Informasi

Pemisahan protein serum berbasis FPLC

Pemisahan protein serum berbasis FPLC


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya sedang mengerjakan proyek yang melibatkan penemuan penanda biologis pada gangguan perkembangan saraf. Saya memiliki instrumen FPLC akta-prime di lab saya tetapi saya tidak tahu cara menggunakannya.

Menurut teori, plasma, atau serum, biasanya mengandung banyak protein dengan berat molekul tinggi - yang mungkin menutupi konsentrasi protein dengan berat molekul kecil yang mungkin relevan dengan penelitian saya.

Saya mencari ekspresi abnormal, jika ada, dari molekul protein tersebut.
Tetapi saya khawatir jika saya menjalankan sampel serum secara langsung, saya akan mendapatkan terlalu banyak pita untuk memungkinkan saya mengidentifikasi molekul yang saya inginkan.

Kolom mana yang harus digunakan untuk memisahkan protein penutup tersebut dari serum - atau, sebagai alternatif, pemisahan apa yang harus dilakukan sebelumnya?

Juga, konsentrasi reagen apa yang harus saya gunakan (terutama re: binding buffer dan elution buffer)?


Pertama, bolehkah saya menyarankan elektroforesis 2D sebagai teknik untuk mengidentifikasi perbedaan tingkat ekspresi protein/penanda. Teknik ini akan memberi Anda resolusi yang lebih besar dan kemudahan membandingkan sampel Anda pada dasarnya dalam satu langkah/eksperimen. Bonus tambahan setelah Anda menentukan protein yang Anda minati, Anda dapat dengan mudah memotongnya dan mengirim analisis spesifikasi massal untuk mengidentifikasi protein Anda. Singkatnya, elektroforesis 2D memisahkan protein berdasarkan pI (titik isoelektriknya) di Dimensi 1 dan kemudian berdasarkan ukurannya di Dimensi 2. Setelah Anda mengidentifikasi protein yang menarik, Anda dapat memurnikannya menggunakan langkah-langkah di bawah ini.

Sumber Gambar

Sekarang untuk mengatasi masalah pemisahan protein Anda untuk analisis. Garis besar umum yang dapat Anda ikuti untuk memisahkan protein, adalah sebagai berikut:

  1. Kolom Pertukaran Ion
  2. Kolom Interaksi Hidrofobik (HIC)
  3. Kromatografi Pengecualian Ukuran (SEC)

Pertukaran Ion pertama karena Anda mengelusi protein dari kolom menggunakan peningkatan konsentrasi garam (0 --> 1M NaCl). Sedangkan Anda membutuhkan garam konsentrasi tinggi untuk memuat protein ke kolom HIC. Jadi, elusi dari pengaturan 1 dapat dengan mudah dibubuhi dengan 5M (Nh4)2SO4 dan dimuat ke kolom HIC (Tanpa dialisis). Juga, pertukaran ion dan HIC adalah kolom berkapasitas tinggi yang resolusinya dapat ditingkatkan dengan gradien garam yang dangkal. Oleh karena itu, rekomendasi saya untuk digunakan terlebih dahulu. Namun, jika Anda yakin penanda/protein yang Anda minati kecil, Anda dapat langsung menggunakan kolom SEC

Kolom pertukaran ion, seperti namanya, memisahkan protein berdasarkan muatannya (Paling kecil ---> Paling Ionik, perhatikan juga muatan +/- protein pada pH itu penting). Buffer yang digunakan untuk pertukaran Ion adalah:

1. Buffer Pengikat 10-50mM Buffer Fosfat pH7.4 (pH plasma) 0-25mM NaCl 2. Buffer Elusi 10-50mM Buffer Fosfat pH7.4 1M NaCl

Gunakan garam serendah mungkin untuk mendapatkan pengikatan kolom yang paling efisien. Elusi dilakukan dengan gradien NACL dari 0% buffer elusi hingga 100% Elusi selama sekitar ~20 kolom Volume.

Kolom HIC memisahkan protein pada hidrofobisitas protein. Urutan elusi dari kolom paling kecil --> paling hidrofobik.

1. Penyangga pengikat 10-50mM Penyangga Fosfat 1M (Nh4)2SO4 2. Penyangga Elusi 10-50mM Penyangga Fosfat (Tanpa Garam)

Anda dapat menemukan protokol yang baik untuk HIC di sini. Elusi juga dilakukan lebih dari ~20 CV dengan gradien 0-100% buffer elusi, mirip dengan elusi pertukaran ion.

Akhirnya, Size Exclusion atau SEC memisahkan protein berdasarkan ukurannya. Urutan elusi terbesar ---> ukuran terkecil. Kolom dijalankan dalam mode isokratik yaitu hanya satu buffer yang digunakan. Komposisi penyangga:

1. 50-100 mM Buffer Fosfat 2. 150mM NaCL

Garam dalam buffer adalah untuk mencegah interaksi non-spesifik protein dengan kolom, yang dapat mengakibatkan protein terelusi lebih lambat dari yang diperlukan. Ini mungkin menghasilkan resolusi yang buruk.

Yang paling penting untuk disadari adalah masing-masing kolom di atas memiliki kumpulan cavetnya sendiri. 1) Kolom penukar ion khusus untuk muatan protein, sehingga Anda akan memiliki banyak protein yang tidak mengikat kolom sama sekali berdasarkan jenis (anion/kation) kolom yang digunakan. 2) Demikian pula, kolom HIC mungkin juga tidak mengikat protein Anda dengan baik. Juga, menambahkan 1M (Nh4)2SO4 akan mengendapkan protein yang mungkin termasuk protein yang Anda minati. 3) Kolom SEC memiliki batas atas ukuran protein yang dapat mereka terima, di atasnya semua protein terelusi bersama pada volume kosong yang mengurangi resolusi (Namun, ini seharusnya tidak menjadi masalah dalam kasus Anda saat Anda mencoba memisahkan berat molekul yang lebih rendah protein dari yang berbobot lebih tinggi.)

Akhirnya, semua langkah di atas bekerja dengan baik mengingat Anda tahu protein yang ingin Anda bersihkan (terpisah). Karena bukan itu masalahnya, Anda harus mengumpulkan dan menjalankan Elektroforesis gel SDS dari fraksi pada setiap tahap pemurnian kolom. Juga, jalankan perbandingan kontrol dan sampel plasma berdampingan untuk mengetahui protein mana yang diekspresikan secara berbeda.

Sebagai penutup, saya ingin menunjukkan bahwa elektroforesis 2D memberi Anda gel untuk dibandingkan, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Jadi itu mungkin solusi yang lebih baik untuk masalah Anda. Namun, saya akui Anda mungkin harus menyiapkan pemurnian untuk mengonfirmasi temuan Anda.

Semoga membantu, Good Luck!


Spesiasi kimia aluminium dalam serum manusia

Spesiasi kimia aluminium dalam fraksi massa molekul rendah (LMM) dan massa molekul tinggi (HMM) serum manusia dibahas. Tinjauan kritis literatur tentang prosedur analitis berbeda yang dijelaskan untuk spesiasi aluminium dalam sampel serum manusia disajikan di sini. Metodologi, persyaratan eksperimental dan instrumental dan kemampuan prosedur analitis yang dilaporkan untuk identifikasi spesies aluminium HMM dan LMM dalam serum manusia diperiksa secara rinci. Pemisahan non-kromatografi yang digabungkan dengan spektrometri serapan atom elektrotermal untuk deteksi aluminium dibandingkan dengan teknik kromatografi (kromatografi eksklusi ukuran, kromatografi pertukaran anion dan kromatografi cair protein cepat) yang digabungkan dengan ETAAS atau deteksi spektrometri massa plasma (ICP-MS) yang digabungkan secara induktif untuk Al- Investigasi spesies HMM. Studi dan teknik yang dilaporkan untuk senyawa Al-LMM juga dirangkum, baik untuk sukarelawan sehat maupun pasien dialisis. Berdasarkan pengetahuan yang diperoleh dari penerapan prosedur analitis yang dikembangkan untuk analisis serum nyata, telah ditunjukkan bahwa sebagian besar Al dalam serum manusia terikat pada Al-transferrin, sedangkan fraksi LMM-Al (10-20% dari total Al) terutama mengandung kompleks Al-sitrat, Al-fosfat dan terner Al-sitrat-fosfat.


Definisi

Elektroforesis adalah metode pemisahan protein berdasarkan sifat fisiknya. Serum ditempatkan pada media tertentu, dan biaya diterapkan. Muatan bersih (positif atau negatif) dan ukuran serta bentuk protein biasanya digunakan dalam membedakan berbagai protein serum

Beberapa subset elektroforesis protein serum tersedia. Nama subset ini didasarkan pada metode yang digunakan untuk memisahkan dan membedakan berbagai komponen serum. Dalam elektroforesis zona, misalnya, subtipe protein yang berbeda ditempatkan di lokasi fisik yang terpisah pada gel yang terbuat dari agar, selulosa, atau bahan tanaman lainnya.2 , 3 Protein diwarnai, dan kepadatannya dihitung secara elektronik untuk menyediakan data grafis pada jumlah absolut dan relatif dari berbagai protein. Pemisahan lebih lanjut dari subtipe protein dicapai dengan pewarnaan dengan agen yang aktif secara imunologis, yang menghasilkan imunofluoresensi dan imunofiksasi.


Elektroforesis: Pemisahan dan Analisis

Pada praktikum sebelumnya kita telah membahas tentang gerak suatu partikel dalam medium fluida, dimana gaya pengendapan adalah gaya tarik gravitasi (pada zat cair yang mengalir), dan gaya lawannya adalah gaya gesekan yang sebanding dengan kecepatan partikel. Gaya-gaya ini bekerja dalam arah yang berlawanan dan akhirnya menyeimbangkan satu sama lain, yang mengarah ke gerakan seragam partikel dalam media cair bergerak (yaitu partikel bergerak dengan kecepatan konstan). Jika medan luar adalah medan listrik dan bukan medan gravitasi, ada dua cara makromolekul akan merespon medan luar. Jika molekul bermuatan, itu akan bermigrasi dalam medan listrik ke elektroda dengan muatan yang berlawanan. Ini adalah prinsip yang mendasari teknik elektroforesis. Jika makromolekul memiliki distribusi muatan yang asimetris (yaitu memiliki momen dipol permanen), molekul akan cenderung berorientasi dalam medan listrik. Prinsip ini memberikan dasar bagi teknik birefringence elektrik dan dichroism. Kami hanya akan membahas elektroforesis.

Pertimbangkan kasus sederhana partikel bermuatan (+Q) yang bergerak dalam medan listrik (E) dalam media nonkonduktor, seperti air. Jika partikel bergerak dengan kecepatan konstan menuju katoda (-elektroda), gaya total Ftot pada partikel adalah 0 (karena F=ma, dan percepatan (a) partikel adalah 0 pada kecepatan konstan). Dua gaya bekerja pada partikel, satu FE, gaya yang diberikan pada partikel bermuatan oleh medan, yang dalam arah gerak (menuju katoda), dan yang lainnya, FF, gaya gesekan pada partikel bermuatan, yang memperlambat gerakannya menuju katoda, dan karenanya berlawanan arah dengan gerakan (menuju elektroda anoda (+)). Ini ditunjukkan pada diagram di bawah ini:

(1) Ftot = Fe + FF = 0, dimana
(2) Fe = QE (gaya listrik) dan
(3) FF = -fv (gaya gesekan),

di mana v adalah kecepatan partikel, dan f adalah konstanta yang disebut koefisien gesekan. Persamaan (3) menunjukkan bahwa gaya FF menghambat gerak menuju katoda sebanding dengan kecepatan partikel. Ini intuitif karena orang akan mengharapkan semakin tinggi kecepatan semakin besar FF yang akan menghambat gerakan. Koefisien gesekan tergantung pada ukuran dan bentuk molekul. Semakin besar molekul, semakin besar koefisien gesekan (yaitu lebih banyak resistensi terhadap gerakan molekul). Dapat ditunjukkan bahwa koefisien gesekan untuk partikel bola diberikan oleh

di mana &eta adalah viskositas (ukuran hambatan aliran cairan - air memiliki viskositas rendah, sirup maple nyata memiliki viskositas tinggi), dan RS (Radius Stokes) adalah jari-jari bola terhidrasi (R . yang lebih besarS, semakin besar koefisien gesekan, semakin besar FF yang menahan gerakan menuju katoda). Dari (1), (2), dan (3), Fe = FF , atau

Jadi v/E = Q/f = U = mobilitas elektroforesis, atau

Oleh karena itu, mobilitas elektroforesis U sebanding dengan kerapatan muatan (muatan/ukuran, Q/RS) dari partikel. Makromolekul dengan kerapatan muatan yang berbeda dapat dipisahkan dengan elektroforesis. Pembahasan ini membahas kasus yang paling sederhana, karena pada kenyataannya terdapat ion lawan dalam larutan (dari garam) yang akan membentuk awan di sekitar makromolekul bermuatan, dan sebagian melindungi partikel bermuatan dari medan listrik E.

Elektroforesis modern dilakukan dalam gel padat (seperti poliakrilamida), yang terbentuk dari larutan akrilamida cair setelah penambahan zat polimerisasi. Gel padat berpori terhadap molekul terlarut dan pelarut dan berfungsi sebagai media untuk elektroforesis sambil membantu menghilangkan gaya konveksi dalam cairan yang akan mengganggu pemisahan. Eksperimen elektroforesis telah dilakukan pada pesawat ulang-alik dalam kondisi tanpa bobot untuk mencegah gangguan tersebut.

Salah satu komplikasi yang mempengaruhi gambaran ideal elektroforesis dalam gel poliakrilamida ini adalah bahwa gel memiliki pori-pori tempat makromolekul bergerak. Seperti pada kromatografi gel, molekul yang lebih kecil dapat melewati pori-pori lebih mudah daripada molekul yang lebih besar, sehingga ada mekanisme penyaringan tambahan yang berkontribusi pada efektif mobilitas (Juga, gel dapat mengubah medan listrik efektif lokal). Efek pengayakan gel sebenarnya meningkatkan daya pisah dari teknik ini.

Telah ditentukan bahwa mobilitas elektroforesis sebenarnya dari protein, U, adalah fungsi dari mobilitas protein dalam larutan sukrosa pekat (Uo) dan T, konsentrasi total akrilamida dalam gel terpolimerisasi. Semakin tinggi konsentrasi akrilamida dalam larutan gel yang tidak terpolimerisasi, semakin kecil ukuran pori-pori pada gel yang terpolimerisasi. Persamaan yang menunjukkan hubungan antara U, Uo, dan T ditunjukkan di bawah ini:

dimana KR adalah kemiringan plot log U vs T untuk protein tertentu. Sejak KR adalah fungsi dari jari-jari molekul, dimungkinkan untuk menentukan berat molekul molekul protein dengan melakukan beberapa pemisahan elektroforesis dalam gel dengan konsentrasi akrilamida yang berbeda (T), dan mengekstrapolasi hasil ke T = 0, sehingga menghilangkan efek ukuran pori . Masalah muncul, bagaimanapun, jika protein tidak berbentuk bulat

Apakah ada cara untuk mendapatkan informasi berat molekul, selain penentuan kemurnian, pada gel tunggal?. Apa yang akan terjadi jika dua protein berbeda, masing-masing dengan berat molekul dan muatan total yang sama, tetapi bentuk yang berbeda, dijalankan pada gel akrilamida tunggal? Yang memiliki bentuk lebih memanjang (jari-jari Stokes besar) akan memiliki mobilitas elektroforesis yang lebih rendah (U = Q/6&pi&etaRS). Rs yang lebih besar juga akan menyebabkan protein memasuki pori-pori pada tingkat yang lebih lambat. Oleh karena itu mobilitas elektroforesis dan efek pengayakan akan menyebabkan protein ini berjalan secara anomali lambat dan memiliki berat molekul yang tampak lebih tinggi. Juga bayangkan dua protein globular dengan ukuran berbeda tetapi dengan perbedaan muatan kompensasi yang memungkinkan kedua protein bermigrasi pada kecepatan yang sama di dalam gel.

Teknik umum yang digunakan untuk menyederhanakan interpretasi proses elektroforesis dalam gel tunggal adalah dengan menjalankan gel dalam kondisi denaturasi. Denaturan pilihan biasanya adalah sodium dodecyl sulfate (SDS), yang merupakan deterjen ionik dengan struktur CH3(CH2)10CH2OSO3 - (Amfifil rantai tunggal). Deterjen ini mengikat dan mendenaturasi sebagian besar protein, dengan sekitar 1,4 g SDS mengikat/g protein (sekitar 1 SDS/2 asam amino). Karena ada 1 muatan negatif/SDS, pengikatan SDS menutupi salah satu muatan pada protein, dan memberikan semua protein muatan negatif yang besar secara keseluruhan. Selain itu, kompleks SDS-protein telah terbukti secara umum memiliki bentuk seperti silinder memanjang. Karena jumlah SDS yang terikat per satuan massa protein adalah konstan, kerapatan muatan keseluruhan pada semua protein adalah serupa, sehingga mobilitas elektroforesis hanya ditentukan oleh efek pengayakan. SDS juga menghilangkan perbedaan bentuk pada protein sebagai variabel yang menentukan pengayakan, karena semua protein memiliki bentuk umum seperti batang yang sama. (Penggunaan SDS analog dengan penggunaan urea 8M dalam kromatografi gel pemisahan protein untuk menentukan berat molekul). Mobilitas hanya menjadi fungsi dari berat molekul protein, dan bukan bentuk. Berat molekul protein yang tidak diketahui dapat ditentukan dengan membandingkan posisi protein pada gel poliakrilamida SDS dengan serangkaian standar berat molekul yang diketahui dari mana plot linier ln Mr vs RF dapat digunakan untuk menghitung berat molekul yang tidak diketahui. Hal ini mirip dengan analisis dalam kromatografi gel, di mana ln Mr adalah fungsi linier dari Krata-rata, koefisien distribusi, ketika gel dijalankan dalam kondisi denaturasi. Namun, beberapa protein berjalan secara anomali pada gel tersebut (karena SDS pengikatan yang tidak lengkap atau berlebih), sehingga teknik alternatif penentuan berat molekul harus digunakan bersama dengan teknik ini.

Protein biasanya dipanaskan dalam SDS sampai 100 o C selama 3 menit, dengan adanya zat pereduksi seperti b-mercaptoethanol, untuk mengubah sifat protein menjadi protein berbentuk batang. Berat molekul semu dapat diperoleh di bawah kondisi non-pereduksi (tanpa b-ME), tetapi ini harus dianggap hanya perkiraan. Menjalankan protein baik dengan adanya dan tidak adanya zat pereduksi dapat memberikan informasi penting tentang struktur subunit protein. Protein multimerik yang subunitnya disatukan oleh ikatan disulfida dapat diuraikan menjadi komponen-komponen individualnya ketika zat pereduksi ditambahkan. Jika subunit disatukan oleh daya tarik antarmolekul nonkovalen, protein akan berjalan secara identik di bawah kondisi denaturasi (SDS), yang akan menghilangkan interaksi subunit, dengan ada atau tidak adanya b-ME. Untuk menentukan komposisi subunit protein yang disatukan oleh interaksi nonkovalen, elektroforesis harus dilakukan tanpa adanya zat pendenaturasi.

  • Nobel E-Museum: Lab Biokimia Virtual. Aula Pemisahan: Elektroforesis - ikuti tautan

Catatan: Tata nama elektroda mungkin membingungkan bagi sebagian dari Anda. Seperti disebutkan di atas, kation bergerak menuju katoda (di mana reduksi terjadi), sehingga katoda harus negatif. Demikian juga, anion bergerak menuju anoda (di mana oksidasi terjadi), sehingga anoda harus positif. Ini adalah kebalikan dari apa yang mungkin Anda ingat dari Kimia Umum atau Analitik, ketika Anda membahas terutama sel galvanik. Dalam sel galvanik, arus listrik dihasilkan dari serangkaian setengah reaksi redoks spontan. Kita berurusan dengan sel elektrolisis, seperti elektrolisis air (2H2O(l) --> 2H2 (g) + O2(g)) atau dalam produksi Cl2(g) dan Mg(s) dari elektrolit berair MgCl2(aq). Dalam sel elektrolitik, catu daya harus memasok arus untuk menggerakkan reaksi nonspontan (secara termodinamika tidak disukai), seperti diuraikan di atas. Lihat gambar ulasan di bawah ini.

Sel Galvani dan Elektrolit

Elektroforesis dilakukan dalam media berpori, namun padat, untuk menghilangkan masalah yang terkait dengan arus konveksi. Media tersebut dibentuk dari polimerisasi larutan cair agarosa (sebagian besar digunakan untuk elektroforesis fragmen DNA dan protein yang sangat besar) atau akrilamida. Polimerisasi akrilamida dimulai dengan penambahan amonium persulfat dengan adanya tetrametilendiamin (TEMED), bersama dengan dimer akrilamida (N,N'-metilen-bis(akrilamida) yang dihubungkan secara kovalen antara nitrogen amida dari akrilamida oleh metilen kelompok Struktur senyawa ini ditunjukkan di bawah ini:

Polimerisasi radikal bebas dari akrilamida dimulai pada penambahan amonium persulfat, yang jika dilarutkan dalam air, membentuk radikal bebas, seperti yang ditunjukkan di bawah ini:

Polimerisasi radikal memulai polimerisasi akrilamida, seperti yang ditunjukkan di bawah ini. TEMED, melalui kemampuannya untuk eksis sebagai radikal bebas, bertindak sebagai katalis tambahan untuk polimerisasi. Gel kaku hanya terbentuk, namun, ketika N,N'-metilen-bis(akrilamida ditambahkan ke dalam campuran selama polimerisasi, yang mengikat silang polimer akrilamida yang berdekatan seperti yang ditunjukkan di bawah ini:

Jumlah bis yang ditambahkan selama polimerisasi mengontrol derajat ikatan silang, dan karenanya ukuran pori gel yang dipolimerisasi. Pengaruh ukuran pori adalah DI DEPAN untuk itu dalam kromatografi gel. Dalam kedua kasus, protein besar mengalami kesulitan memasuki pori-pori. Dalam kromatografi gel, protein besar dipartisi secara istimewa ke dalam fase cair bergerak (volume kosong) dan paling banyak dielusi. DENGAN CEPAT dari kolom. Dalam elektroforesis, protein besar, yang tidak dapat dengan mudah memasuki pori-pori dalam gel, tidak mudah diangkut oleh medan listrik melalui gel, dan sebagian besar terelusi. PERLAHAN-LAHAN. Ukuran pori tidak dapat dikontrol seakurat dalam pembuatan resin kromatografi gel.

Bagaimana protein bermigrasi melalui gel? Suatu larutan protein kental dilapiskan pada bagian atas gel dalam sebuah sumur kecil yang dibentuk menjadi gel selama proses polimerisasi. Bagian bawah dan atas gel dimasukkan ke dalam reservoir yang berisi larutan buffer dan elektroda yang sesuai. Medan listrik diterapkan dan protein bermigrasi melalui gel terhidrasi. Sifat larutan buffer dalam reservoir dan gel terpolimerisasi adalah penting. Komponen buffer tidak boleh berikatan dengan protein yang akan dipisahkan. Selain itu, pH media harus sedemikian rupa sehingga protein memiliki muatan yang sesuai, sehingga mereka akan bermigrasi ke arah yang diharapkan.

Elektroforesis gel terputus-putus:

Ada banyak variasi elektroforesis yang umum digunakan. Gel dapat dipolimerisasi dalam tabung, atau lempengan, dan dengan ada atau tidak adanya zat pendenaturasi. Selain itu, pelat yang diberikan mungkin terdiri dari dua pelat terpisah yang dipolimerisasi satu di atas satu sama lain, masing-masing dengan konsentrasi dan pH akrilamida yang berbeda. Jenis ini disebut elektroforesis gel pH diskontinyu, atau elektroforesis cakram. Kami akan menggunakan teknik ini di lab hari ini. Dua gel konsentrasi pH dan akrilamida yang berbeda (gel susun, dan gel berjalan) ditunjukkan pada gambar di bawah ini.

Gel susun adalah akrilamida konsentrasi rendah (2-4%) yang dipolimerisasi dalam larutan buffer Tris HCl (pH 6,5) dua unit pH di bawah yang digunakan dalam running gel dan reservoir bawah (buffer Tris HCl, pH 8,7). Konsentrasi gel yang lebih rendah atau sedang berjalan bervariasi dari 7-15% akrilamida, tergantung pada berat molekul protein yang akan dipisahkan. Reservoir penyangga atas mengandung penyangga Tris dengan asam lemah seperti glisin (pKa2 = 9,6) dengan pH yang sama dengan gel berjalan.

Apa keuntungan dalam resolusi sistem gel pH terputus-putus? Keuntungan utama adalah bahwa protein elektroforesis dengan cepat melalui gel susun dan "stack" pada antarmuka antara dua gel, sebelum memasuki gel. Ini meningkatkan kekompakan protein sebelum memasuki gel berjalan dan meningkatkan resolusi. Bagaimana cara kerja proses penumpukan ini? Ketika elektroforesis dimulai, ion glisin dari reservoir atas (pada pH 8,7) memasuki gel susun karena pada pH tersebut mereka memiliki muatan negatif parsial rata-rata. Ion buffer gel susun terus bergerak dalam gel susun, tetapi ketika ion glisin memasuki pH 6,5 gel susun, mereka menjadi zwitterion dengan muatan bersih nol, dan karenanya berhenti bergerak menuju anoda. Hambatan listrik di stacking gel kemudian meningkat karena jumlah ion yang bergerak melalui stacking gel berkurang. Untuk menjaga arus konstan di seluruh rangkaian, akan ada terlokalisasi kenaikan tegangan dalam gel susun (dari Hukum Ohm, V = iR). Hal ini akan menyebabkan protein bermigrasi dengan cepat dan semua menumpuk dalam satu piringan yang sangat tipis tepat di belakang ion Cl- di gel susun (yang berada di depan karena mereka memiliki kerapatan muatan dan mobilitas elektroforesis tertinggi dari ion apa pun dalam gel susun. ). Protein tidak akan melewati ion Cl- karena jika mereka melakukannya, mereka akan segera melambat karena mereka tidak lagi berada di area pembawa muatan yang berkurang dan tegangan yang lebih tinggi. Pada antarmuka stacking gel/running gel, protein tidak dapat semua bermigrasi pada kecepatan yang sama, karena efek penyaringan gel yang lebih pekat, dan karenanya akan dipisahkan dalam gel berjalan. Glisin akhirnya memasuki gel berjalan, mengasumsikan keadaan terisi penuh pada pH tersebut (8,7), akan melewati protein, dan mengembalikan kekurangan muatan yang terjadi pada gel susun.

Applet Jawa: Elektroforesis Protein

Deteksi protein dalam gel:

Kebanyakan protein tidak menyerap panjang gelombang cahaya tampak, dan karenanya tidak akan terlihat selama elektroforesis. Untuk memastikan bahwa protein tidak terelusi dari gel ke dalam reservoir buffer yang lebih rendah, protein dengan berat molekul kecil, pewarna anionik, bromofenol biru ditambahkan ke protein sebelum ditempatkan pada gel. Elektroforesis dihentikan ketika pewarna mencapai dekat ujung gel berjalan. Rakitan gel dikeluarkan dari ruang elektroforesis, pelat kaca dipisahkan, dan gel dicuci menjadi serangkaian larutan dengan tujuan membuat protein berpita terlihat oleh mata.

Beberapa teknik saat ini digunakan. Yang paling umum adalah menodai gel dengan Coomassie Blue, yang dilarutkan dalam larutan metanol/asam asetat. Seperti yang ditemukan di lab dua, protein mengikat Coomassie Blue, dengan pergeseran spektral bersamaan dalam sifat absorbansi pewarna terikat. Metanol dan asam asetat dalam larutan pewarna juga membantu "memperbaiki" protein dalam gel, dan mencegah difusinya ke dalam larutan. Setelah gel diwarnai, noda latar belakang gel dihilangkan dengan asam asetat/metanol, meninggalkan pita protein berwarna biru. Sekali lagi, perlu diperhatikan: beberapa protein tidak akan diwarnai dengan Coomassie blue. Teknik pewarnaan umum lainnya melibatkan pewarnaan perak, yang melibatkan reduksi Ag(I) menjadi unsur perak dan pengendapannya oleh protein dalam larutan reaksi yang sesuai, seperti halnya dalam proses fotografi. (Ingat dalam uji BCA, ikatan peptida mereduksi Cu(II) menjadi Cu(I), yang dikhelat menjadi BCA.) Diperlukan solusi pengembang dan fixer. Teknik ini 10-50 X lebih sensitif daripada pewarnaan Coomassie Blue. Modifikasi fluoresen atau radioaktif pra-elektroforesis dari protein memungkinkan sensitivitas yang lebih besar. Setelah elektroforesis protein berlabel radio, gel dapat dikeringkan, dan dilapisi dengan film sinar-X selama beberapa bulan, jika perlu, untuk memungkinkan paparan film yang cukup oleh protein konsentrasi rendah. Teknik visualisasi ini disebut autoradiografi.

Gambar: SDS PAGE Gel dengan standar MW

Fragmen DNA biasanya dipisahkan pada sistem gel agarosa horizontal, yang jauh lebih mudah untuk dituangkan.

Gambar: Fragmen DNA dipisahkan pada gel agarosa

Variasi pada elektroforesis gel:

Pemfokusan isoelektrik: Dalam teknik ini, gradien pH diatur dalam gel poliakrilamida. Hal ini dicapai dengan praelektroforesis serangkaian molekul dengan berat molekul rendah yang mengandung gugus amino dan karboksil yang disebut amfolit. Ketika dikenai medan listrik, spesies yang paling negatif akan terkonsentrasi di anoda, sedangkan yang paling positif akan terkonsentrasi ke katoda. Amfolit yang tersisa akan bermigrasi di antaranya, dengan efek bersih bahwa amfolit bermigrasi ke titik isoelektriknya dan membentuk gradien pH linier dalam gel. Protein yang diaplikasikan pada gel akan bermigrasi ke pH yang sesuai dengan titik isoelektriknya dan berhenti.

elektroforesis 2D: Ini biasanya melibatkan penundukan protein ke elektroforesis pemfokusan isoelektrik dalam cetakan gel poliakrilamida dalam tabung silinder sempit. Setelah elektroforesis ini, gel tabung dikeluarkan, dan ditempatkan di atas gel susun dan dikenai elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dalam arah 90o dari percobaan pemfokusan isoelektrik awal. Jika protein berasal dari sel berlabel 35 Met, mewakili protein unik dapat diperoleh dari populasi sel tertentu.

  • Contoh elektroforetigram 2 D
  • Elektroforesis 2D untuk Proteomik

blotting barat: Setelah percobaan elektroforesis pelat SDS standar dijalankan, gel dilapisi dengan selembar kertas saring nitroselulosa. Sandwich gel dan kertas saring ditempatkan kembali ke ruang elektroforesis, sehingga protein bermigrasi dari gel ke nitroselulosa, di mana mereka mengikat secara ireversibel. Kertas saring dapat dilepas dan direndam dalam larutan yang mengandung antibodi spesifik terhadap protein yang diinginkan pada nitroselulosa. Kompleks protein-antibodi pada kertas saring ini kemudian dapat dideteksi dengan menambahkan antibodi berlabel fluoresen yang mengikat antibodi pertama, misalnya.

Gambar: Gel SDS PAGE dan Western Blot untuk mendeteksi CKK47

Gambar: Deteksi di Western Blots

Fluoresensi

Ketika elektron dalam molekul menyerap energi, mereka dipromosikan ke keadaan energi elektronik yang lebih tinggi. Elektron keadaan tereksitasi ini dapat kembali ke keadaan dasar dalam proses nonradiatif atau radiasi. Dalam deeksitasi radiasi, cahaya dipancarkan. Proses emisi cahaya ini disebut pendaran, yang dapat dibagi menjadi dua kategori:

  • fluoresensi: Jika satu elektron dari pasangan elektron keadaan dasar tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi, elektron yang tereksitasi masih dapat dipasangkan spin dengan pasangan elektron keadaan dasar - yaitu mereka memiliki spin yang berlawanan. Elektron tereksitasi dapat kembali ke keadaan dasar tanpa membalikkan putarannya. (Keadaan tereksitasi adalah kaos keadaan dengan S, keadaan putaran total, dengan rumus S = 2s +1 di mana s = o dan S = 1 untuk sinlget.) Proses ini, yang menghasilkan emisi foton yang cepat, adalah "spin diperbolehkan". Laju emisi foton adalah sekitar 108 s -1 , yang menghasilkan seumur hidup (waktu rata-rata antara eksitasi dan emisi) dari keadaan tereksitasi sekitar 10 ns.
  • fosforesensi: Jika, berbeda dengan kasus di atas, spin elektron tereksitasi dibalik, maka transisinya kembali ke keadaan dasar adalah "spin dilarang" karena elektron keadaan tereksitasi dan pasangan keadaan dasarnya memiliki keadaan spin yang sama. (Keadaan tereksitasi adalah tiga serangkai keadaan dengan S, keadaan putaran total, diberikan rumus S = 2s +1 di mana s = 1 dan S = 3 untuk triplet). Oleh karena itu transisi ini terjadi secara perlahan (dalam rentang ms - s). Mainan yang bersinar dalam gelap menampilkan masa pakai fosforesensi yang lebih lama. (Catatan: Panduan ini akan berkonsentrasi pada fluoresensi.)

Bersaing dengan dua proses deeksitasi adalah proses nonradiatif (seperti melalui tumbukan). Mengingat proses yang bersaing ini, mungkin diharapkan bahwa fosforesensi dalam larutan cair pada suhu kamar mungkin tidak dapat dideteksi

Molekul yang berpendar biasanya aromatik, yang mudah menyerap di daerah sinar UV dan sinar tampak. Fluorofor umum adalah kina, ditemukan dalam air tonik (perhatikan cahaya biru samar di permukaan ketika ditempatkan di bawah sinar matahari langsung), dan fluorescein dan rhodamin, dua fluorofor sering ditambahkan ke antibeku. Atom biasanya tidak berpendar, dengan pengecualian ion europium dan terbium dari deret lantanida. Ini berfluoresensi ketika transisi elektronik terjadi antara orbital f, yang terlindung dari pelarut dalam ion tertentu.

Transisi elektronik yang mendasari pendaran dapat diwakili oleh Diagram Jablonski.

Jadi, S1, dan S2 sesuai dengan keadaan dasar singlet dan keadaan elektronik tereksitasi pertama dan kedua dari sebuah elektron. Dalam setiap keadaan elektronik terdapat beberapa tingkat energi vibrasi 0, 1, 2 . Diagram sederhana ini mengabaikan pendinginan fluoresensi, transfer energi resonansi, dll. Transisi, yang diwakili oleh garis vertikal, dianggap seketika. Sebenarnya, dibutuhkan waktu sekitar 10 -15 detik agar inti tidak bergerak dalam proses tersebut. Elektron keadaan dasar dianggap berada pada tingkat vibrasi 0 So, karena energi panas tidak cukup untuk mendorongnya ke tingkat vibrasi berikutnya. Ketika cahaya diserap, elektron dipromosikan ke tingkat getaran yang lebih tinggi dalam tingkat elektronik yang lebih tinggi. Biasanya elektron yang tereksitasi berelaksasi dengan cepat (< 1 ps) ke tingkat vibrasi terendah S1 atau mungkin S2 melalui proses yang disebut konversi internal. Emisi fluoresensi kemudian dapat terjadi dari keadaan vibrasi terendah S1 ke salah satu keadaan vibrasi So. Oleh karena itu foton yang dipancarkan lebih rendah energinya (panjang gelombangnya lebih panjang) daripada foton yang diserap. Juga karena kedua proses melibatkan pergerakan elektron ke tingkat getaran yang berbeda dengan penyerapan atau emisi foton, dan relaksasi getaran nonradiatif dalam tingkat tersebut, spektrum emisi sering merupakan bayangan cermin dari spektrum penyerapan. (Ini mengasumsikan bahwa tingkat vibrasi di So dan S1 memiliki jarak yang sama. Alternatifnya, elektron di S1 ​​dapat membalik spin dan mengubah ke keadaan T1, dalam proses yang disebut persilangan antarsistem, yang mengarah ke fosforesensi.

Karakteristik Emisi Fluoresensi

  1. Pergeseran Stoke: Energi pancaran lebih kecil dari energi serapan, menyebabkan panjang gelombang pancaran lebih tinggi dari panjang gelombang serapan. (Lihat penjelasan di atas.)
  2. Spektrum Emisi biasanya tidak bergantung pada panjang gelombang eksitasi (aturan Kasha): Hal ini terjadi karena relaksasi yang cepat ke tingkat energi vibrasi terendah dari keadaan tereksitasi.
  3. Pengecualian untuk aturan gambar cermin: Penyimpangan timbul dari perubahan geometri inti dalam molekul keadaan tereksitasi. Ini dapat terjadi jika masa pakai status S1 panjang, memungkinkan waktu untuk bergerak sebelum emisi. Contohnya dapat dilihat dengan p-terfenil dalam sikloheksana, di mana cincin menjadi lebih koplanar dalam keadaan tereksitasi. Karena ada pergeseran elektron dalam keadaan tereksitasi, kompleks antara fluorofor tereksitasi dan komponen larutan lain dapat muncul (kompleks transfer muatan). Atau, beberapa fluorofor kompleks dengan diri mereka sendiri (pyrene). Ini memiliki spektrum emisi struktur yang tinggi pada konsentrasi rendah (yaitu tidak ada kompleks), tetapi pada konsentrasi tinggi, perubahan dalam spektrum emisi terjadi, yang timbul dari emisi dari dimer keadaan tereksitasi atau excimer. Acridine menunjukkan dua spektrum emisi pada pH yang berbeda, yang timbul dari perubahan pka pada eksitasi (5,45-10,7).

Eksitasi fluorofor pada tiga panjang gelombang yang berbeda (EX 1, EX 2, EX 3) tidak mengubah profil emisi tetapi menghasilkan variasi intensitas emisi fluoresensi (EM 1, EM 2, EM 3) yang sesuai dengan amplitudo spektrum eksitasi. Gambar dari Katalog Probe Molekuler, tautan di atas.

Transfer Energi Resonansi Fluoresensi (FRET)

Jika spesies penyerap berada di dekat keadaan tereksitasi fluorofor, dan jika spektrum emisi fluorofor tumpang tindih dengan spektrum serapan spesies kedua, penggabungan dua dipol dapat terjadi, dan energi dapat ditransfer dari keadaan tereksitasi dari fluorofor (donor D) ke spesies penyerap kedua (akseptor A). Transfer energi ini melalui kopling dipol dan bukan melalui pelepasan dan penyerapan sepele dari foton yang dipancarkan. Tidak ada foton yang dihasilkan. Proses ini disebut transfer energi resonansi fluoresensi (FRET). laju transfer energi, k(r) diberikan oleh:

k(r) = (1/ &tau) (RHai/r) 6 dimana RHai adalah jarak Forster yang merupakan ukuran tumpang tindih spektral dari donor dan akseptor (yang sebagian besar makromolekul biologis memiliki nilai yang sama 30-60 angstrom), &tau adalah masa hidup donor tanpa adanya FRET, dan r adalah jarak antara donor dan akseptor. Efisiensi, E, dari FRET untuk pasangan donor/akseptor tunggal pada jarak tetap diberikan oleh:

E = RHai 6 /(RHai 6 + r6 ). Ini menunjukkan efisiensi yang bergantung pada 1/r 6 , membuat FRET sangat sensitif terhadap jarak.

Fluorofor biologis

Tidak semua molekul berfluoresensi. Di antara molekul biologis, beberapa, terutama makromolekul, mengandung substituen aromatik yang berfluoresensi. Ini disebut fluorofor intrinsik, dan termasuk, dalam kasus protein, rantai samping triptofan, tirosin, dan fenilalanin, asam amino aromatik. Rantai samping indol triptofan adalah yang paling berfluoresensi, dan spektrum emisinya, yang sensitif terhadap kondisi pelarut, sering kali bergeser biru saat dikubur, dan berubah merah saat terpapar pelarut. Asam nukleat, meskipun juga mengandung basa aromatik, merupakan fluorofor yang buruk. Banyak molekul biologis dapat dibuat berpendar dengan memodifikasinya secara kovalen (melalui nukleofil pada molekul biologis) dengan fluorofor yang ditambahkan secara eksogen, seperti fluorescein isothicyanate, rhodamine isothiocyante, dansyl chloride, dll. Ini disebut fluorofor ekstrinsik. Ini termasuk molekul yang mengikat secara nonkovalen pada struktur seperti ds-DNA (ethidium bromide) atau membran lipid (diphenylhexatriene). Beberapa fluorofor biologis adalah substrat untuk reaksi enzim. Contohnya adalah flavin teroksidasi (FAD, FMN) dan bentuk tereduksi dari NAD (yaitu NADH). Jenis lain dari fluorofor yang berguna adalah indikator, yang sifat fluoresennya berubah dengan perubahan parameter, seperti pH atau [ion Ca].

Informasi dari Fluoresensi

Informasi tentang struktur molekul dapat disimpulkan dari banyak sifat fluoresen:

  • Pergeseran Stokes dalam spektrum emisi: Pergeseran ini paling besar untuk fluorofor di lingkungan kutub (sebagaimana disebutkan di atas untuk fluoresensi indole. Kesimpulan dapat dibuat dengan mempertimbangkan disposisi rantai samping (terkubur atau permukaan) jika perubahan dicatat pada denaturasi protein. Juga banyak probe berfluoresensi lemah dalam air larutan, tetapi berfluoresensi kuat dalam media nonpolar (terikat pada kantong hidrofobik dalam protein, dalam lapisan ganda atau lipoprotein, dll.)
  • pendinginan: Ini dapat memberikan informasi tentang aksesibilitas fluorofor. Misalnya, tiptopan atau probe yang terkubur akan menunjukkan sedikit perubahan dalam intensitas fluoresensi dengan adanya quencher kutub yang besar, sedangkan triptofan atau probe permukaan akan menunjukkan penurunan intensitas fluoresen yang signifikan.
  • Anisotropi atau polarisasi: Ini mengukur tingkat rotasi fluorofor selama masa pakai fluoresennya. Jika fluorfor kecil berikatan dengan molekul besar, konstanta difusi rotasinya menurun, dan anisotropinya meningkat. Sejak viskositas menurunkan tingkat difusi rotasi, perubahan fluoresensi (seperti di dalam bilayer) dapat disimpulkan dari pengukuran ini. Misalnya, membran yang lebih diperkaya asam lemak jenuh harus menunjukkan peningkatan anisotropi dari probe fluoresen hidrofobik, dibandingkan dengan probe yang sama dalam bilayer yang diperkaya dengan asam lemak tak jenuh ganda.
  • RESAH: Ini dapat digunakan untuk mendemonstrasikan pengikatan antara monomer, misalnya (jika satu protein memiliki triptofan dan yang lainnya merupakan probe fluoresen ekstrinsik.

Probe Molekuler - fluorofor dan dokumentasi yang fantastis

  • Sebuah tutorial dari BioProbes:
    • dapatkan pemahaman dasar tentang fluoresensi
    • Pelajari cara menginterpretasikan spektrum eksitasi dan emisi
    • Memahami perbedaan antara filter eksitasi dan emisi

    Bahan Tambahan Potensial untuk Ditambahkan ke Bagian ini:

    3.1 Pemurnian Protein

    Pemurnian protein adalah serangkaian proses yang dimaksudkan untuk mengisolasi satu atau beberapa protein dari campuran kompleks, biasanya sel, jaringan atau seluruh organisme. Pemurnian protein sangat penting untuk karakterisasi fungsi, struktur dan interaksi protein yang diinginkan.Proses pemurnian dapat memisahkan bagian protein dan non-protein dari campuran, dan akhirnya memisahkan protein yang diinginkan dari semua protein lainnya. Pemisahan satu protein dari yang lain biasanya merupakan aspek pemurnian protein yang paling sulit. Langkah pemisahan biasanya memanfaatkan perbedaan ukuran protein, sifat fisiko-kimia, afinitas pengikatan dan aktivitas biologis. Hasil murni dapat disebut isolat protein.

    Pemurnian protein juga persiapan atau analitis. Pemurnian preparatif bertujuan untuk menghasilkan jumlah protein murni yang relatif besar untuk penggunaan selanjutnya. Contohnya termasuk persiapan produk komersial seperti enzim (misalnya laktase), protein nutrisi (misalnya isolat protein kedelai), dan biofarmasi tertentu (misalnya insulin). Beberapa langkah pemurnian preparatif sering digunakan untuk menghilangkan produk ganda, seperti protein sel inang, yang berpotensi mengancam kesehatan pasien. Pemurnian analitis menghasilkan protein dalam jumlah yang relatif kecil untuk berbagai penelitian atau tujuan analisis, termasuk identifikasi, kuantifikasi, dan studi tentang struktur protein, modifikasi dan fungsi pasca-translasi. Pepsin dan urease adalah protein pertama yang dimurnikan hingga dapat dikristalkan.

    Ekstraksi

    Jika protein yang diinginkan tidak disekresikan oleh organisme ke dalam larutan di sekitarnya, langkah pertama dari setiap proses pemurnian adalah penghancuran sel-sel yang mengandung protein tersebut. Tergantung pada seberapa rapuh protein dan seberapa stabil selnya, seseorang dapat, misalnya, menggunakan salah satu metode berikut: i) pembekuan dan pencairan berulang, ii) sonikasi, iii) homogenisasi dengan tekanan tinggi (French press), iv ) homogenisasi dengan penggilingan (pabrik manik-manik), dan v) permeabilisasi oleh deterjen (misalnya Triton X-100) dan/atau enzim (misalnya lisozim). Akhirnya, puing-puing sel dapat dihilangkan dengan sentrifugasi sehingga protein dan senyawa terlarut lainnya tetap berada di supernatan.

    Juga protease dilepaskan selama lisis sel, yang akan mulai mencerna protein dalam larutan. Jika protein yang diinginkan sensitif terhadap proteolisis, disarankan untuk memprosesnya dengan cepat, dan untuk menjaga agar ekstrak tetap dingin, untuk memperlambat pencernaan. Atau, satu atau lebih protease inhibitor dapat ditambahkan ke buffer lisis segera sebelum gangguan sel. Kadang-kadang juga perlu menambahkan DNAse untuk mengurangi viskositas lisat sel yang disebabkan oleh kandungan DNA yang tinggi.

    Pengendapan dan Kelarutan Diferensial

    Dalam pemurnian protein massal, langkah pertama yang umum untuk mengisolasi protein adalah pengendapan menggunakan garam seperti amonium sulfat (NH4)2JADI4. Proses ini disebut Pengasinan atau Menggaramkan(Gambar 3.1) Hal ini dilakukan dengan menambahkan jumlah amonium sulfat yang meningkat dan mengumpulkan fraksi protein endapan yang berbeda. Amonium sulfat sering digunakan karena sangat larut dalam air, relatif bebas dari pengaruh suhu dan biasanya tidak berbahaya bagi sebagian besar protein. Selanjutnya, amonium sulfat dapat dihilangkan dengan dialisis (Gambar 3.2). Gugus hidrofobik pada protein terpapar ke atmosfer, menarik gugus hidrofobik protein lain dan berkumpul. Protein yang diendapkan akan cukup besar untuk terlihat. Salah satu keuntungan dari metode ini adalah dapat dilakukan secara murah dengan volume yang sangat besar.

    Gambar 3.1 Salting In dan Salting Out. Selama proses penggaraman, molekul garam meningkatkan kelarutan protein dengan mengurangi interaksi elektrostatik antara molekul protein. Ketika konsentrasi garam meningkat, interaksi protein-protein menjadi lebih menguntungkan secara energetik daripada interaksi protein-pelarut dan protein mengendap dari larutan.

    Protein pertama yang dimurnikan adalah protein yang larut dalam air. Pemurnian protein membran integral membutuhkan gangguan membran sel untuk mengisolasi satu protein tertentu dari protein lain yang berada dalam kompartemen membran yang sama. Kadang-kadang fraksi membran tertentu dapat diisolasi terlebih dahulu, seperti mengisolasi mitokondria dari sel sebelum memurnikan protein yang terletak di membran mitokondria. Deterjen seperti sodium dodecyl sulfate (SDS) dapat digunakan untuk melarutkan membran sel dan menjaga protein membran dalam larutan selama pemurnian. Namun, karena SDS menyebabkan denaturasi, deterjen yang lebih ringan seperti Triton X-100 atau CHAPS dapat digunakan untuk mempertahankan asal protein. konformasi selama pemurnian lengkap.

    Gambar 3.2 Dialisis. Proses dialisis memisahkan molekul terlarut berdasarkan ukurannya. Sampel biologis ditempatkan di dalam membran tertutup, di mana protein yang diinginkan terlalu besar untuk melewati pori-pori membran, tetapi ion yang lebih kecil dapat dengan mudah melewatinya. Saat larutan mencapai kesetimbangan, ion-ion menjadi terdistribusi secara merata di seluruh larutan, sementara protein tetap terkonsentrasi di membran. Ini mengurangi konsentrasi garam keseluruhan dari suspensi.

    Ultrasentrifugasi

    Sentrifugasi adalah proses yang menggunakan gaya sentrifugal untuk memisahkan campuran partikel dari berbagai massa atau kepadatan tersuspensi dalam cairan. Ketika bejana (biasanya tabung atau botol) yang berisi campuran protein atau partikel lain, seperti sel bakteri, diputar dengan kecepatan tinggi, inersia setiap partikel menghasilkan gaya dalam arah kecepatan partikel yang sebanding dengan massanya. Kecenderungan partikel tertentu untuk bergerak melalui cairan karena gaya ini diimbangi oleh resistensi yang diberikan cairan pada partikel. Efek bersih dari "memutar" sampel dalam centrifuge adalah partikel besar, kecil, dan padat bergerak keluar lebih cepat daripada partikel yang lebih kecil atau partikel dengan lebih banyak "tarikan" dalam cairan. Ketika suspensi partikel "diputar" dalam centrifuge, "pelet" dapat terbentuk di bagian bawah bejana yang diperkaya untuk partikel paling masif dengan hambatan rendah dalam cairan.

    Partikel yang tidak dipadatkan sebagian besar tetap berada dalam cairan yang disebut "supernatan" dan dapat dikeluarkan dari wadah sehingga memisahkan supernatan dari pelet. Tingkat sentrifugasi ditentukan oleh percepatan sudut yang diterapkan pada sampel, biasanya diukur dibandingkan dengan G. Jika sampel disentrifugasi cukup lama, partikel dalam bejana akan mencapai kesetimbangan di mana partikel terakumulasi secara khusus pada titik di bejana di mana kerapatan apungnya seimbang dengan gaya sentrifugal. Sentrifugasi "equilibrium" semacam itu dapat memungkinkan pemurnian ekstensif dari partikel tertentu.

    Di dalam sentrifugasi gradien sukrosa, gradien konsentrasi linier gula (biasanya sukrosa, gliserol, atau media gradien kepadatan berbasis silika, seperti Percoll) dihasilkan dalam tabung sedemikian rupa sehingga konsentrasi tertinggi ada di bagian bawah dan terendah di bagian atas. Percoll adalah merek dagang yang dimiliki oleh perusahaan GE Healthcare. Sampel protein kemudian dilapisi di atas gradien dan diputar dengan kecepatan tinggi dalam ultrasentrifugasi. Hal ini menyebabkan makromolekul berat bermigrasi ke bagian bawah tabung lebih cepat daripada bahan yang lebih ringan. Selama sentrifugasi tanpa adanya sukrosa, ketika partikel bergerak semakin jauh dari pusat rotasi, mereka mengalami gaya sentrifugal yang semakin banyak (semakin jauh mereka bergerak, semakin cepat mereka bergerak). Masalah dengan ini adalah bahwa jarak pemisahan yang berguna di dalam bejana dibatasi pada jendela kecil yang dapat diamati. Gradien sukrosa yang dirancang dengan baik akan melawan gaya sentrifugal yang meningkat sehingga partikel bergerak dalam proporsi yang dekat dengan waktu mereka berada di medan sentrifugal. Sampel yang dipisahkan oleh gradien ini disebut sebagai sentrifugasi "rate zonal". Setelah protein/partikel dipisahkan, gradien kemudian difraksinasi dan dikumpulkan.

    Gambar 3.3 Gradien Densitas Sukrosa.

    Kembali ke atas

    Strategi Pemurnian

    Pilihan bahan awal adalah kunci untuk desain proses pemurnian. Pada tumbuhan atau hewan, protein tertentu biasanya tidak didistribusikan secara homogen ke seluruh tubuh organ atau jaringan yang berbeda memiliki konsentrasi protein yang lebih tinggi atau lebih rendah. Penggunaan hanya jaringan atau organ dengan konsentrasi tertinggi menurunkan volume yang dibutuhkan untuk menghasilkan sejumlah protein murni. Jika protein hadir dalam kelimpahan rendah, atau jika memiliki nilai tinggi, para ilmuwan dapat menggunakan teknologi DNA rekombinan untuk mengembangkan sel-sel yang akan menghasilkan sejumlah besar protein yang diinginkan (ini dikenal sebagai sistem ekspresi). Ekspresi rekombinan memungkinkan protein untuk ditandai, mis. oleh His-tag atau Strep-tag untuk memfasilitasi pemurnian, mengurangi jumlah langkah pemurnian yang diperlukan. Teknik-teknik ini akan dibahas secara lebih rinci dalam Bab 5.

    Pemurnian analitik umumnya menggunakan tiga sifat untuk memisahkan protein. Pertama, protein dapat dimurnikan menurut titik isoelektriknya dengan mengalirkannya melalui gel bergradasi pH atau kolom penukar ion. Kedua, protein dapat dipisahkan menurut ukuran atau berat molekulnya melalui kromatografi eksklusi ukuran atau dengan analisis SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). Protein sering dimurnikan dengan menggunakan 2D-PAGE dan kemudian dianalisis dengan sidik jari massa peptida untuk menetapkan identitas protein. Ini sangat berguna untuk tujuan ilmiah dan batas deteksi untuk protein saat ini sangat rendah dan jumlah nanogram protein cukup untuk analisisnya. Ketiga, protein dapat dipisahkan oleh polaritas/hidrofobisitas melalui kromatografi cair kinerja tinggi atau kromatografi fase terbalik. Teknik elektroforesis gel dibahas secara lebih rinci dalam Bagian 3.2. Bagian ini akan fokus terutama pada pemisahan kromatografi.

    Untuk pemurnian protein preparatif, protokol pemurnian umumnya berisi satu atau lebih langkah kromatografi. Prosedur dasar dalam kromatografi adalah mengalirkan larutan yang mengandung protein melalui kolom yang diisi dengan berbagai bahan. Protein yang berbeda berinteraksi secara berbeda dengan bahan kolom, dan dengan demikian dapat dipisahkan oleh waktu yang dibutuhkan untuk melewati kolom, atau kondisi yang diperlukan untuk mengelusi protein dari kolom. Biasanya protein dideteksi saat keluar dari kolom dengan absorbansinya pada 280 nm. Ada banyak metode kromatografi yang berbeda, dengan yang paling umum dijelaskan di bawah ini:

    Kromatografi Pengecualian Ukuran (juga dikenal sebagai Kromatografi Filtrasi Gel)

    Kromatografi dapat digunakan untuk memisahkan protein dalam larutan atau dalam kondisi denaturasi dengan menggunakan gel berpori. Teknik ini dikenal sebagai kromatografi eksklusi ukuran. Prinsipnya adalah bahwa molekul yang lebih kecil harus melintasi volume yang lebih besar dalam matriks berpori. Akibatnya, protein dengan kisaran ukuran tertentu akan membutuhkan volume eluen (pelarut) yang bervariasi sebelum dikumpulkan di ujung lain kolom gel. Dengan demikian, protein akan dipisahkan berdasarkan ukurannya (Gambar 3.4).

    Dalam konteks pemurnian protein, eluen biasanya dikumpulkan dalam tabung reaksi yang berbeda. Semua tabung reaksi yang tidak mengandung jejak protein yang dapat diukur untuk dimurnikan dibuang. Dengan demikian, larutan yang tersisa dibuat dari protein untuk dimurnikan dan protein berukuran serupa lainnya.

    Gambar 3.4 Ukuran Kromatografi Pengecualian. Juga dikenal sebagai Kromatografi Filtrasi Gel, adalah metode isolasi resolusi rendah yang melibatkan penggunaan manik-manik yang memiliki &ldquotunnel" kecil di dalamnya yang masing-masing memiliki ukuran yang tepat. Ukurannya disebut sebagai &ldquoexclusion limit," yang berarti bahwa molekul di atas berat molekul tertentu tidak akan masuk ke dalam terowongan. Molekul dengan ukuran lebih besar dari batas eksklusi tidak memasuki terowongan dan melewati kolom relatif cepat dengan membuat jalan di antara manik-manik. Molekul yang lebih kecil, yang dapat memasuki terowongan, melakukannya, dan dengan demikian, memiliki jalur yang lebih panjang yang mereka ambil untuk melewati kolom. Karena itu, molekul yang lebih besar dari batas eksklusi akan meninggalkan kolom lebih awal, sedangkan molekul yang lebih kecil yang melewati manik-manik akan terelusi dari kolom nanti. Metode ini memungkinkan pemisahan molekul berdasarkan ukurannya.

    Kromatografi Interaksi Hidrofobik (HIC)

    Media HIC bersifat amfifilik, dengan daerah hidrofobik dan hidrofilik, memungkinkan pemisahan protein berdasarkan hidrofobisitas permukaannya. Protein target dan spesies agregat produknya cenderung memiliki sifat hidrofobik yang berbeda dan menghilangkannya melalui HIC selanjutnya memurnikan protein yang diinginkan. Selain itu, lingkungan yang digunakan biasanya menggunakan kondisi denaturasi yang tidak terlalu keras dibandingkan teknik kromatografi lainnya, sehingga membantu mempertahankan protein yang diinginkan dalam keadaan asli dan fungsionalnya. Dalam air murni, interaksi antara resin dan daerah hidrofobik protein akan sangat lemah, tetapi interaksi ini ditingkatkan dengan menerapkan sampel protein ke resin HIC dalam buffer kekuatan ionik tinggi. Kekuatan ionik buffer kemudian dikurangi untuk mengelusi protein dalam rangka penurunan hidrofobisitas (Gambar 3.5).

    Gambar 3.5 Kromatografi Interaksi Hidrofobik. Matriks kolom, ditunjukkan dengan warna biru, memiliki ligan hidrofobik yang terikat secara kovalen. Dalam kondisi garam tinggi, protein akan berikatan dengan matriks dengan afinitas yang berbeda, dengan lebih banyak protein hidrofobik (ditunjukkan dengan warna kuning) mengikat lebih erat daripada protein yang lebih hidrofilik (ditunjukkan dengan warna hijau) Ketika konsentrasi garam berkurang, protein yang lebih hidrofilik akan dilepaskan lebih dulu, diikuti lebih banyak protein hidrofobik.

    Kromatografi Pertukaran Ion

    Kromatografi pertukaran ion memisahkan senyawa menurut sifat dan derajat muatan ionnya. Kolom yang akan digunakan dipilih sesuai dengan jenis dan kekuatan muatannya. Resin penukar anion memiliki muatan positif dan digunakan untuk menahan dan memisahkan senyawa bermuatan negatif (anion), sedangkan resin penukar kation memiliki muatan negatif dan digunakan untuk memisahkan molekul bermuatan positif (kation).

    Sebelum pemisahan dimulai buffer dipompa melalui kolom untuk menyeimbangkan ion bermuatan berlawanan. Setelah injeksi sampel, molekul terlarut akan bertukar dengan ion buffer karena masing-masing bersaing untuk situs pengikatan pada resin. Panjang retensi untuk setiap zat terlarut tergantung pada kekuatan muatannya. Senyawa yang bermuatan paling lemah akan terelusi terlebih dahulu, diikuti oleh senyawa yang bermuatan lebih kuat. Karena sifat mekanisme pemisahan, pH, jenis buffer, konsentrasi buffer, dan suhu semuanya memainkan peran penting dalam mengendalikan pemisahan.

    Gambar 3.6 menunjukkan jenis kolom pertukaran ion yang dikenal sebagai a kolom pertukaran kation. Dalam hal ini, penyangga terdiri dari manik-manik kecil yang dilekatkan bahan kimia yang memiliki muatan. Setiap molekul bermuatan memiliki counter-ion. Gambar tersebut menunjukkan manik-manik (biru) dengan gugus bermuatan negatif (merah) terpasang. Dalam contoh ini, ion lawannya adalah natrium, yang bermuatan positif. Gugus bermuatan negatif tidak dapat meninggalkan manik-manik, karena ikatan kovalennya, tetapi ion lawan dapat &ldquoditukar" untuk molekul dengan muatan yang sama. Dengan demikian, kolom pertukaran kationakan memiliki ion lawan bermuatan positif dan senyawa bermuatan positif yang ada dalam campuran yang melewati kolom akan bertukar dengan ion lawan dan & ldquostick & quot dengan gugus bermuatan negatif pada manik-manik. Molekul dalam sampel yang bermuatan netral atau negatif akan melewati kolom dengan cepat. Di sisi lain, di kromatografi pertukaran anion, gugus kimia yang melekat pada manik-manik bermuatan positif dan ion lawan bermuatan negatif. Molekul dalam sampel yang bermuatan negatif akan &ldquostick" dan molekul lain akan melewatinya dengan cepat. Untuk menghapus molekul &ldquostuck" ke kolom, kita hanya perlu menambahkan konsentrasi tinggi ion lawan yang sesuai untuk menggantikan dan melepaskannya. Metode ini memungkinkan pemulihan semua komponen campuran yang berbagi muatan yang sama.

    Kromatografi pertukaran ion adalah alat yang sangat kuat untuk digunakan dalam pemurnian protein dan sering digunakan dalam pemisahan analitik dan preparatif.

    Gambar 3.6 Kromatografi Tukar Kation. Dalam diagram ini, molekul bermuatan negatif (ditunjukkan dalam warna merah) secara kovalen terikat pada manik-manik matriks kolom (ditunjukkan dengan warna biru). Ion natrium (Na+) adalah ion lawan yang digantikan oleh protein bermuatan positif dalam campuran protein. Protein netral dan bermuatan negatif tidak menempel dan akan melewati kolom. Protein bermuatan positif kemudian dapat dielusi dari kolom dengan menambahkan konsentrasi ion lawan yang lebih tinggi (dalam hal ini ion natrium).

    Kromatografi Afinitas adalah teknik pemisahan berdasarkan konformasi molekuler, yang sering menggunakan resin khusus aplikasi. Resin ini memiliki ligan (molekul kecil) yang melekat pada permukaannya yang spesifik untuk dan akan berikatan dengan senyawa yang akan dipisahkan. Paling sering, ligan ini berfungsi dengan cara yang mirip dengan interaksi antibodi-antigen. Kecocokan "lock and key" antara ligan dan senyawa targetnya membuatnya sangat spesifik, sering kali menghasilkan satu puncak, sementara semua yang lain dalam sampel tidak dipertahankan (Gambar 3.7).

    Sebagai contoh, banyak protein membran adalah glikoprotein dan dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas lektin. Protein yang dilarutkan deterjen dapat diizinkan untuk mengikat resin kromatografi yang telah dimodifikasi untuk memiliki lektin yang terikat secara kovalen. Protein yang tidak mengikat lektin dicuci dan kemudian glikoprotein yang terikat secara khusus dapat dielusi dengan menambahkan konsentrasi gula yang tinggi yang bersaing dengan glikoprotein terikat di tempat pengikatan lektin. Beberapa lektin memiliki afinitas tinggi yang mengikat oligosakarida glikoprotein yang sulit bersaing dengan gula, dan glikoprotein terikat perlu dilepaskan dengan mendenaturasi lektin.

    Gambar 3.7 Contoh Kromatografi Afinitas. Dalam contoh ini, protein P1 memiliki afinitas terhadap ligan Z dan akan berikatan dengan kolom sedangkan protein P2 dan P3 akan melewati kolom. Protein P1 kemudian dapat dielusi dari kolom menggunakan ligan bebas Z konsentrasi tinggi.

    Teknik umum melibatkan rekayasa urutan 6 hingga 8 residu histidin ke dalam terminal N atau C dari protein rekombinan. Polihistidin berikatan kuat dengan ion logam divalen seperti nikel dan kobalt. Protein dapat dilewatkan melalui kolom yang mengandung ion nikel amobil, yang mengikat tag polihistidin. Semua protein yang tidak ditandai melewati kolom. Protein dapat dielusi dengan imidazol, yang bersaing dengan tag polihistidin untuk mengikat kolom, atau dengan penurunan pH (biasanya menjadi 4,5), yang menurunkan afinitas tag untuk resin. Meskipun prosedur ini umumnya digunakan untuk pemurnian protein rekombinan dengan tag afinitas yang direkayasa (seperti tag 6xHis), prosedur ini juga dapat digunakan untuk protein alami dengan afinitas bawaan untuk kation divalen.

    Kromatografi imunoafinitas

    Jenis khusus dari kromatografi afinitas adalah kromatografi imunoafinitas (Gambar 3.8).Teknik ini menggunakan pengikatan spesifik antibodi dengan antigennya (molekul target yang akan diikat oleh antibodi secara selektif) untuk memurnikan protein yang diinginkan. Prosedur ini melibatkan imobilisasi antibodi ke substrat padat (misalnya manik berpori atau membran), yang kemudian secara selektif mengikat target, sementara yang lainnya mengalir. Protein target dapat dielusi dengan mengubah pH atau salinitas. Ligan amobil dapat berupa antibodi (seperti Immunoglobulin G) atau dapat berupa protein (seperti Protein A). Karena metode ini tidak melibatkan rekayasa dalam tag, metode ini dapat digunakan untuk protein dari sumber alami. Struktur antibodi dan penggunaannya dalam identifikasi protein akan dibahas lebih rinci dalam Bagian 3.2.

    Gambar 3.8. Percobaan Imunopresipitasi Antigen. Antibodi diimobilisasi terlebih dahulu ke penyangga padat (kiri) atau diimobilisasi menggunakan protein pengikat antibodi setelah inkubasi dengan sampel (kanan). Imobilisasi memungkinkan kompleks imun diekstraksi dari sampel kompleks, dicuci dan dielusi memberikan pengayaan protein yang tinggi yang sedang diselidiki

    Kembali ke atas

    Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan Kromatografi Cair Protein Cepat (FPLC)

    Kromatografi cair kinerja tinggi atau kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC)adalah bentuk kromatografi yang menerapkan tekanan tinggi untuk mendorong zat terlarut melalui kolom lebih cepat. Ini berarti bahwa difusi terbatas dan resolusi ditingkatkan. Bentuk yang paling umum adalah "fase terbalik" HPLC, di mana bahan kolom bersifat hidrofobik. Protein dielusi oleh gradien air dan peningkatan jumlah pelarut organik, seperti asetonitril. Protein terelusi menurut hidrofobisitasnya. Setelah pemurnian dengan HPLC protein berada dalam larutan yang hanya mengandung senyawa volatil, dan dapat dengan mudah menjadi diliofilisasi (kering beku). Pemurnian HPLC sering mengakibatkan denaturasi protein yang dimurnikan dan dengan demikian tidak berlaku untuk protein yang tidak melipat kembali secara spontan.

    Karena kelemahan HPLC, teknik alternatif menggunakan sistem tekanan rendah dikembangkan dan disebut Kromatografi cair protein cepat (FPLC). FPL adalah bentuk kromatografi cair yang sering digunakan untuk menganalisis atau memurnikan campuran protein. Seperti dalam bentuk kromatografi lainnya, pemisahan dimungkinkan karena komponen campuran yang berbeda memiliki afinitas yang berbeda untuk dua bahan, fluida yang bergerak (fase gerak) dan padatan berpori (fase diam). Dalam FPLC fase gerak adalah larutan berair, atau "buffer". Laju aliran buffer dikendalikan oleh pompa perpindahan positif dan biasanya dijaga konstan, sedangkan komposisi buffer dapat bervariasi dengan menarik cairan dalam proporsi yang berbeda dari dua atau lebih reservoir eksternal. Fase diam adalah resin yang terdiri dari manik-manik, biasanya dari agarosa yang berikatan silang, dikemas ke dalam gelas silinder atau kolom plastik. Resin FPLC tersedia dalam berbagai ukuran manik dan ligan permukaan tergantung pada aplikasinya.

    Dalam strategi FPLC yang paling umum, resin penukar ion biasanya dipilih (Gambar 3.9). Campuran yang mengandung satu atau lebih protein yang diinginkan dilarutkan dalam 100% buffer A dan dipompa ke dalam kolom. Protein yang menarik mengikat resin sementara komponen lain dilakukan dalam buffer. Laju aliran total buffer dijaga konstan Namun, proporsi Buffer B (buffer "elution") secara bertahap meningkat dari 0% menjadi 100% sesuai dengan perubahan konsentrasi yang diprogram ("gradient"). Buffer B mengandung konsentrasi tinggi dari ion penukar. Jadi ketika konsentrasi Buffer B meningkat secara bertahap, protein terikat akan terdisosiasi tergantung pada interaksi ioniknya dengan matriks kolom dan muncul dalam eluan. Eluan melewati dua detektor yang mengukur konsentrasi garam (dengan konduktivitas) dan konsentrasi protein (dengan penyerapan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 280nm). Karena setiap protein dielusi, ia muncul dalam eluan sebagai "puncak" dalam konsentrasi protein dan dapat dikumpulkan untuk digunakan lebih lanjut.

    FPLC dikembangkan dan dipasarkan di Swedia oleh Pharmacia pada tahun 1982 dan awalnya disebut kromatografi cair kinerja cepat untuk membedakannya dengan HPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi. FPLC umumnya hanya diterapkan pada protein, namun karena banyaknya pilihan resin dan buffer, FPLC memiliki aplikasi yang luas. Berbeda dengan HPLC, tekanan buffer yang digunakan relatif rendah, biasanya kurang dari 5 bar, tetapi laju alirannya relatif tinggi, biasanya 1-5 ml/menit. FPLC dapat dengan mudah diskalakan dari analisis miligram campuran dalam kolom dengan volume total 5 ml atau kurang hingga produksi industri kilogram protein murni dalam kolom dengan volume banyak liter.

    Gambar 3.9 Sistem FPLC Khas. A. Skema komponen dasar dan jalur aliran tipikal untuk sistem kromatografi. B. Gambar peralatan GE Healthcare AKTA FPLC.

    Skema Pemurnian

    Selama proses pemurnian protein, diperlukan sistem kuantitatif untuk menentukan berapa banyak protein yang telah dimurnikan, berapa konsentrasi protein yang direpresentasikan dari campuran aslinya, seberapa aktif secara biologis protein yang dimurnikan, dan kemurnian protein secara keseluruhan. Ini akan membantu memandu dan mengoptimalkan metode pemurnian yang sedang dikembangkan. Teknik pemisahan yang tidak efektif dapat diabaikan dan teknik lain yang memberikan hasil lebih tinggi atau yang mempertahankan aktivitas biologis protein dapat diadopsi.

    Jadi, setiap langkah dalam skema pemurnian dievaluasi secara kuantitatif untuk parameter berikut: protein total, aktivitas total, aktivitas spesifik, hasil, tingkat pemurnian. Masing-masing parameter ini akan ditentukan dalam contoh protokol yang diberikan di bawah ini.

    Berpura-puralah Anda seorang peneliti yang ingin mengisolasi protein baru yang tidak diketahui dari kultur bakteri. Anda menumbuhkan 500 ml bakteri semalaman pada suhu 37 o C dan memanen bakteri dengan sentrifugasi. Anda menghapus kaldu budaya dan mempertahankan pelet bakteri. Anda kemudian melisiskan bakteri menggunakan freeze/thaw dalam 10 mL buffer reaksi. Anda kemudian mensentrifugasi bakteri yang dilisis untuk menghilangkan bahan yang tidak larut dan mempertahankan supernaten yang mengandung protein larut. Protein yang Anda minati memiliki aktivitas biologis yang dapat Anda ukur dengan menggunakan uji sederhana yang menyebabkan perubahan warna dalam campuran reaksi (Gambar 3.10). Anda juga mencatat bahwa laju reaksi ini meningkat dengan meningkatnya konsentrasi supernaten protein Anda (Gambar 3.10)

    Gambar 3.10. Contoh Reaksi Kimia yang menyebabkan perubahan warna dari jingga menjadi coklat tergantung pada peningkatan konsentrasi.

    Pada titik ini, Anda dapat mengukur konsentrasi dasar Anda untuk tingkat pemurnian pertama (lisis bakteri dan penghilangan protein yang tidak larut dan puing-puing seluler lainnya dengan sentrifugasi).

    Jumlah Protein dihitung dengan mengukur konsentrasi dalam sebagian kecil sampel Anda, dan kemudian mengalikannya dengan total volume sampel Anda. Dalam hal ini, Anda mulai dengan 10 mL supernaten. Dalam uji khas untuk mengukur konsentrasi protein, Anda akan menggunakan 50 - 200 &mL sampel untuk menentukan konsentrasi protein. Misalnya, jika Anda menghitung bahwa ada 7,5 &mug/&mL dalam pengujian awal Anda, Anda perlu mengubah nilai itu menjadi mg/mL dan kemudian mengalikannya dengan 10 mL untuk total 75 mg protein dalam 10 mL supernatan ( Tabel 3.1)

    Total Aktivitasdiukur sebagai aktivitas enzim dalam pengujian, dikalikan dengan total volume sampel. Misalnya, dalam sampel awal, Anda dapat menggunakan 5 hingga 50 &mL sampel dalam reaksi biologis Anda (Gambar 3.10). Jika Anda menghitung aktivitas dalam pengujian Anda menjadi 2,5 unit/&mL, ini akan setara dengan 2.500 unit/mL atau 25.000 unit/10 mL supernatan. Perhatikan bahwa, unit enzim, atau satuan internasional untuk enzim (simbol U, terkadang juga IU) adalah a satuan katalitik enzim aktivitas. 1 U (&mumol/menit) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis konversi satu mikromol substrat per menit pada kondisi tertentu dari metode pengujian.

    Aktivitas tertentudiukur dengan membagi Total Activity dengan Total Protein. Dalam contoh kita, 25.000 unit dibagi 75 mg protein = 333,3 unit/mg.

    Menghasilkan adalah ukuran aktivitas biologis yang tertahan dalam sampel setelah setiap langkah pemurnian. Jumlah pada langkah pertama diatur menjadi 100%. Semua langkah hasil selanjutnya akan dievaluasi menggunakan langkah pemurnian pertama. Ini dihitung dengan membagi total aktivitas langkah saat ini, dengan total aktivitas langkah pertama dan kemudian dikalikan dengan 100.

    Tingkat pemurnianmengevaluasi kemurnian protein yang diinginkan dengan membagi aktivitas spesifik yang dihitung setelah setiap langkah pemurnian dengan aktivitas spesifik dari langkah pemurnian pertama. Jadi, langkah pertama selalu bernilai 1.

    Tabel 3.1 Skema Pemurnian Protein Khas

    Perhatikan bahwa setelah setiap langkah pemurnian bahwa Jumlah Protein turun, saat Anda memurnikan protein Anda dari protein lain dalam campuran. Total Aktivitas juga turun dengan setiap langkah pemurnian, karena beberapa protein yang Anda minati juga hilang pada setiap langkah pemurnian, karena (1) beberapa protein akan menempel pada tabung reaksi dan peralatan gelas, (2) beberapa protein tidak akan mengikat dengan 100% efisiensi matriks kolom Anda, (3) beberapa protein mungkin mengikat terlalu erat untuk dikeluarkan dari matriks kolom selama elusi, dan (4) beberapa protein mungkin terdenaturasi atau terdegradasi selama proses pemurnian.

    Jumlah protein minat Anda yang hilang terwakili dalam keseluruhan persen hasiluntuk setiap langkah pemurnian. jika persen hasil terlalu rendah metode pemurnian alternatif harus dieksplorasi.

    Perhatikan bahwa dalam skema pemurnian protein yang baik bahwa aktivitas tertentu harus naik secara substansial dengan setiap tingkat pemurnian karena jumlah protein yang Anda minati merupakan persentase yang lebih besar dari total protein dalam fraksi itu. Jika aktivitas spesifik hanya meningkat sedikit dalam langkah pemurnian, atau jika menurun selama langkah pemurnian, ini dapat menunjukkan bahwa (1) protein yang Anda minati hilang secara substansial pada langkah itu, (2) bahwa protein yang Anda minati sedang terdenaturasi atau terdegradasi dan tidak lagi aktif secara biologis, atau (3) bahwa kofaktor atau protein pengikat yang diperlukan sedang direduksi pada langkah pemurnian itu. Eksperimen tambahan mungkin perlu dilakukan untuk menentukan penyebab mana yang mendominasi, sehingga langkah-langkah dapat diambil untuk mengurangi inaktivasi protein. Sebagai contoh, banyak protein sensitif terhadap suhu dan akan terdegradasi atau terdenaturasi pada suhu kamar. Menyelesaikan langkah pemurnian di atas es seringkali dapat mengurangi degradasi.

    Secara keseluruhan, peningkatan lipat dalam tingkat pemurnian harus meningkat secara eksponensial selama proses pemurnian. Perhatikan bahwa dalam contoh kita, jika setelah 4 langkah pemurnian protein kita mendekati 95% murni, ini akan menunjukkan bahwa protein yang kita minati membentuk sekitar 1,24% dari total protein dalam sampel.

    Kembali ke atas

    3.2 Identifikasi dan Visualisasi Protein

    Teknik analisis yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi atau memvisualisasikan secara positif protein yang diinginkan dalam campuran juga dapat menjadi alat yang berharga untuk memahami aktivitas biologis dan signifikansi protein dalam sistem kehidupan dan juga dapat digunakan untuk membantu memandu skema pemurnian protein.

    Elektroforesis Gel

    Agarosa adalah polimer linier alami yang diekstraksi dari rumput laut yang membentuk matriks gel dengan ikatan hidrogen ketika dipanaskan dalam buffer dan dibiarkan dingin. Untuk sebagian besar aplikasi, hanya agarosa komponen tunggal yang diperlukan dan tidak diperlukan katalis polimerisasi (Gambar 3.11). Oleh karena itu, gel agarosa sederhana dan cepat disiapkan. Mereka adalah media yang paling populer untuk pemisahan asam nukleat berukuran sedang dan besar dan memiliki rentang pemisahan yang luas tetapi daya penyelesaian yang relatif rendah, karena pita yang terbentuk dalam gel cenderung kabur dan menyebar terpisah. Ini adalah hasil dari ukuran pori dan tidak dapat dikontrol secara luas. Keuntungan dan kerugian dari penggunaan gel agarosa untuk elektroforesis dirangkum dalam Tabel 3.2. Gel agarosa biasanya tidak digunakan untuk sampel protein dan tidak akan dibahas lebih lanjut dalam bab ini. Namun, mereka akan ditinjau kembali dalam Bab 5 yang mencakup teknik asam nukleat.

    Tabel 3.2. Keuntungan dan Kerugian Elektroforesis Gel Agarose.

    Gel poliakrilamida adalah gel ikatan silang kimia yang dibentuk oleh polimerisasi akrilamida dengan zat pengikat silang, biasanya N,N&rsquo-metilenbisakrilamida (Gambar 3.11). Reaksinya adalah polimerisasi radikal bebas, biasanya dilakukan dengan amonium persulfat sebagai inisiator dan N,N,N&rsquo,N&rsquo-tetramethylethylendiamine (TEMED) sebagai katalis. Meskipun gel umumnya lebih sulit untuk disiapkan dan ditangani, melibatkan waktu persiapan yang lebih lama daripada gel agarosa, gel ini memiliki keunggulan utama dibandingkan gel agarosa. Mereka memiliki daya pisah yang lebih besar, dapat menampung sampel dalam jumlah yang lebih besar tanpa kehilangan resolusi yang signifikan dan kemurnian sampel yang diperoleh dari gel poliakrilamida sangat tinggi. Selain itu, ukuran pori gel poliakrilamida dapat diubah dengan cara yang mudah dan dapat dikontrol dengan mengubah konsentrasi dua monomer. Dengan demikian, biasanya digunakan untuk memisahkan protein dan fragmen DNA yang lebih kecil. Perlu dicatat bahwa poliakrilamida adalah neurotoksin (bila tidak dipolimerisasi), tetapi dengan perawatan laboratorium yang tepat, poliakrilamida tidak lebih berbahaya daripada berbagai bahan kimia yang umum digunakan. Beberapa keuntungan dan kerugian penggunaan gel poliakrilamida untuk elektroforesis disajikan pada Tabel 3.3.

    Tabel 3.3. Keuntungan dan Kerugian Elektroforesis Gel Poliakrilamida.

    Jaringan gel terhidrasi memiliki banyak sifat yang diinginkan untuk elektroforesis. Mereka memungkinkan berbagai format eksperimental yang stabil secara mekanis seperti elektroforesis horizontal/vertikal dalam gel slab atau elektroforesis dalam tabung atau kapiler. Stabilitas mekanis juga memfasilitasi manipulasi pasca elektroforesis yang memungkinkan eksperimen lebih lanjut seperti blotting, elektro-elusi atau identifikasi spektral massa/pencetakan jari dari protein utuh atau protein yang dicerna dalam irisan gel. Karena gel yang digunakan dalam biokimia secara kimiawi agak tidak reaktif, mereka berinteraksi minimal dengan biomolekul selama elektroforesis yang memungkinkan pemisahan berdasarkan perbedaan fisik daripada kimia antara komponen sampel.

    Gambar 3.11 Gel yang Biasa Digunakan dalam Elektroforesis. (A) Agarosa tersusun dari agarbiosa, (B) Polimerisasi akrilamida dan bisakrilamida membentuk gel poliakrilamida. Reaksi polimerisasi diprakarsai oleh radikal persulfat dan dikatalisis oleh TEMED.

    Elektroforesis gel protein dengan matriks poliakrilamida, biasa disebut elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE)tidak diragukan lagi salah satu teknik yang paling banyak digunakan untuk mengkarakterisasi campuran protein kompleks. Ini adalah metode yang mudah, cepat dan murah karena mereka hanya membutuhkan jumlah protein dalam urutan mikrogram.

    Protein memiliki muatan listrik bersih jika mereka berada dalam media yang memiliki pH berbeda dari titik isoelektriknya dan karena itu memiliki kemampuan untuk bergerak ketika dikenai medan listrik. Kecepatan migrasi sebanding dengan rasio antara muatan protein dan massanya. Semakin tinggi muatan per satuan massa, semakin cepat migrasinya.

    Protein tidak memiliki struktur yang dapat diprediksi sebagai asam nukleat, dan dengan demikian laju migrasinya tidak serupa satu sama lain. Selanjutnya, mereka tidak akan bermigrasi ketika menerapkan gaya gerak listrik, ketika pH sistem sama dengan titik isoelektrik. Gel PAGE yang dijalankan dengan cara ini disebut HALAMAN Asli, karena protein masih terlipat dalam keadaan aslinya ditemukan in vivo. Dalam situasi ini, protein bermigrasi sesuai dengan muatan, ukuran, dan bentuknya.

    Atau, protein dapat didenaturasi sebelum elektroforesis. Cara paling umum untuk mengubah sifat protein adalah dengan menambahkan deterjen seperti sodium dodecyl sulfate (SDS). Ini tidak hanya mendenaturasi protein, tetapi juga melapisi protein dengan muatan negatif, sehingga semua protein akan berjalan menuju timah positif ketika ditempatkan dalam medan listrik. Jenis elektroforesis ini disebut sebagai SDS-HALAMAN dan memisahkan protein secara eksklusif menurut berat molekul. SDS adalah agen pereduksi yang memecah ikatan disulfida, memisahkan protein menjadi sub-unitnya dan juga memberikan muatan negatif bersih yang memungkinkan mereka untuk bermigrasi melalui gel dalam kaitannya langsung dengan ukurannya. Selain itu, denaturasi membuat mereka kehilangan struktur tersiernya dan oleh karena itu kecepatan migrasi sebanding dengan ukuran dan tidak dengan struktur tersier.

    Deteksi Protein dalam Gel

    Protein yang dipisahkan pada gel poliakrilamida dapat dideteksi dengan berbagai metode, misalnya pewarna dan pewarnaan perak (Gambar 3.12).

    Pewarnaan biru Coomassie memungkinkan mendeteksi hingga 0,2 hingga 0,6 & mikrog protein, dan kuantitatif (linier) hingga 15 hingga 20 & mikrog. Ini sering digunakan dalam larutan asam metanol-asetat dan berubah warna dalam larutan asam isopropanol-asetat (Gbr. 1 A). Untuk pewarnaan gel 2-DE dianjurkan untuk menghilangkan amfolit dengan menambahkan trikloroasetat (TCA) ke pewarna dan selanjutnya menghitamkan dengan asam asetat.

    Ini adalah alternatif untuk gel protein pewarnaan rutin (serta asam nukleat dan lipopolisakarida) karena kemudahan penggunaan dan sensitivitasnya yang tinggi (50 hingga 100 kali lebih sensitif daripada pewarnaan Coomassie blue) (Gbr. 1 B). Teknik pewarnaan ini sangat cocok untuk gel dua dimensi.

    Autoradiografi adalah teknik deteksi molekul berlabel radioaktif yang menggunakan emulsi fotografi yang sensitif terhadap partikel radioaktif atau cahaya yang dihasilkan oleh molekul perantara. Emulsi yang mengandung perak sensitif terhadap radiasi partikulat (alfa, beta) atau radiasi elektromagnetik (gamma, cahaya. ), sehingga mengendap sebagai perak metalik. Emulsi akan berkembang sebagai endapan gelap di daerah di mana protein radioaktif terdeteksi.

    Gambar 3.12. SDS-PAGE. Protein dipisahkan pada SDS-PAGE dan dideteksi dengan pewarnaan Coomassie blue (A) dan silver (B). Standar protein untuk mengetahui berat molekul juga dimuat di tepi.

    Fokus isoelektrik

    Teknik ini didasarkan pada pergerakan molekul dalam gradien pH. Molekul amfoter seperti asam amino dan protein dipisahkan dalam lingkungan dimana terdapat perbedaan potensial dan gradien pH. Daerah anoda (+) bersifat asam dan katoda (-) bersifat basa. Di antara mereka menuruni gradien pH sedemikian rupa sehingga molekul yang akan dipisahkan memiliki titik isoelektriknya dalam kisaran tersebut. Zat yang awalnya berada di daerah dengan pH di bawah titik isoelektriknya bermuatan positif dan bermigrasi menuju katoda, sedangkan zat yang berada di media dengan pH lebih rendah dari pI-nya akan bermuatan negatif dan bermigrasi menuju anoda (Gambar 3.13).Migrasi akan mengarah ke wilayah di mana pH bertepatan dengan pI-nya, memiliki muatan bersih nol (membentuk zwitterion) dan berhenti. Jadi molekul amfoter terletak di pita sempit di mana pI bertepatan dengan pH. Dalam teknik ini titik aplikasi tidak kritis karena molekul akan selalu bergerak ke wilayah pI mereka. Gradien pH yang stabil antara elektroda dicapai dengan menggunakan campuran amfolit dengan berat molekul rendah yang pI mencakup kisaran pH yang telah ditentukan.

    Gambar 3.13. Pemfokusan Isoelektrik. Gradien pH dibuat dalam gel sebelum memuat sampel. Setelah sampel dimuat tegangan diterapkan. Protein akan bermigrasi ke pH isoelektriknya, yang tidak memiliki muatan bersih.

    Elektroforesis Gel Dua Dimensi

    Elektroforesis gel dua dimensi (2-DE) didasarkan pada pemisahan campuran protein menurut dua sifat molekuler, satu di setiap dimensi. Yang paling banyak digunakan didasarkan pada pemisahan dimensi pertama dengan pemfokusan isoelektrik dan dimensi kedua menurut berat molekul dengan SDS-PAGE (Gambar 3.14).

    Alur kerja umum dalam eksperimen 2-DE adalah:

    Metode persiapan sampel tergantung pada tujuan penelitian dan sangat penting untuk keberhasilan percobaan. Faktor-faktor seperti kelarutan, ukuran, muatan, dan titik isoelektrik (pI) protein yang diinginkan masuk ke dalam preparasi sampel. Persiapan sampel juga penting dalam mengurangi kompleksitas campuran protein. Fraksi protein yang akan dimuat pada gel 2-DE harus berada dalam buffer denaturasi kekuatan ionik rendah yang mempertahankan muatan asli protein dan membuatnya tetap larut.

    Bagian ini dilakukan oleh IEF. Dengan menggunakan teknik ini, protein dipisahkan berdasarkan pI-nya, pH di mana protein tidak membawa muatan bersih dan tidak akan bermigrasi dalam medan listrik.

    Langkah pengkondisian diterapkan pada protein yang dipisahkan oleh IEF sebelum proses dimensi kedua. Proses ini mengurangi ikatan disulfida dan mengalkilasi gugus sulfhidril yang dihasilkan dari residu sistein. Secara bersamaan, protein dilapisi dengan SDS untuk pemisahan berdasarkan berat molekul.

    Bagian ini dilakukan oleh SDS-PAGE. Pemilihan gel tergantung pada kisaran berat molekul protein yang akan dipisahkan. Kemampuan untuk menjalankan banyak gel pada saat yang sama dan di bawah kondisi yang sama penting untuk tujuan perbandingan gel-ke-gel.

    Untuk memvisualisasikan protein dalam gel, mereka harus diwarnai dengan cara tertentu. Pemilihan metode pewarnaan ditentukan oleh beberapa faktor, termasuk sensitivitas yang diinginkan, jangkauan linier, kemudahan penggunaan, biaya, dan jenis peralatan pencitraan yang tersedia. Saat ini tidak ada pewarnaan universal yang ideal. Kadang-kadang protein terdeteksi setelah pemindahan ke penyangga membran dengan western blotting, yang dijelaskan lebih rinci di bawah.

    Kemampuan untuk mengumpulkan data dalam bentuk digital adalah salah satu faktor utama yang memungkinkan gel 2-DE menjadi sarana praktis untuk mengumpulkan informasi proteom. Ini memungkinkan perbandingan gel yang tidak berprasangka dan katalogisasi data dalam jumlah besar. Banyak jenis perangkat pencitraan berinteraksi dengan perangkat lunak yang dirancang khusus untuk mengumpulkan, menafsirkan, dan membandingkan data proteomik. Salah satu masalah terbesar dalam 2-DE adalah analisis dan perbandingan campuran kompleks protein. Saat ini ada database yang mampu membandingkan pola gel dua dimensi. Sistem ini memungkinkan perbandingan titik secara otomatis untuk identifikasi yang tepat dari titik-titik yang diperlukan dalam analisis kuantitatif.

    Setelah protein yang menarik dipilih dengan analisis diferensial atau kriteria lain, protein dapat dikeluarkan dari gel, dipisahkan dan dicerna untuk mempersiapkan identifikasinya dengan spektrometri massa. Teknik ini dikenal sebagai sidik jari massa peptida. Kemampuan untuk secara tepat menentukan berat molekul dengan matriks-dibantu laser desorpsi/ionisasi-waktu spektrometri massa penerbangan (MALDI-TOF MS) dan untuk mencari database untuk kecocokan massa peptida telah memungkinkan identifikasi protein throughput tinggi. Protein yang tidak diidentifikasi oleh MALDI-TOF dapat diidentifikasi dengan penandaan urutan atau urutan de novo menggunakan elektrospray Q-TOF LC-MS-MS.

    Gambar 3.14 Elektroforesis Gel Dua Dimensi. Protein dari Chlamydomonas reinhardtii diselesaikan dengan 2-DE dari gel preparatif yang diwarnai dengan reagen perak yang kompatibel dengan MALDI-MS untuk analisis sidik jari massa peptida. Dimensi pertama: pemfokusan isoelektrik dalam gradien pH 3-11. Dimensi kedua: SDS-PAGE dalam gel akrilamida 12% (pengikat silang 2,6%) (tebal 1,0 mm). Bintik-bintik bernomor yang ditandai dengan lingkaran sesuai dengan protein dibandingkan untuk selanjutnya diidentifikasi oleh MALDI-TOF MS. Analisis MALDI-TOF MS dari urutan protein dibahas secara lebih rinci di bagian 3.3 di bawah ini.

    Kembali ke atas

    Struktur dan Produksi Antibodi

    NS antibodi, juga dikenal sebagai imunoglobulin (Ig), adalah protein yang diproduksi oleh sel plasma setelah dirangsang oleh antigen. Antibodi adalah dasar fungsional imunitas humoral. Antibodi terjadi dalam darah, dalam sekresi lambung dan lendir, dan dalam ASI. Antibodi dalam cairan tubuh ini dapat mengikat patogen dan menandainya untuk dihancurkan oleh fagosit sebelum menginfeksi sel. Molekul yang diikat oleh antibodi disebut antigen. Antibodi sangat spesifik untuk antigen tunggal atau sekelompok antigen yang memiliki fitur struktural yang sangat lestari. Protein dapat bertindak sebagai antigen yang dikenali oleh antibodi. Jadi, dalam bidang biokimia dan biologi molekuler, antibodi digunakan sebagai alat penting yang membantu kita menentukan fungsi dan pola ekspresi protein. Mereka juga dapat digunakan secara terapeutik dalam pengobatan penyakit seperti kanker.

    Struktur Antibodi

    Jenis antibodi yang paling umum digunakan dalam metodologi biokimia dikenal sebagai imunoglobulin G (IgG) dan akan menjadi fokus bagian ini. Molekul antibodi IgG terdiri dari empat polipeptida: dua rantai berat identik (unit peptida besar) yang sebagian terikat satu sama lain dalam formasi &ldquoY&rdquo, yang diapit oleh dua rantai ringan identik (unit peptida kecil), seperti yang diilustrasikan pada Gambar 3.15 . Ikatan antara asam amino sistein dalam molekul antibodi menempelkan polipeptida satu sama lain. Area di mana antigen dikenali pada antibodi adalah domain variabel dan basis antibodi terdiri dari domain konstan.

    Gambar 3.15 Struktur Immunoglobulin G (IgG) (a) Saat sel B garis germinal matang, enzim yang disebut DNA rekombinase secara acak mengeluarkan segmen V dan J dari gen rantai ringan. Penyambungan pada tingkat mRNA menghasilkan penataan ulang gen lebih lanjut. Akibatnya, (b) setiap sel B matang menghasilkan antibodi tunggal yang memiliki wilayah variabel unik yang mampu mengikat antigen yang berbeda.

    Dalam sel B garis germinal, wilayah variabel gen rantai ringan memiliki 40 variabel (V) dan lima segmen penghubung (J). Sebuah enzim yang disebut DNA recombinase secara acak mengeluarkan sebagian besar segmen ini dari gen selama pematangan sel B, dan menyambung satu segmen V ke satu segmen J. Selama pemrosesan RNA, semua kecuali satu segmen V dan J disambungkan. Rekombinasi dan penyambungan dapat menghasilkan lebih dari 10 6 kemungkinan kombinasi VJ! Akibatnya, setiap sel B yang berdiferensiasi dalam tubuh manusia biasanya memiliki rantai variabel unik yang akan mengenali antigen unik. Domain konstan, yang tidak mengikat antibodi, adalah sama untuk semua antibodi.

    Produksi Antibodi Poliklonal

    Antibodi yang digunakan untuk tujuan penelitian dan diagnostik sering diperoleh dengan menyuntikkan hewan laboratorium seperti kelinci atau kambing dengan zat tertentu. antigen. Dalam beberapa minggu, sistem kekebalan hewan akan menghasilkan antibodi spesifik tingkat tinggi untuk antigen tersebut. Antibodi ini dapat dipanen dalam antiserum, yang merupakan seluruh serum yang dikumpulkan dari hewan setelah terpapar antigen. Karena kebanyakan antigen adalah struktur kompleks dengan banyak epitop, mereka menghasilkan produksi banyak antibodi pada hewan laboratorium. Ini disebut antibodi poliklonal respon juga khas dari respon terhadap infeksi oleh sistem kekebalan tubuh manusia. Antiserum yang diambil dari hewan dengan demikian akan mengandung antibodi dari banyak klon sel B, dengan setiap sel B merespons epitop spesifik pada antigen (Gambar 3.16).

    Gambar 3.16. Produksi Antibodi Poliklonal. Diagram ini menggambarkan proses untuk memanen antibodi poliklonal yang diproduksi sebagai respons terhadap antigen.

    Hewan laboratorium biasanya disuntik setidaknya dua kali dengan antigen ketika digunakan untuk memproduksi antiserum. Injeksi kedua akan mengaktifkan sel memori yang membuat kelas IgG antibodi terhadap antigen tersebut. Sel-sel memori juga mengalami pematangan afinitas, menghasilkan kumpulan antibodi dengan afinitas rata-rata yang lebih tinggi. Pematangan afinitas terjadi karena mutasi pada daerah variabel gen imunoglobulin, menghasilkan sel B dengan situs pengikatan antigen yang sedikit berubah. Pada paparan ulang antigen, sel-sel B yang mampu memproduksi antibodi dengan situs pengikatan antigen afinitas tinggi akan dirangsang untuk berproliferasi dan menghasilkan lebih banyak antibodi daripada rekan-rekan mereka yang berafinitas lebih rendah. NS pembantu, yang merupakan bahan kimia yang memicu aktivasi umum sistem kekebalan yang merangsang produksi antibodi yang lebih besar, sering dicampur dengan antigen sebelum disuntikkan.

    Antiserum yang diperoleh dari hewan tidak hanya akan mengandung antibodi terhadap antigen yang diperkenalkan secara artifisial di laboratorium, tetapi juga akan mengandung antibodi terhadap antigen lain yang pernah terpajan pada hewan selama hidupnya. Untuk alasan ini, antiserum pertama-tama harus &ldquopurified&rdquo untuk menghilangkan antibodi lain sebelum menggunakan antibodi untuk penelitian atau uji diagnostik.

    Produksi Antibodi Monoklonal

    Beberapa jenis pengujian memerlukan spesifisitas dan afinitas antibodi yang lebih baik daripada yang dapat diperoleh dengan menggunakan antiserum poliklonal. Untuk mencapai spesifisitas tinggi ini, semua antibodi harus berikatan dengan afinitas tinggi pada satu epitop. Spesifisitas tinggi ini dapat disediakan oleh antibodi monoklonal (mAbs). Tabel 3.4 membandingkan beberapa karakteristik penting dari antibodi monoklonal dan poliklonal.

    Tabel 3.4 Perbandingan Antibodi Monoklonal dan Poliklonal

    Tidak seperti antibodi poliklonal, yang diproduksi pada hewan hidup, antibodi monoklonal diproduksi in vitro menggunakan teknik kultur jaringan. mAbs diproduksi dengan mengimunisasi hewan, seringkali tikus, berkali-kali dengan antigen spesifik. Sel B dari limpa hewan yang diimunisasi kemudian dikeluarkan. Karena sel B normal tidak dapat berkembang biak selamanya, mereka menyatu dengan sel B kanker abadi yang disebut sel myeloma, untuk menghasilkan hibridoma sel. Semua sel kemudian ditempatkan dalam media selektif yang memungkinkan hanya hibridoma yang tumbuh. Sel myeloma yang tidak menyatu tidak dapat tumbuh, dan sel B yang tidak menyatu akan mati. Hibridoma, yang mampu tumbuh terus menerus dalam kultur sambil memproduksi antibodi, kemudian disaring untuk mAb yang diinginkan. Mereka yang menghasilkan mAb yang diinginkan ditanam dalam kultur jaringan, media kultur dipanen secara berkala dan mAb dimurnikan dari media. Ini adalah proses yang sangat mahal dan memakan waktu. Mungkin perlu berminggu-minggu kultur dan banyak liter media untuk menyediakan mAb yang cukup untuk eksperimen atau untuk merawat satu pasien. mAb mahal (Gambar 3.17).

    Gambar 3.17. Antibodi Monoklonal (mAbs) diproduksi dengan memasukkan antigen ke tikus dan kemudian menggabungkan sel B poliklonal dari limpa tikus ke sel myeloma. Sel hibridoma yang dihasilkan dikultur dan terus memproduksi antibodi terhadap antigen. Hibridoma yang menghasilkan mAb yang diinginkan kemudian ditumbuhkan dalam jumlah besar pada media selektif yang dipanen secara berkala untuk mendapatkan mAb yang diinginkan.

    Kembali ke atas

    Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dan Microarrays

    Sejak penggunaan pertama antibodi untuk mendeteksi antigen, banyak teknologi berbeda telah dikembangkan yang memanfaatkan kemampuan antibodi untuk mengikat molekul lain. Selama tahun 1950-an, ilmuwan Yalow dan Berson mengembangkan metode di mana radioaktivitas digunakan untuk menentukan jumlah analit dalam larutan. Ini disebut 'radioimmunoassay' (RIA), di mana Yarlow menerima hadiah Nobel pada tahun 1977, adalah metode yang sangat sensitif untuk mendeteksi hormon tetapi menggunakan radioaktivitas untuk deteksi antigen tidak aman dan cocok untuk penggunaan umum. Oleh karena itu, prosedur alternatif dikembangkan dengan menghubungkan enzim ke antibodi alih-alih molekul radioaktif, dan dengan menempelkan molekul ke permukaan. Salah satu aplikasi yang paling umum saat ini adalah mengukur jumlah biomolekul dalam sampel dengan "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). Istilah ini awalnya mengacu pada penggunaan enzim untuk melaporkan interaksi antara antibodi dan pasangan pengikatnya (Gan & amp Patel, 2013). Dasar untuk Perlmann dan Engvall di Swedia (Engvall & Perlmann, 1971) serta Schuurs dan van Weemen dari Belanda (Van Weemen & amp Schuurs, 1971), yang membuat pengujian dengan reagen yang tidak dapat bergerak dan dimodifikasi enzim pada awal 1970-an. Saat ini, para ilmuwan juga menggunakan molekul berwarna (disebut fluorofor) yang memancarkan kembali cahaya saat eksitasi untuk memvisualisasikan interaksi antibodi-antigen. Banyak varian prosedur eksperimental telah dikembangkan, dan adalah umum untuk membangun tes menggunakan lebih dari satu antibodi untuk mendeteksi target yang diinginkan (lihat Gambar 3.xx C-D). Untuk lebih meningkatkan kemungkinan yang ditawarkan oleh format immunoassay, aplikasi berdasarkan microarray telah dikembangkan dan yang memungkinkan untuk mengukur lebih dari satu molekul dalam ruang reaksi tunggal (lihat di bawah).

    Desain Uji ELISA

    Penggunaan antibodi memungkinkan merancang eksperimen dengan berbagai cara untuk analisis yang dimaksudkan. Untuk mencapai hasil terbaik dari percobaan, reagen, aditif, dan larutan yang berbeda harus diuji kombinasi dan konsentrasinya yang optimal, waktu inkubasi dan jumlah siklus pencucian perlu dievaluasi dan disesuaikan. Hal ini untuk menghindari interaksi yang tidak diinginkan, yang mengganggu analisis untuk mendeteksi target yang diinginkan. Selain itu, mode bagaimana target diidentifikasi dan deteksi dapat dilakukan dalam beberapa cara, seperti yang dijelaskan pada Gambar 3.18

    Gambar 3.18. Pengaturan berbeda untuk ELISA dan Imunosay Lainnya. Dalam uji ELISA, antibodi dapat (A) mendeteksi antigen yang tidak bergerak, (B) menangkap antigen berlabel, (C) menangkap antigen yang tidak berlabel dan menggunakan antibodi berlabel kedua untuk mendeteksi antigen yang ditangkap, atau (D) menggunakan antibodi ketiga antibodi untuk deteksi, atau bahkan menggunakan dua antibodi untuk deteksi (E). Pelabelan langsung antibodi atau antigen seperti pada (A), (B), dan (C) adalah metode deteksi yang paling sederhana dan tercepat. Menggunakan antibodi sekunder sebagai metode deteksi, seperti yang ditunjukkan pada (D) dan (E), akan lebih meningkatkan sensitivitas dan selektivitas analisis. Metode yang digunakan dalam (D) juga memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar, sedangkan metode (E) lebih meningkatkan spesifisitas, karena tiga antibodi harus mengikat antigen untuk menghasilkan molekul reporter. Dari pengujian yang disajikan, konsep yang paling umum digunakan ditunjukkan pada (C) dan (D).

    Multiplexing

    Era baru dalam immunoassay dimulai dengan pengembangan teknologi yang disebut microarrays. Istilah microarray paling sering menggambarkan organisasi teratur tetesan volume kecil yang telah mengering pada area permukaan yang kecil. Dimensi reaksi diperkecil sehingga banyak pengujian dapat dilakukan dalam beberapa sampel secara paralel, beberapa ribu fitur berbeda dapat disajikan pada solusi sekitarnya. Ini berarti bahwa para ilmuwan dapat mengukur sejumlah besar molekul dengan satu percobaan tunggal. Ada kemungkinan untuk menggunakan slide kaca mikroskop dan robotika khusus yang menyimpan tetesan cairan yang sangat kecil (1 nl = 0,000000001 liter) pada permukaan kaca secara teratur. Ini meninggalkan bintik-bintik dengan diameter kurang dari satu milimeter (0,15 mm). Teknik umum lainnya untuk multiplexing adalah dengan menggunakan partikel yang lebih kecil dan berkode warna (diameter 0,005 mm). Partikel-partikel ini dapat dilapisi dengan antibodi untuk mengeluarkan analit dari larutan.

    Kepekaan

    Dalam banyak aplikasi penting untuk mengukur jumlah yang sangat kecil (kadang-kadang hanya jejak) dari sebuah molekul dalam sampel yang diberikan. Untuk mencapai sensitivitas yang diperlukan, kondisi percobaan perlu disesuaikan dengan antibodi, sistem deteksi, dan jenis sampel. Selain itu, ada kemajuan dalam penggunaan warna yang lebih baik, laser dan filter khusus amplifikasi sinyal, serta miniaturisasi ( Ekins & Edwards, 1997 ).

    Contoh spesifik

    Ada banyak contoh bagaimana tes ELISA dapat digunakan dalam penelitian dasar dan diagnostik klinis. Salah satu contoh spesifiknya adalah sensitifitas sandwich-type enzyme-linked immunoassay yang digunakan untuk menentukan jumlah protein prostate-specific antigen (PSA), yang merupakan biomarker yang digunakan untuk mendeteksi kanker prostat (Kuriyama et al., 1980).

    Tes microarray di sisi lain, sebelumnya telah menerima banyak perhatian untuk digunakan dalam analisis paralel molekul DNA dan RNA. Untuk menerjemahkan keuntungan mereka menjadi tes untuk analisis protein dengan antibodi, protokol dan rutinitas baru harus dikembangkan dan ditetapkan. Saat ini, ada teknik multipleks untuk mengukur jumlah protein dalam jenis sampel yang berbeda (misalnya sel, serum darah, urin), untuk menentukan bagaimana protein dimodifikasi dalam proses biologis (misalnya fosforilasi), atau untuk menggambarkan interaksi protein-protein tertentu. Contoh lain adalah analisis antibodi yang beredar dalam darah dari pasien. Aplikasi berbasis microarray juga telah dibuat untuk antibodi yang dimurnikan dan untuk mempelajari karakteristik pengikatan antibodi dan merupakan aspek penting saat menggunakan reagen pengikat sebagai reagen penelitian. Microarray protein tersebut dapat terdiri dari protein, fragmen protein, atau peptida kecil untuk menguji spesifisitas reagen pengikat. Mikroarray protein dapat mengungkapkan interaksi ke seluruh protein atau fragmen protein yang lebih besar, sedangkan mikroarray peptida menunjukkan bagian tertentu (epitop) dari protein yang diikat oleh antibodi. Hasil pemetaan epitop tipikal ditunjukkan pada Gambar 3.19 (Edfors et al., 2014). Mensintesis jutaan peptida yang tumpang tindih dengan hanya satu pergeseran residu asam amino pada susunan tersebut memungkinkan pemetaan wilayah pengikatan antibodi pada resolusi tinggi. Ini memberikan informasi yang sangat rinci tentang epitop linier (kontinu) yang dikenali oleh antibodi. Sama seperti dengan protein, fragmen protein atau antigen lainnya, perakitan peptida pada susunan juga dapat digunakan untuk studi reaktivitas antibodi dalam sampel plasma dari pasien dengan penyakit menular dan autoimun.

    Gambar 3.19. Pemetaan Epitop Antibodi Poliklonal. Antibodi poliklonal mengikat ke susunan peptida di mana hasilnya menampilkan empat epitop linier yang berbeda dan peptida tumpang tindih berurutan yang terikat. Sumbu X: peptida, sumbu Y: intensitas fluoresensi rata-rata (MFI). (Edfors et al., 2014)

    Kembali ke atas

    Western Blot

    Western Blot (WB) adalah metode umum untuk mendeteksi dan menganalisis protein.Itu dibangun di atas teknik yang melibatkan transfer, juga dikenal sebagai blotting, protein yang dipisahkan oleh elektroforesis dari gel ke membran di mana mereka dapat divisualisasikan secara khusus. Prosedur ini pertama kali dijelaskan oleh H. Towbin et al pada tahun 1979 ( Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979 ) dan dua tahun kemudian diberi nama oleh W. Neal Burnette ( Burnette, 1981 ). Towbin et al menjelaskan transfer elektroforesis protein dari gel poliakrilamida ke lembaran nitroselulosa di mana pola gel asli diperoleh secara akurat. Setup terdiri dari satu set standar tujuh langkah, Gambar 3.20.

    Gambar 3.20. Langkah-Langkah Standar dalam Western Blotting. Langkah-langkah standar melibatkan preparasi sampel (1), elektroforesis Gel (2), Blotting ke membran (3), pemeriksaan antibodi (4), Deteksi (5), Pencitraan (6) dan Analisis (7).

    Sampel disiapkan dan dimuat ke gel dan selama elektroforesis protein bermuatan negatif bergerak menuju anoda bermuatan positif. Untuk menganalisis lebih lanjut protein, mereka dipindahkan ke membran dalam prosedur yang disebut blotting. Setelah transfer, membran diblokir untuk mencegah interaksi protein-membran yang tidak diinginkan dalam langkah-langkah berikut. Untuk memvisualisasikan protein yang diinginkan, membran biasanya diperiksa terlebih dahulu menggunakan antibodi spesifik protein primer diikuti dengan antibodi sekunder berlabel yang digunakan untuk deteksi. Sebuah gambar diambil dari membran dan hasilnya dianalisis.

    Dengan menambahkan larutan penanda terpisah ke salah satu sumur dalam gel, dimungkinkan untuk memperkirakan ukuran protein selain interaksi antibodi yang digunakan untuk memverifikasi protein spesifik. Pemisahan pada gel tidak hanya karena ukuran tetapi juga sampai batas tertentu tergantung pada muatan molekul, daerah hidrofobik, dan tingkat denaturasi. Pengaturan percobaan dapat bervariasi dalam banyak cara untuk paling sesuai dengan penyelidikan spesifik. Saat menganalisis hasil, variasi antar lajur mengenai pemuatan dan kecepatan transfer antar blot, harus dipertimbangkan. Selain itu, hubungan non-linier dari sinyal yang dihasilkan di seluruh rentang konsentrasi sampel juga merupakan aspek pertimbangan ketika menafsirkan hasil. Hasil percobaan WB tergantung pada tiga faktor penting yaitu kemampuan antibodi untuk mengikat protein tertentu, kekuatan interaksi, dan konsentrasi protein yang diinginkan itu sendiri. Selain itu, spesifisitas pengikatan ke target dan reaktivitas silang yang rendah juga merupakan fitur penting. Bentuk hasil WB tidak selalu mudah untuk ditafsirkan karena ukuran protein dapat bervariasi dari berat teoritis karena modifikasi pascatranslasi, seperti glikosilasi, atau interaksi dengan protein lain. Namun, WB adalah metode yang sangat umum dan hampir semua antibodi komersial yang tersedia telah divalidasi menggunakan metode ini.

    Persiapan sampel

    Langkah pertama WB adalah menyiapkan sampel, mis. jaringan, sel, atau larutan lain, yang akan dianalisis. Biasanya jaringan perlu dipecah dengan pencampuran, homogenisasi, atau sonikasi. Buffer ditambahkan untuk melisiskan sel dan melarutkan protein dan seringkali inhibitor ditambahkan untuk mencegah denaturasi atau degradasi. Berbagai jenis metode filtrasi dan sentrifugasi diterapkan untuk mempersiapkan sampel lebih lanjut. Penting untuk menentukan konsentrasi protein total dari ekstrak yang dihasilkan agar dapat memuat jumlah tertentu pada gel untuk memungkinkan perbandingan antar sampel. Biasanya uji biokimia digunakan untuk menentukan konsentrasi protein. Ekstrak kemudian diencerkan dengan loading buffer yang terdiri dari gliserol dan pewarna (misalnya bromofenol biru). Gliserol digunakan untuk menyederhanakan pemuatan dengan menaikkan densitas ekstrak dan pewarna ditambahkan untuk memvisualisasikan sampel. Panas diterapkan pada sampel untuk memecah struktur protein, yang akan membantu menjaga muatan negatif dari netralisasi (Mahmood & Yang, 2012). Lebih disukai kontrol positif dan negatif disertakan dalam pengaturan untuk mengkonfirmasi identitas protein serta aktivitas antibodi.

    Elektroforesis gel

    Setelah preparasi sampel, ekstrak siap dimuat untuk memisahkan protein menurut ukurannya dengan elektroforesis gel. Medan listrik diterapkan di atas gel yang menyebabkan molekul bermuatan bergerak. Dalam WB gel poliakrilamida digunakan untuk pemisahan protein dan metode ini disebut elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE) bila menggunakan kondisi asli. Untuk kondisi denaturasi, natrium dodesil sulfat (SDS) ditambahkan ke sistem dan metode ini disebut SDS-PAGE. SDS mengikat protein dan membentuk misel bermuatan negatif di sekitar protein terlepas dari muatan yang melekat. Kondisi denaturasi melarutkan struktur tridimensi protein dan muatan protein menjadi relatif terhadap ukurannya sehingga pemisahan protein hanya berdasarkan ukuran. Saat menggunakan kondisi asli, mobilitasnya bergantung pada muatan dan ukuran hidrodinamik yang memungkinkan deteksi perubahan muatan karena degradasi kimia, perubahan konformasi karena pelipatan atau pembukaan, agregasi, atau peristiwa pengikatan lainnya.

    Gel biasanya terdiri dari dua bagian dengan kepadatan yang berbeda: (i) gel susun, dan (ii) gel pemisah, (Gambar 3.21). Perbedaan antara kedua bagian tersebut adalah pada pH dan konsentrasi gel. Dengan pH yang agak asam dan konsentrasi akrilamida yang lebih rendah, gel susun memisahkan protein dengan buruk tetapi memungkinkan mereka untuk membentuk pita tajam yang sangat jelas sebelum mereka memasuki gel pemisah. Dengan kondisi yang lebih mendasar dan konsentrasi gel yang lebih tinggi, gel pemisah membuat protein berdiferensiasi berdasarkan ukuran karena protein yang lebih kecil bergerak lebih cepat dalam gel daripada yang lebih besar. Gel pracetak nyaman digunakan, namun dimungkinkan untuk dicetak dengan tangan. Gel direndam dalam buffer dan sampel protein dan penanda dimuat ke sumur di gel. Tegangan diterapkan pada gel dan protein akan mulai bergerak ke bawah gel karena muatan listrik negatifnya. Memilih voltase yang tepat adalah penting karena voltase yang terlalu tinggi akan membuat gel terlalu panas dan mungkin merusak pita.

    Gambar 3.21. Gel Poliakrilamida Vertikal Khas dalam Penyangga

    Blotting ke membran

    Setelah elektroforesis gel, protein dipindahkan ke membran pendukung padat, yang merupakan langkah ketiga Western Blot. Dalam proses transfer tegangan diterapkan untuk mentransfer protein dari gel ke membran. Setup termasuk spons, kertas saring, gel, dan membran, yang ditempatkan di antara gel dan elektroda positif (Gambar 3.22). Ini memastikan migrasi protein bermuatan negatif dari gel ke membran. Ada tiga jenis membran: nitroselulosa, polivinilidena difluorida (PVDF), dan nilon. Meskipun membran nilon lebih unggul dalam beberapa aspek, pengikatan latar belakang yang tinggi dan pewarnaan ireversibel dari beberapa pewarna membuat jenis membran ini kurang umum dibandingkan dua alternatif lainnya. Keuntungan utama dari membran nitroselulosa adalah latar belakang yang rendah terlepas dari metode deteksi. Karena ukuran pori rata-rata yang relatif besar, membran nitroselulosa tidak boleh digunakan untuk transfer protein dengan berat molekul rendah. Selain itu, saat kering, membran menjadi rapuh yang membuatnya sulit untuk ditangani. Membran PVDF yang lebih stabil memungkinkan pelabelan ulang dan lebih nyaman untuk disimpan. Sifat hidrofobik PVDF menghasilkan kapasitas pengikatan protein yang tinggi, namun, sebagai konsekuensinya, latar belakangnya juga lebih tinggi.

    Gambar 3.22. Prosedur Transfer Western Blotting. Protein dalam gel dipindahkan ke membran dan sampel divisualisasikan melalui pemblokiran, penambahan antibodi, dan pencucian sesuai jadwal tertentu.

    Ada dua metode untuk blotting yang disebut basah dan semi-kering. Kondisi basah lebih disukai ketika transfer harus efisien dan memberikan kualitas tinggi mengenai pita yang jelas dan tajam. Selain itu, ini adalah pilihan yang lebih baik untuk transfer kompleks protein yang lebih besar. Gel, membran, dan kertas saring terendam seluruhnya dalam buffer selama transfer dan tidak ada risiko mengeringkan gel. Blotting semi-kering lebih cepat dan volume buffer yang dibutuhkan lebih sedikit. Namun, metode transfer ini biasanya kurang efisien, terutama untuk protein yang lebih besar, dan ada risiko panas berlebih dan pengeringan gel saat menggunakan waktu transfer yang diperpanjang.

    Pemeriksaan antibodi

    Langkah keempat dari WB adalah pemeriksaan antibodi. Untuk mencegah pengikatan antibodi yang tidak spesifik pada membran, daripada pengikatan spesifik pada protein yang diinginkan, suatu zat digunakan untuk memblokir situs residu pada membran. Zat yang umum digunakan adalah susu kering tanpa lemak, 5% Bovine Serum Albumin (BSA) yang diencerkan dalam Tris Buffered Saline Tween (TBST), serum kambing normal, kasein, atau gelatin ikan ( Mahmood & Yang, 2012 ). Susu mudah didapat dan murah, namun tidak cocok untuk semua label deteksi. Gelatin ikan memberikan latar belakang yang lebih rendah tetapi dapat menutupi beberapa protein serta menjadi buffer pemblokiran yang relatif mahal. BSA tidak mahal, sedangkan serum dapat mengandung imunoglobulin sehingga menimbulkan reaktivitas silang. Pemilihan agen pemblokiran yang cermat adalah kuncinya karena tidak ada buffer pemblokiran yang ideal untuk semua interaksi antigen-antibodi yang berbeda. Prosedur pemblokiran terdiri dari inkubasi membran dalam buffer pemblokiran yang sesuai selama satu jam atau lebih. Saat menggunakan waktu inkubasi yang lama, pemblokiran harus dilakukan pada +4°C untuk mengesampingkan risiko pewarnaan artefak atau latar belakang. Pemblokiran adalah keseimbangan yang halus antara mengurangi latar belakang tanpa mengurangi sinyal dari protein yang diinginkan.

    Membran yang tersumbat kemudian diinkubasi dengan antibodi primer. Antibodi diencerkan hingga konsentrasi yang sesuai dalam TBST, phosphate buffered saline (PBS), atau wash buffer. Lebih disukai untuk menginkubasi antibodi dengan BSA jika antibodi akan digunakan kembali. Setelah membran dicuci, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder yang berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder diberi label dengan reporter. Ketika menggunakan antibodi poliklonal sebagai antibodi sekunder, mungkin menimbulkan beberapa latar belakang. Dalam kasus pewarnaan latar belakang, antibodi sekunder dapat diblokir terlebih dahulu dengan serum non-imun dari inang tempat ia dihasilkan. Optimalisasi konsentrasi antibodi sekunder direkomendasikan karena variasi yang cukup luas antara antibodi serta sistem deteksi digunakan.

    Deteksi

    Pada langkah kelima dari WB, kompleks protein-antibodi-antibodi terdeteksi pada membran. Ada beberapa jenis pelabelan antibodi sekunder, mis. enzim, fluorofor, biotinilasi, konjugasi emas, dan radioisotop, seperti dicontohkan pada Gambar 3.23. Di antara enzim yang paling umum adalah HRP yang digunakan bersama dengan zat chemiluminescent, chemifluorescent, atau chromogenic. HRP memiliki spesifisitas substrat yang tinggi memberikan latar belakang yang rendah, stabil, dan murah. Dalam chemiluminescense, enzim HRP mengkatalisis oksidasi luminol dari reagen pendeteksi luminol peroksida. Reaksi multi-langkah menghasilkan emisi cahaya. Bahan kimia tertentu seperti fenol dapat meningkatkan cahaya yang dipancarkan. Metode langsung adalah penggunaan fluoresensi, fluorofor memancarkan cahaya setelah tereksitasi dan tidak diperlukan agen pendeteksi. Sangat cocok untuk kuantitatif Barat dan karena fluorofor yang berbeda memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda, dimungkinkan untuk melakukan multiplexing dan deteksi spesifik lebih dari satu protein pada saat itu. Menggunakan bahan kimia dan/atau enzim untuk menginduksi pembentukan fluorofor aktif dari substrat fluorogenik disebut kemifluoresensi. Untuk lebih meningkatkan intensitas sinyal, sistem berbasis biotin streptavidin dua langkah dapat digunakan. Konjugasi emas juga merupakan metode di mana protein berwarna merah tua karena akumulasi emas. Radioisotop juga dapat digunakan tetapi memerlukan penanganan khusus dan cukup mahal.

    Gambar 3.23. Sistem Reporter yang Berbeda.

    Pencitraan

    Pencitraan adalah langkah keenam dari WB dan penangkapan dapat dilakukan secara analog menggunakan film, atau dibuat secara digital dengan kamera CCD atau pemindai yang menangkap berbagai jenis sinyal yang dipancarkan. Perangkat pencitraan CCD memungkinkan kuantisasi dengan sensitivitas deteksi tinggi dan rentang linier yang luas tanpa limbah kimia atau kebutuhan untuk ruangan gelap. Ini dapat digunakan untuk mendeteksi membran, gel bernoda, atau untuk aplikasi sinar ultraviolet.

    Analisis

    Langkah terakhir dari WB adalah menganalisis hasilnya. Dalam aplikasi kualitatif yang khas, keberadaan protein yang diinginkan dikonfirmasi, jumlahnya diperkirakan dengan inspeksi visual, dan ukurannya ditentukan dengan perbandingan dengan penanda. Perbaikan dan pengembangan, terutama terhadap reagen deteksi yang sangat sensitif dan teknik pencitraan canggih, menjadikan WB alat yang potensial untuk analisis kuantitatif. Aplikasi kuantitatif memerlukan definisi jumlah protein secara relatif atau absolut. Beberapa faktor yang perlu dipertimbangkan seperti sensitivitas, stabilitas sinyal, rentang dinamis linier, normalisasi, dan rasio signal-to-noise. Minimum protein yang dapat dilihat dalam pengujian yang diberikan memberikan batas deteksi (LOD), dan batas intensitas sinyal yang dapat diandalkan digunakan untuk kuantifikasi yang tepat adalah batas kuantifikasi (LOQ). Faktor-faktor yang mempengaruhi istilah-istilah ini adalah kualitas dan konsentrasi antibodi serta waktu pemaparan ketika mempertimbangkan jumlah minimum protein yang terdeteksi. Sistem sinyal yang stabil memperluas jendela waktu untuk mencapai sensitivitas tinggi, eksposur ganda, dan kemungkinan untuk mendeteksi pita lemah. Rentang yang memungkinkan kuantisasi yang merata dan tepat di mana intensitas sinyal masih sebanding dengan jumlah protein disebut rentang dinamis linier. Penting untuk menghindari saturasi sinyal karena jumlah protein yang berlebihan atau konsentrasi antibodi yang tinggi. LOD rendah dan kuantisasi sinyal lemah dan kuat memberikan rentang dinamis linier yang luas. Protein yang diinginkan harus dinormalisasi ke referensi internal yang memungkinkan fluktuasi jumlah protein yang dimuat ke setiap sumur atau konsentrasi yang berbeda. Ini dapat dicapai dengan protein rumah tangga atau protein berduri. Rasio antara sinyal dan kebisingan penting untuk menghitung protein dengan benar. Ini sangat penting ketika mendeteksi pita lemah di mana latar belakang yang lebih tinggi diharapkan. Sebuah Western Blot khas terlihat pada Gambar 3.24.

    Gambar 3.24. Hasil Western Blot yang khas menggunakan antibodi terkonjugasi HRP dan kamera CCD.

    Kembali ke atas

    Imunohistokimia

    Imunohistokimia (IHC) adalah teknik berbasis mikroskop yang kuat untuk memvisualisasikan komponen seluler, misalnya protein atau makromolekul lain dalam sampel jaringan. Kekuatan IHC adalah output visual intuitif yang mengungkapkan keberadaan dan lokalisasi protein target dalam konteks berbagai jenis sel, keadaan biologis, dan/atau lokalisasi subseluler dalam jaringan kompleks.

    Teknik IHC ditemukan selama tahun 1940-an (Coons, Creech, & amp Jones, 1941) dan secara rutin digunakan sebagai alat penting dalam perawatan kesehatan dan patologi untuk mis. tujuan diagnostik atau untuk stratifikasi pasien untuk rezim pengobatan yang dioptimalkan. IHC juga banyak digunakan dalam penelitian di mana molekul yang menarik dianalisis untuk mempelajari perannya baik dalam sel dan jaringan yang sehat maupun yang sakit pada tingkat molekuler, seluler, atau jaringan. Ada banyak cara berbeda untuk melakukan visualisasi target dalam jaringan menggunakan metode berbasis IHC atau IHC, dan banyak protokol tersedia untuk berbagai aplikasi dan pengujian. Meskipun IHC umumnya merupakan metode yang kuat dan mapan, pengujian baru seringkali membutuhkan pengoptimalan yang cermat tergantung pada jaringan atau pada sifat protein target, molekul pengikat dan/atau sistem reporter. Bertahun-tahun pengembangan teknis dan ketersediaan yang sangat meningkat untuk molekul pengikat tertentu telah sangat meningkatkan kegunaan dan area aplikasi untuk IHC. Kemajuan di bidang teknik dan reagen berbasis IHC telah memungkinkan para ilmuwan dan penyedia layanan kesehatan dengan alat, pengujian, dan biomarker yang lebih tepat. Selain itu, kemajuan teknis telah memungkinkan mis. deteksi simultan yang sangat sensitif dari beberapa protein dalam sampel yang sama, dan deteksi interaksi protein-protein.

    Uji IHC klasik diilustrasikan pada Gambar 3.25 dan melibatkan deteksi epitop yang diekspresikan oleh target protein tunggal dalam sampel jaringan menggunakan "antibodi primer" yang mampu mengikat epitop tersebut dengan spesifisitas tinggi. Setelah peristiwa pengikatan epitop-antibodi, "antibodi sekunder" yang mampu mengikat antibodi primer dengan spesifisitas tinggi ditambahkan. Antibodi sekunder digabungkan ke molekul reporter dan setelah peristiwa pengikatan antibodi-antibodi, substrat kimia ditambahkan yang bereaksi dengan molekul reporter untuk menghasilkan endapan berwarna di lokasi seluruh kompleks epitop-antibodi.

    Gambar 3.25. Prinsip Dasar Imunohistokimia. Dalam ilustrasi skema, bagian jaringan tertanam parafin yang difiksasi formalin diwarnai menggunakan antibodi primer yang diarahkan ke target protein tertentu. Larutan yang mengandung antibodi primer ditambahkan ke bagian jaringan dan antibodi dibiarkan beberapa saat untuk menemukan dan mengikat targetnya. Setelah langkah ini, antibodi yang tidak terikat dan kelebihan dibersihkan dan antibodi sekunder ditambahkan. Antibodi sekunder, yang membawa molekul penghubung dengan enzim horseradish peroxidase (HRP), juga dibiarkan beberapa saat untuk berikatan dengan antibodi primer, diikuti dengan langkah pencucian lainnya. Setelah ini, 3,3' Diaminobenzidine (DAB) ditambahkan. Enzim HRP mengubah substrat DAB menjadi endapan kecoklatan yang disimpan dalam jaringan di lokasi reaksi, sehingga menghasilkan representasi visual di mana antibodi primer pertama kali mengikat targetnya.

    Persiapan tisu

    Jaringan memainkan peran sentral dalam percobaan dan penting untuk diproses sehingga epitop dan morfologi yang tepat dipertahankan. Pemrosesan yang paling umum untuk IHC adalah menyiapkan blok jaringan tertanam parafin tetap (FFPE) formalin. Tujuan fiksasi formalin adalah untuk menghasilkan ikatan silang kimiawi protein di dalam jaringan. Ini mengakhiri semua proses seluler dan membekukan komponen seluler di tempat dan dalam konformasi mereka pada saat fiksasi dan juga mencegah degradasi. Setelah fiksasi yang memadai, jaringan diproses lebih lanjut dan akhirnya tertanam dalam blok parafin, yang kemudian dipotong menjadi irisan tipis (biasanya 4-10 & mikrom) menggunakan mikrotom. Bagian-bagian tersebut dipindahkan ke slide kaca dan dibiarkan menempel sebelum diproses lebih lanjut.

    Metode lain untuk fiksasi selain formalin kadang-kadang digunakan. Ini termasuk jenis aldehida lain atau menggunakan larutan alkohol yang berbeda. Pilihan terbaik dari fiksatif sangat tergantung pada pengujian. Alternatif umum untuk FFPE adalah menyiapkan sampel jaringan beku.Dalam hal ini, jaringan tertanam dalam media cryoprotective dan dibekukan, dan fiksasi dilakukan setelah pemotongan. Jaringan beku dipotong dalam kriostat dan memiliki keuntungan dari waktu pemrosesan yang singkat dan pengawetan epitop sensitif yang lebih baik, tetapi seringkali dapat lebih rendah daripada jaringan FFPE dalam hal mempertahankan morfologi histologis.

    Pengambilan antigen (epitop)

    Kekhawatiran terkait dengan pengikat silang fiksatif seperti formalin, atau terlalu lama waktu yang dihabiskan dalam media fiksatif adalah masking epitop, yang dapat menghalangi antibodi primer untuk mengikat targetnya. Khususnya dengan sampel FFPE, seringkali ada kebutuhan untuk mengembalikan beberapa ikatan silang kimia dan "mengambil" epitop sebelum melanjutkan ke IHC yang sebenarnya. Ada beberapa protokol pengambilan antigen yang tersedia dan strategi utama termasuk memperlakukan slide jaringan dengan panas, enzim pencernaan, deterjen, atau kombinasinya. Metode yang paling umum untuk pengambilan antigen dalam sampel FFPE adalah dengan merebus slide jaringan dalam buffer sitrat asam selama sekitar 15-20 menit.

    Ikatan antibodi

    Kualitas dan spesifisitas molekul pengikat sangat penting untuk setiap teknik berbasis IHC, dan pilihan pengikat dapat secara langsung mempengaruhi hasil, keandalan, dan mungkin juga interpretasi pengujian. Antibodi sejauh ini merupakan jenis molekul pengikat yang paling umum digunakan untuk IHC, dan meskipun sebagian besar antibodi mampu mendeteksi molekul yang diinginkan secara memadai, mereka juga dapat sangat bervariasi dalam spesifisitasnya untuk target yang diinginkan. Oleh karena itu, antibodi dengan spesifisitas tinggi lebih dapat diandalkan saat menafsirkan pengikatan "on-target", karena mereka menghasilkan sedikit atau tidak ada pengikatan "off-target" atau "background". Antibodi yang kurang spesifik dapat menghasilkan lebih banyak ikatan di luar target, dan latar belakang yang dihasilkan mungkin akan mengganggu interpretasi yang benar dari sinyal tepat sasaran yang sebenarnya. Ada dua jenis utama antibodi yaitu antibodi poliklonal yang merupakan campuran heterogen dari antibodi yang mengikat epitop yang berbeda pada target dan antibodi monoklonal yang semuanya mengikat epitop yang sama. Antibodi poliklonal seringkali sangat kuat karena kemampuannya untuk mendeteksi dan mengikat banyak epitop pada target yang sama. Namun, epitop yang mereka ikat seringkali tidak terdefinisi dengan baik dan dengan kekhususan epitop yang beragam dan beragam, muncul kemungkinan peningkatan peristiwa pengikatan di luar target dan kebisingan latar belakang. Namun, potensi antibodi poliklonal dapat menguntungkan karena konsentrasi peristiwa pengikatan di sekitar molekul tepat sasaran biasanya melebihi potensi kebisingan latar belakang. Kekurangannya adalah antibodi poliklonal biasanya sumber daya yang terbatas karena berasal dari serum hewan. Antibodi monoklonal, sebaliknya, memiliki lebih banyak kontinuitas karena dapat diproduksi dalam garis sel hibridoma. Antibodi monoklonal juga sering didefinisikan dengan baik dalam hal pengikatan epitop, tetapi masih dapat menghasilkan hasil yang sulit untuk ditafsirkan jika spesifisitasnya rendah atau jika epitop target hadir dalam kelimpahan yang rendah.

    Optimalisasi dan titrasi konsentrasi antibodi yang hati-hati untuk setiap pengujian diperlukan, karena hasilnya tidak hanya bergantung pada spesifisitas dan afinitas antibodi terhadap target, tetapi juga pada konsentrasi dan ketersediaan epitop tepat sasaran dan potensial di luar sasaran yang ada di Sampel. Menambahkan terlalu banyak antibodi ke sampel akan meningkatkan jumlah kemungkinan peristiwa pengikatan off-target afinitas rendah setelah epitop on-target jenuh dengan pengikat. Dengan menurunkan konsentrasi antibodi, peristiwa pengikatan di luar target menjadi lebih jarang karena biasanya memiliki afinitas yang lebih rendah daripada peristiwa pengikatan tepat sasaran. Risiko ketika mencoba untuk mengurangi latar belakang saat menggunakan antibodi afinitas rendah adalah bahwa sinyal sesuai target secara bersamaan melemah ke titik memberikan hasil negatif palsu.

    Jenis molekul pengikat lain yang kadang-kadang digunakan dalam teknik berbasis IHC termasuk affibodi, peptida, fragmen antibodi atau molekul kecil lainnya.

    Sistem deteksi

    Seluruh tujuan melakukan IHC adalah untuk mendapatkan representasi visual di mana target dapat ditemukan dalam jaringan eksperimental, dan sebaiknya juga mendapatkan informasi tentang pola ekspresi target di antara populasi sel heterogen dan/atau lokalisasi subseluler. Ini dicontohkan pada Gambar 3.26, yang menggambarkan bagaimana antibodi yang berbeda digunakan untuk memvisualisasikan kompartemen seluler atau jaringan yang berbeda dalam jaringan yang kompleks. Untuk memvisualisasikan interaksi target-antibodi, diperlukan semacam sistem deteksi yang menghasilkan noda atau sinyal yang dapat diamati. Metode yang paling umum untuk memperkenalkan sistem deteksi pada percobaan adalah dengan menggunakan antibodi sekunder yang membawa molekul reporter yang terikat sebelumnya, yaitu enzim atau fluorofor. Antibodi sekunder biasanya ditargetkan secara khusus terhadap molekul antibodi dari spesies hewan yang berbeda. Misalnya, jika antibodi primer dibangkitkan pada kelinci, maka antibodi sekunder harus dibangkitkan pada hewan lain dan ditargetkan secara khusus terhadap antibodi kelinci.

    Gambar 3.26. Memvisualisasikan target protein yang berbeda dalam jaringan yang kompleks. Kolom kanan menunjukkan perbesaran gambar yang sesuai di kolom kiri. Pada gambar IHC, bagian berurutan dari kerongkongan manusia yang diwarnai menggunakan empat antibodi berbeda memungkinkan perbandingan langsung pola ekspresi protein yang berbeda di dalam jaringan dan di dalam kompartemen subseluler. Gambar atas hanya counterstained untuk hematoxylin untuk perbandingan. Antibodi p63 menodai inti sel dalam populasi sel yang berada di bagian basal epitel esofagus. Antibodi EGFR (Epidermal growth factor receptor) tampaknya menodai populasi sel yang sama seperti p63, tetapi menodai membran seluler alih-alih inti. Antibodi G6PD (Glukosa-6-fosfat dehidrogenase) menodai sitoplasma dari sel-sel epitel esofagus yang lebih luas dan juga sel-sel yang berada di jaringan ikat. Antibodi Laminin (LAMB2) hanya menodai sel dan struktur di jaringan ikat yang mendasari kerongkongan.

    Untuk sampel jaringan FFPE, metode deteksi yang paling umum adalah dengan menggunakan reaksi enzimatik untuk menghasilkan endapan berwarna di tempat pengikatan antibodi. Antibodi sekunder kemudian membawa enzim, mis. horseradish peroxidase (HRP) atau alkaline phosphatase (AP), yang mampu mengubah chromogens seperti 3,3' Diaminobenzidine (DAB) atau 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/ p-nitroblue tetrazolium chloride (BCIP/NBT ) menjadi endapan coklat atau kebiruan yang disimpan dalam jaringan di tempat reaksi. Noda kromogenik dapat diamati dalam mikroskop cahaya dan biasanya sangat stabil dalam jangka waktu yang lama, yang bermanfaat jika eksperimen perlu diarsipkan atau ditinjau di lain waktu.

    Untuk bagian jaringan beku, lebih umum menggunakan antibodi sekunder terkait fluorofor yang memancarkan warna tertentu (biasanya hijau, merah, atau biru) ketika dieksitasi oleh panjang gelombang cahaya yang benar. Selain itu, fluorofor biasanya tidak stabil untuk jangka waktu yang lama. Namun, manfaat menggunakan fluorofor adalah bahwa mereka menyediakan metode yang mudah untuk melakukan eksperimen pelabelan ganda di mana beberapa antibodi terhadap beberapa target diuji dalam sampel yang sama. Antibodi sekunder perlu ditargetkan terhadap antibodi primer yang berbeda dan juga untuk digabungkan ke fluorofor yang berbeda. Antibodi sekunder yang berbeda kemudian diamati secara terpisah dengan menariknya secara berurutan dengan panjang gelombang cahaya yang berbeda. Hasil eksitasi yang berbeda ini disimpan sebagai gambar terpisah (atau saluran warna) dan nantinya dapat dihamparkan untuk menyimpulkan ko-lokalisasi protein, dll.

    Menggunakan antibodi sekunder pembawa reporter untuk deteksi itu sendiri merupakan langkah amplifikasi karena beberapa antibodi sekunder mampu mengikat antibodi primer tunggal, tetapi terkadang langkah amplifikasi lebih lanjut diperlukan untuk meningkatkan sinyal dan sensitivitas percobaan. Dalam kasus seperti itu, antibodi sekunder malah dapat membawa "molekul penghubung", misalnya polimer biotin, yang mampu merekrut lebih banyak molekul reporter dalam langkah selanjutnya. Strategi untuk memperkuat sinyal ini berguna untuk metode deteksi enzimatik dan fluoresen.

    Counterstaining

    Pewarnaan imunohistokimia menggunakan chromogens sering mendapat manfaat dari penerapan counterstain yang meningkatkan kontras dan memfasilitasi pengamatan fitur histologis. Jenis counterstain yang paling umum digunakan untuk sampel FFPE adalah hematoxylin yang menodai sitoplasma seluler dengan warna pucat kebiruan, dan menodai inti sel dengan nuansa kebiruan yang lebih gelap, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.26. Pewarnaan fluorescent biasanya tidak diimbangi dengan hematoxylin, karena metode deteksi tidak didasarkan pada mikroskop cahaya. Sebaliknya, cara yang paling umum untuk mendapatkan counterstaining untuk fluoresensi adalah dengan memberi label inti sel dengan menambahkan pewarna fluoresen yang mengikat asam nukleat, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.27. Setelah reaksi imunohistokimia yang sebenarnya, satu-satunya langkah yang tersisa adalah menutup dan menyegel sampel untuk perlindungan dan penyimpanan jangka panjang. Cara yang paling umum adalah dengan "lem" kaca penutup ke sampel menggunakan resin buatan yang tersedia secara komersial.

    Gambar 3.27 Sel endotel di bawah mikroskop. Nukleus diwarnai biru dengan DAPI, mikrotubulus ditandai hijau oleh antibodi yang terikat pada FITC dan filamen aktin diberi label merah dengan phalloidin yang terikat pada TRITC. Sel endotel arteri pulmonalis sapi

    Gambar dari NIH ImageJ-Programmpaket

    Contoh spesifik

    IHC banyak digunakan dalam penelitian dan praktik klinis. Proyek Human Protein Atlas (HPA) adalah contoh utama bagaimana IHC dengan throughput tinggi digunakan untuk mencapai pemetaan skala besar proteom manusia di banyak jaringan, kanker, dan sel. Dalam proyek HPA, rantai produksi antibodi skala besar internal yang disederhanakan memfasilitasi pembuatan antibodi spesifik, yang setelah melewati rezim karakterisasi dan validasi dasar, digunakan untuk secara sistematis menodai microarray jaringan yang berisi ratusan inti jaringan dalam satu percobaan. Sistem untuk IHC yang digunakan oleh HPA sangat bergantung pada standarisasi protokol dan otomatisasi menggunakan mesin, tetapi evaluasi titrasi optimal untuk setiap antibodi dilakukan secara manual sebelum antibodi disetujui untuk pewarnaan pada jaringan lengkap. Setiap inti jaringan yang diwarnai dianotasi sehubungan dengan pewarnaan imunohistokimia dalam jaringan dan jenis sel, dan setelah itu diterbitkan sebagai gambar resolusi tinggi di portal web untuk dilihat secara bebas oleh siapa saja.

    Dalam praktik klinis, IHC terutama digunakan dalam patologi untuk membantu dokter mengevaluasi spesimen jaringan sehubungan dengan keadaan sehat dan atau sakit, untuk menetapkan diagnosis, dan untuk menentukan subtipe molekuler dari berbagai jenis kanker. Contoh spesifik di mana IHC digunakan secara diagnostik adalah ketika ahli patologi disajikan dengan sampel tumor metastatik dan asal jaringan tumor primer tidak diketahui. Dalam kasus ini, ahli patologi menggunakan panel antibodi berbeda yang menargetkan protein spesifik jaringan, seperti antigen spesifik prostat untuk kanker prostat, atau reseptor estrogen untuk kanker ginekologi, atau sitokeratin 20 untuk kanker gastrointestinal (Gremel et al., 2014). Setelah klasifikasi luas dibuat, antibodi spesifik jaringan tambahan digunakan untuk menentukan lebih lanjut asal tumor primer. Informasi ini berguna untuk memilih strategi terbaik atau paling tepat untuk terapi obat dan/atau untuk menemukan tumor primer untuk terapi radiasi dan/atau pembedahan.

    Kembali ke atas

    3.3 Sintesis dan Pengurutan Protein

    Sintesis Protein Fase Padat

    Peptida disintesis secara kimia melalui reaksi kondensasi gugus karboksil dari satu asam amino dengan gugus amino yang lain. Strategi gugus pelindung biasanya diperlukan untuk mencegah reaksi samping yang tidak diinginkan dengan berbagai rantai samping asam amino. Sintesis peptida kimia paling sering dimulai pada ujung karboksil peptida (C-terminus), dan berlanjut ke amino-terminus (N-terminus). Biosintesis protein (peptida panjang) pada organisme hidup terjadi dalam arah yang berlawanan. Sintesis kimia memfasilitasi produksi peptida yang sulit diekspresikan pada bakteri, penggabungan asam amino yang tidak alami, modifikasi tulang punggung peptida/protein, dan sintesis protein-D, yang terdiri dari asam-asam amino-D.

    Metode yang ditetapkan untuk produksi peptida sintetis di laboratorium dikenal sebagai sintesis peptida fase padat (SPPS). Dipelopori oleh Robert Bruce Merrifield, SPPS memungkinkan perakitan cepat rantai peptida melalui reaksi berturut-turut dari turunan asam amino pada pendukung berpori yang tidak larut.

    Dukungan padat terdiri dari manik-manik resin polimer kecil yang difungsikan dengan gugus reaktif (seperti gugus amina atau hidroksil) yang terhubung ke rantai peptida yang baru lahir. Karena peptida tetap terikat secara kovalen pada penyangga selama sintesis, reagen berlebih dan produk samping dapat dihilangkan dengan pencucian dan penyaringan. Pendekatan ini menghindari isolasi peptida produk yang relatif memakan waktu dari larutan setelah setiap langkah reaksi, yang akan diperlukan bila menggunakan sintesis fase larutan konvensional.

    Setiap asam amino yang akan digabungkan ke rantai peptida N-terminus harus dilindungi pada N-terminus dan rantai sampingnya menggunakan gugus pelindung yang sesuai seperti Boc (labil asam) atau Fmoc (labil basa), tergantung pada rantai samping dan strategi perlindungan yang digunakan (lihat di bawah).

    Prosedur SPPS umum adalah salah satu siklus berulang dari reaksi deproteksi dan kopling terminal-N alternatif. Resin dapat dicuci di antara setiap langkah. Pertama asam amino digabungkan ke resin. Selanjutnya, amina dideproteksi, dan kemudian digabungkan dengan asam bebas dari asam amino kedua. Siklus ini berulang sampai urutan yang diinginkan telah disintesis. Siklus SPPS juga dapat mencakup langkah pembatasan yang menghalangi ujung asam amino yang tidak bereaksi agar tidak bereaksi. Pada akhir sintesis, peptida mentah dibelah dari pendukung padat sekaligus menghilangkan semua gugus pelindung menggunakan reagen asam kuat seperti asam trifluoroasetat atau nukleofil. Peptida mentah dapat diendapkan dari pelarut non-polar seperti dietil eter untuk menghilangkan produk samping yang larut organik. Peptida mentah dapat dimurnikan menggunakan HPLC fase terbalik. Proses pemurnian, terutama peptida yang lebih panjang dapat menjadi tantangan, karena sejumlah kecil beberapa produk sampingan, yang sangat mirip dengan produk tersebut, harus dihilangkan. Untuk alasan ini apa yang disebut proses kromatografi kontinu seperti MCSGP semakin banyak digunakan dalam pengaturan komersial untuk memaksimalkan hasil tanpa mengorbankan tingkat kemurnian.

    SPPS dibatasi oleh hasil reaksi, dan biasanya peptida dan protein dalam kisaran 70 asam amino mendorong batas aksesibilitas sintetis. Kesulitan sintetik juga bergantung pada sekuens. Biasanya, sekuens rawan agregasi seperti amiloid sulit dibuat. Panjang yang lebih panjang dapat diakses dengan menggunakan pendekatan ligasi seperti ligasi kimia asli, di mana dua peptida sintetik yang sepenuhnya terdeproteksi dapat digabungkan bersama dalam larutan.

    Gambar 3.28 Sintesis fase padat dari dipeptida menggunakan resin amida (difungsikan amina). Grup pelindung terminal-N (PG) dapat berupa Fmoc atau Boc, tergantung pada skema grup pelindung yang digunakan. Rantai samping asam amino (R1, R2 dll.) dilindungi secara ortogonal.

    Urutan Protein menggunakan Degradasi Edman

    Degradasi Edman, yang dikembangkan oleh Pehr Edman, adalah metode pengurutan asam amino dalam peptida. Dalam metode ini, residu terminal amino diberi label dan dibelah dari peptida tanpa mengganggu ikatan peptida antara residu asam amino lainnya.

    Gambar 3.29 Skema Degradasi Edman. Dalam metode ini, Fenil isothiocyanate direaksikan dengan gugus amino terminal-N yang tidak bermuatan, dalam kondisi basa ringan, untuk membentuk siklus feniltiokarbamoil turunan. Kemudian, di bawah kondisi asam, turunan dari asam amino terminal ini dibelah sebagai turunan tiazolinon. Asam amino tiazolinon kemudian diekstraksi secara selektif ke dalam pelarut organik dan diolah dengan asam untuk membentuk turunan asam amino feniltiohidantoin (PTH) yang lebih stabil yang dapat diidentifikasi dengan menggunakan kromatografi atau elektroforesis. Prosedur ini kemudian dapat diulangi lagi untuk mengidentifikasi asam amino berikutnya.

    Kelemahan utama degradasi Edman adalah bahwa peptida yang diurutkan dengan cara ini tidak dapat memiliki lebih dari 50 hingga 60 residu (dan dalam praktiknya, di bawah 30). Panjang peptida terbatas karena derivatisasi siklis tidak selalu selesai. Masalah derivatisasi dapat diselesaikan dengan memecah peptida besar menjadi peptida yang lebih kecil sebelum melanjutkan reaksi. Ia mampu secara akurat mengurutkan hingga 30 asam amino dengan mesin modern yang mampu menghasilkan efisiensi lebih dari 99% per asam amino. Keuntungan dari degradasi Edman adalah hanya menggunakan 10 - 100 pico-mol peptida untuk proses sequencing. Reaksi degradasi Edman diotomatisasi pada tahun 1967 oleh Edman dan Beggs untuk mempercepat proses dan 100 perangkat otomatis digunakan di seluruh dunia pada tahun 1973.

    Karena degradasi Edman berasal dari N-terminus protein, itu tidak akan bekerja jika N-terminus telah dimodifikasi secara kimia (misalnya dengan asetilasi atau pembentukan asam piroglutamat). Pengurutan akan berhenti jika ditemukan asam non-&alfa-amino (misalnya asam isoaspartat), karena zat antara cincin beranggota lima yang disukai tidak dapat dibentuk. Degradasi Edman umumnya tidak berguna untuk menentukan posisi jembatan disulfida. Ini juga membutuhkan jumlah peptida 1 picomole atau lebih untuk hasil yang terlihat.

    Setelah 2D SDS PAGE, protein dapat ditransfer ke membran blotting polyvinylidene difluoride (PVDF) untuk analisis lebih lanjut. Degradasi Edman dapat dilakukan langsung dari membran PVDF. Urutan residu N-terminal yang menghasilkan lima hingga sepuluh asam amino mungkin cukup untuk mengidentifikasi Protein of Interest (POI).

    Analisis urutan dengan Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry.

    Spektrometri massa adalah teknik untuk menganalisis dengan akurasi tinggi komposisi berbagai unsur kimia dan isotop atom yang membelah inti atomnya menurut rasio massa-muatannya (m/z). Ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi unsur-unsur kimia yang berbeda yang membentuk suatu senyawa atau untuk menentukan kandungan isotop dari unsur-unsur yang berbeda dalam senyawa yang sama.

    Spektrometri massa proteinmengacu pada penerapan spektrometri massa untuk mempelajari protein. Spektrometri massa adalah metode penting untuk penentuan massa yang akurat dan karakterisasi protein, dan berbagai metode dan instrumentasi telah dikembangkan untuk banyak kegunaannya.Aplikasinya meliputi identifikasi protein dan modifikasi pasca-translasinya, penjelasan kompleks protein, subunit dan interaksi fungsionalnya, serta pengukuran global protein dalam proteomik. Ini juga dapat digunakan untuk melokalisasi protein ke berbagai organel, dan menentukan interaksi antara protein yang berbeda serta dengan lipid membran.

    Dua teknik yang sering digunakan dengan sampel biologis cair dan padat: ionisasi semprotan elektro dan desorpsi/ionisasi laser berbantuan matriks laser (MALDI). Dalam analit ionisasi MALDI yang dikokristalisasi dengan matriks yang sesuai diubah menjadi ion oleh aksi laser. Sumber ionisasi ini biasanya dikaitkan dengan time of flight analyzer (TOF) di mana ion-ion dipisahkan menurut muatan massanya setelah dipercepat dalam medan listrik. Akhirnya, detektor spektrometer massa merekam muatan yang diinduksi atau arus yang dihasilkan ketika ion melewati atau menyentuh permukaan. Spektrum massa dicatat untuk setiap protein (Gambar 3.30).

    Gambar 3.30. Identifikasi protein oleh MALDI-TOF MS. Alur kerja identifikasi protein mengembangkan uji MALDI-TOF MS (A), diikuti oleh fragmentasi peptida MS/MS (B) dan analisis data spektral dengan algoritma pencarian database MASCOT (C).

    Secara umum, protein dianalisis baik dalam pendekatan "top-down" di mana protein dianalisis utuh, atau pendekatan "bottom-up" di mana protein pertama kali dicerna menjadi fragmen. Pendekatan menengah "tengah-bawah" di mana fragmen peptida yang lebih besar dianalisis kadang-kadang juga dapat digunakan. Namun pendekatan top-down sebagian besar terbatas pada studi protein tunggal dengan throughput rendah karena masalah yang terlibat dalam menangani protein utuh, heterogenitasnya, dan kompleksitas analisisnya.

    Pada pendekatan kedua, disebut sebagai MS "bottom-up", protein dicerna secara enzimatik menjadi peptida yang lebih kecil menggunakan protease seperti tripsin. Tripsinadalah protease serin dari superfamili klan PA, ditemukan dalam sistem pencernaan banyak vertebrata, di mana ia menghidrolisis protein. Tripsin memotong rantai peptida terutama pada sisi karboksil asam amino lisin atau arginin, kecuali jika salah satunya diikuti oleh prolin. Ini digunakan untuk berbagai proses bioteknologi. Proses ini biasanya disebut sebagai proteolisis tripsin atau tripsinisasi, dan protein yang telah dicerna/diperlakukan dengan tripsin dikatakan telah mengalami tripsinisasi.

    Selanjutnya, peptida ini dimasukkan ke dalam spektrometer massa dan diidentifikasi dengan sidik jari massa peptida atau spektrometri massa tandem. Oleh karena itu, pendekatan ini menggunakan identifikasi pada tingkat peptida untuk menyimpulkan keberadaan protein yang disatukan kembali dengan de novo deteksi ulang. Fragmen yang lebih kecil dan lebih seragam lebih mudah untuk dianalisis daripada protein utuh dan juga dapat ditentukan dengan akurasi tinggi, oleh karena itu pendekatan "dari bawah ke atas" ini merupakan metode studi yang disukai dalam proteomik. Pendekatan lebih lanjut yang mulai berguna adalah pendekatan menengah "tengah-bawah" di mana peptida proteolitik yang lebih besar daripada peptida triptik tipikal dianalisis.

    Protein yang diinginkan biasanya merupakan bagian dari campuran kompleks beberapa protein dan molekul, yang hidup berdampingan dalam media biologis. Ini menghadirkan dua masalah signifikan. Pertama, dua teknik ionisasi yang digunakan untuk molekul besar hanya bekerja dengan baik ketika campuran mengandung jumlah konstituen yang kira-kira sama, sedangkan dalam sampel biologis, protein yang berbeda cenderung hadir dalam jumlah yang sangat berbeda. Jika campuran seperti itu diionisasi menggunakan electrospray atau MALDI, spesies yang lebih banyak memiliki kecenderungan untuk "menenggelamkan" atau menekan sinyal dari yang kurang melimpah. Kedua, spektrum massa dari campuran kompleks sangat sulit untuk ditafsirkan karena banyaknya jumlah komponen campuran. Hal ini diperparah oleh fakta bahwa pencernaan enzimatik protein menimbulkan sejumlah besar produk peptida.

    Mengingat masalah ini, metode elektroforesis gel satu dan dua dimensi dan kromatografi cair kinerja tinggi banyak digunakan untuk pemisahan protein. Metode pertama memfraksinasi seluruh protein melalui elektroforesis gel dua dimensi (Gambar 3.31). Dimensi pertama gel 2D adalah pemfokusan isoelektrik (IEF). Dalam dimensi ini, protein dipisahkan oleh titik isoelektriknya (pI) dan dimensi kedua adalah elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE). Dimensi ini memisahkan protein menurut berat molekulnya. Setelah langkah ini selesai, pencernaan in-gel terjadi.

    Dalam beberapa situasi, mungkin perlu untuk menggabungkan kedua teknik ini. Bintik-bintik gel yang diidentifikasi pada Gel 2D biasanya disebabkan oleh satu protein. Jika identitas protein diinginkan, biasanya metode pencernaan in-gel diterapkan, di mana tempat protein yang diinginkan dipotong, dan dicerna secara proteolitik. Massa peptida yang dihasilkan dari pencernaan dapat ditentukan dengan spektrometri massa menggunakan sidik jari massa peptida. Jika informasi ini tidak memungkinkan identifikasi protein yang tegas, peptidanya dapat dikenakan spektrometri massa tandem untuk de novo pengurutan. Perubahan kecil dalam massa dan muatan dapat dideteksi dengan 2D-PAGE. Kelemahan teknik ini adalah rentang dinamisnya yang kecil dibandingkan dengan metode lain, beberapa protein masih sulit untuk dipisahkan karena keasaman, kebasaan, hidrofobisitas, dan ukurannya (terlalu besar atau terlalu kecil).

    Metode kedua, kromatografi cair kinerja tinggi digunakan untuk memfraksinasi peptida setelah pencernaan enzimatik. Karakterisasi campuran protein menggunakan HPLC/MS disebut juga shotgun proteomic dan MuDPIT (Multi-Dimensional Protein Identification Technology). Campuran peptida yang dihasilkan dari pencernaan campuran protein difraksinasi dengan satu atau dua langkah kromatografi cair. Eluen dari tahap kromatografi dapat langsung dimasukkan ke spektrometer massa melalui ionisasi elektrospray, atau diletakkan pada serangkaian titik kecil untuk analisis massa selanjutnya menggunakan MALDI.

    Gambar 3.31 Skema Protein Fingerprinting dengan Spektrometri Massa. Campuran protein dibuat dari kultur sel atau sampel tussie dan dipisahkan dengan elektroforesis gel. Protein tunggal diisolasi dan dicerna menggunakan tripsin untuk menghasilkan campuran peptida. Peptida dipisahkan dengan kromatografi cair dan dianalisis dengan spektrometri massa

    Kembali ke atas

    3.4 Penjelasan Struktur Protein

    Kristalografi Sinar-X

    Kristalografi Sinar-X Protein adalah teknik yang digunakan untuk mendapatkan struktur tiga dimensi dari protein tertentu dengan difraksi sinar-X dari bentuk kristalnya. Struktur tiga dimensi ini sangat penting untuk menentukan fungsionalitas protein. Membuat kristal menciptakan kisi di mana teknik ini menyelaraskan jutaan molekul protein bersama-sama untuk membuat pengumpulan data lebih sensitif. Ini seperti mendapatkan setumpuk kertas, mengukur lebarnya dengan penggaris, dan membagi panjang itu dengan jumlah halaman untuk menentukan lebar satu lembar kertas. Dengan teknik rata-rata ini, tingkat kebisingan berkurang dan rasio sinyal terhadap kebisingan meningkat. Spesifisitas situs aktif dan situs pengikatan protein sepenuhnya bergantung pada konformasi protein yang tepat. Selain struktur protein, molekul biologis lainnya dapat diselidiki menggunakan kristalografi sinar-X. Itu adalah kristalografi sinar-X oleh Rosalind E.Franklin, yang memungkinkan J.D. Watson dan F.H.C. Crick untuk mengetahui struktur heliks ganda DNA.

    Kristalografi sinar-X dapat mengungkapkan struktur tiga dimensi terperinci dari ribuan protein. Tiga komponen dalam analisis kristalografi sinar-X adalah kristal protein, sumber sinar-X, dan detektor.

    Kristalografi sinar-X digunakan untuk menyelidiki struktur molekul melalui pertumbuhan kristal padat dari molekul yang mereka pelajari. Ahli kristalografi mengarahkan sinar-X bertenaga tinggi ke kristal kecil yang mengandung triliunan molekul identik. Kristal menyebarkan sinar-X ke detektor elektronik. Detektor elektronik adalah jenis yang sama yang digunakan untuk menangkap gambar dalam kamera digital. Setelah setiap ledakan sinar-X, yang berlangsung dari beberapa detik hingga beberapa jam, para peneliti secara tepat memutar kristal dengan memasukkan orientasi yang diinginkan ke dalam komputer yang mengontrol peralatan sinar-X. Hal ini memungkinkan para ilmuwan untuk menangkap dalam tiga dimensi bagaimana kristal menyebarkan, atau mendifraksikan, sinar-X. Intensitas setiap sinar terdifraksi dimasukkan ke dalam komputer, yang menggunakan persamaan matematika untuk menghitung posisi setiap atom dalam molekul yang mengkristal. Hasilnya adalah gambar digital tiga dimensi dari molekul tersebut (Gambar 3.32).

    Ahli kristalografi mengukur jarak antar atom dalam angstrom. &ldquoruler&rdquo yang sempurna untuk mengukur jarak angstrom adalah sinar-X. Sinar-X yang digunakan oleh ahli kristalografi memiliki panjang sekitar 0,5 hingga 1,5 angstrom, yang merupakan ukuran yang tepat untuk mengukur jarak antar atom dalam molekul. Jika radiasi memiliki panjang gelombang yang jauh lebih besar atau jauh lebih kecil daripada panjang ikatan ikatan kovalen, cahaya tidak akan terdifraksi dan tidak ada pengetahuan baru tentang struktur yang akan diperoleh. Itulah mengapa sinar-X digunakan.

    Gambar 3.32 Alur Kerja untuk Memecahkan Struktur Molekul dengan Kristalografi Sinar-X

    Gambar dari Thomas Splettstoesser

    Prosesnya dimulai dengan mengkristalkan protein yang diinginkan. Kristalisasi protein menyebabkan semua atom protein diorientasikan dengan cara yang tetap terhadap satu sama lain sambil tetap mempertahankan konformasi aktif biologisnya - persyaratan untuk difraksi sinar-X. Protein harus diendapkan atau diekstraksi dari larutan. Aturan praktis di sini adalah untuk mendapatkan protein semurni mungkin untuk menumbuhkan banyak kristal (ini memungkinkan kristal memiliki sifat bermuatan, dan distribusi muatan permukaan untuk hasil hamburan yang lebih baik). 4 langkah penting yang dilakukan untuk mencapai kristalisasi protein, yaitu:

    1. Memurnikan protein. Tentukan kemurnian protein dan jika tidak murni (biasanya >99%), maka harus menjalani pemurnian lebih lanjut.
    2. Harus mengendapkan protein. Biasanya dilakukan dengan melarutkan protein dalam pelarut yang sesuai (larutan penyangga air dengan garam organik seperti 2-metil-2,4-pentanadiol). Jika protein tidak larut dalam buffer air atau buffer organik air maka deterjen seperti natrium lauril sulfat harus ditambahkan.
    3. Solusinya harus dibawa ke jenuh (mengembunkan protein dari sisa pelarut membentuk inti kondensasi). Hal ini dilakukan dengan menambahkan garam ke larutan pekat protein, mengurangi kelarutannya dan membiarkan protein membentuk kristal yang sangat terorganisir (proses ini disebut salting out). Metode lain termasuk kristalisasi batch, kristalisasi cair-cair, difusi uap, dan dialisis.
    4. Biarkan kristal yang sebenarnya tumbuh. Karena kristal inti terbentuk, ini akan menghasilkan pertumbuhan kristal yang sebenarnya.

    Kristal kemudian dibombardir dengan sinar-X, pola difraksi direkam, dan struktur dikonfigurasi ulang dari pola difraksi menggunakan Transformasi Fourier. Melalui Transformasi Fourier, distribusi kerapatan elektron diilustrasikan sebagai rangkaian bentuk dan garis paralel yang ditumpuk di atas satu sama lain (garis kontur), seperti peta medan. Pemetaan tersebut memberikan representasi tiga dimensi dari kerapatan elektron yang diamati melalui kristalografi sinar-x. Saat menafsirkan peta kerapatan elektron, resolusi perlu diperhitungkan. Resolusi 5Å - 10Å dapat mengungkapkan struktur rantai polipeptida, 3Å - 4Å kelompok atom, dan 1Å - 1,5Å atom individu. Resolusi dibatasi oleh struktur kristal dan untuk protein sekitar 2Å.

    Banyak kemajuan dalam penemuan obat dan obat-obatan sebagian besar disebabkan oleh X-Ray Crystallography dengan mengidentifikasi target obat pada banyak penyakit yang berkembang saat ini. Pada akhir 80-an misalnya, para ilmuwan membuat terobosan dalam menggunakan X-Ray Crystallography untuk menghasilkan struktur HIV Protease, enzim yang penting untuk siklus hidup retrovirus. Enzim memotong untaian protein virus yang merupakan komponen utama sel virus yang belum matang menjadi protein matang yang terpisah yang dapat terus membentuk partikel virus yang lebih matang dan menular. Dengan melihat lebih dekat pada strukturnya, khususnya simetrinya, para peneliti mulai membuat senyawa yang berinteraksi dengan sisi aktif enzim, yang berada di tengah bagian simetrisnya, untuk mematikan enzim dan mencegahnya berfungsi dengan baik. Hebatnya, pada pertengahan 90-an, tiga obat HIV Protease inhibitor berada di pasar, secara drastis mengurangi tingkat kematian virus AIDS (Gambar 3.33).

    Gambar 3.33. Struktur kristal D-enansiomer dari PR HIV-1 rekayasa tulang punggung disiapkan secara totalsintesis kimia yang dikomplekskan dengan inhibitor D-MVT101. (a) Kokristal diperoleh dari 50% amonium sulfat, pH 5,4, pada gugus ruang P212121a = 67,5, b = 92,8, c = 29,4 Å. Terdapat dua monomer protein dan satu inhibitor pada unit asimetrik kristalografi. (b) Pandangan stereo tracing C&alpha dari D HIV-1 PR. Inhibitor Bound D MVT-101 ditampilkan sebagai tongkat hijau. Koordinat disimpan ke HIV Structural Database48 kode akses: NCI2009

    Kembali ke atas

    Pencitraan Resonansi Magnetik Nuklir (NMR)

    Spektroskopi resonansi magnetik nuklir protein (biasanya disingkat protein NMR) adalah bidang biologi struktural di mana spektroskopi NMR digunakan untuk memperoleh informasi tentang struktur dan dinamika protein, dan juga asam nukleat, dan kompleksnya. Bidang ini dipelopori oleh Richard R. Ernst dan Kurt Wüthrich di ETH, dan oleh Ad Bax, Marius Clore, dan Angela Gronenborn di NIH, antara lain. Penentuan struktur dengan spektroskopi NMR biasanya terdiri dari beberapa fase, masing-masing menggunakan seperangkat teknik yang sangat khusus. Sampel disiapkan, pengukuran dibuat, pendekatan interpretatif diterapkan, dan struktur dihitung dan divalidasi.

    NMR melibatkan sifat mekanik kuantum dari inti pusat ("nucleus") dari atom. Sifat-sifat ini bergantung pada lingkungan molekuler lokal, dan pengukurannya memberikan peta tentang bagaimana atom-atom itu terikat secara kimia, seberapa dekat mereka di ruang angkasa, dan seberapa cepat mereka bergerak terhadap satu sama lain. Sifat-sifat ini pada dasarnya sama dengan yang digunakan dalam pencitraan resonansi magnetik (MRI) yang lebih dikenal, tetapi aplikasi molekuler menggunakan pendekatan yang agak berbeda, sesuai dengan perubahan skala dari milimeter (yang menarik bagi ahli radiologi) menjadi nanometer (atom terikat adalah biasanya sebagian kecil dari nanometer terpisah). Perubahan skala ini membutuhkan sensitivitas deteksi dan stabilitas yang jauh lebih tinggi untuk pengukuran jangka panjang. Berbeda dengan MRI, studi biologi struktural tidak secara langsung menghasilkan gambar, tetapi mengandalkan perhitungan komputer yang kompleks untuk menghasilkan model molekul tiga dimensi.

    Saat ini sebagian besar sampel diperiksa dalam larutan dalam air, tetapi metode sedang dikembangkan untuk juga bekerja dengan sampel padat. Pengumpulan data bergantung pada penempatan sampel di dalam magnet yang kuat, mengirimkan sinyal frekuensi radio melalui sampel, dan mengukur penyerapan sinyal tersebut. Tergantung pada lingkungan atom dalam protein, inti atom individu akan menyerap frekuensi yang berbeda dari sinyal radio. Lebih lanjut, sinyal absorpsi dari inti yang berbeda dapat terganggu oleh inti yang berdekatan. Informasi ini dapat digunakan untuk menentukan jarak antar inti. Jarak ini pada gilirannya dapat digunakan untuk menentukan keseluruhan struktur protein.

    Sebuah studi khas mungkin melibatkan bagaimana dua protein berinteraksi satu sama lain, mungkin dengan maksud untuk mengembangkan molekul kecil yang dapat digunakan untuk menyelidiki interaksi biologis normal ("biologi kimia") atau untuk memberikan kemungkinan petunjuk untuk penggunaan farmasi (pengembangan obat). Seringkali, pasangan protein yang berinteraksi mungkin telah diidentifikasi oleh studi genetika manusia, menunjukkan interaksi dapat terganggu oleh mutasi yang tidak menguntungkan, atau mereka mungkin memainkan peran kunci dalam biologi normal organisme "model" seperti lalat buah, ragi, cacing C. elegan, atau tikus.

    Resonansi magnetik inti protein dilakukan pada sampel air dari protein yang sangat murni. Biasanya, sampel terdiri dari antara 300 dan 600 mikroliter dengan konsentrasi protein dalam kisaran 0,1 &ndash 3 milimolar. Sumber protein dapat berupa alami atau diproduksi dalam sistem produksi menggunakan teknik DNA rekombinan melalui rekayasa genetika. Protein yang diekspresikan secara rekombinan biasanya lebih mudah diproduksi dalam jumlah yang cukup, dan metode ini memungkinkan pelabelan isotop.

    Protein yang dimurnikan biasanya dilarutkan dalam larutan buffer dan disesuaikan dengan kondisi pelarut yang diinginkan. Sampel NMR disiapkan dalam tabung kaca berdinding tipis. (Gambar 3.34)

    Gambar 3.34 Sampel NMR Disiapkan dalam Tabung Kaca Berdinding Tipis

    Dengan protein yang tidak berlabel, prosedur yang biasa adalah merekam satu set eksperimen resonansi magnetik nuklir homonuklear dua dimensi melalui spektroskopi korelasi (COSY), yang beberapa jenisnya termasuk spektroskopi korelasi konvensional, korelasi total spektroskopi (TOCSY) dan spektroskopi efek Overhauser nuklir (NOESY). Eksperimen resonansi magnetik nuklir dua dimensi menghasilkan spektrum dua dimensi. Satuan dari kedua sumbu adalah pergeseran kimia. Magnetisasi transfer COZY dan TOCSY melalui ikatan kimia antara proton yang berdekatan (Gambar 3.35). Eksperimen spektroskopi korelasi konvensional hanya mampu mentransfer magnetisasi antar proton pada atom yang berdekatan, sedangkan pada eksperimen spektroskopi korelasi total proton hanya mampu meneruskan magnetisasi, sehingga ditransfer di antara semua proton yang dihubungkan oleh atom yang berdekatan. Jadi dalam spektroskopi korelasi konvensional, proton alfa mentransfer magnetisasi ke proton beta, proton beta mentransfer ke proton alfa dan gamma, jika ada, maka proton gamma mentransfer ke proton beta dan delta, dan proses berlanjut. . Dalam spektroskopi korelasi total, alfa dan semua proton lainnya dapat mentransfer magnetisasi ke beta, gamma, delta, epsilon jika mereka dihubungkan oleh rantai proton yang berkesinambungan. Rantai proton yang berkelanjutan adalah rantai samping dari asam amino individu.

    Jadi kedua percobaan ini digunakan untuk membangun apa yang disebut sistem spin, yaitu membangun daftar resonansi dari pergeseran kimia proton peptida, proton alfa dan semua proton dari setiap rantai samping residu. Pergeseran kimia mana yang sesuai dengan inti mana dalam sistem spin ditentukan oleh konektivitas spektroskopi korelasi konvensional dan fakta bahwa berbagai jenis proton memiliki pergeseran kimia yang khas.Untuk menghubungkan berbagai spinsystem secara berurutan, eksperimen spektroskopi efek Overhauser nuklir harus digunakan. Karena percobaan ini mentransfer magnetisasi melalui ruang, itu akan menunjukkan puncak silang untuk semua proton yang dekat dalam ruang terlepas dari apakah mereka berada dalam sistem putaran yang sama atau tidak. Residu tetangga secara inheren dekat dalam ruang, sehingga penugasan dapat dibuat oleh puncak di NOESY dengan sistem putaran lainnya.

    Gambar 3.35: Perbandingan spektrum 2D COZY dan TOCSY untuk asam amino seperti glutamat atau metionin. TOCSY menunjukkan crosspeaks diagonal antara semua proton dalam spektrum, tetapi COZY hanya memiliki crosspeaks antara tetangga.

    Salah satu masalah penting menggunakan resonansi magnetik nuklir homonuklear adalah tumpang tindih antara puncak. Ini terjadi ketika proton yang berbeda memiliki pergeseran kimia yang sama atau sangat mirip. Masalah ini menjadi lebih besar ketika protein menjadi lebih besar, sehingga resonansi magnetik nuklir homonuklear biasanya terbatas pada protein atau peptida kecil.

    Jika protein rekombinan dapat diproduksi, protein yang dihasilkan dapat diberi label dengan Nitrogen-15 atau dengan Karbon-13 untuk memungkinkan eksperimen yang lebih rinci, seperti spektroskopi koherensi kuantum tunggal heteronuklear (HSQC). Percobaan 15N yang paling sering dilakukan adalah HSQC 1 H-15 N. Eksperimen ini sangat sensitif dan oleh karena itu dapat dilakukan dengan relatif cepat. Hal ini sering digunakan untuk memeriksa kesesuaian protein untuk penentuan struktur menggunakan NMR, serta untuk optimasi kondisi sampel. Ini adalah salah satu rangkaian standar percobaan yang digunakan untuk penentuan struktur larutan protein. HSQC dapat dikembangkan lebih lanjut menjadi eksperimen NMR tiga dan empat dimensi, seperti 15 N-TOCSY-HSQC dan 15 N-NOESY-HSQC (Gambar 3.36).

    1 H&ndash 15 N Spektrum HSQC dari fragmen protein berlabel isotop NleG3-2. Setiap puncak dalam spektrum mewakili pasangan N-H yang terikat, dengan dua koordinatnya yang sesuai dengan pergeseran kimia masing-masing atom H dan N. 1 H&ndash 15 N Spektrum HSQC dari fragmen protein berlabel isotop NleG3-2. Setiap puncak dalam spektrum mewakili pasangan N-H yang terikat, dengan dua koordinatnya yang sesuai dengan pergeseran kimia masing-masing atom H dan N.

    Gambar 3.36 1 Spektrum HSQC H&ndash 15 N dari sebuah fragmen protein berlabel isotop NleG3-2. Setiap puncak dalam spektrum mewakili pasangan N-H yang terikat, dengan dua koordinatnya yang sesuai dengan pergeseran kimia masing-masing atom H dan N.

    Gambar dari: Wu, B., et. Al. (2010) PLoS Patogen 6(6):e1000960.

    Mikroskop cryo-elektron

    Mikroskop kriogenik-elektron (cryo-EM) baru-baru ini muncul sebagai teknik yang kuat dalam biologi struktural yang mampu memberikan peta kepadatan resolusi tinggi dari struktur makromolekul (Gbr. 3.37). Resolusi mendekati 1,5 Å sekarang dimungkinkan dan peta dalam rentang 1&ndash4-Å menginformasikan konstruksi model atomistik dengan tingkat kepercayaan yang tinggi. Kapasitas baru bagi peneliti untuk menentukan struktur makromolekul pada resolusi tinggi dan tanpa perlu kristalogenesis telah menyebabkan ledakan minat dalam mengadopsi cryo-EM.

    Suspensi protein dibekukan pada jaringan pendukung mikroskop transmisi-elektron (TEM) berdiameter 3 mm yang terbuat dari bahan konduktif (misalnya Cu atau Au) yang dilapisi dengan film karbon dengan susunan perforasi reguler berdiameter 1&ndash2&mum. Sebanyak 3&ndash5 &mul sampel dimasukkan ke dalam kisi-kisi yang kemudian segera disemprot dengan kertas saring dengan tujuan untuk membuat lapisan penyangga/protein pada kisi-kisi yang, ketika dibekukan, akan cukup tipis untuk ditembus oleh berkas elektron. Mengoptimalkan ketebalan es merupakan langkah penting dalam preparasi sampel karena lapisan es yang lebih tebal meningkatkan kemungkinan bahwa elektron yang datang akan mengalami beberapa peristiwa hamburan dan dengan demikian mengurangi kualitas gambar. Dalam kasus ketebalan es yang ekstrim, berkas elektron tidak menembus sama sekali. Setelah blotting, kisi-kisi dengan cepat dicelupkan ke dalam rendaman cairan etana&mdasha kriogen yang sangat efektif yang membekukan air dengan kecepatan yang cukup untuk mencegah pembentukan kristal es. Pembentukan lapisan es vitreous adalah langkah mendasar dalam cryo-EM dan mempertahankan target dalam keadaan hampir asli. Lapisan es vitreous yang dihasilkan dengan molekul protein tersuspensi kemudian harus tetap dekat dengan suhu nitrogen cair (&minus&tipis196 °C) selama penyimpanan dan pencitraan dalam TEM untuk mencegah perubahan fase pada jenis es lain yang tidak dapat menerima pencitraan berkualitas tinggi dan pengawetan protein struktur.

    Pembentukan gambar di cryo-EM terutama oleh kontras fase, meskipun antara 7 dan 10% kontras gambar berasal dari kontras amplitudo. Kontras amplitudo, di mana elektron dihamburkan sedemikian rupa sehingga dihilangkan oleh aperture atau filter energi di sepanjang jalur kolom TEM, umumnya tidak dipertimbangkan, karena informasi yang diperoleh biasanya beresolusi rendah dibandingkan dengan kontras fase.

    Gambar 3.37 Mikroskop Cryo-Electron. (a) Pusat Skotlandia untuk Pencitraan Makromolekul JEOL CryoARM 300. (b) Struktur resolusi 2.2-Å resolusi tinggi dari lumazine synthase.

    Keuntungan dan Kerugian Penjelasan Struktur

    Mendapatkan sampel protein murni, sangat terkonsentrasi (mM) adalah hambatan utama untuk kristalografi sinar-x dan NMR. Konsentrasi tinggi diperlukan karena kedua teknik tidak sensitif terhadap analisis molekul tunggal, dan populasi protein tertentu yang besar diperlukan untuk mengatasi penghalang signal-to-noise. Pada catatan yang sama sampel harus sangat homogen, sehingga pemurnian protein diperlukan di beberapa titik. Cryo-EM membutuhkan protein yang jauh lebih sedikit daripada dua metode lainnya, tetapi masih 'banyak' menurut standar apa pun. Biasanya, Cryo-EM memerlukan sediaan pada konsentrasi 1 mg/ml dalam volume minimal 50 &mul, sedangkan kristalogenesis mungkin memerlukan 500 &mul protein pada konsentrasi 5 -10 mg/ml. Cryo-Em juga membutuhkan protein untuk disiapkan dalam buffer rendah garam, dengan aditif minimal, untuk memastikan pembekuan dan kontras gambar yang baik.

    Produksi protein rekombinan menggunakan E. coli adalah metode pilihan ketika sejumlah besar protein diperlukan. Proses ini melibatkan pengambilan gen (seringkali cDNA) dari protein yang diinginkan, menyambungkannya menjadi vektor yang dapat diinduksi yang sesuai, mengubah vektor menjadi E. coli tuan rumah, dan menumbuhkan budaya dalam media yang kaya. Tuan rumah bakteri akan berkembang biak selama fase pertumbuhan, setelah itu diinduksi untuk mengekspresikan protein yang diinginkan. Jika semuanya berjalan dengan baik, protein akan diekspresikan secara larut dan dalam jumlah yang tinggi. Sayangnya, proses ini lebih mudah diucapkan daripada dilakukan. Banyak protein eukariotik tidak terekspresi dengan baik pada inang prokariotik, dan seringkali modifikasi perlu dilakukan untuk mengoptimalkan inang bakteri, penggunaan kodon, media, dll. untuk mendapatkan hasil protein rekombinan yang layak. Selain itu, protein sering diekspresikan secara tidak larut sebagai badan inklusi dan membutuhkan konsentrasi tinggi (2M hingga 8M) denaturan seperti urea atau guanidin hidroklorida untuk melarutkannya, dan kemudian dialisis bertahap ke dalam buffer yang sesuai untuk melipatnya kembali. Atau, organisme eukariotik seperti S. cerevisiae (ragi), garis sel serangga dan mamalia dapat digunakan, terutama ketika modifikasi pasca-terjemahan diperlukan, meskipun penurunan hasil dan peningkatan biaya keseluruhan umum terjadi pada organisme ini.

    Kesulitan produksi protein diperparah untuk NMR oleh fakta bahwa semua protein harus berlabel 15 N dan/atau 13 C, karena hanya isotop-isotop ini yang memiliki nukleus dengan keadaan putaran + ½ dan -½ yang memungkinkan transisi energi yang diperlukan untuk frekuensi radio Sinyal NMR mencatat bahwa 1 H juga memiliki status spin & frac12 tetapi sangat melimpah.

    Stabilitas protein merupakan masalah untuk kristalografi dan NMR. Setelah protein diekspresikan, dimurnikan, dan dipekatkan, protein harus mempertahankan integritas strukturalnya selama percobaan. Untuk kristalografi, ini melibatkan proses kristalisasi, di mana sampel protein ditempatkan dalam berbagai larutan (paling sering melibatkan konsentrasi tinggi polietilen glikol) yang menginduksi kristalisasi. Sering disebut sebagai teknik voodoo, kondisi kristalisasi diuji dalam metode throughput tinggi menggunakan pelat penyaringan 96-sumur, dan setiap pukulan lebih dioptimalkan menggunakan volume yang lebih besar dari larutan tertentu. Sementara kondisi kristalisasi pada akhirnya dapat ditemukan, prosesnya dapat berlangsung dari beberapa hari hingga bahkan satu atau dua tahun untuk terjadi, menjadikan proses kristalisasi sebagai langkah pembatas laju untuk kristalografer protein. Selama ini, protein harus tetap berada dalam larutan dan mempertahankan strukturnya sehingga menghasilkan kristal berkualitas tinggi suatu kondisi yang tidak sering terjadi.

    Demikian pula, sampel protein yang stabil dan sangat terkonsentrasi diperlukan untuk melakukan banyak eksperimen NMR yang lebih maju. Ini karena banyak dari eksperimen ini membutuhkan waktu berhari-hari dan bahkan berminggu-minggu, di mana homogenitas larutan adalah kunci untuk memperoleh spektrum berkualitas. Jika protein terbuka atau mengendap dari larutan selama percobaan, perubahan kimia yang dihasilkan tidak akan menghasilkan sinyal apa pun, atau sinyal yang tidak dapat digunakan untuk penentuan struktur/dinamika.

    Untuk Cryo-EM, bekerja dengan spesimen beku-hidrat membawa sejumlah tantangan baik untuk manipulasi dan pencitraan. Saat menangani kisi cryo-EM untuk memuatnya ke mikroskop, paparan uap air atmosfer dengan cepat menyebabkan penumpukan es di kisi. Di bawah TEM, kristal es di permukaan grid ini muncul sebagai batu besar yang benar-benar menghalangi berkas elektron. Dengan demikian, kisi-kisi disimpan di bawah nitrogen cair sebanyak mungkin untuk meminimalkan kontaminasi embun beku. Masalah dengan kondisi es sering terjadi&mdashin pembekuan cepat yang cukup mengarah pada pembentukan es heksagonal, sementara devitrifikasi terjadi ketika sampel memanas, yang mengarah pada pembentukan es kubik . Berbagai tingkat kontaminasi dapat terjadi, dan pembekuan pada tekanan atmosfer menyebabkan pengendapan kristal es yang disebutkan di atas, sementara kontaminasi di dalam kolom atau di bawah kondisi vakum rendah menimbulkan artefak yang lebih halus.

    Salah satu keunggulan kristalografi protein adalah ukurannya tidak menjadi masalah. Apakah seseorang bekerja dengan protein monomer 25 kDa, atau kompleks multimerik 900 kDa, jika dapat dikristalisasi dan menghasilkan pola difraksi resolusi tinggi, strukturnya dapat ditentukan. Hal ini disebabkan fakta bahwa sekali dalam bentuk kristal, protein berada dalam konformasi yang kurang lebih statis yang, setelah melewati sinar x-ray pada sudut yang berbeda, dapat menghasilkan model struktural tunggal. Cryo-EM serupa dalam hal ini. Struktur yang sangat besar, termasuk kompleks nukleoprotein masif, seperti ribosom, dapat dijelaskan menggunakan Cryo-EM. Hal yang sama tidak dapat dikatakan untuk NMR.

    Dalam NMR, protein dalam keadaan larut dan karena itu dalam gerakan konstan. Pergerakan paling penting yang mengatur kualitas spektral adalah kecepatan jatuh molekul. Untuk protein yang lebih besar dari sekitar 40 kDa, laju tumbling menurun secara signifikan, yang pada gilirannya meningkatkan laju relaksasi transversal (T2). Pada dasarnya, ini menghasilkan sinyal NMR yang lebih lemah dan cepat membusuk, yang memanifestasikan dirinya dalam pelebaran puncak dan tumpang tindih spektral.

    Salah satu keuntungan utama dari NMR adalah kemampuannya untuk merekam dinamika protein skala kecil dan besar, sebuah fenomena yang umumnya ditekan ketika protein dikristalisasi. Meskipun protein yang mengkristal dapat menunjukkan sejumlah gerakan di dalam kisi, gerakan tersebut memanifestasikan dirinya sebagai gangguan statis atau dinamis, yang pertama dapat menghasilkan dua konformasi berbeda dari wilayah tertentu, dan yang terakhir dalam kerapatan elektron rata-rata. Secara umum, kristalisasi dapat membatasi fleksibilitas dan gerakan alami protein. Cryo-EM mengalami keterbatasan yang sama karena sampel dibekukan dan tidak bergerak. Namun, cryo-EM mampu menangkap snap shot dari struktur asli karena pembekuan terjadi seketika dan tidak memerlukan pembentukan kisi kristal.

    Kristalografi, bagaimanapun, tidak ditinggalkan dalam dingin ketika datang ke analisis struktur dinamis. Kristalografi time-resolved dapat digunakan untuk memantau perubahan struktur protein pada penambahan beberapa ligan, atau perubahan lingkungan. Karena semua kristal protein sangat terhidrasi, mereka dapat berfungsi sebagai wadah untuk beberapa reaksi biokimia. Kristal biasanya direndam dalam larutan yang mengandung ligan yang diinginkan untuk memulai reaksi biokimia, setelah itu kristal dengan cepat ditempatkan ke dalam balok-garis dan pola difraksi diperoleh. Ini dapat dilakukan beberapa kali jika perlu untuk mendapatkan berbagai intermediet struktural. Prosesnya membutuhkan banyak hal untuk berjalan dengan benar: protein tidak dapat menjadi tidak teratur atau kristal menjadi retak selama proses perendaman, dan sinkrotron bertenaga tinggi diperlukan untuk mengumpulkan data difraksi berkualitas tinggi dalam waktu pemaparan yang singkat.

    Pada akhirnya, kristalografi sinar-X protein, spektroskopi cryo-EM dan NMR bukanlah teknik yang saling eksklusif yang dapat dengan mudah diambil di mana yang lain gagal. Dalam menganalisis eksperimen dinamika NMR, misalnya, seseorang dapat memperoleh manfaat besar dari data struktur kristal yang ada, atau data cryo-EM di mana data struktural NMR dapat ditumpangkan. Demikian pula, data struktur NMR dapat digunakan untuk melengkapi cryo-EM atau struktur kristal dengan informasi lebih lanjut tentang dinamika protein, informasi pengikatan, dan perubahan konformasi dalam larutan.

    Kembali ke atas

    3.5 Analisis Proteom

    Proteom adalah seluruh rangkaian protein yang diproduksi atau dimodifikasi oleh suatu organisme atau sistem. Proteomik telah memungkinkan identifikasi jumlah protein yang terus meningkat. Ini bervariasi dengan waktu dan persyaratan yang berbeda, atau tekanan, yang dialami sel atau organisme. Proteomik adalah domain interdisipliner yang mendapat banyak manfaat dari informasi genetik dari berbagai proyek genom, termasuk Proyek Genom Manusia. Ini mencakup eksplorasi proteom dari tingkat keseluruhan komposisi protein, struktur, dan aktivitas. Ini adalah komponen penting dari genomik fungsional.

    Setelah genomik dan transkriptomik, proteomik adalah langkah selanjutnya dalam studi sistem biologis. Ini lebih rumit daripada genomik karena genom suatu organisme kurang lebih konstan, sedangkan proteom berbeda dari sel ke sel dan dari waktu ke waktu. Gen yang berbeda diekspresikan dalam tipe sel yang berbeda, yang berarti bahwa bahkan set dasar protein yang diproduksi dalam sel perlu diidentifikasi.

    Di masa lalu, fenomena ini dinilai dengan analisis RNA, tetapi ditemukan tidak memiliki korelasi dengan kandungan protein. Sekarang diketahui bahwa mRNA tidak selalu diterjemahkan menjadi protein, dan jumlah protein yang diproduksi untuk sejumlah mRNA tertentu tergantung pada gen yang ditranskripsi dari dan pada keadaan fisiologis sel saat ini. Proteomik mengkonfirmasi keberadaan protein dan memberikan ukuran langsung dari jumlah yang ada.

    Sebuah sel dapat membuat set protein yang berbeda pada waktu yang berbeda atau dalam kondisi yang berbeda, misalnya selama perkembangan, diferensiasi sel, siklus sel, atau karsinogenesis. Kompleksitas proteom yang semakin meningkat, seperti yang disebutkan, sebagian besar protein mampu menjalani berbagai modifikasi pasca-translasi.

    Oleh karena itu, studi proteomik dapat menjadi kompleks dengan sangat cepat, bahkan jika topik studi dibatasi. Dalam pengaturan yang lebih ambisius, seperti ketika biomarker untuk subtipe kanker tertentu dicari, ilmuwan proteomik mungkin memilih untuk mempelajari beberapa sampel serum darah dari beberapa pasien kanker untuk meminimalkan faktor pengganggu dan memperhitungkan kebisingan eksperimental. Lebih lanjut, banyak protein mengalami modifikasi pascatranslasi seperti fosfoirlasi. Banyak dari modifikasi pasca-translasi ini sangat penting untuk fungsi protein. Dengan demikian, desain eksperimental yang rumit terkadang diperlukan untuk menjelaskan kompleksitas dinamis dari proteom.

    3.6 Referensi

    Molnar, C. dan Gair, J. (2013) Antibodi. Bab dalam Konsep dalam Biologi, Diterbitkan oleh B.C. Buka Proyek Buku Teks. Tersedia di: https://opentextbc.ca/biology/chapter/23-3-antibodies/

    Proyek Atlas Manusia. (2019) Metode. Tersedia di: https://www.proteinatlas.org/learn/method

    Uhlén M et al, 2015. Peta berbasis jaringan dari proteom manusia. Sains
    PubMed: 25613900 DOI: 10.1126/science.1260419


    Kromatografi Afinitas (AC)

    Kromatografi afinitas adalah proses multi-langkah (pengikatan, pencucian, elusi) yang ditandai dengan pengikatan spesifik molekul target ke bahan kolom. Oleh karena itu, ligan fase diam harus dicocokkan dengan molekul target. Dalam langkah pencucian, semua bagian sampel yang tidak terikat secara spesifik dihilangkan. Langkah elusi berikutnya melepaskan molekul target.


    Hasil

    FliC dalam Persiapan Protein Dari UPEC CFT073 dan MC4100

    Kami awalnya menilai hasil dan kemurnian relatif FliC dalam ekstrak dari lisat sel utuh dan preparat protein yang diperkaya flagela yang dihasilkan oleh pemotongan fisik, filtrasi, dan ultrasentrifugasi. Analisis western blot dari lisat sel utuh yang dibuat dari UPEC CFT073 dan MC4100 (ditumbuhkan dalam media cair) menggunakan anti-flagellin antisera menunjukkan tidak ada pita yang berbeda untuk CFT073 atau MC4100 (yang tidak beroperasi flhDC) (Barembruch dan Hengge, 2007). Pengenalan pMG600 (mengandung flhDC gen dari serratia) ke MC4100 menghasilkan pita untuk FliC (繀 kDa) yang menunjukkan pemulihan ekspresi flagela dalam galur ini (Gambar 2A).

    Gambar 2. Deteksi FliC di seluruh sel lisat UPEC CFT073 dan MC4100 E. coli. (A) Western blot untuk FliC menggunakan lisat sel utuh CFT073 Wt (jalur 1), MC4100 (jalur 2), dan MC4100+pflhDC (jalur 3 jalur 繀 kDa). Lisis sel berasal dari kultur cairan bakteri dan direaksikan dengan anti-flagellin pool antiserum tipe-H. Ekspresi berlebihan flagela di MC4100+pflhDC menghasilkan deteksi FliC. (B) Western blot untuk FliC menggunakan preparat protein yang diperkaya untuk flagela menggunakan metode fisik geser, filtrasi dan ultrasentrifugasi. Ditampilkan: preparat CFT073 Wt yang diperkaya flagela (masing-masing protein jalur 1𠄲 1.0, dan 2.5 μg, pita 繠 kDa), MC4100 (jalur 3 tanpa pita), MC4100+pflhDC (4 band 繀, 繠 kDa), CFT073ΔfliC (5 tanpa pita), dan MC4100+pflhDC lisat sel utuh dibuat dari 0,25% kultur agar lunak (6 pita 繀 kDa). (C) Gel SDS-PAGE yang diwarnai Coomassie dari sampel protein yang ditunjukkan digunakan untuk Western blot. M, Penanda.

    Analisis selanjutnya dari preparat protein yang diperkaya untuk flagela dengan metode fisik menunjukkan pita untuk CFT073 (繠 kDa) dan pemulihan serupa ekspresi flagela di MC4100 melalui pengenalan pflhDC dalam trans selain pita FliC dengan ukuran yang diharapkan (繀 kDa) di MC4100 pflhDC pengayaan flagela mengungkapkan pita dengan ukuran yang setara dibandingkan dengan CFT073 (繠 kDa) bersama dengan pita kecil (Gambar 2B). Tidak ada pita yang terdeteksi dalam sediaan protein yang diperkaya untuk flagela yang berasal dari CFT073ΔfliC (Gambar 2B).

    Lisis sel utuh yang dibuat menggunakan agar lunak 0,25% meningkatkan ekspresi flagela dan mengungkapkan pita yang kuat untuk FliC tetapi kontaminan protein yang menonjol (Gambar 2B, C). Penambahan protease inhibitor memiliki efek yang dapat diabaikan dalam hal proteolisis, seperti yang diamati dalam penelitian sebelumnya (Lu et al., 2013). Proses agitasi dalam tabung microcentrifuge yang mengandung bantalan bola tidak memiliki efek yang dapat dideteksi pada kelangsungan hidup E. coli, dengan 3 eksperimen independen yang membandingkan budaya “pre-” dan “post-𠇚gitasi yang menunjukkan jumlah c.f.u. (nilai rata-rata ± SEM “pre-” = 2.28 ± 0.1 × 108 cfu mL 𢄡 vs. “post-” 2.24 ± 0.1 × 108 mL 𢄡 ). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan (i) ekspresi FliC diberikan ke MC4100 oleh flhDC dipasok dalam trans, (ii) pengayaan flagela menghasilkan populasi dominan 繠 kDa (CFT073/pflhDC) dan 繀 kDa (MC4100/pflhDC), dan (iii) kultur cair lebih unggul daripada kultur agar lunak untuk memperkaya FliC karena kemurnian yang lebih tinggi, tetapi memberikan hasil keseluruhan yang lebih rendah karena ekspresi flagela yang lebih sedikit (bahkan di bawah kondisi kultur yang menggabungkan IPTG untuk menginduksi flhDC ekspresi dalam CFT073/pflhDC).

    Pemurnian FliC Dari CFT073㥄 dan Identifikasi Protein yang dimurnikan bersama

    Metode yang dijelaskan di atas mencapai kemurnian relatif maksimum FliC sekitar 85% berdasarkan intensitas densitometri dari pita utama (FliC) dibandingkan dengan pita kontaminasi kecil yang diamati dalam gel SDS-PAGE yang diwarnai Coomassie dan Western blots (data tidak ditampilkan). Agar FliC cocok untuk pengujian imunologis, kami berusaha mencapai tingkat kemurnian yang lebih tinggi dan melakukan pendekatan genetik untuk meminimalkan kontaminan protein asing. Untuk mencapai ini, kami menggunakan beberapa strain mutan CFT073, yang disebut CFT073Δ4 (Wurpel et al., 2014), yang berisi penghapusan pada gen yang mengkode fimbriae permukaan utama, termasuk tipe 1, F1C dan P fimbriae ini digunakan untuk ekstraksi FliC bersama turunannya CFT073Δ4ΔfliC untuk menghasilkan kontrol pembawa untuk pengujian lebih lanjut.

    Ekstraksi fisik flagela dari CFT073Δ4 meningkatkan kemurnian relatif ekstrak FliC menjadi 纕% menurut analisis densitometri gel SDS-PAGE (Gambar 3A). Sangat penting dalam pengujian ini untuk menganalisis jumlah protein yang lebih tinggi dalam gel (hingga 12,5 μg) daripada yang biasanya dianalisis untuk mencapai tingkat sensitivitas yang lebih tinggi untuk mendeteksi jejak kontaminasi protein. Kami memurnikan gel pita kontaminasi yang tersisa dan mengidentifikasi protein ini menggunakan spektrometri massa (MS) untuk menilai potensi pentingnya dalam memodifikasi interaksi inang-patogen dalam pengujian hilir. Analisis MS mengidentifikasi protein ini sebagai protein membran luar utama OmpA dan OmpC, dan fimbrilin dan protein fimbrial yang terlokalisasi di permukaan (Tabel 4) protein ini memiliki peran penting dalam interaksi host-patogen, termasuk mengikat reseptor pemulung fagosit dan bertindak sebagai imunogen utama (Jeannin dkk., 2005 Liu dkk., 2012). Membandingkan dengan protokol pemurnian flagelin bakteri yang dijelaskan oleh Smith et al. (2003) kami mengamati hasil protein dan kontaminasi yang lebih tinggi dengan fimbrilin tetapi spesies dengan berat molekul lebih tinggi yang kurang asing menggunakan protokol kami (Gambar 3B). Oleh karena itu, kami mencari metode tambahan untuk memisahkannya dari FliC, pasca-pemurnian.

    Gambar 3. Profil protein dari flic-ekstrak yang diperkaya dari CFT073Δ4fim Δfokus Δpap1 Δpap2) dan nya flic-turunan yang kurang. (A) Gel SDS-PAGE diwarnai Coomassie dari preparat protein FliC (5 μg) diperkaya untuk flagela dari CFT073/pflhDC (1), CFT073ΔfliC/pflhDC (2), CFT073Δ4/pflhDC (3), dan CFT073Δ4ΔfliC/pflhDC (4) pita berlabel a-e diekstraksi gel dan selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometri massa untuk mengidentifikasi protein dan tercantum dalam Tabel 3. (B) Gel SDS-PAGE yang diwarnai Coomassie dari sampel protein (10 μg) disiapkan menggunakan protokol untuk pemurnian flagelin bakteri yang dijelaskan oleh (Smith et al., 2003) (1) dibandingkan dengan protokol yang digunakan dalam penelitian ini (2). Perbedaan dalam jumlah relatif fimbrilin dan spesies asing dengan berat molekul lebih tinggi ditunjukkan dalam gel. M, Penanda.

    Tabel 4. Identitas protein yang dimurnikan bersama yang diisolasi dengan FliC dari CFT073Δ4 dan itu fliC-Defisiensi derivatif menggunakan proses fisik geser, filtrasi dan ultrasentrifugasi.

    Pasca-pemurnian FliC ke Homogenitas Menggunakan FPLC dan Penghapusan Endotoksin

    Untuk menghasilkan FliC yang sangat murni, ekstrak protein yang dimurnikan seperti di atas menggunakan proses fisik pemotongan, filtrasi dan ultrasentrifugasi selanjutnya dipisahkan dengan kromatografi eksklusi ukuran menggunakan sistem pemurnian protein murni ÄKTA dengan kolom Superdex 200 Meningkatkan 10/300 GL. Fraksi dianalisis dengan absorbansi UV pada 215 dan 280 nm selama elusi, dan dikumpulkan dan fraksi yang mengandung protein kemudian dipekatkan menggunakan kolom Ultra Spin dan dianalisis dengan SDS-PAGE. FliC terelusi dalam fraksi 13 dengan puncak tunggal, seperti yang diilustrasikan pada Gambar 4A. Pengaturan absorbansi UV standar 280 nm (digunakan untuk memantau protein dalam fraksi terelusi) tidak mendeteksi FliC karena tidak adanya triptofan (dan sedikit residu tirosin) dalam protein, yang mengharuskan penerapan panjang gelombang 215 nm alternatif untuk memantau FliC.

    Gambar 4. Profil protein ekstrak yang diperkaya FliC dari CFT073Δ4fim Δfokus Δpap1 Δpap2). (A) Kromatogram FliC dari ekstrak CFT073Δ4. (B) SDS-PAGE gel protein (5 μg) dalam fraksi 13 dihasilkan dari CFT073Δ4/pflhDC (1) dan CFT073Δ4ΔfliC/pflhDC (2) mengikuti konsentrasi protein dengan filter sentrifugal. M, Penanda.

    Yang penting, percobaan ini menunjukkan bahwa FLPC pada dasarnya mencapai penghapusan lengkap semua kontaminan protein asing dari CFT073Δ4 Ekstrak FliC (Gambar 4B). Proses pasca-pemurnian diakhiri dengan menerapkan preparat FliC ke kolom penghilangan endotoksin, yang menghasilkan tingkat rata-rata endotoksin dalam preparasi akhir 0,005 ± 0,002 EU.μg 𢄡 jauh di bawah level yang dilaporkan sebelumnya. studi stimulasi imun dari FliC murni (maks. 0,125 EU.μg 𢄡 Braga et al., 2008, 0,025 EU.μg 𢄡 Metcalfe et al., 2010) dan FliA (0,011 EU.μg 𢄡 Schulke dkk., 2010). Tanpa melakukan langkah penghilangan endotoksin ini, sediaan FliC secara rutin menunjukkan konsentrasi endotoksin yang mencemari di atas 1 EU.μg 𢄡 . Bersama-sama, data ini dikombinasikan dengan temuan kami tentang metode ekstraksi fisik menetapkan pasca-pemurnian dan penghapusan endotoksin berbasis FLPC sebagai metode yang sangat baik untuk pemurnian pasca-pemurnian FliC UPEC yang tidak didenaturasi menjadi homogen, idealnya cocok untuk uji imunologi hilir.

    Karakterisasi Stabilitas Panas Homopolimer FliC

    Filamen flagela terdiri dari 11 protofilamen, masing-masing terdiri dari monomer FliC yang distabilkan sebagai homopolimer oleh interaksi subunit hidrofobik (Yonekura et al., 2003). Variasi stabilitas filamen flagela antar spesies (Yoon dan Mekalanos, 2008) mendorong kami untuk mengkarakterisasi stabilitas panas homopolimer FliC CFT073 dengan tujuan menghasilkan monomer FliC sambil meminimalkan denaturasi protein sehingga protein yang dimurnikan idealnya cocok untuk inang-patogen tes interaksi. Eksperimen yang dilakukan dengan gradien suhu menunjukkan bahwa perlakuan 60ଌ selama 10 menit menghasilkan monomer FliC dengan efisiensi mendekati 90% (Gambar 5). Suhu di atas 60ଌ menghasilkan peningkatan kecil dalam efisiensi monomerisasi sedangkan pada suhu di bawah 50ଌ terjadi monomerisasi minimal. Oleh karena itu, 60ଌ dipilih sebagai optimal untuk memungkinkan pembangkitan monomer FliC yang efisien tetapi membatasi efek denaturasi panas. Kami kemudian memeriksa kecenderungan FliC monomer untuk mempolimerisasi sendiri setelah perlakuan panas ini untuk ini, filamen flagela diinkubasi pada suhu kamar (RT), 60ଌ atau 90ଌ dan protein kemudian disimpan pada 4ଌ, RT atau 37ଌ selama 2, 24, atau 48 jam. Analisis gel asli dari protein yang diperlakukan dengan cara ini menunjukkan tidak ada polimerisasi ulang yang berarti dari monomer FliC menjadi filamen setelah monomer diinkubasi dan disimpan pada 4ଌ. Sebaliknya, FliC yang disimpan pada RT atau 37ଌ selama 24 jam atau lebih, menunjukkan beberapa polimerisasi ulang (Gambar 6). Kami menyimpulkan dari data ini bahwa monomer FliC UPEC relatif stabil sebagai monomer setidaknya selama 2 jam setelah depolimerisasi pada 60ଌ selama 10 menit tetapi inkubasi monomer pada suhu yang lebih tinggi dan/atau untuk periode waktu yang lebih lama menyebabkan beberapa derajat polimerisasi ulang sendiri.

    Gambar 5. Momerisasi yang diinduksi panas dari FliC murni. Gel PAGE asli menunjukkan disosiasi FliC dari filamen polimer menjadi monomer FliC (A) dan kuantifikasi densitometrik relatif monomer pada setiap suhu yang diuji (B).

    Gambar 6. Stabilitas monomer FliC. Sekitar 5 μg FliC (10 μl), diencerkan dalam buffer gel asli diinkubasi pada suhu kamar (RT), 60ଌ atau 90ଌ protein kemudian disimpan pada 4ଌ, RT atau 37ଌ selama 2 jam (A), 24 jam (B) dan 48 jam (C) dan kemudian diselesaikan dalam gel asli. Gambar menunjukkan tidak ada re-polimerisasi yang cukup besar ke dalam filamen flagela FliC yang diinkubasi dan disimpan pada 4ଌ. Sebaliknya, FliC yang disimpan pada RT atau 37ଌ selama 24 jam atau lebih, menunjukkan beberapa polimerisasi ulang yang tampak sebagai dua pita utama (bukan pita tunggal) dalam gambar. (B) dan (C).

    Respon Sitokin Makrofag terhadap FliC . yang Sangat Murni

    Untuk menilai aktivitas imunologi FliC yang dimurnikan hingga homogenitas, kami selanjutnya menerapkan FliC murni ke uji stimulasi makrofag in vitro. Paparan makrofag murine J774A.1 ke 1 μg FliC selama 5 jam menyebabkan peningkatan produksi TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, IL-12(p40) dan IL- 12 (p70) (Gambar 7), Kami menghasilkan kontrol pembawa yang sesuai untuk percobaan ini dengan menyiapkan ekstrak dari a fliC turunan dari CFT073Δ4 (GU2642), yang diproses dengan cara yang identik dengan persiapan FliC di atas. Dibandingkan dengan stimulasi dengan FliC, tidak ada tingkat signifikan dari sitokin ini dalam kultur makrofag yang terpapar pada kontrol pembawa (yaitu, ekstrak dari GU2642) atau kontrol media kultur saja (Gambar 7). Kami tidak mengamati tingkat signifikan sitokin lain yang sebelumnya tidak terkait dengan flagela, seperti G-CSF dan GM-CSF (data tidak ditampilkan) dan juga tidak mendeteksi tingkat signifikan IFN-γ yang sebelumnya telah dikaitkan dengan respons seluler terhadap flagela (Wyant et al., 1999). Investigasi efek penghilangan endotoksin pada respons makrofag menunjukkan tingkat beberapa sitokin yang lebih tinggi dalam kultur yang distimulasi dengan FliC murni yang tidak dirawat untuk penghilangan endotoksin (“pre-”) dibandingkan dengan FliC yang dirawat untuk pembuangan endotoksin ( “post-”) (Gambar 8). Perbandingan respons makrofag terhadap jumlah FliC yang berbeda menunjukkan bahwa jumlah FliC ρ μg juga memicu produksi beberapa sitokin yang signifikan misalnya, 0,05 μg FliC menginduksi produksi TNF-α yang signifikan dibandingkan dengan kultur kontrol. yang diobati dengan pembawa saja (Gambar 8). Dalam pengujian terpisah menggunakan monosit U937 manusia dan 5.637 sel epitel, kami mengamati respons signifikan serupa untuk TNF-α, IL-1β, dan IL-6 tetapi tidak ada respons signifikan untuk IL-8 atau IL-12(p70) (data tidak ditampilkan). Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa respons sitokin proinflamasi makrofag seperti yang diamati dalam penelitian ini secara langsung dapat dikaitkan dengan FliC dan konsisten dengan laporan sebelumnya tentang sifat stimulasi imun flagela.

    Gambar 7. Respon sitokin makrofag terhadap FliC yang dimurnikan hingga homogen dari UPEC CFT073Δ4. Makrofag J774A.1 dirangsang dengan 1 μg FliC selama 5 jam dan supernatan digunakan untuk mengukur kadar TNF-α, IL-1β, IL-6, KC (dipilih sebagai ekuivalen fungsional manusia IL-8), IL-12 (hal 40), dan IL-12 (hal 70). FliC menginduksi konsentrasi yang lebih tinggi dari sitokin ini dibandingkan dengan kontrol Carrier (dibuat dari GU2642 menggunakan prosedur pemurnian identik) atau kontrol Media saja.

    Angka 8. Respon sitokin makrofag terhadap FliC dimurnikan ke tahapan protokol yang ditentukan sebelum dan sesudah penghapusan endotoksin. Makrofag J774A.1 dirangsang dengan 0,05-1 μg FliC yang tidak diobati untuk penghilangan endotoksin (“pre-“) vs. yang diobati untuk pembuangan endotoksin (“post-“) selama 5 jam dan supernatan digunakan untuk mengukur kadar TNF-α dan IL-6. *P < 0,05 ****P < 0,0001.


    Konsentrasi sampel

    Ini dapat menjadi keuntungan untuk mengkonsentrasikan sampel sebelum filtrasi gel untuk meminimalkan volume sampel dan memfasilitasi pemisahan ukuran resolusi tinggi yang cepat. Kolom HiTrap menawarkan solusi yang nyaman dan siap digunakan untuk konsentrasi sampel. Tabel 7 memberikan contoh faktor konsentrasi tinggi yang dicapai ketika memekatkan protein dari bahan awal yang sangat encer menggunakan kolom HiTrap yang dikemas dengan media Sepharose HP. Hasil serupa dapat dicapai dengan kolom HiTrap yang dikemas dengan media Sepharose Fast Flow atau Sepharose XL


    File tambahan

    Sebuah lab-on-a-chip untuk pemisahan darah yang cepat dan kuantifikasi hematokrit dan analit serum

    Jika Anda bukan penulis artikel ini dan Anda ingin mereproduksi materi darinya dalam publikasi non-RSC pihak ketiga, Anda harus secara resmi meminta izin menggunakan Pusat Izin Hak Cipta. Buka halaman Instruksi kami untuk menggunakan Pusat Izin Hak Cipta untuk detailnya.

    Penulis yang berkontribusi pada publikasi RSC (artikel jurnal, buku atau bab buku) tidak perlu secara resmi meminta izin untuk mereproduksi materi yang terkandung dalam artikel ini asalkan pengakuan yang benar diberikan dengan materi yang direproduksi.

    Materi yang direproduksi harus dikaitkan sebagai berikut:

    • Untuk reproduksi material dari NJC:
      Direproduksi dari Ref. XX dengan izin dari Center National de la Recherche Scientifique (CNRS) dan The Royal Society of Chemistry.
    • Untuk reproduksi materi dari PCCP:
      Direproduksi dari Ref. XX dengan izin dari Perhimpunan Pemilik PCCP.
    • Untuk reproduksi materi dari PPS:
      Direproduksi dari Ref. XX dengan izin dari European Society for Photobiology, European Photochemistry Association, dan The Royal Society of Chemistry.
    • Untuk reproduksi materi dari semua jurnal dan buku RSC lainnya:
      Direproduksi dari Ref. XX dengan izin dari The Royal Society of Chemistry.

    Jika materi telah diadaptasi alih-alih direproduksi dari publikasi RSC asli "Direproduksi dari" dapat diganti dengan "Diadaptasi dari".

    Dalam semua kasus, Ref. XX adalah referensi ke-XX dalam daftar referensi.

    Jika Anda adalah penulis artikel ini, Anda tidak perlu secara resmi meminta izin untuk mereproduksi gambar, diagram, dll. yang terkandung dalam artikel ini dalam publikasi pihak ketiga atau dalam tesis atau disertasi asalkan pengakuan yang benar diberikan dengan materi yang direproduksi.

    Materi yang direproduksi harus dikaitkan sebagai berikut:

    • Untuk reproduksi material dari NJC:
      [Kutipan asli] - Direproduksi dengan izin dari The Royal Society of Chemistry (RSC) atas nama Center National de la Recherche Scientifique (CNRS) dan RSC
    • Untuk reproduksi materi dari PCCP:
      [Kutipan asli] - Direproduksi dengan izin dari Masyarakat Pemilik PCCP
    • Untuk reproduksi materi dari PPS:
      [Kutipan asli] - Direproduksi dengan izin dari The Royal Society of Chemistry (RSC) atas nama European Society for Photobiology, European Photochemistry Association, dan RSC
    • Untuk reproduksi materi dari semua jurnal RSC lainnya:
      [Kutipan asli] - Direproduksi dengan izin dari The Royal Society of Chemistry

    Jika Anda adalah penulis artikel ini, Anda masih perlu mendapatkan izin untuk mereproduksi seluruh artikel dalam publikasi pihak ketiga dengan pengecualian reproduksi seluruh artikel dalam tesis atau disertasi.

    Informasi tentang mereproduksi materi dari artikel RSC dengan lisensi yang berbeda tersedia di halaman Permintaan Izin kami.


    Metode

    Serum fase akut kuda yang dikumpulkan digunakan dalam penelitian, berdasarkan sampel individu dari kuda milik klien yang tersisa setelah analisis diagnostik di Laboratorium Pusat, Departemen Klinis Hewan dan Ilmu Hewan, Universitas Kopenhagen, Denmark. Dimasukkannya sampel dalam penelitian ini telah disetujui oleh komite etik lokal di Departemen Ilmu Klinis dan Hewan Hewan, Universitas Kopenhagen, Denmark. Konsentrasi SAA dalam serum pool diukur hingga 1600 mg/L, menggunakan immunoassay turbidimetri yang tersedia secara komersial yang sebelumnya divalidasi untuk pengukuran diagnostik SAA kuda oleh anggota kelompok kami [24]. Lima puluh mililiter kolam serum dibekukan kering dari 𠄴ଌ hingga suhu kamar pada 10 mbar. Ikhtisar prosedur analitis dan preparatif diberikan pada Gambar  1 . Kehadiran dan komposisi SAA terdeteksi dalam serum dan preparat oleh IEF, electroblotting (Amersham Pharmacia Biotech), dan immunostaining dengan antibodi anti-SAA (Tri-delta Development Ltd), seperti yang sebelumnya dilakukan dalam beberapa studi SAA yang dilakukan oleh kelompok kami [ 6,30,31].

    Ikhtisar prosedur termasuk dalam penelitian. Metode yang diterapkan (dilingkari) dan produk yang diperoleh dianalisis untuk kandungan SAA dan kotoran (diuraikan dalam kotak) dalam upaya untuk memurnikan amiloid A serum kuda (SAA).Isoform SAA dideteksi dalam supernatan, fraksi, dan endapan menggunakan pemfokusan isoelektrik, elektroblotting, dan immunostaining. Kemurnian SAA yang terdeteksi dinilai dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakril amida (SDS-PAGE), diikuti dengan pewarnaan protein serum dengan perak nitrat. SFE: Ekstraksi fluida superkritis dengan CO2. FPLC-SEC: Kromatografi ekslusif ukuran kromatografi cair polimer cepat. IEF: Pemfokusan isoelektrik.

    Serum kering beku disuspensikan dalam 70% 2-propanol, 8 M urea, dan air Milli-Q, masing-masing, dalam konsentrasi 10 mg serum kering beku per mililiter pelarut. Supernatan dianalisis untuk keberadaan isoform SAA terlarut.

    Ekstraksi cairan superkritis (SFE) dilakukan dengan menggunakan 600 mg serum beku-kering dalam sistem Speed ​​SFE (Pemisahan Terapan). Ekstraksi dilakukan pada 50 mPa dengan aliran 4 L CO2 per menit pada 40ଌ selama 30 menit. Ekstrak dikumpulkan dalam botol kaca dan ekstraksi diulang menggunakan etanol 96% sebagai pengubah (1,0 mL/menit). Ekstrak dan sisa-sisa dikeringkan dengan udara, diencerkan dalam urea 8 M, dan dianalisis untuk keberadaan SAA.

    SEC dilakukan dengan kromatografi cair polimer cepat (FPLC-SEC) menggunakan kolom Superdex� 10/300 GL (GE Healthcare) dan buffer yang mengandung 20 mM natrium dihidrofosfat dan 50 mM natrium klorida, pH 6,9. Standar filtrasi gel yang mengandung tiroglobulin (660 kDa), gammaglobin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), mioglobin (17 kDa), dan sianokobalamin (1,35 kDa) (Bio-Rad) digunakan untuk membuat kurva standar untuk memperkirakan molekuler bobot fraksi FPLC yang berbeda. Dua ratus mikroliter supernatan disaring yang dihasilkan dari suspensi serum beku-kering dalam air Milli-Q (dijelaskan di atas) disuntikkan ke kolom dan dipisahkan pada aliran 1 ml/menit menghasilkan tekanan 1,5 mPa. Berat molekul SAA kuda diverifikasi oleh Sodium dodecyl sulphate – elektroforesis gel poliakrilamida (SDS-PAGE) dalam Sistem Gel Phast (Amersham Pharmacia Biotech) diikuti dengan elektroblotting dan imunostaining seperti dijelaskan di atas. Sebuah penanda berat molekul (Bio Rad) dipisahkan sebelum blotting dan diwarnai dengan silvernitrate (Pharmacia LKB Biotechnology) [32] dan digunakan sebagai standar.

    IEF preparatif dilakukan di Unit Pemurnian IEF Hoefer IsoPrime, (Amersham Pharmacia Biotech) [33,34]. Tujuh polimembran buffer dengan pH 5, 6, 7, 7,5, 8, 8,5, dan 9 dibuat dengan akrilamidobuffer (Fluka BioChemika dan GE Healthcare Biosciences), dalam gel yang terdiri dari 30% akrilamida/bis-akrilamida (Sigma Aldrich), Tetramethylethylenediamine ( Pharmacia Biothech) dan 40% amonium persulfat (Bio-Rad). Filter mikrofiber kaca Whatman GF/D 47 mm terbungkus dalam membran. Chamber diisi dengan air Milli-Q sesuai dengan rekomendasi dari produsen, dan 5 ml supernatan yang dihasilkan dari suspensi serum kering beku dalam urea 8 M (dijelaskan di atas) diterapkan dalam ruang pemisahan 2 (antara gel dengan pH 5 dan 6). Pemisahan dilakukan selama 24 jam pada daya konstan 4 W. Preparat dikeringkan di udara dan dilarutkan dalam urea 8 M sebelum deteksi SAA. Endapan yang terlihat dilarutkan dalam urea 8 M semalam pada suhu kamar, dan zat terlarut diselidiki untuk keberadaan SAA.

    Protein serum dalam supernatan, fraksi, dan endapan diwarnai dengan silvernitrate [32] mengikuti SDS-PAGE di Phast Gel System (Amersham Pharmacia Biotech) untuk menilai kemurnian sediaan, dan penanda berat molekul digunakan sebagai standar (Bio Rad).


    Pemurnian kromatografi cair protein cepat fraksi hidrofobik proteosa-pepton susu sapi dan karakterisasi dengan elektroforesis dua dimensi

    Susu sapi Fraksi hidrofobik proteosa-pepton dibuat dengan kromatografi cair protein cepat interaksi hidrofobik. Metode ini memiliki beberapa keunggulan seperti kecepatan tinggi, reproduktifitas sederhana yang baik dan denaturasi yang lebih sedikit. Proteosa-pepton dielusi dari kolom TSK-Phenyl-5PW dengan gradien kekuatan ionik NaH2PO4 1 M-0 M, pH 6·8, menggunakan laju aliran 6 ml/menit selama 56 menit. Jumlah protein yang disuntikkan adalah 62·5 mg, namun dapat ditingkatkan hingga 100 mg. Urutan elusinya adalah -CN-4P < BSA (1·6% dari total N) < -CN-5P < -CN-1P. Fraksi hidrofobik diperoleh dalam air murni pada akhir gradien (17,3% dari total N). Sebuah kartograf proteosa-pepton dicapai dengan elektroforesis dua dimensi. Fraksi hidrofobik ini mewakili tiga zona utama M r 30000–28000, 19000 dan 11000, yang masing-masing terdiri dari 13, 4 dan 2 titik utama yang didistribusikan antara 4·9 dan 6·1 titik isoelektrik (IP). Bintik-bintik ini berhubungan dengan glikoprotein. ·7, 5·0 dan 5·1 IP yang bermigrasi ke M r 18000 sementara -CN-1P diidentifikasi sebagai M r 9000 di dua titik 5·1 dan 5·3 IP.


    Informasi penulis

    Afiliasi

    Departemen Patologi, Fakultas Kedokteran Albert Einstein, New York, AS

    Maya Tanase, Valerio Zolla, Cristina C Clement, Francesco Borghi, Aleksandra M Urbanska & Laura Santambrogio

    Departemen Kimia, Universitas Bologna, Bologna, Italia

    Maya Tanase, Francesco Borghi, Barbara Roda, Andrea Zattoni & Pierluigi Reschiglian

    Departemen Biologi Molekuler Perkembangan, Fakultas Kedokteran Albert Einstein, New York, AS


    Tonton videonya: FPLC Christmas Greeting 2021 (Februari 2023).