Informasi

12.5: Latihan 1 - Transformasi ragi - Biologi

12.5: Latihan 1 - Transformasi ragi - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Protokol berikut adalah sedikit modifikasi dari protokol transformasi “Cepat dan Kotor” yang dijelaskan oleh Amberg dkk. (2005). Modifikasi metode ini dapat meningkatkan efisiensinya dengan beberapa kali lipat (Gietz dan Schiestl, 2007), yang akan diperlukan jika potongan linier DNA digunakan untuk mengubah ragi.

Siapkan campuran master transformasi

1. Siapkan campuran master transformasi. Bahan-bahan berikut menyediakan reagen yang cukup untuk lima reaksi transformasi. Gabungkan dan campur dalam tabung microcentrifuge:

100 L litium asetat 2 M steril (segar)
400 L steril 50% PEG-3350
4 L 2-mercaptoethanol (BAU!! tambahkan ini di lemari asam!)

Siapkan reaksi transformasi individual - untuk setiap transformasi:

2. Tambahkan 15 L DNA sperma salmon terdenaturasi (2 mg/mL) ke tabung mikrosentrifus baruberlabeldengan nama (atau kode) plasmid.

Catatan: Penting agar DNA sperma salmon beruntai tunggal agar prosedur ini bekerja dengan baik. Rebus DNA selama 5 menit untuk mendenaturasi DNA. Dinginkan DNA dengan cepat dengan menempatkannya segera di atas es. Simpan DNA di atas es sampai Anda siap menggunakannya.

3. Tambahkan 5 L DNA plasmid miniprep ke dalam tabung mikrosentrifugasi yang diberi label yang sesuai.

4. Tambahkan 100 L campuran transformasi dari langkah 1 ke setiap tabung mikrosentrifugasi. Vortex selama 10-15 detik untuk mencampur isinya.

5. Dengan menggunakan tusuk gigi steril atau ujung mikropipet, kerok koloni ragi besar (atau setara dengan "kepala korek api" ragi) dari piring YPD. Pindahkan ragi ke dalam tabung microcentrifuge yang berisi larutan transformasi/DNA (langkah 4) dengan memutar tusuk gigi beberapa kali. Pastikan bahwa sel-sel tersuspensi secara seragam sebelum melanjutkan.

Ulangi langkah 2-5 untuk setiap reaksi transformasi Anda. Pastikan untuk menyertakan kontrol yang tidak mengandung DNA plasmid.

6. Inkubasi campuran transformasi pada suhu 37 C dengan pengocokan selama 30-45 menit.

Letakkan sel yang ditransformasi pada media selektif yang tidak memiliki urasil.

7. Keluarkan 10 L sel yang disuspensikan kembali dan tambahkan ke 90 L air steril dalam tabung mikrosentrifugasi. Sampel ini akan diencerkan secara serial untuk pelat titik (langkah 9) yang akan Anda gunakan untuk menghitung efisiensi transformasi.

8. Sebarkan sisa campuran pada pelat media selektif tanpa urasil. Transfer reaksi transformasi ke piring, dan kemudian kocok ~ 4 manik-manik kaca steril yang akan menyebarkan sel. Tutup piring dan habiskan 0,5-1 menit mengaduk piring sehingga manik-manik menyebarkan campuran transformasi secara merata di atas permukaan piring. Buang manik-manik kaca ke dalam wadah limbah yang sesuai, sehingga dapat disterilkan dan digunakan kembali. Inkubasi cawan pada suhu 30 C sampai koloni dapat dideteksi. Paling awal bahwa koloni akan terlihat biasanya 2 hari. Jika koloni kecil, biarkan mereka tumbuh satu hari lagi pada suhu 30 C. Hitung jumlah koloni di piring.

Tentukan jumlah sel yang hidup dalam campuran transformasi.

9. Siapkan serangkaian 4 pengenceran tambahan sel yang disisihkan pada langkah 7. Gunakan pengenceran ini
untuk plat spot pada media YPD. Setiap baris di piring harus berisi sel-sel dari reaksi transformasi yang berbeda. Inkubasi sel pada suhu 30 C atau suhu kamar sampai koloni individu dapat dideteksi. Jangan biarkan piring tumbuh terlalu banyak, karena Anda perlu membedakan koloni individu.

Hitung efisiensi transformasi. Efisiensi transformasi dipengaruhi oleh kualitas DNA yang digunakan dan detail yang tepat dari prosedur transformasi.

10. Hitung fraksi sel yang ditransformasikan seperti gambar di bawah ini. Volume total campuran transformasi adalah ~ 120 L, termasuk sel ragi. Sepuluh L digunakan untuk pelapisan titik dan 100 L sisanya digunakan untuk transformasi.

11. Efisiensi transformasi biasanya dinyatakan dengan jumlah sel yang ditransformasi per g DNA. Di lab terakhir (Bab 11), Anda menganalisis preparat plasmid Anda pada gel agarosa dan memperoleh perkiraan kasar konsentrasi DNA preparat plasmid Anda. Perhatikan bahwa Anda menganalisis 7 L persiapan plasmid pada gel tersebut. Di lab transformasi ini, Anda menggunakan 5 L preparat plasmid Anda.

Hitung efisiensi transformasi:

A. Kalikan jumlah sel yang diubah pada pelat YC dengan 1,1
(Hanya 100 dari 110 L dalam reaksi transformasi yang dilapisi.)

B. Ubah ng plasmid dalam reaksi transformasi Anda menjadi g.

C. Bagilah nilai yang dihitung di A dengan nilai di B.


Pengembangan alat biologi sintetis untuk insinyur Pichia pastoris sebagai sasis untuk produksi produk alami

Ragi metilotrofik Pichia pastoris (alias Komagataella phaffii) adalah salah satu inang yang paling umum digunakan untuk produksi industri protein rekombinan. Sebagai ragi non-konvensional, P. pastoris memiliki karakteristik biologis yang unik dan sistem ekspresinya telah berkembang dengan baik. Dengan kemajuan dalam biologi sintetik, lebih banyak upaya telah dicurahkan untuk mengembangkan P. pastoris menjadi sasis untuk produksi berbagai senyawa bernilai tinggi, seperti produk alami. Tinjauan ini dimulai dengan pengenalan alat biologi sintetik untuk rekayasa P. pastoris, termasuk vektor, promotor, dan terminator untuk ekspresi gen heterolog serta Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated System (CRISPR/Cas) untuk pengeditan genom. Tinjauan ini kemudian diikuti dengan contoh produksi produk alami bernilai tambah dalam rekayasa metabolik P. pastoris ketegangan. Terakhir, tantangan dan pandangan dalam mengembangkan P. pastoris sebagai sasis biologi sintetis diprospek.


Kloning rekombinasi terkait transformasi (TAR) untuk studi genomik dan biologi sintetis

Kloning rekombinasi terkait transformasi (TAR) mewakili alat unik untuk isolasi dan manipulasi molekul DNA besar. Teknik ini memanfaatkan rekombinasi homolog tingkat tinggi dalam ragi Sacharomyces cerevisiae. Sejauh ini, kloning TAR adalah satu-satunya metode yang tersedia untuk secara selektif memulihkan segmen kromosom hingga 300 kb panjangnya dari genom kompleks dan sederhana. Selain itu, kloning TAR memungkinkan perakitan dan kloning seluruh genom mikroba hingga beberapa Mb serta rekayasa jalur metabolisme besar. Dalam ulasan ini, kami merangkum aplikasi kloning TAR untuk genomik fungsional/struktural dan biologi sintetik.

Kata kunci: HAC Kromosom buatan manusia Biologi sintetik Kloning TAR Transformasi terkait rekombinasi.

Pernyataan konflik kepentingan

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan. Artikel ini tidak berisi penelitian apa pun dengan peserta manusia atau hewan yang dilakukan oleh penulis mana pun.


Transformasi Ragi

Protokol ini disampaikan oleh Matt Kaeberlein.

Protokol ini bekerja dengan baik untuk mengubah plasmid dan kaset gangguan PCR.

  • TE + 100mM LiAc (Encerkan stok 1M LiAc dan 10X TE dalam air 1:1:8).
  • PIRING (1X TE, 100 mM LiAc 40% PEG)
  1. Tumbuhkan ragi untuk ditransformasikan dalam semalam di YPD.
  2. Encerkan kembali kultur semalam 1:100 dalam YPD segar dan kultur pada 30C selama 4-6 jam.
  3. Putar 15mL sel.
  4. Cuci sel 2X dalam 0,5mL TE + 100 mM LiAc
  5. Menangguhkan kembali sel dalam 200uL TE + LiAc
  6. Tambahkan DNA transformasi.
  7. Tambahkan 20uL ssDNA yang baru direbus.
  8. Tambahkan larutan PLATE 1mL. Campur dengan inversi beberapa kali.
  9. Inkubasi pada suhu 30C selama 30 menit.
  10. Inkubasi pada suhu 37C selama 15 menit. Campur dengan inversi setiap 5 menit.
  11. Putar sel dan piring pada media selektif.

Untuk mentransformasi DNA saya menggunakan 1 uL mini-prep DNA untuk plasmid dan 30-50uL produk PCR untuk gangguan PCR.

Dalam praktiknya, saya biasanya menaikkan dan menurunkan 45 mL sel dalam tabung 50 mL. Saya melakukan pencucian 2X kemudian membagi sel menjadi 3 tabung eppendorf individu untuk transformasi.


Transformasi tanaman yang dimediasi Agrobacterium: biologi dan aplikasi

Transformasi genetik tanaman sangat bergantung pada bakteri patogen Agrobacterium tumefaciens sebagai alat yang ampuh untuk mengirimkan gen yang diinginkan ke tanaman inang. Di dalam inti tanaman, DNA yang ditransfer mampu berintegrasi ke dalam genom tanaman untuk diwariskan ke generasi berikutnya (yaitu transformasi stabil). Atau, DNA asing dapat secara sementara tetap berada di dalam nukleus tanpa berintegrasi ke dalam genom tetapi masih ditranskripsi untuk menghasilkan produk gen yang diinginkan (yaitu transformasi transien). Dari penemuan A. tumefaciens hingga aplikasinya yang luas dalam bioteknologi tanaman, berbagai aspek interaksi antara A. tumefaciens dan tanaman telah dijelaskan. Artikel ini bertujuan untuk memberikan tinjauan komprehensif tentang biologi dan aplikasi transformasi tanaman yang dimediasi Agrobacterium, yang mungkin berguna bagi ahli mikrobiologi dan biologi tanaman yang menginginkan pemahaman yang lebih baik tentang transformasi tanaman, ekspresi protein pada tanaman, dan interaksi tanaman-mikroba. .

Angka

Langkah utama Agrobacterium…

Langkah-langkah utama dari proses transformasi tanaman yang dimediasi Agrobacterium tumefaciens. (1) Lampiran A.…


Transformasi ragi - efisiensi rendah (Des/15/2008 )

Halo semuanya,
Saya mengubah ragi menggunakan metode LiOAc/PEG. Efisiensinya rendah, sekitar 10^3-10^4 koloni / plasmid ug.

Protokolnya adalah:
240 ul 50% w/v PEG3350
35 ul 1M LiOAc
25 ul pembawa ssDNA
1 ul plasmid
Aduk rata dan tambahkan ke sel yang sudah dicuci.
30 derajat C, 30 menit
42 derajat C, 20 menit
putar ke bawah, suspensi kembali dalam air
pelapisan

apa jenis ragi yang Anda kerjakan?

Jika ini S.pombe, saya akan mengatakan Anda harus meningkatkan durasi inkubasi 30 C menjadi 1 jam, mengurangi kejutan panas (42 C) menjadi sekitar 10-5 menit (saya pribadi menggunakan 5 menit) dan menambahkan 42ul DMSO untuk meningkatkan kejutan panas .

Juga seberapa keras Anda memutar sel Anda? Putar untuk waktu sesingkat mungkin pada pengaturan kecepatan terendah yang bisa dilakukan mesin Anda. Sel-sel ragi rapuh setelah protokol transformasi.

Jika Anda menambahkan DMSO, cuci bersih sebelum melapisi sel.

Setelah sel Anda dilapisi, jaga inkubator Anda tetap lembab. S.pombe tidak menyukai permukaan plat yang kering. Ini membantu meningkatkan tingkat pertumbuhan dan tingkat pemulihan yang lebih rendah. Jadi, jika Anda menggunakan kelembapan dan menghitung koloni, pastikan Anda melakukan ini untuk semua eksperimen Anda.

Bisakah Anda memberi tahu saya lebih banyak tentang apa yang Anda lakukan setelah kultur sel Anda siap. Apakah Anda mencuci sel Anda dalam TE+LiAc sebelum membuat campuran DNA+sel akhir?

Terakhir, protokol transformasi LiAc agak kasar dan mungkin dapat didorong ke sekitar 10^5 koloni/ug DNA tetapi tidak lebih. Ada protokol yang lebih baik, tetapi lebih kompleks dan memakan waktu.

Terima kasih, perneseblue,
Saya bekerja dengan ragi roti. Sel-sel dipelet dengan cfg pada 3000 rpm, 5 menit. Dicuci sekali dengan 1x volume air. Campuran transformasi ( plasmsid, ssDNA, PEG3350, LiOAc) kemudian ditambahkan ke pelet sel. Dicampur dengan vortexing selama 10 detik. Setelah 30 menit 30 derajat C, dan 20 menit 42 derajat C inkubasi, sel-sel itu pelet, disuspensikan kembali dalam air, dan disepuh di piring seleksi.
Saya akan mencoba menambahkan DMSO lain kali.


Transformasi ragi

Protokol ini didasarkan pada Gietz, R.D. dan R.A. Hutan. (2002) TRANSFORMASI RAGI DENGAN METODE DNA/PEG CARRIER Liac/SS. Metode dalam Enzimologi 350: 87-96. Beberapa langkah dari protokol ini didasarkan pada informasi yang diperoleh dari:

Protokol ini digeneralisasi dan tidak dianggap optimal untuk semua strain, kondisi, dan aplikasi. Beberapa aspek dari protokol ini mungkin harus dimodifikasi secara signifikan agar sesuai dengan kebutuhan khusus Anda. Ia bekerja untuk transformasi sederhana, penargetan dalam ragi, perbaikan GAP, dan transformasi multi-plasmid untuk dua-hibrida.

1) Lukis atau tempelkan ragi pada YAPD selama 24-48 jam. Dapat juga menggunakan ragi dari piring yang lebih tua (3 bulan? pada 4 derajat) jika efisiensi tidak menjadi masalah dan strain bekerja sama.

2) Inokulasi kultur 2 x 3-5ml dalam media 2xYAPD atau SC (tabung snap cap 15ml) dari coretan segar dan inkubasi O/N 30 derajat, 200rpm. Media SC mungkin perlu diunggulkan lebih banyak (atau lebih banyak tabung mungkin diperlukan).

YAPD dapat menggantikan 2xYAPD tetapi efisiensi akan menurun dan ragi akan membutuhkan waktu lebih lama untuk tumbuh.

1) Pra-hangatkan 50ml 2xYAPD hingga 30 derajat dalam labu 500ml (setidaknya 10 menit). Nyalakan penangas air 42 derajat (membutuhkan waktu 30 menit atau lebih).

2) Encerkan kultur O/N 1:10 dalam air dan ambil OD pada 600nm. Gunakan 2xYAPD (atau YAPD atau SC bila perlu) yang diencerkan 1:10 dalam air sebagai blanko. Kultur yang diencerkan biasanya memiliki OD antara 0,1 dan 1,0.

3) Encerkan biakan hingga kira-kira 0,1 OD dalam 50 ml 2xYAPD yang telah dihangatkan sebelumnya dan inkubasi 3-6 jam hingga OD mencapai 1,0 (atau dekat). Tingkat pertumbuhan ragi bervariasi jadi bersiaplah untuk menunggu. Biasanya memakan waktu 5-6 jam tetapi bisa memakan waktu sedikit lebih lama.

CONTOH: Kultur yang diencerkan pada langkah 2 memiliki OD atau 0,2 sehingga OD kultur adalah 2,0. Untuk mendapatkan OD kira-kira 0,1 untuk langkah 3, Anda akan menambahkan 2,5 ml kultur ke 50ml 2xYAPD yang telah dipanaskan sebelumnya (pengenceran 20x). Jelas itu tidak tepat karena Anda sekarang akan memiliki 52,5ml, bukan 50ml, tetapi cukup dekat. Jika Anda menginginkannya dengan tepat, Anda cukup mengeluarkan 2.5ml 2xYAPD dari labu sebelum Anda menambahkan kultur 2.5ml Anda tetapi itu tidak perlu.

4) Pelet 3000rpm, 10 menit di RT di RT6000 atau centrifuge serupa.

5) Sambil memutar ragi, rebus DNA sperma salmon 5 menit dengan tutup mendidih dan dinginkan di atas es. Gunakan 3-4 kali (simpan pada -20) dan dapatkan tabung baru. Jangan sampai mendidih lagi dan lagi.

6) Suspensikan kembali dalam 1ml ddH2O dan pindahkan ke tabung 1,5ml.

7) Vortex 1 menit atau sampai ragi dalam suspensi (tidak ada gumpalan).

8) Pelet dengan kecepatan maksimal, 30 detik, RT dan disuspensikan kembali dalam 1ml ddH2O dengan vortex seperti sebelumnya. 100ul akan digunakan untuk setiap transformasi sehingga ada cukup ragi untuk 10 transformasi.

9) Pindahkan 100 ul ragi ke tabung 1,5 ml terpisah untuk setiap transformasi dan pelet dengan kecepatan maksimal, 30 detik, RT dan buang supernatannya.

10) Untuk setiap transformasi, buat yang berikut (campuran induk atau terpisah):

50ul DNA sperma salmon 2mg/ml

34ul atau plasmid Anda + air (1ul DNA miniprep bakteri cukup banyak)

11) Tambahkan campuran transformasi ke pelet ragi dari langkah #9 dan vortex 1 menit atau sampai ragi berada dalam suspensi (tidak ada gumpalan).

12) Tempatkan ragi pada 42 derajat selama 40 menit. Untuk efisiensi terbaik, waktu kejut yang optimal perlu ditentukan secara empiris dan dapat bervariasi dari 10 menit hingga 60 menit. Untuk transformasi plasmid seleksi tunggal sederhana 20-30 menit biasanya berfungsi dengan baik.

13) Pelet pada kecepatan maksimal, 30 detik, RT dan hapus campuran transformasi.

14) Tambahkan 1ml ddH2O dan gunakan ujung pipet 1ml untuk mengaduk sel ke dalam larutan. Jika perlu, pipet ragi ke atas dan ke bawah dengan sangat lembut.

15) Pelat 200ul pada pelat selektif 100mm atau 150mm yang sesuai dan tumbuh 3-4 hari pada 30 derajat. *Alih-alih 1ml pada langkah 14, Anda juga dapat meresuspensi ragi dalam 400ul dan menempatkan seluruh jumlah pada satu piring 150mm jika diinginkan.

Efisiensi sangat bervariasi berdasarkan regangan dan transformasi DNA. Ini dapat bervariasi dari 1吆^3 hingga 1吆^5 (atau lebih) koloni per ug DNA input (untuk DNA plasmid).

10g ekstrak BactoYeast

100mg adenin hemisulfat

Autoclave 20 menit pada siklus cair.

Media selektif akan bervariasi berdasarkan strain dan aplikasi.

2mg/ml dalam TE. Sigma D1626. Buat 100ml dalam labu menggunakan pengaduk magnet. Membutuhkan waktu 2-4 jam untuk larut. Aliquot dalam tabung 1.5ml (1ml/tabung).

Tempatkan 50gm polietilen glikol, MW 3350 (Sigma) dalam gelas piala 150 ml dan tambahkan 35 ml ddH20. Aduk selama 1-2 jam dengan batang pengaduk magnet sampai larut. q.s. hingga 100 ml dan terus diaduk selama minimal 10 menit agar tercampur. Saring menggunakan saringan 0,45 um dan alikuot dalam kerucut 15ml (masing-masing 10ml) dan simpan di RT.

1.0M Litium Asetat. Tidak perlu pH-nya.

Tim Schedl, Ph.D
Departemen Genetika
Kotak Kampus #8232
Fakultas Kedokteran Universitas Washington
4566 Scott Ave.
St. Louis, MO 63110


Tonton videonya: GABUNGAN TRANSFORMASI DAN SIFAT KALIS TUKAR TERTIB (November 2022).