mungkin di hilir PKA karena penghambat PKA selektif PKI menurunkan fosforilasi mTORC2 yang diinduksi isoprenalin, dan 8-bromo-cAMP meningkatkan fosforilasi mTORC2 (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014). Menariknya,2serapan glukosa yang distimulasi adrenoseptor hanya sebagian bergantung pada cAMP (Nevzorova et al., 2002 Nevzorova et al., 2006 Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014), menunjukkan kontribusi dari efektor alternatif yang tidak bergantung pada cAMP . Keterlibatan GRK2 dalam2Homeostasis glukosa yang dimediasi adrenoseptor telah disarankan sebagai salah satu mekanisme yang mungkin (Dehvari et al., 2012). Sel CHO-K1 yang secara stabil mengekspresikan GLUT4 manusia yang membawa epitop c-Myc eksofasial (CHO-GLUT4myc) ditransfeksi dengan tipe liar atau terpotong2-adrenoseptor tidak memiliki seluruh ekor terminal-C, atau ditransfusikan bersama dengan tipe liar2-adrenoseptor dan ARKct, yang mengasingkan subunit Gβγ yang diperlukan untuk perekrutan GRK2 ke membran plasma. Sel yang mengekspresikan tipe liar2-adrenoseptor plus ARKct, atau reseptor terpotong saja, menunjukkan penurunan ambilan glukosa yang distimulasi isoprenalin secara nyata dibandingkan dengan sel yang mengekspresikan tipe liar.2-adrenoseptor saja. Selain itu, sel CHO-GLUT4myc yang mengekspresikan mutan GRK2 K220R kinase-mati menunjukkan penurunan translokasi GLUT4 ke permukaan sel secara signifikan (Dehvari et al., 2012). Secara kolektif, penelitian kami menunjukkan peran potensial GRK2 dan PKA sebagai kinase hulu mTORC2 setelah aktivasi2-adrenoseptor.

Penyerapan glukosa dimediasi oleh2-adrenoseptor diblokir oleh inhibitor GLUT dan dengan pretreatment dengan GLUT4 siRNA (Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014). Diabetes tipe 2 terkait erat dengan defek pada mekanisme pensinyalan insulin yang melibatkan substrat reseptor insulin (Chakrabarti et al., 2013), aktivitas PI3K, dan fosforilasi Akt (Cusi et al., 2000), tetapi2-adrenoseptor yang diekspresikan dalam otot rangka dapat melewati cacat ini melalui regulasi perdagangan GLUT4 yang dimediasi mTORC2, memberikan jalur kompensasi setelah hilangnya sensitivitas insulin (Sato et al., 2014 Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, et al., 2014 ). Ini sangat menarik mengingat2Ekspresi -adrenoseptor tidak berubah pada otot rangka dari pasien diabetes (Frederiksen et al., 2008).

Selain penting untuk pengambilan glukosa,2Akumulasi cAMP yang distimulasi adrenoseptor dapat memiliki efek jangka panjang pada fenotipe otot (Pearen, Ryall, Lynch, & Muscat, 2009). Stimulasi kronis otot rangka2-adrenoseptor yang menggunakan agonis seperti clenbuterol, fenoterol, dan formoterol dapat mengaktifkan jalur pensinyalan anabolik, yang mengarah pada peningkatan massa otot dan kapasitas produksi kekuatan (Lynch & Ryall, 2008 ) Proses anabolik dan anti-katabolik sebagai respons terhadap2-adrenoseptor agonis terjadi melalui translasi dan sintesis protein yang dimediasi oleh sumbu pensinyalan Akt-mTOR-S6 kinase (Hagg et al., 2016 Gambar 1). Stimulasi kronis2-adrenoseptor meningkatkan transkripsi koaktivator PPAR-γ 1-α, yang dikaitkan dengan penekanan myostatin, dan efek ini diblokir oleh ICI-118.551, suatu yang sangat selektif.2-antagonis adrenoseptor (Jesinkey, Korrapati, Rasbach, Beeson, & Schnellmann, 2014). Pengobatan tikus dengan formoterol merangsang peningkatan kecil tapi signifikan dalam fosforilasi Akt dan mTOR di otot gastrocnemius setelah 8 jam, berbeda dalam kerangka waktu dari pengukuran yang lebih akut dari fosforilasi Akt/mTOR dan pengambilan glukosa (10 menit hingga 2 jam Sato, Dehvari, Oberg, Dallner, dkk., 2014). Atrofi otot yang diinduksi deksametason dan transisi isoform rantai berat miosin yang lambat ke cepat dimusuhi oleh2-adrenoseptor agonis clenbuterol, yang merangsang aktivitas Akt dan mTORC1, dan ekspresi faktor pertumbuhan 1 seperti insulin (Jesinkey et al., 2014). Temuan ini berpotensi memberikan dasar baru untuk pendekatan farmakologis untuk menargetkan mTOR untuk pengobatan kondisi yang melibatkan kehilangan otot.

1.2 Peran aktivasi mTOR yang dimediasi adrenoseptor di jantung

1.2.11-adrenoseptor dan mTOR di jantung

Fungsi jantung diatur secara ketat melalui kedua1- dan -adrenoseptor, karena pelepasan noradrenalin dari terminal saraf simpatik yang mempersarafi jantung dan oleh sirkulasi adrenalin yang dilepaskan dari kelenjar adrenal sebagai respons terhadap bahaya atau stres. -adrenoseptor terdiri sekitar 90% dari total adrenoseptor jantung, dan -1- adrenoseptor menyumbang 10% sisanya. Pada gagal jantung, tidak seperti1-adrenoseptor,1- adrenoseptor tidak diatur ke bawah dan karena itu dapat memainkan peran yang ditingkatkan dalam mengatur kontraktilitas jantung (Skomedal, Borthne, Aass, Geiran, & Osnes, 1997 ). Meskipun mRNA untuk ketiga1- subtipe adrenoseptor terdeteksi di jantung tikus dan tikus, kardiomiosit hanya mengekspresikan1A- dan1B-subtipe (O'Connell et al., 2003 ) sedangkan1D-adrenoseptor terbatas pada pembuluh darah koroner (McCloskey et al., 2003 O'Connell et al., 2003). Karena peran peningkatan diduga dalam gagal jantung,1- Fungsi dan pensinyalan adrenoseptor oleh karena itu menjadi perhatian khusus.

Serangkaian studi tikus knockout menunjukkan bahwa tidak ada1A- tidak juga1B- adrenoseptor diperlukan untuk fungsi kontraktil basal (O'Connell et al., 2003 Vecchione et al., 2002). Namun, ekspresi berlebih spesifik kardiomiosit dari1A- adrenoseptor meningkatkan fungsi kontraktil basal (Lin et al., 2001) dan mengurangi remodeling yang merugikan setelah kelebihan tekanan (Du et al., 2004 Du et al., 2006). Hasil ini konsisten dengan studi in vitro oleh Mohl et al. (2011), mengidentifikasi1A- Jalur pensinyalan yang diperantarai adrenoseptor yang meningkatkan masuknya kalsium dan kontraktilitas kardiomiosit. Sebaliknya, ekspresi berlebihan dari1B-adrenoseptor menyebabkan penurunan fungsi kontraktil dan remodeling patologis di jantung (Lemire et al., 2001 Wang, Du, Autelitano, Milano, & Woodcock, 2000). Kapasitas1A- adrenoseptor untuk meningkatkan fungsi kontraktil mungkin memiliki peran kompensasi penting pada gagal jantung.

Selain mempertahankan kontraktilitas miosit, aktivasi1-adrenoseptor meningkatkan penyerapan glukosa (Shi, Papay, & Perez, 2016), prekondisi yang dimediasi reseptor, hipertrofi jantung, dan penghambatan apoptosis kardiomiosit (Jensen, O'Connell, & Simpson, 2011 O'Connell, Jensen, Baker, & Simpson , 2014 ). α1-adrenoseptor diekspresikan dalam miokardium manusia dan tidak diatur ke bawah pada gagal jantung (Jensen, Swigart, De Marco, Hoopes, & Simpson, 2009 ), dan blokade1- adrenoseptor memperburuk gagal jantung (Dhaliwal et al., 2009 Jensen et al., 2011). Dalam miosit jantung murine yang mengekspresikan . endogen1A- dan1B- adrenoseptor, pengobatan agonis jangka panjang meningkatkan kelimpahan1A- adrenoseptor tanpa desensitisasi efek inotropik, sementara peningkatan stimulasi atau ekspresi1A- tapi bukan1B- adrenoseptor in vivo membatasi remodeling jantung global dan mengurangi mortalitas akibat gagal jantung (Du et al., 2006 Rorabaugh et al., 2005). Dalam model tikus transgenik yang mengekspresikan kardiomiosit . secara berlebihan1A-adrenoseptor, hewan dilindungi dari gagal jantung dengan peningkatan angiogenesis terkait dengan sekresi VEGF dari kardiomiosit (Zhao, Zhai, Gygi, & Goldberg, 2015 ).

Studi in vitro dan in vivo telah menunjukkan bahwa stimulasi1-adrenoseptor mengurangi kematian sel kardiomiosit. Apoptosis yang diinduksi hipoksia, kelaparan serum, dan isoprenalin dapat dihambat oleh paparan kardiomiosit terhadap fenilefrin, suatu non-selektif.1-adrenoseptor agonis. Efek sitoprotektif fenilefrin ini diblokir oleh fentolamin dan prazosin (Iwai-Kanai et al., 1999). Kardiomiosit dari1A-/α1B- Tikus knockout adrenoseptor menunjukkan peningkatan nekrosis dan apoptosis secara signifikan ketika terkena rangsangan toksik seperti doxorubicin atau H2HAI2 (Huang et al., 2007 O'Connell et al., 2006), dan sensitivitas ini dapat dikurangi dengan ekspresi ulang1A- adrenoseptor tetapi tidak1B-adrenoseptor (Huang et al., 2007). Agen kemoterapi doxorubicin menghasilkan efek kardiotoksik pada pasien dan pada model hewan. Pada tikus, infus in vivo jangka panjang dari1A- agonis adrenoseptor A61603 melindungi kardiomiosit terhadap apoptosis dan mengurangi remodeling ventrikel yang merugikan dan fibrosis miokard setelah pengobatan doksorubisin, sehingga meningkatkan fungsi jantung (Chan, Dash, & Simpson, 2008 Montgomery et al., 2017). Efek perlindungan A61603 ini tidak diamati di1A- tikus knockout adrenoseptor. Studi lain menunjukkan bahwa dabuzalgron, . selektif yang tersedia secara oral1A- agonis adrenoseptor juga meningkatkan kelangsungan hidup dan mempertahankan pemendekan fraksional pada tipe liar tetapi tidak pada1A- tikus knockout adrenoseptor (Beak et al., 2017). Semua studi ini menunjukkan bahwa1- adrenoseptor bisa menjadi target penting pada gagal jantung.

non-selektif1- fenilefrin agonis adrenoseptor adalah agen hipertrofik terkenal di jantung dan telah dikaitkan dengan aktivasi target mTORC1 S6K1 (Boluyt et al., 1997 ). Pengobatan miosit ventrikel tikus neonatal (NRVMs) dengan fenilefrin merangsang aktivitas S6K1, meningkatkan sintesis protein, dan menghasilkan peningkatan 50% di area kardiomiosit. Aktivitas dan hipertrofi S6K1 yang diinduksi fenilefrin secara signifikan dikurangi oleh inhibitor mTORC1 rapamycin dan oleh inhibitor PI3K LY294002. Namun, penulis mengakui bahwa senyawa seperti LY294002 mempengaruhi kinase terkait PI3K lainnya (Boluyt et al., 1997). Sebagaimana diuraikan dalam bagian otot rangka dari tinjauan ini, inhibitor PI3K termasuk wortmannin dan LY294002 memiliki aktivitas substansial di mTOR (Brunn et al., 1996 Knight et al., 2006). Dengan demikian, studi di mana LY294002 digunakan sebagai satu-satunya inhibitor PI3K harus dipertimbangkan dengan hati-hati. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa fenilefrin mengaktifkan S6K1 dan mempromosikan hipertrofi kardiomiosit melalui mTORC1 dan mungkin PI3K. Kami baru-baru ini telah menunjukkan bahwa pengobatan NRVM dengan . yang sangat selektif1A-AR agonis A61603 meningkatkan fosforilasi protein ribosom S6, target hilir mTORC1 dan S6K1, dan ini dihambat oleh rapamycin. Hipertrofi NRVM yang diamati sebagai respons terhadap A61603 dicegah oleh inhibitor mTOR KU0063794, yang memblokir fosforilasi dan aktivasi mTORC1 dan mTORC2 (Sato et al., 2018). Dengan demikian jelas bahwa1-adrenoseptor merangsang mTORC1 dan ini bisa menjadi pemain penting dalam kemampuan1-adrenoseptor untuk melindungi jantung.

Fenilefrin merangsang aktivasi S6K1 dan fosforilasi 4E-BP1 pada kardiomiosit dewasa (Wang & Proud, 2002). Protein yang terakhir berinteraksi dengan eIF4E dan menekan terjemahan. Fosforilasi 4E-BP menghasilkan disosiasinya dari eIF4E dan aktivasi terjemahan mRNA. Respon terhadap fenilefrin diblokir oleh penghambat MEK, dan ekspresi adenoviral dari MEK yang aktif secara konstitutif menyebabkan aktivasi S6K1, fosforilasi 4E-BP1, dan aktivasi sintesis protein dengan cara yang sensitif terhadap rapamycin. Studi ini memberikan wawasan tentang jalur pensinyalan yang melibatkan Ras, MEK, dan mTOR (Wang & Proud, 2002). Fenilefrin juga mengaktifkan S6K2 pada kardiomiosit ventrikel tikus dewasa. Baik MEK1/2 inhibitor dan rapamycin menghapuskan aktivasi S6K2 yang diinduksi fenilefrin, dan ekspresi S6K2 yang diaktifkan secara konstitutif aktif MEK1. Ini menunjukkan bahwa MEK/ERK1/2 dalam kombinasi dengan pensinyalan mTOR berperan dalam mengatur aktivasi S6K2 yang diinduksi fenilefrin (Wang, Gout, & Proud, 2001).

Meski klasik1- jalur pensinyalan adrenoseptor termasuk PKC yang bergantung pada Ca 2+, fenilefrin juga mengatur S6K1/2 dan 4E-BP1 (substrat hilir mTORC1) yang mengarah ke sintesis protein dengan cara PKC independen Ca 2+ pada kardiomiosit dewasa (Wang, Rolfe, & Bangga, 2003). PKCα klasik yang bergantung pada Ca 2+ dan PKCδ dan PKCε yang tidak bergantung pada Ca 2+ mudah dideteksi pada kardiomiosit dewasa (Puceat, Hilal-Dandan, Strulovici, Brunton, & Brown, 1994 Steinberg, Goldberg, & Rybin, 1995). Selain itu, PKC independen Ca2+ juga diperlukan untuk aktivasi ERK1/2 yang diinduksi fenilefrin yang ditunjukkan oleh aktivasi ERK1/2 yang berkurang secara signifikan dengan adanya inhibitor PKC spektrum luas BIM I (Toullec et al., 1991) . Rottlerin (Gschwendt et al., 1994), penghambat selektif PKCδ, hampir sepenuhnya menghambat fosforilasi ERK1/2 yang diinduksi fenilefrin, sedangkan Gö6979 (Martiny-Baron et al., 1993), penghambat PKC yang bergantung pada Ca 2+ tidak memiliki efek yang jelas pada aktivasi ERK1/2. Lebih lanjut, Rottlerin mencegah aktivasi S6K yang diinduksi fenilefrin sedangkan Gö6979 tidak memiliki efek yang jelas. Fosforilasi 4E-BP1 juga dihambat oleh rottlerin dengan cara yang sama (Wang et al., 2003). Data ini menunjukkan bahwa isoform PKC Ca2+ -independen memainkan peran penting dalam1pensinyalan mTOR yang dimediasi adrenoseptor pada kardiomiosit dewasa.

Sementara mTORC1 memainkan peran penting dalam hipertrofi kardiomiosit, ada bukti yang meyakinkan bahwa mTORC2 mendorong perkembangan dan kelangsungan hidup kardiomiosit (Gonzalez-Teran et al., 2016 Shende et al., 2016 Xu & Brink, 2016 ). Misalnya, tikus dengan knockdown rictor khusus kardiomiosit dan dengan demikian gangguan mTORC2 menampilkan kelainan pada usia 6 bulan, termasuk pelebaran jantung, fibrosis, dan gagal jantung yang diperburuk sebagai respons terhadap kelebihan tekanan (Sciarretta et al., 2015 Yano et al. ., 2014 ). Setelah prakondisi iskemik, aktivasi mTORC2 meningkatkan kelangsungan hidup kardiomiosit sebagian dengan menekan aktivitas kinase Mst1 (penekan tumor besar kinase 2), komponen kunci dari jalur Hippo yang mendorong apoptosis dan menghambat pertumbuhan sel (Sciarretta et al., 2015 Yano et al. al., 2014). Yang penting, kardiomiosit yang kekurangan rictor atau overexpress Mst1 menunjukkan peningkatan kematian sel. Dalam studi oleh Shende et al. ( 2016 ), knockdown rictor khusus kardiomiosit yang diinduksi tamoxifen digunakan untuk memungkinkan perkembangan jantung normal. Tikus di mana ekspresi Cre recombinase diinduksi pada usia 4 atau 10 minggu menunjukkan ukuran jantung normal dan ekokardiografi hingga 44 minggu setelah pengobatan tamoxifen, tetapi penyempitan aorta transversal dan kelebihan tekanan yang dihasilkan menyebabkan disfungsi jantung yang lebih jelas daripada pada tikus tipe liar, menunjukkan pentingnya mTORC2 pada gagal jantung (Shende et al., 2016 Volkers et al., 2013).

jantung1-adrenoseptor telah dikaitkan dengan mTOR dalam memberikan efek kardioprotektif. Serum dan kinase-1 responsif glukokortikoid (SGK1) adalah substrat hilir mTORC2 (Garcia-Martinez & Alessi, 2008 ) yang mengatur kelangsungan hidup dan hipertrofi kardiomiosit sebagai respons terhadap non-selektif1-adrenoseptor agonis fenilefrin, baik in vivo maupun in vitro (Aoyama et al., 2005). Kardiomiosit yang terinfeksi dengan pengkodean vektor adenoviral SGK1 yang aktif secara konstitutif menunjukkan penurunan apoptosis setelah kekurangan serum atau oksigen dan peningkatan penggabungan [3H]-leusin sebagai respons terhadap fenilefrin, sementara ekspresi SGK1 mati kinase meningkatkan apoptosis. SGK1 juga telah ditempatkan di hilir PI3K (Park et al., 1999), meskipun sekali lagi penghambatan mTOR mungkin telah mengacaukan interpretasi percobaan ini yang melibatkan penggunaan LY294002 sebagai penghambat PI3K.

Kami telah menunjukkan bahwa noradrenalin dan1A-adrenoseptor agonis A61603 meningkatkan penyerapan glukosa di NRVMs dengan aktivasi paralel AMPK dan mTORC2 tetapi tidak mempromosikan fosforilasi Akt di Thr 308 atau Ser 473 (Sato et al., 2018). Kurangnya fosforilasi Akt mencerminkan temuan serupa oleh Wang et al. (2001), yang mendemonstrasikan menggunakan kardiomiosit dewasa bahwa fenilefrin tidak menghasilkan fosforilasi Akt pada Ser 473 dan bahwa ekspresi adenoviral dari mutan Akt dominan-negatif gagal memblokir aktivasi S6K2 oleh fenilefrin. Kami menemukan bahwa penghambat mTORC1/2 KU0063794 sebagian berkurang1A- adrenoseptor dan penyerapan glukosa yang distimulasi insulin dalam kardiomiosit, sedangkan rapamycin inhibitor mTORC1 tidak berpengaruh. A61603 merangsang fosforilasi mTOR di Ser 2448 dan Ser 2481 . Secara keseluruhan, data menunjukkan bahwa1A-adrenoseptor merangsang mTORC2 untuk meningkatkan penyerapan glukosa dan mTORC1 untuk mempromosikan sintesis protein dan hipertrofi pada NRVM (Sato et al., 2018 Gambar 2), tetapi mekanisme terperinci dimana1A-adrenoseptor mengaktifkan mTORC2 masih belum diketahui.

1.2.2 - adrenoseptor dan mTOR di jantung

Aktivasi -adrenoseptor memainkan peran penting dalam pengaturan fungsi kardiovaskular, termasuk efek inotropik dan kronotropik positif (Bristow et al., 1993 Brodde, 1991). Noradrenalin memberikan efeknya pada jantung hampir secara eksklusif melalui1-adrenoseptor (Kaumann, Hall, Murray, Wells, & Brown, 1989). Jadi, dalam kondisi fisiologis normal1-adrenoseptor adalah adrenoseptor jantung utama yang bertanggung jawab untuk pengaturan denyut jantung dan kontraktilitas. The1-adrenoseptor mengaktifkan Gα . kanonikSkaskade pensinyalan -adenylate cyclase-cAMP-PKA. Pada kardiomiosit, aktivasi PKA mendorong fosforilasi beberapa protein yang meningkatkan mobilisasi kalsium terutama dari retikulum sarkoplasma dan, pada tingkat lebih rendah, dari lingkungan ekstraseluler, yang menyebabkan peningkatan laju kontraksi dan relaksasi dan peningkatan kekuatan kontraksi (Sirenko et al. al., 2014 Gambar 2). Pada tahap awal gagal jantung, curah jantung meningkat melalui stimulasi berlebihan dari -1-adrenoseptor sebagai mekanisme kompensasi untuk suplai darah dan oksigen yang tidak mencukupi (Brodde, 1993), tetapi ini menyebabkan kerusakan struktural jangka panjang, termasuk remodeling ventrikel, apoptosis dan fibrosis kardiomiosit, dan hipertrofi jantung (Engelhardt, Hein, Wiesmann, & Lohse, 1999 O'Connor dkk., 1999). Selain itu, bukti terbaru menunjukkan bahwa1-adrenoseptor menurunkan autofagi miokard yang mempertahankan homeostasis seluler (Wang et al., 2013 Wang et al., 2015). Penghambatan autophagy menyebabkan akumulasi protein terdenaturasi dan organel yang rusak, berkontribusi terhadap disfungsi jantung (Magnusson, Wallukat, Waagstein, Hjalmarson, & Hoebeke, 1994), dan up-regulasi autophagy oleh mTORC1 inhibitor rapamycin dapat meningkatkan gangguan fungsi jantung (Wang dkk., 2015). The1Penghambatan autophagy yang dimediasi adrenoseptor terjadi melalui fosforilasi PKA dari Ser 12 dalam protein LC3 yang berhubungan dengan autophagy (Kroemer, Zamzami, & Susin, 1997). mTORC1 terlalu aktif pada tahap awal gagal jantung dan berperan dalam1penghambatan autophagy yang dimediasi adrenoseptor (Wang et al., 2015 Gambar 2).

1.3 Peran -adrenoseptor dan mTOR dalam jaringan adiposa

Ada dua jenis jaringan adiposa dengan fungsi fisiologis yang berbeda: jaringan adiposa putih (WAT) yang menyimpan energi kimia sebagai triasilgliserol dan BAT yang melepaskan energi kimia sebagai panas (termogenesis). BAT bertanggung jawab untuk termogenesis non-menggigil yang dimediasi secara simpatik pada mamalia dan diaktifkan oleh anggota keluarga adrenoseptor (Cannon & Nedergaard, 2004). Selain itu, banyak kelompok telah menggambarkan keberadaan adiposit coklat di depot yang dianggap terutama WAT, baik pada model hewan maupun pada manusia (Petrovic et al., 2010 Wu et al., 2012). Sel-sel ini berbeda dari BAT prototipikal yang ditemukan pada hewan pengerat atau bayi manusia dan telah disebut adiposit "brite" (coklat putih) atau "krem" (Petrovic et al., 2010 Wu et al., 2012). Munculnya adiposit brite saja tidak cukup untuk mendorong peningkatan pengeluaran energi, karena sel-sel ini juga harus diaktifkan oleh rangsangan lingkungan, hormonal, atau farmakologis seperti obat yang bekerja pada GPCR (Merlin et al., 2016 ). Ekspresi adrenoseptor dalam adiposit coklat, putih, dan brite dan kontribusinya terhadap fungsi adiposit dijelaskan secara rinci dalam ulasan yang menyertainya (Evans, Merlin, Bengtsson, & Hutchinson, 2019). Kami akan fokus di sini pada interaksi antara pensinyalan adrenoseptor dan peran kompleks mTOR dalam pencoklatan adiposit dan metabolisme glukosa.

1.3.1 -adrenoseptor dan mTOR di WAT

Ketika nutrisi berlimpah, insulin dilepaskan dari pankreas dan merangsang penyerapan glukosa dan asam lemak oleh jaringan adiposa, di mana mereka disimpan sebagai triasilgliserol yang membentuk tetesan lipid. Sinyal insulin dalam adiposit dimediasi oleh jalur PI3K-Akt-mTOR, menghasilkan efek anabolik termasuk pertumbuhan sel dan penghambatan lipolisis (Chakrabarti et al., 2013). Selama periode puasa atau stres, katekolamin dilepaskan oleh sistem saraf simpatik untuk mengaktifkan -adrenoseptor. Stimulasi3-adrenoseptor di WAT mengaktifkan adenilil siklase, menyebabkan peningkatan kadar cAMP dan aktivitas PKA. PKA memfosforilasi dan mengatur beberapa target penting dalam adiposit, termasuk lipase sensitif-hormon dan perilipin terkait tetesan lipid, yang secara kolektif mempromosikan hidrolisis trigliserida dan pembebasan asam lemak bebas (Granneman & Moore, 2008 Gambar 3).

Dua penelitian telah menyarankan bahwa lipolisis yang distimulasi adrenoseptor menonaktifkan mTOR di WAT (Mullins et al., 2014 Scott & Lawrence, 1998). Mullins dkk. ( 2014 ) menunjukkan bahwa lipolisis yang dimediasi -adrenoseptor menekan penyerapan glukosa karena lipolisis menyebabkan kompleks mTORC1 dan mTORC2 terdisosiasi (Gambar 3). Hal ini sesuai dengan usulan bahwa dalam adiposit putih, cAMP secara tidak langsung mencegah aktivasi mTOR, karena ada penurunan p70S6K, target hilir mTORC1 (Scott & Lawrence, 1998). Sebaliknya, ada penelitian baru yang menunjukkan bahwa stimulasi3-adrenoseptor di WAT tidak menghambat kompleks mTOR tetapi mengaktifkan mTORC1 melalui PKA (Liu et al., 2016), menghasilkan pencoklatan depot WAT. Varians dalam hasil ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa stimulasi -adrenoseptor berinteraksi secara berbeda dengan mTOR di depot WAT yang berbeda. Meskipun demikian, hasil ini menunjukkan bahwa regulasi -adrenoseptor mTOR dapat memiliki peran penting dalam fungsi WAT.

1.3.2 -adrenoseptor dan mTOR di BAT

Pengikatan noradrenalin ke BAT -adrenoseptor mengaktifkan kaskade sinyal intraseluler yang mengarah pada peningkatan ekspresi uncoupling protein 1 (UCP1) dan pemecahan trigliserida menjadi asam lemak bebas yang mengaktifkan UCP1 di membran mitokondria bagian dalam (Gambar 3). UCP1 yang diaktifkan meruntuhkan gradien proton yang mendorong sintesis ATP dan penyimpanan energi sehingga, pensinyalan -adrenoseptor meningkatkan respirasi mitokondria dan termogenesis tanpa menggigil (Cannon & Nedergaard, 2004). Kapasitas metabolisme BAT berpotensi memungkinkannya untuk mempengaruhi homeostasis energi seluruh tubuh. Misalnya, BAT telah terbukti memainkan peran penting dalam regulasi homeostasis glukosa dan sekresi insulin (Guerra et al., 2001). Paparan dingin hewan meningkatkan pengambilan glukosa ke dalam BAT karena aktivasi sistem saraf simpatik (Shibata, Perusse, Vallerand, & Bukowiecki, 1989 Shimizu, Nikami, & Saito, 1991), dan respons ini ditiru oleh pemberian agonis -adrenoseptor in vivo (Liu, Perusse, & Bukowiecki, 1994 Olsen et al., 2014). Adiposit coklat tikus yang dikultur in vitro juga menunjukkan peningkatan penyerapan glukosa setelah pengobatan dengan agonis -adrenoseptor (Chernogubova, Hutchinson, Nedergaard, & Bengtsson, 2005 Dallner, Chernogubova, Brolinson, & Bengtsson, 2006 Merlin et al., 2018 Olsen et al., 2014). Sedangkan peran untuk3Penyerapan glukosa yang dimediasi adrenoseptor pada hewan pengerat sudah mapan, kontribusi reseptor ini dalam jaringan adiposa manusia kurang jelas. Namun, telah ditunjukkan bahwa paparan dingin meningkatkan penyerapan 18 F-2-deoxyglucose di depot BAT manusia, dan efek ini dapat ditiru dengan pemberian3-adrenoseptor agonis mirabegron yang digunakan secara klinis untuk kandung kemih yang terlalu aktif (Baskin et al., 2018 Cypess et al., 2015).

Ada bukti kuat bahwa pengambilan glukosa sebagai respons terhadap -3-adrenoseptor agonis terjadi melalui GαSJalur –cAMP–PKA, berdasarkan penggunaan inhibitor farmakologis (Chernogubova, Cannon, & Bengtsson, 2004 Olsen et al., 2014). Selain itu, 8-bromo-cAMP dan aktivasi hulu GαS oleh toksin kolera keduanya meningkatkan penyerapan glukosa dalam adiposit coklat primer (Chernogubova et al., 2004 Olsen et al., 2014). Mekanisme lain yang terlibat dalam3Pengambilan glukosa yang dimediasi adrenoseptor termasuk lokalisasi -3-adrenoseptor di lingkungan mikro kaya lipid dalam membran plasma (Sato et al., 2012), isoform PKC konvensional dan baru (Chernogubova et al., 2004), dan AMPK (Hutchinson, Chernogubova, Dallner, Cannon, & Bengtsson, 2005 Inokuma dkk., 2005). Seperti yang ditunjukkan pada otot rangka, mTORC2 memainkan peran penting dalam pengambilan glukosa adiposit yang distimulasi oleh agonis -adrenoseptor, serta insulin.

Kontribusi mTORC1 dan mTORC2 telah diperiksa pada tikus dengan ablasi spesifik raptor atau rictor di semua adiposit, karena sel-sel ini mengekspresikan Cre recombinase di bawah kendali promotor adiponektin (Kumar et al., 2010 Polak et al., 2008 ). Ablasi raptor (mTORC1) dalam jaringan adiposa meningkatkan pelepasan mitokondria tetapi tidak berpengaruh pada fosforilasi Akt yang dimediasi insulin atau profil toleransi glukosa pada tikus yang diberi makan makanan (Polak et al., 2008 ). Sebaliknya, adiposit yang diisolasi dari tikus dengan ablasi spesifik lemak rictor (mTORC2) menunjukkan penurunan fosforilasi Akt-Ser 473 yang dirangsang insulin, translokasi GLUT4 ke permukaan sel, dan pengambilan glukosa, dan tikus-tikus ini memiliki profil toleransi glukosa yang terganggu in vivo ( Kumar dkk., 2010). Studi-studi ini menunjukkan bahwa seperti pada otot rangka, kompleks mTORC2 terlibat dalam homeostasis glukosa dalam adiposit.

Kami telah menunjukkan menggunakan adiposit coklat bahwa mTORC2 terlibat dalam3penyerapan glukosa yang dimediasi adrenoseptor (Olsen et al., 2014). Penghambatan keseluruhan mTOR oleh Torin-1 atau KU0063794 mengurangi penyerapan glukosa, tetapi dua baris bukti menunjukkan keterlibatan mTORC2 daripada mTORC1: (a) 24 jam, tetapi tidak 2 jam, pengobatan rapamycin melemahkan3serapan glukosa yang dimediasi adrenoseptor (rapamycin secara akut menghambat mTORC1, sedangkan pengobatan jangka panjang mencegah perakitan mTORC2), dan (b) siRNA melawan rictor, tetapi bukan raptor, mengurangi pengambilan glukosa oleh3-adrenoseptor (Mohl et al., 2011 Olsen et al., 2014). Dalam adiposit coklat,3Pengambilan glukosa yang dimediasi adrenoseptor bergantung pada sintesis de novo dan translokasi GLUT1 (Dallner et al., 2006), yang keduanya bergantung pada cAMP (Gambar 3). mTORC2 secara khusus terlibat dalam translokasi GLUT1 yang baru disintesis ke membran plasma, tetapi tidak diperlukan untuk sintesis de novo GLUT1 (Olsen et al., 2014). Dalam kultur adiposit coklat, penghambatan PI3K oleh senyawa 15e, atau Akt oleh inhibitor X, mengurangi serapan glukosa yang distimulasi insulin tetapi tidak isoprenalin. Akt difosforilasi pada Thr 308 dan Ser 473 sebagai respons terhadap insulin tetapi bukan isoprenalin (Olsen et al., 2014).

Sebuah studi baru-baru ini juga menunjukkan bahwa tikus yang kekurangan rictor dalam jaringan adiposa adalah hipotermia, menunjukkan peningkatan kerentanan terhadap dingin, dan memiliki gangguan penyerapan glukosa dan glikolisis yang diinduksi dingin (Albert et al., 2016). Studi ini menunjukkan bahwa mTORC2 memainkan peran sentral dalam metabolisme jaringan adiposa dan translokasi GLUT 1/4 in vitro dan in vivo. Menariknya, kandungan GLUT 1/4 dalam membran plasma adiposit coklat tidak diubah oleh paparan dingin dalam penelitian tersebut. Juga berbeda dengan temuan kami sebelumnya (Olsen et al., 2014), baik adiposit coklat tikus yang diabadikan yang diobati dengan noradrenalin (1 M) selama 5 menit dan BAT asli dari tikus tipe liar yang dirawat selama 30 menit in vivo dengan noradrenalin (1 mg ·kg 1 ) menunjukkan fosforilasi Akt di Ser 473 , yang dikenal sebagai hilir mTORC2. Tidak ada penjelasan yang jelas untuk perbedaan dengan adiposit coklat kami, namun, pandangan yang muncul adalah bahwa depot adiposa menunjukkan heterogenitas yang cukup besar dalam komposisi sel (Shinoda et al., 2015). Ini akan menjelaskan perbedaan antara data in vivo dan in vitro dan mungkin juga konsisten dengan perbedaan fenotipik antara kultur adiposit coklat primer yang mewakili populasi awal pra-adiposit vaskular stroma dan adiposit yang diabadikan yang telah dipilih untuk keberadaan plasmid. pengkodean antigen T SV40 (Klein, Fasshauer, Klein, Benito, & Kahn, 2002 ) dan karena itu hanya mewakili sebagian kecil dari populasi sel awal. Selain itu, noradrenalin dapat mengaktifkan2-adrenoseptor hadir dalam BAT atau adiposit coklat, mempromosikan pensinyalan melalui Gαsaya/o-Gβγ-PI3K-PDK1-Akt sumbu. Dalam adiposit coklat batang yang diturunkan dari multipoten manusia (hMADS) yang diabadikan yang diobati dengan isoprenalin konsentrasi rendah, penyerapan glukosa diblokir oleh inhibitor mTOR KU0063794, seperti yang terlihat pada kultur primer adiposit coklat tikus (Olsen et al., 2014 ). Akan menarik untuk menentukan apakah sel hMADS menampilkan fosforilasi Akt pada Ser 473 sebagai respons terhadap pengobatan isoprenalin.

1.3.3 mTORC1 memediasi pencoklatan adiposit brite

Selain BAT, ada peningkatan bukti keberadaan adiposit coklat di depot yang dianggap terutama WAT, baik pada model hewan maupun pada manusia (Petrovic et al., 2010). Sel-sel ini berbeda dari BAT prototipikal yang ditemukan pada hewan pengerat atau bayi manusia dan telah disebut adiposit "brite" (coklat putih) atau "beige". Dua penelitian menunjukkan bahwa adiposit brite berkontribusi secara signifikan terhadap pengeluaran energi seluruh tubuh: Model tikus yang telah meningkatkan adiposit brite dalam WAT dilindungi dari obesitas yang disebabkan oleh diet (Seale et al., 2011), dan WAT yang kecoklatan berkontribusi pada adaptif non-menggigil. thermogenesis tanpa adanya adiposit coklat klasik (Schulz et al., 2013). Hasil in vitro kami menunjukkan bahwa stimulasi3-adrenoseptor meningkatkan pengambilan glukosa pada adiposit coklat dan britis, tetapi tidak pada adiposit putih, berbeda dengan insulin, yang meningkatkan pengambilan glukosa di ketiga kultur adiposit (Merlin et al., 2018).

Studi terpisah menunjukkan bahwa jalur -adrenoseptor-cAMP-PKA dapat menyebabkan aktivasi mTORC1 (Gambar 3) dan diperlukan untuk induksi pencoklatan jaringan adiposa dan pengembangan BAT (Liu et al., 2016). Selain itu, tikus tipe liar yang diobati dengan rapamycin inhibitor mTORC1 atau tikus dengan penghapusan raptor spesifik adiposit tidak toleran terhadap dingin dan menunjukkan gangguan ekspresi UCP1 dan komponen mitokondria lainnya dalam WAT inguinal, menunjukkan bahwa mungkin ada peran untuk mTORC1 bahkan dalam perkembangan awal adiposit brite WAT inguinal (Liu et al., 2016 Tran et al., 2016). Beberapa gen target hilir PPAR-α dan reseptor terkait estrogen (ERRα) serupa di bawah kendali mTORC1. PPAR-α adalah reseptor nuklir utama untuk asam lemak -oksidasi dan telah terbukti berpartisipasi dalam ekspresi UCP1 baik secara langsung maupun tidak langsung melalui ERRα (Morganstein et al., 2010). Oleh karena itu, mTORC1 tampaknya memiliki peran penting dalam proses katabolik pencoklatan jaringan adiposa dan disipasi energi kimia oleh termogenesis.


DISKUSI

Beberapa bukti menunjukkan keterlibatan molekul pensinyalan yang mengatur remodeling sitoskeleton dan dinamika aktin dalam fenotipe struktural dan sinaptik yang ditampilkan oleh tikus model FXS (67, 72, 74). Telah dilaporkan bahwa FMRP dan Rac1 terhubung dalam jalur pensinyalan yang sama dan bahwa fungsi Rac1 terganggu tanpa adanya FMRP (67, 68). Selain itu, bentuk PAK1 dominan-negatif, yang menghambat aktivitas PAK, atau blokade farmakologis PAK1 menyelamatkan perubahan struktural dan perilaku yang ditampilkan oleh tikus model FXS (6971). Penemuan kami tentang peningkatan aktivitas Rac1, fosforilasi PAK1/2 dan cofilin, dan rasio F-aktin/G-aktin sejalan dengan penelitian sebelumnya, menunjukkan interaksi antara Rac1 dan FMRP (67, 68, 72). Hasil kami dapat membantu menjelaskan mengapa pengurangan fosforilasi/aktivasi PAK efektif dalam menyelamatkan beberapa fenotipe pada tikus model FXS (6971). Perlu dicatat bahwa berbeda dengan temuan kami, penurunan fosforilasi cofilin dan peningkatan kadar PP2Ac, yang merupakan fosfatase yang mendefosforilasi cofilin, dilaporkan pada fibroblas murine yang kekurangan FMRP (68). Perbedaan antara temuan ini kemungkinan besar disebabkan oleh perbedaan model (kultur sel versus irisan otak) dan/atau jenis sel (fibroblas versus neuron) yang digunakan dalam dua penelitian. Di masa depan, akan menarik untuk membahas apakah pensinyalan Rac1-PAK1/2-cofilin meningkat di otak pasien FXS.

Kami menemukan bahwa aktivasi reseptor mGluR grup 1 memicu aktivasi jalur pensinyalan PAK1 / 2-cofilin yang mengatur dinamika aktin di area CA1 hippocampus pada tikus tipe liar. Sebaliknya, ketika kami memeriksa efek aktivasi mGluR pada aktivitas jalur PAK1 / 2-cofilin pada tikus model FXS, kami tidak mengamati peningkatan lebih lanjut, menunjukkan bahwa jalur pensinyalan ini sudah berada di dataran tinggi. Hasil ini konsisten dengan beberapa laporan sebelumnya yang menunjukkan pemisahan mGluR dari jalur pensinyalan hilir pada tikus model FXS. Misalnya, fosforilasi dasar dari p70 ribosomal protein S6 kinase 1 (S6K1) dan interaksi eIF4E-eIF4G, yang merupakan efektor hilir dari jalur mTORC1 dan ERK dan menghubungkan mGluRs ke mesin sintesis protein, sudah meningkat pada tikus model FXS dan tidak dirangsang lebih lanjut oleh aktivasi kelompok 1 mGluRs (38, 39). Selain itu, stimulasi mGluR grup 1 mengarah pada peningkatan hippocampal LTD pada tikus model FXS tetapi tidak lagi memerlukan aktivasi ERK dan mTORC1, atau sintesis protein de novo (27, 82, 83, 88). Konsisten dengan temuan kami, ditunjukkan bahwa aktivasi Rac1-PAK1 yang diinduksi oleh aktivitas sinaptik rusak di hipokampus tikus model FXS (54). Dalam konteks ini, hasil kami menunjukkan bahwa jalur Rac1-PAK1/2-cofilin diubah dan tidak digabungkan dengan aktivitas group1 mGluR pada tikus FXS, seperti yang sebelumnya ditunjukkan untuk pensinyalan mTORC1 dan ERK, serta sintesis protein de novo.

Khususnya, kami menemukan bahwa memblokir interaksi eIF4E-eIF4G dengan 4EGI-1, yang meningkat pada tikus model FXS (38, 40), menormalkan pensinyalan Rac1-PAK1/2-cofilin (Gbr. 4), plastisitas sinaptik (Gbr. 2), diskriminasi konteks, dan kepadatan tulang belakang (Gbr. 1) fenotipe pada tikus model FXS. 4EGI-1 adalah penghambat sintesis protein yang bergantung pada tutup, yang, dengan menghalangi asosiasi eIF4E dengan eIF4G, mencegah pembentukan kompleks inisiasi eIF4F (47, 48, 75, 76). Efek 4EGI-1 pada pensinyalan Rac1-PAK1/2-cofilin diamati baik dalam kondisi dasar untuk tikus model FXS dan setelah stimulasi DHPG pada tikus tipe liar dan model FXS, menunjukkan bahwa mengganggu interaksi eIF4E-eIF4G bermanfaat dengan tidak adanya FMRP. Dari sudut pandang molekuler, ada kemungkinan bahwa beberapa penyelamatan fenotipik ini dimediasi oleh 4EGI-1 pada tikus model FXS memiliki lebih dari satu penjelasan.

Banyak fenotipe yang ditampilkan oleh tikus model FXS diselamatkan dengan mengganggu komponen jalur mTORC1 dan ERK, yang keduanya mengatur sintesis protein hilir grup 1 mGluRs (39, 41, 43, 44). Misalnya, baik secara genetik atau farmakologis menghambat substrat mTORC1 S6K1 (41, 43) atau fosforilasi eIF4E yang bergantung pada ERK (39) dapat menyelamatkan banyak fenotipe pada tikus model FXS. Khususnya, interaksi eIF4E-eIF4G ditingkatkan pada tikus model FXS (38, 40) dan aktivasi mTORC1 dan ERK meningkatkan tingkat interaksi eIF4E-eIF4G untuk memulai sintesis protein (8991). Pada saat yang sama, normalisasi beberapa fenotipe yang ditampilkan oleh tikus FXS juga dapat dicapai dengan menghambat aktivitas PAK1 secara genetik atau farmakologis (69, 70).

Data kami konsisten dengan model yang menggambarkan CYFIP1 sebagai molekul yang mengatur sintesis protein dan dinamika aktin dengan bolak-balik antara kompleks FMRP/eIF4E dan Rac1/WRC (9, 67, 72). Hasil kami menunjukkan bahwa, pada awal, CYFIP1 lebih disukai terkait dengan Rac1, mungkin di kompleks WRC, daripada eIF4E, pada tikus model FXS (Gbr. 6B). Pemberian 4EGI-1 menghambat asosiasi eIF4E dengan eIF4G dan menciptakan eIF4E bebas yang bersaing dengan Rac1 untuk mengikat CYFIP1, sehingga memulihkan keseimbangan antara jalur pensinyalan ini (Gbr. 6C). Meskipun detail molekuler yang tepat yang menghubungkan interaksi Rac1 dengan CYFIP1 (dengan efek pada pensinyalan PAK1/2-cofilin oleh 4EGI-1) tidak jelas, ada kemungkinan bahwa Rac1 menjadi kurang efektif dalam mengaktifkan PAK1/2-cofilin hilir di tidak adanya CYFIP1. Di masa depan, akan menarik untuk menyelidiki detail molekuler dari interaksi ini.

(A) Di area CA1 hippocampus pada tikus WT, CYFIP1 hadir dalam dua kompleks makromolekul: CYFIP1-FMRP-eIF4E, yang menekan terjemahan, dan CYFIP1-WRC-Rac1-GTP, yang mengatur remodeling aktin. Aktivasi mGluR1/5 mengubah keseimbangan antara dua kompleks ini dengan meningkatkan aktivasi Rac1 dan molekul pensinyalan hilir dan menginduksi sintesis protein melalui relokasi CYFIP1 ke kompleks WRC-Rac1-GTP. Perubahan seiring dalam jalur pensinyalan ini memastikan plastisitas sinaptik fisiologis normal dan fungsi otak yang lebih tinggi. (B) Pada tikus model FXS, molekul pensinyalan yang mengatur sintesis protein dan dinamika aktin tidak lagi diatur oleh aktivasi mGluR1/5. Selain itu, tidak adanya FMRP menyebabkan sintesis protein yang berlebihan, mungkin melalui peningkatan asosiasi eIF4E ke eIF4G. Kurangnya FMRP juga menghasilkan perubahan dalam dinamika aktin melalui peningkatan kelimpahan Rac1-GTP dan peningkatan asosiasi CYFIP1 ke WRC-Rac1-GTP. Gangguan kedua modul sinyal ini menghasilkan plastisitas sinaptik yang menyimpang, morfologi tulang belakang, dan fungsi otak yang merupakan karakteristik FXS. (C) 4EGI-1 mengembalikan keseimbangan antara sintesis protein dan dinamika aktin dengan menciptakan eIF4E bebas yang bersaing dengan Rac1-GTP untuk mengikat CYFIP1. Ini menormalkan plastisitas sinaptik yang menyimpang, morfologi tulang belakang, dan fungsi kognitif yang ditunjukkan pada tikus model FXS. Panah putus-putus menunjukkan mekanisme fosforilasi tidak langsung. Panah tebal dan tipis menunjukkan interaksi yang ditingkatkan dan dikurangi, masing-masing. Panah merah menunjukkan efek 4EGI-1.

Singkatnya, hasil kami mendukung model yang menghubungkan sintesis protein yang tidak diatur dengan dinamika aktin yang berubah di FXS, dan menggarisbawahi pentingnya regulasi seimbang dari dua jalur ini untuk fungsi otak normal (Gbr. 6). Selain itu, hasil kami menyarankan cara alternatif untuk melawan fenotipe abnormal yang ditampilkan oleh tikus model FXS, yang dapat ditempuh dengan menggunakan obat yang menormalkan kedua jalur molekuler.


Kesimpulan dan perspektif

Jalur mTOR muncul sebagai pemain penting dalam etiologi kanker dan penyakit metabolik, termasuk diabetes dan obesitas. Kemajuan menakjubkan baru-baru ini dalam pemahaman target hulu dan hilir mTOR memberikan penjelasan rasional untuk asal-usul dan perkembangan penyakit ini. Misalnya, insulin adalah efektor hulu utama mTOR yang meningkatkan sintesis protein sebagai bagian dari modulasi proses anabolik sebagai respons terhadap glukosa. Dengan demikian, defisiensi dalam pensinyalan mTOR mungkin memainkan peran dalam perkembangan diabetes tipe II yang resisten terhadap glukosa dan insulin (Pende et al. 2000). Seperti dibahas di atas, hubungan antara jalur mTOR dan kanker juga jelas terlihat, karena sebagian besar komponen mTOR hulu dan hilir secara langsung terlibat dalam inisiasi dan perkembangan kanker. Pemahaman yang ditingkatkan tentang jalur pensinyalan mTOR harus mengarah pada desain obat untuk mengobati diabetes dan kanker. Keberhasilan rapamycin dalam uji klinis untuk kanker, restenosis pada katup jantung (Marks 2003), dan arthritis (Forre et al. 2000) menyoroti banyak penyakit yang berasal dari proliferasi menyimpang dan yang terkait dengan mTOR. Obat lain yang bekerja pada komponen lain dari jalur juga dicari. Studi sedang berlangsung untuk mengembangkan obat yang menghambat efektor mTOR hulu seperti Akt/PKB atau target hilir seperti eIF4E.

Beberapa detail penting terkait pengaturan aktivitas mTOR masih belum terselesaikan. Secara khusus, mekanisme dimana Rheb mengaktifkan mTOR masih sulit dipahami, dan penelitian di masa depan kemungkinan akan diarahkan untuk menyelesaikan tautan ini. Selain itu, seperti dibahas sebelumnya, perlu ada klarifikasi tentang interaksi antara pengaturan aktivitas mTOR oleh faktor pertumbuhan dan nutrisi. Pertanyaan penting dan belum terselesaikan lainnya menyangkut identitas target hilir S6K, yang mengaktifkan terjemahan mRNA TOP untuk merangsang pertumbuhan sel. Seperti dijelaskan di atas, eIF4B dapat menjadi kandidat (Raught et al. 2004), meskipun protein lain yang belum ditemukan juga dapat berperan (misalnya, lihat Fingar et al. 2004).

Jalan penting untuk studi di masa depan adalah pemahaman tentang pembicaraan silang antara jalur pensinyalan PI3K-Akt/PKB-mTOR dan jalur pensinyalan yang mengarah ke aktivasi ERK. Jelas bahwa kedua jalur bekerja sama untuk mempengaruhi banyak fungsi seluler. Interaksi ini memiliki konsekuensi penting untuk kontrol pertumbuhan sel, memori, dan pembelajaran. Kedua jalur pensinyalan ini mengaktifkan komponen kunci dari mesin translasi yang terlibat dalam perekrutan ribosom ke mRNA. Jalur ERK bertanggung jawab untuk memfosforilasi eIF4E (Waskiewicz et al. 1997 Pyronnet et al. 1999 Radimerski et al. 2002), sebuah modifikasi yang dianggap meningkatkan aktivitasnya sedangkan, seperti dijelaskan di atas, jalur mTOR memfosforilasi 4E-BPs, yang , pada gilirannya, merangsang aktivitas eIF4E dan meningkatkan perekrutan ribosom. Eksperimen terbaru menunjukkan bahwa jalur ERK dan mTOR bekerja sama untuk merangsang translasi dan menginduksi glioblastoma pada model tikus (Rajasekhar et al. 2003). Karena kedua jalur menjadi diaktifkan di neuron sebagai respons terhadap pengalaman, mereka kemungkinan bekerja sama untuk mempromosikan sintesis protein baru yang diperlukan untuk pembelajaran dan memori.


Tonton videonya: Daya Ingat Memori I Sensory Memory I Short Term Memory I Long Term Memory (Oktober 2022).