Informasi

Cara menghapus jalur buruk dalam analisis ImageJ Westernblot

Cara menghapus jalur buruk dalam analisis ImageJ Westernblot


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya menggunakan ImageJ untuk melakukan analisis terhadap Gambar Westernblot.

Jika semuanya berjalan sesuai keinginan, alur kerjanya baik-baik saja. Tetapi jika saya melakukan kesalahan saat membuat jalur, tidak ada pembatalan untuk jalur dan juga tidak ada cara untuk menghapus semua jalur yang dapat saya temukan.

Bagaimana cara kembali ke gambar asli saya atau membatalkan pembuatan jalur?

Saya menggunakan 1.49e di Mac OS


ImageJ tidak memiliki fitur untuk menghapus jalur individual. Tapi itu seharusnya tidak menjadi masalah. Yang harus Anda lakukan adalah menggambar jalur pertama dengan benar (Saya mengacu pada ukuran). Lalu tekan 1. Sekarang, saat seleksi masih ... dipilih, klik di dalamnya, tetapi bukan pada nomor (di mana kursor menjadi tangan), dan seret ke mana Anda ingin jalur berikutnya. Dan tekan 2. Dan seterusnya. Gambar semua jalur Anda.

Sekarang, jika Anda salah menempatkan jalur, klik alat pemilihan persegi panjang, lalu klik nomor jalur saat kursor berada di tangan. Ini akan dipilih. Jika Anda mengalami masalah dengan ini, gunakan pintasan Ctrl+1 dan Ctrl+2 atau menunya Menganalisa - gel - Pilih Jalur Sebelumnya/Berikutnya untuk memilih antara jalur. Kursor berubah menjadi normal. Klik di mana saja di dalam jalur dan seret ke tempat yang tepat.

Jika jalur pertama buruk dan Anda ingin menghapus semua jalur, buka saja Menganalisa, Gel dan klik Mengatur ulang.


Penelitian yang tidak bias

Sebagai ilmuwan molekuler, saya melakukan banyak western blot. Seperti yang Anda ketahui, western blot sangat tidak berguna kecuali Anda dapat mengukur perbedaan antara jalur. Gambar J (atau FIJI) sering digunakan untuk mengukur hasil dari western blot. Namun, saya selalu lelah bahwa ada banyak cara untuk memasukkan bias ke dalam kuantifikasi Anda dengan program ini. Saya bertanya-tanya apakah orang yang sama akan menganalisis western blot yang sama beberapa kali, apakah mereka akan mendapatkan nilai yang sama setiap kali? Untuk menjelajahi ini, saya memutuskan untuk menggunakan gambar western blot lama dan melihat nilai berbeda apa yang bisa saya dapatkan tanpa berusaha menjadi bias.
Untuk memulai, saya menggunakan western blot di bawah ini. Karena ini hanya latihan intrik, saya hanya menganalisis band teratas pada tiga kolom terakhir.

6 komentar:

Ini adalah analisis yang sangat menarik, yang selalu saya pikirkan. Masuk akal bahwa ada variasi antara upaya Anda karena area di sekitar pita, dan saya ingin tahu apakah mungkin untuk mempertimbangkannya saat Anda melakukan analisis western blot. Sesuatu seperti replika teknis dari pemilihan area? Seperti yang Anda sebutkan, penting untuk mengoreksi kebisingan dan itu adalah langkah tambahan lain dari varians dan potensi bias. Saya ingin tahu apakah Anda melakukan analisis yang sama dengan kontrol pemuatan, dan kemudian menormalkan sinyal. Saya menyadari ini hanyalah eksperimen intrik yang cepat, dan sepertinya mungkin band teratas itu adalah kontrolnya, atau band palsu. Terlepas dari analisis Anda dapat menunjukkan konsekuensi dari jenis analisis ini, dan itu membuat
saya bertanya-tanya apakah kontrol pemuatan akan membantu. Atau jika itu hanya akan menjadi lapisan lain dari bias pemilihan area.
Hal ini juga menunjukkan bahwa terkadang kita sangat bergantung pada "signifikansi statistik" dari intensitas band ini. Sekali lagi, ini semua hanya saya yang mengamati pita ini tanpa mengetahui relevansi ilmiahnya (atau benar-benar eksperimen sama sekali), tetapi ketika saya melihat pita-pita itu, saya tidak melihat perbedaan intensitas. Karena analisis Anda mengatakan ada, penting untuk mengetahui apakah perbedaan ini relevan secara biologis.

Saya menemukan posting ini sangat menarik, lab saya adalah lab fisiologi dan kami mencoba untuk tidak melakukan western blot kecuali kami benar-benar harus melakukannya. Kami baru-baru ini harus melakukan beberapa (selalu berusaha untuk menyenangkan pengulas) dan ketika saya menganalisis data menggunakan ImajeJ saya mulai bertanya-tanya hal yang sama persis. Meskipun jalurnya paralel setelah Anda mengambil gambar, Anda harus memperhitungkan kebisingan, jumlah protein yang dimuat ke dalam gel Anda dan seperti yang Anda sebutkan bias yang dibuat saat Anda bertanggung jawab untuk memilih area yang tepat untuk kuantifikasi. Meskipun perbedaan jumlah protein terkadang dapat dideteksi dengan kuantifikasi mata telanjang dengan perangkat lunak, kita harus menyadari bias yang kita perkenalkan.
Seperti yang disebutkan Amanda, semua kuantifikasi kembali ke signifikansi dan p<0,05 ajaib! Namun, melihat adalah percaya sehingga ketika kami melihat bahwa jalur 1 Anda memiliki pita yang lebih tipis jika dibandingkan dengan jalur 6, dapatkah kami menganggapnya relevan secara eksperimental? Atau akankah kita selalu terjebak dalam paradigma kebermaknaan.

Ini benar-benar posting yang menarik bagi saya karena saya sudah lama bertanya-tanya tentang ini ketika saya pertama kali membuat Western Blot dan diberitahu bahwa saya dapat menggunakan ImageJ untuk menganalisis band. Sebenarnya saya telah melakukan banyak noda dalam beberapa tahun terakhir, tetapi hanya beberapa kali ketika saya benar-benar menggunakan ImageJ dan ingin melihat perbedaan intensitasnya. Ini tidak berarti tidak membantu sama sekali, tetapi saya akan merekomendasikan penggunaan ImageJ untuk menganalisis intensitas pita dengan hati-hati.

Ada beberapa faktor yang dapat membuat analisis ImageJ menjadi rumit. Hal pertama adalah sensitivitas reagen dan film yang Anda kembangkan atau sistem pencitraan yang Anda gunakan. Ada beberapa pilihan di luar dan yang kami gunakan di lab kami adalah sistem film tradisional dan tidak terlalu sensitif untuk membedakan sedikit perbedaan. Sebenarnya salah satu anggota lab kami pernah mencoba kontrol pemuatan, di mana dia memuat lisat protein yang sama dalam jumlah yang lebih besar, katakanlah, 2ug, 4ug, 8ug,20ug. Kemudian dia melakukan blot dan menganalisis dengan ImageJ dan dia tidak melihat peningkatan intensitas lipatan yang sama seperti yang dia muat di tempat pertama. Trennya benar, intensitas pasti lebih besar dengan lebih banyak pemuatan, tetapi intensitasnya tidak dua kali lipat dalam 4ug, atau 4 kali lipat dalam 8ug dibandingkan dengan pemuatan 2ug. Jadi saya akan meragukan jumlah kesimpulan yang dibuat oleh analisis intensitas ImageJ, apalagi melakukan analisis statistik setelahnya di bawah pengaturan lab kami.

Hal kedua yang saya ingat adalah bahwa bahkan jika Anda memiliki sistem yang sangat sensitif, Anda harus tetap memastikan bahwa apa yang Anda bandingkan telah dilakukan dalam satu percobaan dan dianalisis dalam satu kesempatan untuk mengurangi kemungkinan kesalahan atau bias. Seperti yang telah Anda tunjukkan di blog tentang pengaturan garis di bagian bawah untuk menghitung nilai di bawah kurva, ini juga bisa rumit karena Anda mungkin menggambar garis yang sangat berbeda pada periode analisis yang berbeda. Saya pikir ini terkait dengan satu kuliah di kelas kami bahwa Anda harus mengumpulkan semua data yang Anda butuhkan terlebih dahulu, dan kemudian Anda duduk dan menganalisisnya sesuai dengan rencana.

Dengan semua itu, itulah mengapa penasihat saya selalu mengatakan, "jangan gunakan imageJ untuk menganalisis data dan menunjukkan statistik, Anda harus terlebih dahulu membujuk saya melalui bola mata saya."

Terima kasih telah melakukan bukti kerja prinsip ini dengan ImageJ. Saya pikir penting bahwa Anda dapat menetapkan validitas pengukuran Anda sebelum digunakan untuk analisis eksperimental dan menarik kesimpulan darinya. Validasi ini tidak selalu diketahui oleh pembaca setelah publikasi dan saya bertanya-tanya tentang standardisasi dan kuantifikasi dengan teknik lain. Program kami baru-baru ini memiliki pembicara seminar yang memberikan ceramah tentang bakteri yang berkerumun yang menggabungkan atau tidak menggabungkan zona kawanan mereka di piring agar satu sama lain berdasarkan keterkaitan strain. Perilaku "merging" dilambangkan dengan apakah "garis batas" terbentuk di antara dua zona gerombolan. Beberapa gambar garis batas tidak jelas dan perbedaannya tidak tampak mutlak. Penetapan metode yang andal dan akurat untuk menentukan perilaku populasi, seperti yang telah Anda validasikan pada ImageJ di sini, akan benar-benar meningkatkan kepercayaan diri saya pada data dan kesimpulan pembicara. Harapan saya adalah seiring berkembangnya kami sebagai ilmuwan, kami akan mengambil pendekatan yang Anda miliki untuk mengejar integritas ilmiah dengan memvalidasi metode kami dan menjadi lebih berpengetahuan tentang kesimpulan yang memenuhi syarat untuk kami buat.

Dengan kuantifikasi ImageJ dari western blots, masalah utama yang saya hadapi, seperti yang Anda tunjukkan, adalah di mana harus menarik garis untuk menghilangkan noise. Saya diajari menggambar garis dari dataran tinggi (mewakili sinyal dasar/latar belakang) di satu sisi puncak ke dataran tinggi di sisi lain, sementara orang lain yang menganalisis data diajari menggambar garis dari minimum lokal di satu sisi. sisi puncak ke minimum lokal di sisi lain puncak. Kami terkadang mendapatkan hasil yang sangat berbeda sehingga kami memutuskan untuk menjalankan uji-t dua sampel untuk skor pada beberapa pemain barat kami untuk melihat apakah ada perbedaan antara skor saya dan skornya. Kami menemukan bahwa ada dan pada akhirnya kami harus membakukan metode penilaian kami. Kami datang dengan protokol untuk mencoba mencakup sebanyak mungkin variasi dan keadaan yang mungkin kami hadapi dan akhirnya penilaian kami tidak lagi berbeda secara signifikan. Namun, dalam proses pembuatan protokol ini kami berbicara dengan beberapa postdoc dan PI junior yang secara teratur menjalankan western dan masing-masing memiliki variasi sendiri tentang cara melakukan analisis ini. Saya tidak mengetahui protokol formal untuk analisis ImageJ dari Western, tetapi karena jarang (jika pernah) dilaporkan dalam metode bagaimana seseorang melakukan analisis ini (selain mereka melakukan analisis kuantitatif menggunakan ImageJ) dan mengingat sejauh mana pencetak gol dapat bervariasi metode mereka mungkin protokol yang lebih formal diperlukan. Jika data itu sendiri bias, tidak ada cara statistik yang dapat sepenuhnya mengoreksi itu.
Cara lab kami mungkin menjelaskan ini adalah standar yang kami lakukan sejauh data barat yang dapat dipublikasikan adalah, sementara itu penting untuk melakukan analisis kuantitatif pada western, jika Anda tidak dapat melihat hasilnya secara kualitatif (yaitu hanya dapat melihat pita itu ukuran berbeda dengan mata telanjang), terutama mengingat tingkat variasi yang ada dalam metode analisis kami, hasil Anda jauh lebih tidak dapat dipercaya dan mungkin harus diambil dengan sebutir garam, dan dengan demikian tidak akan dianggap dapat diterbitkan. Saya akan tertarik untuk mendengar apa praktik laboratorium Anda yang menjalankan western berkaitan dengan analisis kualitatif vs kuantitatif.

Western adalah roti dan mentega saya di sarjana dan bahkan kemudian menghitungnya membuat saya gugup dengan cara yang masih belum dilakukan plot aliran sekarang. Selalu terasa seperti posting metode #terlalu jujur ​​untuk mengatakan bahwa Anda memperhatikan tingkat kebisingan. Orang Barat juga selalu mengkhawatirkan saya dengan fakta bahwa setelah titik tertentu, Anda kehilangan sinyal yang lebih tinggi karena film dikembangkan sebaik mungkin, dan bagian yang terbuka saat ini cukup besar untuk membatasi area di sekitarnya yang juga dapat bereaksi. Orang Barat masih merupakan alat yang hebat, tetapi saya berharap kami memiliki metode kuantifikasi langsung yang lebih sedikit untuk menafsirkannya, atau kurang bergantung pada kuantifikasi tersebut vs ada/tidaknya atau perbedaan yang sangat jelas.


Bagaimana cara menentukan intensitas pita Western blot? - Siswa SMA yang membutuhkan bantuan untuk Pameran Sains! (Feb/03/2005 )

Saya melakukan eksperimen menggunakan Western Blot untuk proyek pameran sains saya.

Saya mendengar bahwa untuk menghasilkan grafik, intensitas pita harus dievaluasi menggunakan adobe photoshop 5.5 atau 7.0. Saya bertanya-tanya apakah seseorang dapat memberi tahu saya, langkah demi langkah bagaimana cara mendapatkan piksel/intensitas pita yang dihasilkan menggunakan program?

Terima kasih! Saya menghargai bantuan!

Saya mendengar bahwa ini dapat dilakukan dengan photoshop, tetapi saya tidak memiliki pengalaman langsung dalam hal itu. di lab kami, kami menggunakan ScionImage dari Scion Corp.

Anda bisa mendapatkan ini di sini, meskipun dukungan hanya diberikan kepada pelanggan yang membayar.

tapi kemudian, mungkin seseorang datang yang menggunakan PS untuk kuantifikasi dan dapat membantu Anda.

Hai
Saya tidak akan memberi tahu Anda prosedurnya tetapi saya ingin menunjukkan tentang kualitas kuantisasi. sejujurnya metode tunggal yang pernah saya dengar terdiri dari memuat ekstrak Anda pada GEL yang SAMA dan jumlah protein yang diketahui 2, 4, 6, 8, dll. dengan protein berbeda dengan berat molekul berbeda dan jika Anda menggunakan antibodi, untuk mengungkapkan film Anda dengan waktu eksposur yang sama (dalam praktiknya disebut corevelation). Jika Anda hanya menginginkan nilai perkiraan (tetapi tidak terlalu buruk), Anda dapat menggunakan photoshop seperti yang dikatakan oleh jadefalcon.

Hal pertama yang harus Anda lakukan adalah mendapatkan eksposur yang BAIK dari gel Anda. Ini berarti Anda JANGAN terlalu banyak mengekspos. Aturan praktisnya adalah Anda harus dapat melihat melalui pita (yaitu menempelkannya pada selembar kertas dan melihat apakah Anda dapat membaca teks tertentu melaluinya..)

Kedua, SEMUA band yang ingin Anda bandingkan harus di film yang sama. Kuantifikasi semuanya relatif terhadap satu pita yang Anda masukkan sebagai 1 (atau 100%).

1) Di PS, muat gambar Anda
2) Kemudian lakukan, Image>Adjust>Invert (dengan cara ini, Anda membalikkan skala)
3) Gambarlah sebuah kotak, yang menutupi SATU pita menggunakan Marquee Tool (lakukan pita terbesar terlebih dahulu, karena kotak HARUS berukuran sama sepanjang analisis. Dengan cara ini tidak perlu mempertimbangkan ukuran kotak )
4) Kemudian lakukan, Image>Histogram dan tuliskan Mean
5) Kemudian seret kotak ke band berikutnya dan ulangi
6) Terakhir, seret kotak untuk mengukur Mean dari Background, dan kurangi angka dari yang lainnya.
7) Bagi semua angka dengan nomor referensi Anda untuk satu set sebagai 1 (atau 100%)

Ini adalah cara yang SANGAT kasar untuk melakukannya, tetapi berikan Anda beberapa petunjuk tentang peningkatan/penurunan relatif ekspresi.

Ingatlah ketika Anda membuat gambar digital dari film Anda menggunakan pemindai, Anda perlu membuat gambar dengan kualitas setinggi mungkin. Kami memindai film kami dalam skala abu-abu dan menghasilkan file TIFF resolusi 1200 dpi.

Jangan membuat jpeg dari film Anda, jpeg berisi jauh lebih sedikit data gambar daripada file tiff.

Saya mencoba menggunakan gambar Scion di atas. Saya tidak punya pengalaman menggunakan photoshop untuk mengukur band juga.

Muat file tiff ke dalam gambar Scion. Saya tidak pernah menggunakan scion image, tetapi prinsipnya saya kira akan sama dalam program gambar apa pun. Saya yakin metode ini jauh dari sempurna, tetapi mungkin berhasil untuk Anda

Pertama gambar kotak di area yang tidak memiliki pita dan pilih analisis->measure. Ini akan memberi tahu Anda intensitas latar belakang gambar Anda (rata-rata), dan juga area kotak Anda Tulis angka-angka ini.

Selanjutnya, gambar ROI (wilayah minat) di sekitar pita yang ingin Anda ukur dan pilih ukuran analisis>. Sekali lagi Anda akan mendapatkan pengukuran area, dan pengukuran intensitas rata-rata. Tuliskan angka-angka ini. Ulangi ini untuk semua pita yang ingin Anda ukur.

Berhati-hatilah dalam membuat ROI Anda dan saya bereksperimen menggambar ROI dan membandingkan nilai yang Anda dapatkan darinya sampai Anda merasa dapat menggambarnya dengan benar dan mendapatkan pengukuran yang akurat.

Saya mungkin salah, tetapi untuk mengukur pita Anda, Anda harus mengalikan intensitas rata-rata dan luasnya untuk mendapatkan angka yang Anda inginkan. Lakukan ini juga untuk latar belakang Anda. Tuliskan angka-angka ini.

Selanjutnya kurangi nilai latar belakang (area x intensitas rata-rata) dari masing-masing nilai pita Anda (area x intensitas rata-rata)

Beri tahu saya jika ini masuk akal. Juga jika ada yang bisa meningkatkan metode yang saya jelaskan, jangan ragu untuk melakukannya

Saya tidak yakin bagaimana mengukur intensitas pita, tetapi ada perangkat lunak gratis bernama ImageJ (dari NIH) yang dapat diunduh dari internet yang digunakan lab kami untuk melakukan analisis densitometri pada Western blot kami.

Mengapa tidak memberikan alamat yang tepat.

nyg1234-
harap perhatikan tanggal posting terakhir itu

Saya curiga Anda bisa menemukan alamatnya jika Anda menggunakan google? atau, sebagai alternatif, mencari di situs NIH?

Satu lagi tentang kuantifikasi western blot dan Scion Image (atau ImageJ)…

Berikut adalah ilustrasi hasil yang saya dapatkan:

Dengan hasil seperti yang diilustrasikan pada gambar, bukankah lebih baik untuk memperhitungkan ukuran (area) pita dan bukan hanya intensitasnya.

Saya memiliki sedikit pengalaman menggunakan Scion Image tetapi, ketika menggunakan Gelplot Macro, saya hanya dapat memilih jalur yang berbeda dengan alat seleksi persegi panjang dan ukuran seleksi persegi panjang harus tetap sama untuk setiap jalur.

Alih-alih menggambar area yang diinginkan, saya ingin menggunakan pemilihan tongkat ajaib, tetapi ini menyiratkan ambang batas gambar, apakah itu ide yang bagus?

Apakah Anda menerapkan modifikasi apa pun (ambang batas/tingkatkan kontras/...) pada gambar sebelum pengukuran?

Alih-alih mengurangi nilai latar belakang tunggal untuk keseluruhan film (dari pemilihan persegi panjang yang diambil di mana saja pada film), apakah merupakan ide yang baik atau membuang-buang waktu untuk mengurangi nilai latar belakang ke setiap jalur (diambil tepat di atas atau di bawah yang sesuai jalur).


Pengantar

Sel diatur menurut dogma sentral, yaitu aliran dari informasi genetik ke ekspresi protein. Tingkat ekspresi protein menentukan nasib sel misalnya, tingkat ekspresi faktor transkripsi tertentu mengatur diferensiasi otot rangka [1]. Dengan demikian, sangat penting untuk mengukur ekspresi protein untuk memahami fenomena atau potensi seluler pada tingkat molekuler. Western blotting adalah metode standar untuk mengukur ekspresi protein [2]. Metode chemiluminescence umumnya digunakan untuk mendeteksi protein karena sensitivitasnya yang tinggi dan kemudahan penggunaannya [3, 4]. Namun, perkembangan terbaru dalam proteomik telah berfokus pada teknologi untuk mendeteksi ekspresi beberapa protein secara bersamaan, yang bertentangan dengan metode chemiluminescence yang mendeteksi protein tunggal. Salah satu metode untuk deteksi simultan dari beberapa protein yang memungkinkan analisis lebih kuantitatif adalah blotting barat fluorescent [5-7]. Namun, sensitivitas deteksi metode ini lebih rendah daripada metode chemiluminescence.

Dalam penelitian ini, untuk meningkatkan resolusi dan sensitivitas blotting barat fluoresen, kami fokus pada langkah mikroskop fluoresensi. Kamera CCD mikroskop mampu menangkap gambar beresolusi tinggi, tetapi memiliki bidang visual yang kecil. Jadi, kami menangkap gambar dengan resolusi tinggi dan bidang lebar dengan menggabungkan beberapa mikrograf fluoresensi. Selain itu, kami berhasil meningkatkan sensitivitas deteksi ke tingkat yang sebanding dengan metode chemiluminescence dengan mengoptimalkan filter dan pewarna fluoresen.


Cara menghilangkan autofluoresensi

Jika Anda mengalami masalah dengan autofluoresensi, hal pertama yang harus dilakukan adalah mencoba dan mengisolasi penyebabnya dengan menyelidiki sampel Anda. Saat Anda memulai eksperimen, jalankan kontrol tanpa label untuk menentukan apakah ada kontribusi terhadap fluoresensi latar belakang dari prosedur pewarnaan.

Penting juga untuk mengetahui spektrum autofluoresensi Anda. Ini dapat ditentukan dengan menggunakan pemindaian lambda spektral. Pemindaian spektral akan membantu pengoptimalan eksperimen dan menghindari puncak yang kuat dalam autofluoresensi.

Setelah Anda memiliki gagasan yang baik tentang spektrum autofluoresensi Anda, tahap selanjutnya adalah mengoptimalkan pilihan fluorofor Anda. Jika spektrum autofluoresensi dan fluorofor Anda tumpang tindih sangat dekat, maka ada kemungkinan besar sinyal Anda akan ditutupi oleh autofluoresensi. Dalam hal ini, pilih fluorofor dengan spektrum yang jauh dari autofluoresensi latar belakang Anda. Misalnya, jika autofluoresensi Anda berada di wilayah spektrum biru, pindahkan fluorofor Anda ke hijau atau merah.

Saat memilih fluorofor, pilih probe modern seperti Alexa Fluor, Dylight, atau Atto. Pewarna ini cenderung lebih cerah, lebih stabil, dan memiliki pita eksitasi dan emisi yang lebih sempit, sehingga lebih mudah untuk memilih hanya sinyal dari fluorofor Anda. Jika mikroskop Anda dapat mendeteksinya, pewarna merah jauh adalah cara yang sangat baik untuk menghindari masalah dengan autofluoresensi, karena panjang gelombang ini jarang ditemukan dalam sampel biologis. Mampu mendeteksi pewarna merah jauh memiliki manfaat tambahan untuk dapat memperluas jumlah saluran yang dapat digunakan untuk eksperimen multiwarna.

Dengan fluorofor yang dipilih, penting untuk tidak menjalankan eksperimen Anda secara membabi buta dengan konsentrasi yang tercantum pada tabung. Lebih sering daripada tidak, titrasi fluor phore akan diperlukan, menguji konsentrasi yang berbeda pada sampel Anda. Ini adalah posisi terendah Anda untuk melihat konsentrasi mana yang memberi Anda diferensiasi terbaik dari latar belakang Anda dan autofluoresensi terendah. Gunakan instruksi pabrik sebagai panduan dan buat rangkaian pengenceran fluorofor untuk mencakup kisaran sedikit di bawah dan sedikit di atas penggunaan yang disarankan. Uji pengenceran ini terhadap sampel Anda untuk mengetahui mana yang akan memberi Anda sinyal yang paling berguna.

Optimalkan pengaturan mikroskop Anda

Pengaturan pada mikroskop confocal Anda memainkan peran besar di mana sinyal terlihat pada gambar Anda, termasuk autofluoresensi. Gunakan pengaturan ini untuk keuntungan Anda untuk memotong sebanyak mungkin sinyal autofluoresensi dengan mengadaptasi deteksi spektral. Ada berbagai cara untuk melakukan ini tergantung pada mikroskop, tetapi opsi yang paling fleksibel adalah memilih laser cahaya putih yang digabungkan dengan detektor spektral. Ini berarti bahwa Anda dapat secara tepat menyetel panjang gelombang cahaya yang mencapai sampel Anda serta panjang gelombang yang melewati detektor. Hal ini memungkinkan kontrol yang sangat halus saat memilih sinyal mana yang direkam dalam gambar yang diambil, dan memberikan banyak kesempatan untuk menghilangkan autofluoresensi.

Gambar 1: Saat membandingkan spektrum autofluoresensi dan fluorofor, pilih fluorofor yang tidak tumpang tindih dengan sinyal autofluoresensi.

Memperlakukan sampel Anda untuk menghindari autofluoresensi

Autofluoresensi sering kali tidak berasal dari sampel, tetapi dari cara perlakuannya sebelum pencitraan. Misalnya, media pemasangan, media kultur jaringan, dan plastik laboratorium semuanya dapat menjadi sumber autofluoresensi.

Jika Anda menjalankan eksperimen pencitraan sel hidup, maka pertimbangkan untuk mengganti media kultur normal Anda dengan media bebas fenol merah yang telah dihangatkan sebelumnya atau larutan garam buffer bening sebelum pencitraan. Selain indikator pH phenol red, yang sangat berfluoresensi saat dieksitasi pada 440 nm, media kultur dan suplemen seperti FBS dapat mengandung banyak protein dan molekul kecil dengan sinyal fluoresennya sendiri—semuanya dapat ditambahkan ke latar belakang autofluoresensi yang kuat. jika mereka tidak dihapus. Jika Anda memutuskan untuk mengganti sel Anda ke jenis media baru untuk pencitraan langsung, penting untuk menyadari bahwa ini dapat menyebabkan perubahan tak terduga dalam perilaku dan fenotipe sel, jadi tergantung pada apa yang Anda pelajari, Anda mungkin perlu menyesuaikan sel untuk media baru terlebih dahulu.

Anda juga perlu mengukur autofluoresensi dari piringan pencitraan yang Anda gunakan dengan pengaturan mikroskop yang sama untuk melihat apakah ini merupakan sumber autofluoresensi. Jika ya, coba gambar menggunakan cawan kultur dengan jendela kaca atau cawan beralas kaca yang dirancang khusus untuk dilepas
sinyal autofluoresensi.

Masalah serupa juga dapat dilihat saat pencitraan biopsi dan sampel jaringan yang telah terpapar bahan kimia. Contoh umum adalah saluran pencernaan, yang dapat memiliki sejumlah besar autofluoresensi jika terkena antibiotik seperti tetrasiklin yang memiliki tanda fluoresen yang kuat. Dalam hal ini, fluoresensi dapat dengan mudah dihilangkan dengan pembilasan menyeluruh dengan buffer saline atau penggunaan pelarut secara hati-hati.

Jika Anda memperbaiki sel, metode fiksasi dapat berdampak besar pada autofluoresensi. Pertimbangkan alternatif formalin dan glutaraldehid, dan cobalah untuk tidak menyimpan sampel tetap terlalu lama sebelum pencitraan, karena autofluoresensi dapat meningkat seiring waktu.

Meskipun menghilangkan autofluoresensi melalui desain eksperimental adalah optimal, terkadang hal itu tidak mungkin dilakukan. Dalam kasus ini, mungkin ada solusi komputasi untuk masalah autofluoresensi Anda. Dengan menggunakan perangkat lunak mikroskop atau solusi sumber terbuka seperti ImageJ, dimungkinkan untuk menganalisis piksel yang mengandung fluoresensi aut dan mencoba menguranginya dari keseluruhan gambar [1]. Namun, berhati-hatilah, bahwa pendekatan komputasional bisa rumit. Ada banyak metode dan algoritme yang berbeda untuk dipilih, jadi ada baiknya mencoba beberapa untuk melihat mana yang bekerja dengan baik. Penting untuk diingat bahwa metode ini sering kali dapat mengurangi kekuatan sinyal fluorofor Anda serta autofluoresensi, jadi gunakanlah dengan hati-hati dan perhatikan bahwa sering kali ada kompromi antara meningkatkan kontras dengan dasar dasar dan mengurangi intensitas sinyal Anda.

Menghapus autofluoresensi setelah fiksasi

Setelah sampel Anda disiapkan dan disimpan di dalam freezer, sepertinya ada autofluoresensi yang tetap ada. Meskipun lebih mudah untuk menghilangkan autofluoresensi pada tahap persiapan sampel, tentu ada langkah-langkah yang dapat diambil bahkan pada tahap selanjutnya dalam proses tersebut.

Ada banyak perawatan kimia yang dapat melemahkan sinyal autofluoresensi. Beberapa di antaranya tersedia secara komersial, sementara yang lain dapat dengan mudah disiapkan menggunakan bahan kimia laboratorium umum seperti natrium borohidrida, Sudan black B, amonium etanol, dll. [2,3].

Pemutihan foto cenderung memiliki konotasi negatif dalam mikroskop, yang dikaitkan dengan kehilangan sinyal fluoresen Anda setelah menghabiskan waktu lama mencari gambar terbaik dengan laser yang muncul sedikit terlalu tinggi. Namun, untuk autofluorescence, bleaching bisa menjadi teman Anda. Sebelum menambahkan fluorofor, Anda dapat memperlakukan sampel dengan lampu LED intensitas tinggi untuk memutihkan semua autofluoresensi latar belakang. Setelah itu, fluorofor pilihan Anda akan jauh lebih kontras dengan latar belakang yang diputihkan [4]​​​​​.


HASIL DAN DISKUSI

Latihan laboratorium ini membutuhkan 2 atau 3 periode laboratorium untuk diselesaikan (lihat Tabel I untuk garis waktu). Pada hari pertama, biakan kaldu LB cair (2 ml) diinokulasi dari koloni terisolasi di piring yang sebelumnya dicoret dan diinkubasi oleh asisten pengajar atau instruktur. Pada waktu yang diinginkan (baik bersamaan dengan inokulasi awal, yang telah kami lakukan secara rutin, atau setelah waktu pertumbuhan tertentu), induser ditambahkan ke kultur (IPTG untuk lac operon dalam sel DH5α, arabinosa untuk plasmid pGLO dalam sel HB101, dan inkubasi dilanjutkan pada suhu 37 °C dengan pengocokan. Setelah waktu inkubasi yang ditentukan (5 atau 6 jam hingga semalam), 1,5 ml kultur dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi, dan sel-sel dipelet dengan sentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 2 menit. Setelah resuspensi dalam buffer pemuatan 1× SDS, sampel dapat langsung dimasukkan ke dalam gel poliakrilamida untuk elektroforesis atau disimpan pada suhu -20 °C hingga digunakan. Elektroforesis dan pemrosesan dapat dilakukan pada hari yang sama, namun jika demikian maka transfer protein ke membran PVDF perlu juga dilakukan pada hari yang sama. Setelah transfer, membran dapat disimpan pada suhu 4 °C selama 1 atau 2 hari, atau dapat langsung dibawa ke langkah pemblokiran diikuti dengan inkubasi semalam dengan antibodi primer. Langkah-langkah ini semua dapat dilakukan dalam satu periode sekitar 3 jam atau dibagi menjadi 2 hari. Pencucian, inkubasi dengan antibodi sekunder, dan pengembangan menggunakan substrat chemiluminescent semua harus dilakukan dalam 1 hari dan juga harus memakan waktu sekitar 3 jam.

Hasil khas siswa untuk analisis lac kontrol operon ditunjukkan pada Gambar. 3A. Seperti dapat dengan mudah dilihat, ada peningkatan sinyal untuk protein -galaktosidase dengan adanya penginduksi IPTG, tetapi masih ada sejumlah besar sinyal tanpa adanya penginduksi. Perbedaan ini lebih terlihat untuk sampel yang ditumbuhkan untuk waktu yang lebih singkat (5 atau 6 jam bila dibandingkan dengan 10 jam). Perbedaan ini bukan disebabkan oleh perbedaan total protein, seperti yang dapat dilihat dengan perbandingan jumlah protein di setiap jalur dalam gel pewarnaan Coomassie Blue yang identik (Gbr. 3B). Untuk kultur semalam, ada sedikit perbedaan sinyal untuk -galaktosidase antara sampel protein yang tidak diinduksi dan diinduksi (Gbr. 4). Hasil ini sesuai dengan temuan yang dipublikasikan bahwa kontrol menurun pada kultur fase diam [5].

Analisis Western blot dari ekspresi -galaktosidase dalam sel bakteri yang diinduksi dan tidak diinduksi. A, sel DH5α diinkubasi dengan adanya (+) atau tidak adanya (−) dari penginduksi IPTG seperti yang dijelaskan di bawah "Bahan dan Metode" untuk waktu yang ditunjukkan pada bawah dari gambar. Protein total dipulihkan dan dipisahkan oleh SDS-PAGE, dipindahkan ke membran PVDF, dan diinkubasi dengan antibodi anti-β-galaktosidase tikus. Deteksi dilakukan dengan chemiluminescence menggunakan antibodi anti-mouse-HRP. B, Gel diwarnai Coomassie Blue menunjukkan protein total dari sel terinduksi (+) dan tidak terinduksi (−). Gel dimuat secara identik dengan gel yang digunakan untuk Western blot yang ditunjukkan pada gambar A. M, protein penanda yang termasuk dalam gel (spidol tanpa noda Bio-Rad Precision, dengan berat molekul dari atas ke bawah 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, dan 10 kDa).

Western blot dari ekspresi -galaktosidase dalam kultur semalam (fase diam). Seperti dapat dilihat, tampaknya ada sedikit perbedaan antara sampel protein yang tidak diinduksi dan diinduksi.

Hasil dari Western blot siswa dari operon arabinosa ditunjukkan pada Gambar. 5. Dua jalur pertama mengandung protein total dari lisat sel kultur semalam yang tumbuh dengan adanya (+) dan tidak adanya (−) arabinosa, penginduksi untuk operon. Blot telah diinkubasi dengan antibodi poliklonal terhadap GFP, yang merupakan produk dari gen reporter yang terkait dengan promotor arabinosa dalam konstruk. Sinyal yang kuat untuk ukuran GFP diamati untuk sampel yang diinduksi, sedangkan tidak ada sinyal yang terdeteksi yang diamati di jalur yang tidak diinduksi. Pita berat molekul yang lebih tinggi adalah protein yang tidak terkait yang bereaksi silang dengan antibodi. Beberapa sampel menjadi sasaran imunopresipitasi untuk mengkonsentrasikan GFP, seperti yang dapat diamati oleh pita GFP yang sangat terkonsentrasi di jalur IP+ (Gbr. 5). Untuk kultur semalam yang ditumbuhkan tanpa penginduksi arabinosa, pita dengan ukuran yang sesuai terdeteksi, tetapi intensitasnya jauh lebih rendah jika dibandingkan dengan jalur sampel yang diinduksi. Pita ini hampir tidak terdeteksi dalam sampel yang tidak diinduksi yang ditumbuhkan hanya selama 5 jam. Variasi diamati antara sampel dan mungkin akibat perbedaan lama waktu pertumbuhan sampai dan setelah induksi dan perbedaan kecil pada suhu inkubasi. Perbedaan pasca inkubasi lainnya juga dapat menyebabkan variasi, termasuk pelet yang tidak mencukupi atau resuspensi sel bakteri, denaturasi protein yang tidak lengkap sebelum SDS-PAGE, kesalahan dalam pemuatan gel, dan langkah transfer atau pasca transfer.

Analisis Western blot ekspresi GFP dari promotor yang dapat diinduksi arabinosa. Strain inang HB101 yang membawa plasmid pGLO ditumbuhkan dengan adanya (+) atau tidak adanya (−) penginduksi arabinosa semalaman, total protein diisolasi seperti sebelumnya (untuk panel kiri, berlabel L untuk lisat), dan sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE. Protein kemudian dipindahkan ke membran PVDF dan diinkubasi dengan antibodi anti-GFP kelinci seperti yang dijelaskan di bawah "Bahan dan Metode." NS panel kanan termasuk sampel yang ditumbuhkan dengan adanya (+) atau tidak adanya (-) penginduksi semalaman atau selama 5 jam, seperti yang ditunjukkan, setelah konsentrasi oleh IP. M adalah jalur penanda yang mengandung protein berlabel (penanda 30 dan 40 kDa dapat diamati). NS panah menunjukkan ukuran protein GFP 29-kDa. Pita berat molekul yang lebih tinggi tampaknya disebabkan oleh artefak yang bereaksi silang dari sel.

Potensi Masalah/Pemecahan Masalah

Weak signals may be due to one or more of the following: insufficient transfer from gel to membrane, incorrect transfer buffers, incubation with antibody was not long enough, or antibody is too dilute.

Too much background can result from using too much antibody or from allowing the membrane to dry out during the incubation steps. Enough solution should be used to keep the membrane completely submersed but without wasting excess solution and antibody. We have found that a pipette tip box lid is an ideal size for holding 20–30 ml of solution. The proper dilution of antibody needs to be empirically determined.

Suboptimal immunoprecipitation conditions may lead to reduced protein signal or an increase in nonspecific bands and background staining following Western analysis. Salt and detergent concentrations in the IP buffer can be adjusted as needed to maximize efficiency and specificity.

Questions for Classroom Discussion

What is the basis of any differences in the amount of β-galactosidase observed in Western blots relative to time of growth?

Does there appear to be more control of gene expression in the logarithmic stage of growth versus stationary phase?

Why should the time when inducer is added to the culture affect expression levels if the cells are grown to the same final density?

How might temperature of culture incubation affect expression what would be some possible reasons for altering the temperature?

Upon comparison, does the ara promoter show greater or lesser control over gene expression when compared with the lac promoter?

How does immunoprecipitation enhance detection levels of proteins?

When would lac promoter constructs have the advantage over ara promoter constructs?

For what applications would the ara promoter be most useful?

What modifications to either promoter might be useful to obtain optimal expression under specific growth conditions?


Hasil dan Diskusi

Optimization of PCFT expression

In pilot studies where we varied the number of viral particles per cell (multiplicity of infection, MOI) and density of Sf9 cells grown in a 50-ml suspension culture, we found that PCFT expression was better at a MOI of 2 and a density of 2 x 10 6 cell/ml. Fig 1A shows PCFT expression under these conditions, as a function of time after infection. For each timed sample, we determined cell viability and PCFT expression by Western blot. PCFT expression peaked 48 h post-infection with a cell viability of

40%. In summary, the following conditions yielded the best PCFT expression: Sf9 cells infected at a density of 2 x 10 6 cell/ml with a MOI of 2 and harvested 48 h after infection.

A. Sf9 cells in 50 ml suspension culture at a density of 2 x 10 6 cells/ml were infected at a MOI of 2. One-ml whole cell samples were collected at the indicated time points, electrophoresed on a 4–15% Mini Protean TGX Precast SDS-PAGE gel (BioRad), transferred to a PVDF membrane, and immunoblotted using an antibody against the His6 tag of PCFT. PCFT bands were observed at

43 kDa. The highest PCFT expression was observed 48 h post infection. No PCFT expression was observed at the time of infection (0 h) or in uninfected cells after 48 h (uninf). B. Treatment of membrane vesicles with PNGase F under non-denaturing conditions shifted the PCFT band from

39 kDa (each lane treated with PNGase corresponds to a different sample preparation).

The whole cell samples used for the initial expression investigations yielded two close bands (

43 kDa) in Western blots. N-linked glycosylation of two asparagine residues within the first extracellular loop has been observed in recombinant human PCFT expressed in mammalian cells or Xenopus laevis oocytes [26, 31]. In these expression systems, treatment with PNGase F shifted the PCFT band in Western blots from

35 kDa. Insect cells can add compact, relatively homogenous α1–6 fucosylated Man3GlcNAc2 sugar moieties [32] of

16 kDa per glycosylation site [33]. Therefore, we suspected that the band with slower mobility in our blots corresponds to glycosylated PCFT localized at the plasma membrane, whereas the faster band corresponds to non-glycosylated PCFT. Isolation of membrane vesicles and solubilization yielded samples highly-enriched in the 43 kDa species (Fig 1B control). Consistent with glycosylation, PNGase treatment shifted the slower mobility band to a band of higher mobility (Fig 1B). In our hands, PCFT bands obtained from Sf9 whole cell lysates correspond to approximate molecular weights of 43 for glycosylated PCFT and 39 for deglycosylated PCFT.

Detergent screening for solubilization of PCFT

DDM has been widely used as a detergent to solubilize and study membrane proteins, including MFS transporters [34–43]. In pilot experiments to identify detergents suitable for solubilization of PCFT from Sf9 membranes we tested nine different detergents (concentrations in % w/v), including nonionic (0.5–2% DDM, 1–2% UDM, 0.5–2% DM, 1.25% and 4.5% OG, 1.25% NG, 1% DMNG) and zwitterionic detergents (0.5% AZ, 1% and 2.5% CHAPS and 1% FS-12). PCFT in Sf9 membranes was solubilized with these detergents, centrifuged at high-speed to separate solubilized proteins (supernatant) from unsolubilized material (pellet), separated by SDS-PAGE, and visualized by Western blot. The efficiency of solubilization was assessed by comparing the intensity of the PCFT band after solubilization to that of the control band (unsolubilized, non-centrifuged sample). PCFT in the Sf9 membranes was solubilized quantitatively (

90 to 100%) with 1 or 2% DDM, 1% FS-12 or 0.5% AZ (Fig 2). DDM consistently yielded very high efficiency in solubilization (> 70%). Based on this and its widespread use, we used DDM for all subsequent preparations.

Nine different detergents were used at the indicated concentrations to analyze solubilization of PCFT from membranes isolated from Sf9 cells. After a 2-h incubation, solubilized supernatants and pellets were analyzed using 4–15% MiniProtean TGX Precast SDS-PAGE gels, transferred to PVDF membranes and immunoblotted for detection with an antibody against the His6 tag of PCFT. First lane (Total protein) is the total amount of PCFT in Sf9 crude membranes before solubilization, and the second lane is a sample without detergent. (A) Non-solubilized pellets of the initial screen, (B) solubilized supernatants of the initial screen, and (C) solubilized supernatants with increased OG and CHAPS concentrations. See text for detergent abbreviations.

Affinity purification

We enriched PCFT from solubilized membrane proteins by liquid chromatography based on the affinity of its His6 tag for transition metals. The PCFT eluted from a TALON Co 2+ resin was significantly cleaner than that eluted from a resin containing immobilized Ni 2+ (data not shown). The His6-tagged PCFT eluted from the Co 2+ resin with 200 mM imidazole migrated at ca. 43 kDa in a 4–15% MiniProtean TGX Precast SDS-PAGE gel and showed a high degree of purity (Fig 3).

PCFT was reconstituted in liposomes as described in Experimental Procedures. Purified protein and reconstituted PCFT were subjected to SDS-PAGE (4–15% MiniProtean TGX Precast gel). (A) Protein staining (Stain-free gel, BioRad) and (B) Western blot of the same gel analyzed using an antibody against the His6 tag of PCFT. Lane 1: purified protein eluted from the Talon Co 2+ resin lane 2: PCFT reconstituted in proteoliposomes.

Size-Exclusion Chromatography (SEC) analysis

DDM-solubilized PCFT purified by immobilized Co 2+ affinity chromatography was purified further by SEC, with an overall yield of pure PCFT of

0.9 mg/l culture. Based on PCFT’s elution volume of 11.4 ml and the elution profiles of protein standards, the calculated molecular mass of the PCFT-DDM complex was

280 kDa (Fig 4) consistent with a large amount of detergent, as has been observed previously for other 12 transmembrane segment transporters [44]. Alternatively, our purified PCFT could be an oligomer, but this seems unlikely because we have shown that the monomer is the human PCFT structural/functional unit in membranes of mammalian cells and frog oocytes [26].

(A) Elution profile of PCFT solubilized in DDM. Elution volumes of standard proteins are indicated as follows: thyroglobulin (T, 669 kDa), ferritin (F, 440 kDa), aldolase (A, 158 kDa), conalbumin (C, 75 kDa), ovalbumin (O, 44 kDa). Blue dextran (BD, 2 MDa) was used for void volume determination. (B) PCFT fraction corresponding to the peak PCFT elution fraction was analyzed by protein staining (BioRad stain-free imaging). (C) The partition coefficients (Kav) of the standard proteins are plotted against the log of their molecular weights to calculate the size of the PCFT-DDM complex, yielding an apparent size of 280 kDa.

Functional characterization

Specific uptake of folic acid in Sf9 cells.

The uptake of 3 H-folic acid in Sf9 cells expressing PCFT and uninfected cells was measured over 10 min at pH 5.5 [29]. The time course of folic acid uptake was not examined in the present study, but Fig 5A shows that the uptake in cells expressing PCFT was significantly higher than in uninfected cells, and was reduced in the presence of a 200-fold excess of cold (unlabeled) folic acid (one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test, P < 0.0001). These data indicate that PCFT expressed at the plasma membrane in Sf9 cells is functional. Fig 5B shows that the uptake measured at pH 5.5 over 10 min was concentration dependent, with a KM for 3 H-folic acid uptake of 1.94 ± 0.20 μM (n = 3). This KM is similar to that reported in mammalian cells (1.7 μM in HEK 293 cells)[29] and x. laevis oocytes (1.3 μM)[9].

(A) 10-min uptake of 500 nM 3 H-folic acid (FA) by PCFT-expressing Sf9 cells determined at pH 5.5. Data are means ± SD. The value in Sf9 cells expressing PCFT (PCFT) was significantly different from that of uninfected cells (Control) (1-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test, P ≤ 0.0001, ****). Uptake was reduced significantly in the presence of a 200-fold excess of unlabeled folic acid (PCFT + Ex FA) (1-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test, P ≤ 0.0001, ****). The difference between the PCFT + Ex FA and Control was not significant (ns). (B) Concentration dependence of the 3 H-folic acid uptake in PCFT-expressing Sf9 cells (PCFT) and uninfected cells (Control). Data was fit using the Michaelis Menten equation (Graphpad Prism, San Diego, CA).

Functionality of lipid reconstituted PCFT.

Affinity purified PCFT was concentrated to 0.6 mg/ml and reconstituted in unilamellar liposomes as indicated under Experimental Procedures. The protein staining of SDS-PAGE gel and Western blot analysis in Fig 3 show the presence of PCFT in the proteoliposomes. PCFT function was demonstrated by the 30-s uptake of 300 nM 3 H-folic acid (Fig 6), where PCFT-proteoliposomes showed significantly higher uptake of 3 H-folic acid than liposomes (t-test: L vs. PCFT-PL P = 0.008, r 2 = 0.86 one preparation, n = 3). These results demonstrate reconstitution of functional PCFT in liposomes.

The 30-s uptake of 300 nM 3 H-folic acid (FA) into unilamellar PCFT-proteliposomes (PCFT-PL) was measured at pH 5.5. Unilamellar empty liposomes (L) served as control. The uptake in PCFT-PL was significantly higher than that in liposomes (t-test: L–PCFT-PL P = 0.008, r 2 = 0.86 one preparation, n = 3).


Hasil

Peroxisome fission is important for degradation

To analyze whether peroxisome fission is important for glucose-induced selective peroxisome degradation (macropexophagy), we analyzed this process in wild-type H. polymorpha as well as in two mutant strains (dnm1 dan pex11) that are strongly impaired in peroxisome fission. 19 , 20 In line with earlier observations, the levels of the peroxisomal marker protein alcohol oxidase (AO) gradually decreased in the wild-type control upon induction of macropexophagy by glucose ( Fig.ꀚ and B ). However, in both dnm1 dan pex11 cells, no significant reduction of AO protein levels was observed. A similar result was obtained in the atg11 control strain, which is defective in selective pexophagy. 21 These results suggest that a reduction in peroxisome fission affects glucose-induced macropexophagy.

Figureਁ. Reduced peroxisome degradation in H. polymorpha dan S. cerevisiae fission mutants. (A) Pexophagy was induced by glucose in H. polymorpha cells grown for 20 h on methanol. Equal volumes of cultures were loaded per lane. Western blots decorated with anti-alcohol oxidase (α-AO) antibodies show no significant reduction in AO levels in the peroxisomal fission mutants dnm1 dan pex11, similar to the atg11 control, which is blocked in pexophagy, whereas AO levels gradually decreased in the wild-type control as expected. (B) Densitometry quantification of the blots shown in (A). The amount of AO protein present at t = 0 h was set to 100%. The bar represents the standard error of the mean (SEM). (**p < 0.01). (C) Western blot analysis showing thiolase levels of S. cerevisiae cells grown on oleate and subsequently diluted into SD(-N) medium to induce peroxisome degradation. Samples were harvested at different time points, and equal amounts of protein were loaded per lane. There is no significant decrease of thiolase in the dnm1vps1∆ double mutant where the peroxisomal fission is completely blocked. A similar result was obtained for the atg1 control strain. In the wild-type and the single vps1 dan dnm1 deletion strains degradation occurred. (D) Quantification of thiolase blots shown in (C). The level of thiolase protein at t = 0 h was set to 100%. Levels were adjusted to the loading control glucose-6-phosphate dehydrogenase (not shown). The bar represents the SEM (**p < 0.01). (E) Constitutive peroxisome degradation is reduced in H. polymorpha fission mutants. Cells were grown on methanol for 16 h. Western blots were prepared using crude extracts and anti-GFP antibodies to detect Pmp47-GFP and GFP degradation products. The data show that the levels of the cleaved fusion protein (lower band) are reduced in pex11 dan dnm1 cells, relative to the wild-type control. Equal concentrations of protein were loaded per lane. (F) Quantification of blots shown in (E). The levels of full-length Pmp47-GFP proteins were arbitrarily set to 100%. The levels of cleaved GFP (lower band) are indicated as percentage of the full-length fusion protein. The bar represents the SEM (*p < 0.05 **p < 0.01).

To rule out that the observed block in pexophagy is not related to the fission defect in H. polymorpha dnm1 atau pex11 cells, but related to a direct function of fission proteins in pexophagy, we performed a control study using Saccharomyces cerevisiae. Different from H. polymorpha, in baker’s yeast, Dnm1 and Vps1 have redundant functions in peroxisome fission. Consequently, single dnm1 dan vps1 mutants are only partially affected in peroxisome fission and thus can be analyzed for a direct function of these proteins in pexophagy. 22 As shown in Figureꀜ and D , single S. cerevisiae dnm1 dan vps1 mutants were not blocked in glucose-induced pexophagy, whereas cells of the dnm1 vps1 double mutant, which has a major peroxisome fission defect, were impaired in peroxisome degradation.

Menggunakan H. polymorpha strain that produces the peroxisomal membrane protein Pmp47 fused to green fluorescent protein (Pmp47-GFP), we analyzed constitutive peroxisome degradation in methanol-grown cells of H. polymorpha wild type and both dnm1 dan pex11 mutant strains using western blot analysis and anti-GFP antibodies ( Fig.ꀞ ). As expected, in extracts of wild-type cells in addition to the band representing the full-length Pmp47-GFP fusion protein, a faster migrating band consisting of cleaved GFP was also evident, indicative of constitutive pexophagy. The ratio of the amount of cleaved GFP relative to the full-length fusion protein was reduced in dnm1 dan pex11 cells compared with wild-type controls ( Fig.ꀟ ), indicating that constitutive autophagy of peroxisomes is also affected in H. polymorpha pex11 dan dnm1 sel. 23 Summarizing these data indicates that in yeast peroxisome fission is required for pexophagy.

Intra-peroxisomal protein aggregates affect growth and cause oxidative stress

Next, we addressed whether peroxisome fission acts in quality control of the organelles. For this we took advantage of earlier observations that production of a mutant variant of catalase, designated Cat mut , produced in wild-type H. polymorpha (i.e., also producing the endogenous catalase protein) forms enzymatically inactive protein aggregates in the peroxisomal lumen. 13 Peroxisomes containing these protein aggregates were used as a model for aberrant peroxisomes in this study.

First, we tested whether the presence of peroxisomal protein aggregates had physiological consequences. As shown in Figureꀪ cultures of the Cat mut strain showed a reduced yield. Remarkably, the specific catalase activities in cell extracts of cells of the Cat mut strain (185 U/mg) were enhanced relative to that of the wild-type control (130 U/mg). ROS measurements indicated that at all time points examined, the cells containing peroxisomal protein aggregates had enhanced ROS levels relative to the wild-type control ( Fig.ꀫ ).

Figureਂ. The effect of peroxisomal protein aggregates on growth and ROS levels. (A) Final optical densities of wild-type, dnm1 dan pex11 cells, producing or not producing Cat mut , upon growth on methanol as sole carbon source for 40 h. Cell were extensively precultivated in glucose medium and subsequently shifted to medium containing methanol. Final optical densities are expressed as adsorption at 660 nm. The bar represents the SEM (*p < 0.05). (B) ROS levels in cells at different time points after the shift of glucose-grown cells to methanol medium. The mean intensity was measured by FACS. Cat mut cells show an enhanced ROS production relative to wild-type controls. The bar represents the SEM (*p < 0.05 **p < 0.01).

Intraperoxisomal protein aggregates are removed by fission and degradation

To substantiate whether the protein aggregates induce peroxisome fission, we introduced Cat mut in the H. polymorpha atg1 mutant, in which autophagic degradation of peroxisomes is blocked. 24 In order to visualize peroxisomes we introduced the fluorescent peroxisomal membrane marker Pmp47-GFP. Fluorescence microscopy analyses of cells, cultivated for 16 h on methanol, revealed that the Cat mut -producing atg1 strain contained, in addition to the normal organelles, relatively small organelles that were not observed in the atg1 parental strain ( Fig.ꀺ ). This result was confirmed by electron microscopy analysis of KMnO4-fixed cells ( Fig.ꀻ ) and also showed the presence of aggregates in the small organelles ( Fig.ꀻ ). Subsequent analysis, however, revealed that small organelles were not evident by fluorescence microscopy of wild-type cells producing Cat mut ( Fig.ꀺ ), whereas electron microscopy revealed that these cells harbored fewer small aggregate-containing peroxisomes relative to the atg1 strain producing Cat mut . Apparently, the small separated organelles were rapidly removed in the wild-type background. This process was further analyzed by electron microscopy. These analyses revealed that once formed, aggregates migrated to the periphery of the organelle where they were included in the buds that subsequently split off from the mother organelle ( Fig.ꀼ ).

Figureਃ. Microscopy analysis of H. polymorpha atg1, atg1-Cat mut and wild-type-Cat mut cells. Cells were grown on glycerol/methanol for 16 h. Peroxisomal membranes are marked by Pmp47-GFP. (A) Relative to the atg1 control, the atg1-Cat mut strain contains multiple small peroxisomes, which was not evident in wild-type-Cat mut cells. The bar represents 1 µm. The peroxisomal phenotype was confirmed by electron microscopy (B). Note the presence of protein aggregates in many of the organelles in atg1-Cat mut cells of which fewer are observed in wild-type-Cat mut cells. The bar represents 0.5 µm. (C) Ultrathin sections of KMnO4-fixed atg1-Cat mut cells showing different stages of the formation of a small peroxisome containing a protein aggregate. The bar represents 0.2 µm. (D) Electron micrographs, showing details of dnm1.atg1 cells (left panel) and pex11.atg1 cells (right panel) producing Cat mut , demonstrating the presence of aggregates in the enlarged peroxisomes in these cells. The bar represents 0.2 µm. P, peroxisomes M, mitochondria N, nucleus V, vacuole.

To further address their degradation, we cultivated the H. polymorpha Cat mut strain on a mixture of glycerol/methanol and subsequently administered 1 mM of the protease inhibitor phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) to the culture to reduce the rate of degradation of autophagic bodies in the vacuole. Electron microscopy analysis of these cells showed that at the onset of the experiment vacuoles in Cat mut -producing cells contained very low numbers of autophagic bodies ( Fig.ꁊ and B ). However, after 2 ( Fig.ꁌ and D ) and 4 h ( Fig.ꁎ and F ) of PMSF administration the accumulation of aggregate containing organelles in the vacuole was evident. These structures were not observed in the wild-type control. The presence of catalase protein was confirmed by immunocytochemistry ( Fig.਄G and H ). These data suggest that peroxisomes with protein aggregates are delivered to the vacuole for autophagic degradation. In conclusion, we showed that protein aggregates, which accumulated in the peroxisomal lumen are removed by concerted fission and degradation events.

Figure਄. Catalase aggregates are degraded by autophagy. H. polymorpha wild-type and Cat mut cells were cultivated on glycerol/methanol for 12 h and subsequently treated with 1 mM PMSF (t = 0). Electron micrographs of KMnO4-fixed Cat mut cells [at t = 0 h (B)], [at t = 2 h (D) and t = 4 h (F)] revealed progressive accumulation of autophagic bodies containing peroxisomes with protein aggregates that are not observed in wild-type cells (A, C and E). Immunocytochemical localization of catalase shows that labeling is confined to peroxisomes of wild-type cells (G) and is also abundant in the vacuole of Cat mut cells (H). M, mitochondria N, nucleus P, peroxisomes V, vacuole. The bar represents 0.5 µm.

Degradation of aggregates is reduced in dnm1, pex11 and atg11 sel

Clearly, the separation of small aggregate-containing peroxisomes is different from the fission events that participate in normal peroxisome proliferation in wild-type cells. Therefore, we analyzed if this fission process depends on Dnm1 and Pex11. 19 , 20 To this end, corresponding deletion stains were constructed that produced Cat mut N-terminally fused to GFP (GFP-Cat mut ) to fluorescently mark the protein aggregates. Fluorescence microscopy analysis of cells also producing the DsRed-SKL peroxisomal matrix marker protein revealed that small green fluorescent spots were present in peroxisomes of both mutant strains, as well as in the wild-type control ( Fig.ਅ ). To analyze the possible presence of GFP-Cat mut in the vacuole, the red vacuolar marker FM 4� was used instead of DsRed-SKL ( Fig.ਆ ). Fluorescence microscopy analysis confirmed that green fluorescence was observed only infrequently in vacuoles of dnm1 dan pex11 cells relative to the wild-type control ( Fig.ਆ ). Western blot analysis using crude extracts of these cells confirmed reduced cleavage of GFP-Cat mut relative to that in the wild-type cells producing GFP-Cat mut ( Fig.ਇ ). The reduced degradation of the aggregates also affected growth of the strains as lower growth yields on methanol were observed in both dnm1 dan pex11 cells for the strains producing Cat mut ( Fig.ꀪ ).

Figureਅ. Visualization of catalase protein aggregates. H. polymorpha wild-type, dnm1 dan pex11 cells, producing DsRed-SKL and GFP-Cat mut , were grown on methanol for 16 h. The peroxisomes contained GFP spots in the peroxisomal lumen, which represent the protein aggregates.

Figureਆ. Visualization of catalase protein aggregates. Identical experiment as shown in Figureਅ , using wild-type, dnm1 dan pex11 cells, producing GFP-Cat mut stained with the vacuolar marker dye FM 4�. GFP fluorescence was frequently observed in the vacuoles of wild-type cells. GFP fluorescence was also observed in the vacuoles of the dnm1 dan pex11 cells, albeit at reduced numbers compared with the wild-type control. The bar represents 1 µm.

Figureਇ. Autophagic degradation of GFP-Cat mut is reduced in pex11 dan dnm1 sel. (A) Western blot analysis using crude extracts of cells described in Figureਅ , decorated with anti-GFP antibodies. All strains contain both the full-length GFP-Cat mut protein together with GFP (arrow), due to cleavage of the fusion protein. Pyruvate carboxylase (Pyc1) was used as a loading control. (B) Quantification of the levels of GFP-Cat mut and GFP protein of the blots shown in (A). The level of full-length GFP-Cat mut is set to 100%. The bar represents the SEM (**p < 0.01). (C) Quantification of GFP fluorescence in the vacuole. The percentage of cells containing GFP fluorescence in the vacuole was calculated for wild-type, dnm1 dan pex11 cells containing PAOXGFP-Cat mut . Per strain 2 samples of each 100 cells were counted The bar represents the SEM (*p < 0.05).

To strengthen the observation that Dnm1 and Pex11 are indeed required for the separation of the small aggregate-containing peroxisomes, we also performed electron microscopy analysis of dnm1 atg1 dan pex11 atg1 double-mutant cells producing Cat mut . As evident from Figureꀽ , these cells harbor large peroxisomes that contain protein aggregates.

Degradation of the aggregates was also reduced upon deletion of ATG11, a gene involved in selective peroxisome degradation. Di dalam atg11 cells producing GFP-Cat mut numerous green spots were observed ( Fig.ꂊ ). However, vacuoles did not accumulate GFP as observed in the wild-type background (compare Fig.ਆ and Fig.ꂋ ). The block in autophagic degradation was furthermore evident from western blot analysis of these cells showing that cleavage of GFP from the GFP-Cat mut fusion protein was strongly reduced ( Fig.ꂌ ).

Figureਈ. Autophagic degradation of GFP-Cat mut is reduced in atg11 sel. (A) Di dalam H. polymorpha atg11 cells producing DsRed-SKL and GFP-Cat mut and grown on methanol for 16 h, most GFP-Cat mut spots colocalize with the peroxisomal matrix marker DsRed-SKL. Some of the green spots do not colocalize with DsRed-SKL. Most likely this is the result of the asymmetric peroxisome fission process, resulting in the formation of small aggregate-containing peroxisomes that contain no or very little DsRed-SKL. (B) Vacuolar staining of atg11 GFP-Cat mut cells with FM 4� dye. GFP fluorescence in the vacuoles is reduced in atg11 cells relative to the wild-type control (see Fig.ਆ ). The bar represents 1 µm. (C) Western blots decorated with anti-GFP antibodies fail to demonstrate the GFP cleavage product (arrow) in atg11 cells producing GFP-Cat mut .


NegativeArraySizeException

This error usually means that your image planes are larger than the maximum supported size.

The original ImageJ only supports image planes with 2 gigapixels (2^31 = 2147483648 pixels in case of a square image, the maximum allowed is 46340 x 46340 pixels) or less. If your data has extremely large image planes—e.g., 50000 x 50000 pixels—you may need to analyze region by region. One way to do this is using the “Crop on import” feature of the Bio-Formats plugin.

If you are using Bio-Formats to open a file, however, the size limit is a bit more complicated. Instead of using short[] as in ImageJ, Bio-Formats store data in byte[] when reading planes. If the source image is in 16 bit or in 32 bit (4 bytes, eg. floating point TIFF), the maximum pixel numbers allowed per plane will be 1/2 (1 gigapixels) or 1/4 (0.5 gigapixels), respectively.

ImageJ2 supports larger image planes internally, but uses the original ImageJ user interface by default, which once again limits visualization to 2 gigapixels. The ImageJ2 team is working to lift these size restrictions see imagej/imagej#87.


Metode

Plant materials and growth conditions

Arabidopsis (Columbia-0) and the T-DNA insertion mutant line (SALK_056011, locus At4g17740) were obtained from the Arabidopsis Resource Center (Columbus, OH). Seedlings were grown on 1/2 MS medium containing 3.0% sucrose (pH 5.7) for 4 weeks under the conditions of 16 h light / 8 h dark cycle and 20 μmol photons m − 2 s − 1 light intensity during the light periods.

Blue native PAGE and 2D SDS-PAGE

Chloroplasts were extracted from 50 wild-type and 50 atctpa-mutant plants. Blue native gel electrophoresis was performed as described previously [25, 38]. For 2D SDS-PAGE, the blue native gel lanes were excised with a razor blade and incubated in 2 × SDS sample buffer containing 2.5% (vol / vol) β-mercaptoethanol (β-ME) for 20 min at 75 °C, then for 20 min at 25 °C. Lanes with denatured proteins were placed on top of 12% SDS gels, then subjected to the second dimensional separation.

Immunoblot analysis

For immunoblotting, protein samples were separated on 12% SDS gels and transferred to nitrocellulose membranes (BioTrace™ NT nitrocellulose, Mexico) followed by a western blot analysis. After blocking with 5% milk, the membranes were subsequently incubated with primary antibodies generated against the indicated proteins and detected using the Super Signal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate kit (Thermo Scientific, USA).

Yeast two-hybrid assay and growth curves analysis

The yeast two-hybrid assay was performed using the Split Ubiquitin System (DUAL membrane, Dualsystems Biotech) as described previously [39, 40]. The mature D1 (amino acids 1–344) and pD1 (amino acids 1–353) were cloned into pCCW-STE vector (encoding the Cub-LexA-VP16 fragment) as the bait for interaction assay. CP43, CP47 and D2 were cloned into pDSL-Nx vector (encoding the NubG fragment) as the prey for the assay. Yeast strain NMY32 was co-transformed with the bait and prey constructs, respectively. The interactions were determined by the growth of yeast cells on agar plates with Synthetic Defined (SD) medium lacking Trp, Leu, His, and adenine (SD-Trp Leu His Ade, FunGenome) without or with 2 mM 3-amino-1, 2, 4-Triazole (3-AT). The growth curves of liquid cultured yeast cells were obtained by measuring the absorbance at 600 nM (OD600). Six colonies of each transformation were cultured in SD-Trp Leu His Ade medium containing 30 μg / ml kanamycine. OD600 values were recorded at various time points. pDSL-Nx vector was used as the negative control, and NubI was used as the positive control.

Analisis statistik

ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) was employed to qualify the distribution ratio of PSII subunits among different subcomplexes.


Tonton videonya: WESTERN BLOT ANALYSIS using ImageJ Software. Non-NIH method. RESULTS AND INTERPRETATION (Oktober 2022).