Informasi

DpnI over-pencernaan

DpnI over-pencernaan


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kami memiliki protokol panjang yang kami optimalkan yang mencakup pencernaan DpnI dari produk PCR (untuk menghapus salah satu template DNA jika dimetilasi, dan sementara kami tidak yakin dalam tes buta, kemungkinan DNA yang relevan akan termetilasi).

Saya ingin tahu apakah kami dapat memperpanjang waktu inkubasi/reaksi DpnI menjadi 4-5 jam. Ini akan membuat langkah-langkah bersamaan di layar lebih mudah untuk dikelola. Apakah ada yang memperpanjang pencernaan DpnI? Seberapa "bocor" atau tidak spesifik suatu proses?

Terima kasih.


Menurut instruksi ini dapat dilakukan selama 1 jam tetapi ini untuk plasmid besar. Saya setuju dengan Chris bahwa itu seharusnya tidak menjadi masalah. Sebagai alternatif, Anda dapat mengatur langkah inkubasi DpnI 37°C di mesin PCR dan setelah berapa lama waktu yang disarankan, Anda dapat mengatur mesin PCR menjadi dingin hingga 4°C secara otomatis, sehingga Anda dapat membiarkannya di sana selama yang Anda inginkan .


Di lab tempat saya berlatih, kami biasanya menambahkan sejumlah kecil enzim dan menyimpannya untuk pencernaan semalam pada suhu 37 derajat. Jadi jumlah waktu yang Anda inginkan untuk menyimpannya tergantung pada jumlah enzim yang Anda tambahkan. Periksa unit enzim dan tambahkan sesuai dengan jumlah DNA Anda.

Kami melakukan pencernaan DpnI untuk mutagenesis juga, kami menambahkan 100 ng plasmid kami dengan enzim 1uL dan itu bekerja dengan baik. Kami memiliki set lain dengan 2uL DpnI tetapi tampaknya tidak berhasil karena kami tidak memiliki koloni.

Mungkin kelebihan enzim menyebabkan hilangnya spesifisitas atau semacam penghambatan umpan balik negatif.


Mentor saya mengajari saya bahwa kita bisa melakukan pencernaan DpnI minimal 4 jam dan maksimal 12 jam. Saya pernah meninggalkan reaksi sampai sekitar 16 jam (?) tapi hasilnya oke. Mentor saya menyarankan untuk menempatkan pada 4oC setelah 12 jam, jika kami tidak dapat segera melanjutkan pekerjaan.


Sebuah throughput tinggi, kloning dan strategi penyaringan bebas pembatasan berdasarkan ccd Penggantian gen B

Dalam bidang-bidang yang menuntut throughput tinggi, seperti bioteknologi dan biologi struktural, kloning molekuler adalah alat penting dalam memperoleh hasil protein rekombinan yang tinggi. Di sini, kami membahas metode bebas pembatasan yang dikembangkan baru-baru ini dalam kloning, dan menyajikan protokol yang lebih hemat biaya yang telah dioptimalkan untuk meningkatkan kloning dan skrining kloning.

Hasil

Dalam studi kasus kami, tiga gen -laktamase homolog berhasil dikloning menggunakan protokol bebas restriksi ini. Untuk mengkloning gen, kami memilih strategi penggantian gen, di mana gen rekombinan mengandung overhang yang menargetkan wilayah vektor ekspresi termasuk pengkodean sitotoksin ccd B-gen.

Kesimpulan

Kami memberikan bukti lebih lanjut bahwa penggantian gen dapat diterapkan dengan protokol kloning throughput tinggi. Menargetkan pengganti ccd B- gen ditemukan sangat berhasil untuk seleksi balik menggunakan protokol ini. Ini menghilangkan kebutuhan untuk pengobatan dengan enzim restriksi Dpn Saya yang sejauh ini merupakan pendekatan pemilihan klon yang disukai. Dengan demikian, kami menyajikan protokol kloning yang dioptimalkan menggunakan bebas pembatasan ccd Strategi penggantian gen B, yang memungkinkan kloning paralel pada tingkat throughput tinggi.


Aktivitas bintang

Aktivitas bintang atau "santai" adalah sifat inheren dari endonuklease restriksi di mana, di bawah kondisi yang tidak optimal, enzim restriksi dapat bekerja pada urutan pengenalan dengan perbedaan kecil dari situs pengenalan kanoniknya. Misalnya, seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 1, EcoRI mengenali dan membelah situs 5'-GAATTC-3', tetapi aktivitas bintangnya dapat mengakibatkan pembelahan pada 5'-TAATTC-3' dan 5'-CAATTC-3'. Demikian pula, BamHI dapat memotong 5'-NGATCC-3', 5'-GPuATCC-3', dan 5'-GGNTCC-3' (di mana N adalah singkatan dari nukleotida apa pun) di samping urutan pengenalan normalnya, 5'-GGATCC- 3'.

Gambar 1. Potensi bintang atau aktivitas santai dari dua enzim restriksi umum, EcoRI dan BamHI.

Secara khusus, di bawah kondisi reaksi yang optimal, laju pembelahan di situs "bintang" jauh lebih rendah daripada di situs pengenalan normal (sekitar 10 5 –106 perbedaan). Dengan demikian, jumlah enzim restriksi yang berlebihan dan/atau waktu inkubasi yang lama (pencernaan berlebih) adalah penyebab umum aktivitas bintang selama pencernaan. Selain itu, persentase gliserol yang lebih tinggi (misalnya, & gt5%), konsentrasi garam yang rendah, pH suboptimal, keberadaan pelarut organik, dan kation divalen selain Mg 2+ dapat berkontribusi pada pembelahan DNA substrat yang tidak spesifik. Dengan menggunakan protokol dan buffer yang direkomendasikan oleh produsen enzim, aktivitas bintang dapat dihindari. Beberapa enzim restriksi, bersama dengan buffernya, telah dioptimalkan untuk tidak menunjukkan aktivitas bintang bahkan setelah pencernaan semalaman.


Pencernaan tidak sempurna

Pencernaan yang tidak lengkap adalah masalah yang sering ditemui saat menggunakan endonuklease restriksi. Pencernaan yang tidak sempurna dapat terjadi ketika terlalu banyak atau terlalu sedikit enzim yang digunakan. Adanya kontaminan dalam sampel DNA dapat menghambat enzim, juga mengakibatkan pencernaan tidak sempurna. Kondisi reaksi yang kurang optimal seperti komposisi buffer, waktu inkubasi, dan suhu reaksi juga merupakan penyebab umum dari pencernaan yang tidak lengkap.

Beberapa enzim restriksi membutuhkan kofaktor untuk aktivitas penuh. Misalnya, Esp3I (BsmBI) membutuhkan DTT, sedangkan Eco57I (AcuI) membutuhkan S-adenosylmethionine. Beberapa enzim restriksi seperti AarI dan BveI (BspMI) memerlukan dua salinan situs pengenalan untuk pembelahan yang efisien untuk enzim restriksi ini, oligonukleotida dengan situs pengenalan sering ditambahkan ke reaksi untuk meningkatkan aktivitas enzimatik.

Selain kondisi reaksi dan sifat enzim, sifat DNA mungkin berperan dalam pencernaan restriksi (Tabel 1). DNA termetilasi dapat tahan terhadap pembelahan oleh beberapa enzim restriksi (lihat bagian metilasi untuk rinciannya). Kedekatan situs pengenalan enzim dengan termini (dalam DNA substrat linier), serta kedekatan antara situs pembelahan (dalam pencernaan ganda) dapat menentukan seberapa efisien enzim memotong DNA. Selain itu, beberapa molekul DNA superkoil lebih sulit untuk dibelah daripada rekan liniernya, dan meningkatkan jumlah enzim 5 hingga 10 kali lipat dapat membantu pencernaan yang lengkap.

Tabel 1. Penyebab umum pencernaan yang tidak lengkap.

  • Terlalu sedikit enzim
  • Terlalu banyak substrat
  • pH tidak optimal
  • Suhu tidak optimal
  • Waktu inkubasi singkat
  • Kofaktor
  • Persyaratan urutan pengakuan
  • Preferensi situs
  • Metilasi
  • Kedekatan situs pembatasan
  • Struktur

Pemasok enzim memberikan rekomendasi penggunaan dalam sisipan produk, yang harus diikuti dengan cermat untuk mencapai pencernaan yang lengkap.


Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama: Wesley E. Robertson, Louise F. H. Funke, Daniel de la Torre, Julius Fredens.

Afiliasi

Laboratorium Dewan Penelitian Medis Biologi Molekuler, Cambridge, Inggris, Inggris

Wesley E. Robertson, Louise F.H. Funke, Daniel de la Torre, Julius Fredens & Jason W. Chin

Divisi Teknik Biologi dan Biologi, Institut Teknologi California, Pasadena, CA, AS

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Anda juga dapat mencari penulis ini di PubMed Google Cendekia

Kontribusi

Semua penulis berkontribusi untuk mengembangkan protokol ini dan menulis makalah ini. J.W.C. mengawasi proyek tersebut.

Penulis yang sesuai


Kesimpulan

E. coli fag 9 g mengandung basa dG + yang dimodifikasi dalam genomnya (25–27% relatif terhadap dG) yang membuat DNA resisten terhadap sekitar dua pertiga REase Tipe II yang diperiksa dalam penelitian ini. Fragmen restriksi dengan ujung tumpul atau ujung lengket yang berasal dari fag 9 g dapat diligasi dengan ligase DNA T3 dan T4. E. coli DNA ligase mampu mengikat ujung yang lengket secara efisien, tetapi tidak dengan ujung yang tumpul. Fragmen restriksi fag 9 g (fragmen SspI) dapat didegradasi oleh sejumlah eksonuklease DNA. DNA fag 9 g dapat dimodifikasi lebih lanjut dengan seringnya adenin metiltransferase EcoGII dan beberapa m5 C MTase lainnya, seperti M.AluI, M.CviPI, dan M.HhaI. Studi ini memberikan eksperimen pembuktian konsep bahwa modifikasi basa ganda pada prinsipnya dapat dimasukkan ke dalam fag 9 g. Phage 9 g DNA dapat berfungsi sebagai cetakan untuk PCR dengan Phusion® dan Q5® DNA Polymerase. Beberapa WT E. coli strain yang diisolasi dari lingkungan dapat melemahkan infeksi fag 9 g mungkin oleh sistem restriksi Tipe II yang menargetkan urutan pengenalan hanya A/T, dengan restriksi yang bergantung pada modifikasi, atau dengan mekanisme redaman fag lain yang tidak diketahui. Mutan NEB 10β yang resisten terhadap fag 9 telah diisolasi yang resisten terhadap infeksi fag 9 g dan . Homolog GAT-QueC ditemukan dalam lima Enterobakteri dan Pseudomonas fag menunjukkan bahwa fag ini juga mengandung modifikasi dG +. dG + modifikasi dan enzim restriksi telah ditemukan di pulau genom bakteri, menunjukkan fag mungkin telah memperoleh jalur sintesis dG + melalui transduksi fag dan transfer gen horizontal. Analisis lingkungan gen dari enzim metabolik DNA/RNA yang berdekatan dengan TGT atau QueC menunjukkan ko-lokalisasi nuklease keluarga PLD, nuklease seperti Cas4, DNA helicase, sistem RM Tipe I, sistem interferensi yang dipandu RNA (protein domain Piwi), perbaikan DNA enzim, integrase dan transposase yang terkait dengan elemen genetik seluler. Situs pengikatan dan pembelahan fag 9 g teminase (pas site) dipetakan dengan sekuensing langsung DNA fag dan pemetaan restriksi.


DISKUSI

Kami menjelaskan di sini kloning dan ekspresi sistem BsrDI dan BtsI R-M, dan penemuan dua enzim nicking alami Nb.BsrDI dan Nb.BtsI. Selain itu, varian nicking untai teratas, Nt.BsrDI dan Nt.BtsI, dibuat dengan mencampur subunit B yang kekurangan katalitik dengan masing-masing subunit wt A. Dua situs katalitik independen terlibat dalam subunit besar dan kecil BsrDI / BtsI untuk pembelahan untai atas dan bawah.

Hanya beberapa DNA nicking endonucleases (NEases) alami yang telah dideskripsikan dari sumber bakteri dan virus. Dua NEase DNA spesifik-untai dan spesifik-urutan ditemukan dalam lisat virus Chlorella NYs-1 dan NY2A (17, 18). Ini adalah Nt.CviPII (sebelumnya bernama CviNYSI nickase, CCD, D = A, G atau T) dan Nt.CviQII (sebelumnya bernama CviNY2A nickase, R↓AG, R = A atau G). Sistem N-M CviPII dan CviQII telah dikloning dan diekspresikan dalam inang heterolog (19, 20). Nt.BstSEI dan isoschizomer Nt.BstNBI (GAGTCN4) ditemukan dalam dua strain B. stearothermophilus (21, 22). Nt.BspD6I, sebuah isoschizomer dari Nt.BstNBI dengan urutan asam amino yang identik juga telah diklon ( 23). Nt.BstNBI dianggap sebagai enzim nicking yang telah kehilangan kemampuan untuk dimerisasi karena enzim yang dimurnikan dari galur asli adalah NEase. Baru-baru ini, bagaimanapun, gen yang mengkode mitra subunit kecilnya telah diidentifikasi berdekatan dengan pengkodean gen untuk subunit nicking (Heiter, D. dan G.G.W., data tidak dipublikasikan). Agaknya, subunit kecil dari endonuklease BstNBI dipisahkan dari subunit besar dan dipisahkan dari subunit besar selama pemurnian, menghasilkan enzim nicking untai atas alami. Demikian pula, gen yang mengkodekan subunit kecil dari 186 residu aa telah ditemukan di hilir gen Nt.BspD6I. Aktivitas restriksi BspD6I dilarutkan dengan mencampurkan Nt.BspD6I dengan subunit kecil yang dimurnikan (24). Berdasarkan hasil mutagenesis BsrDI dan BtsI, kemungkinan untuk merekayasa varian nicking untai terbawah dari BstNBI/BstSEI/BspD6I REases dengan mencampur varian kekurangan katalitik dari Nt.BstNBI/Nt.BstSEI/Nt.BspD6I dengan beratnya subunit kecil, dengan asumsi bahwa dua situs katalitik independen berada di dua subunit.

Strand-specific NEases telah digunakan dalam DNA strand displacement amplification (SDA), EXPAR DNA amplification (25), dalam perakitan dan kloning fragmen DNA, dan dalam persiapan nicked-duplex atau gapped DNA untuk mempelajari perbaikan DNA dan DNA base stacking. , 27). Baru-baru ini, nicking endonuclease-mediated DNA amplification (NEMDA) menggunakan Nt.CviPII dan Bst DNA polimerase tanpa adanya input primer juga telah dijelaskan (19). Nt.CviPII mencerna DNA genom menjadi DNA dupleks parsial kecil yang berfungsi sebagai template dan primer untuk ekstensi primer. Baru-baru ini, enzim nicking telah digunakan untuk nick dan DNA label untuk sistem barcoding molekul tunggal (28, 29).

Jumlah NEases yang relatif kecil yang diidentifikasi di alam telah mendorong upaya untuk merekayasa NEases dari REases Tipe IIA/Tipe IIS/Tipe IIT yang ada dengan menukar domain atau mutagenesis (Tipe IIA, REase yang membelah situs asimetris Tipe IIT, REase heterodimer). Varian nicking khusus untai telah dibuat dari AlwI, Bpu10I, BbvCI, BsaI, BsmBI, BsmAI, BsmI, BspQI, MlyI, Mva1269I dan SapI (REBASE) (30). Untuk Mva1269I, mutasi residu Asp, Glu, dan Lys kritis dari CT menghasilkan enzim yang memotong untai bawah dari urutan pengenalan. Bermutasi CB dari Mva1269I menghasilkan enzim yang secara khusus memotong untai atas, tetapi pada efisiensi yang sangat rendah kecuali jika untai bawah sudah terpotong (15). Situs katalitik Mva1269I tampaknya bertindak secara berurutan, dengan CB membelah untai bawah terlebih dahulu, dan dengan demikian menciptakan substrat di mana CT dapat bertindak untuk membelah untaian atas (15). Hasil yang sebanding diamati dengan BsmI: turunan nicking untai bawah (Nb.BsmI, E546V) telah dihasilkan ketika residu Glu dari CT diganti dengan Val atau Ala (Z.Z., Meixsell,T. dan S.-Y.X., data tidak dipublikasikan). Mutasi residu Arg dari PD-Xn-MANTANn-Motif QR di CB menghasilkan varian R123D dengan aktivitas nicking rendah. Meskipun BsrDI dan BtsI asli lebih suka memotong untai bawah terlebih dahulu dan kemudian mematahkan untai atas dalam restriksi DNA ds (data tidak ditampilkan), isolasi Nt.BsrDI dan Nt.BtsI menyiratkan bahwa tidak ada persyaratan ketat untuk memotong untai bawah terlebih dahulu, yaitu hidrolisis untai atas dapat berlangsung tanpa untai bawah yang terpotong sebelumnya.

Kemungkinan mekanisme pembelahan DNA

Ada beberapa nuklease lain yang situs katalitiknya terikat pada rantai polipeptida yang sama, pada rantai yang terpisah atau dibentuk oleh dimerisasi. Misalnya, homing endonuclease PI-SceI memiliki dua situs katalitik dalam satu rantai polipeptida (satu untuk pembelahan setiap untai) ( 31). Transposase Tn7 terdiri dari dua subunit yang berbeda, TnsA dan B, yang masing-masing memotong untai terpisah ( 32). Sebaliknya, beberapa rekombinasi (Tn10 dan Tn5) menggunakan satu situs aktif untuk membelah kedua untai. BfiI membutuhkan homodimerisasi untuk membentuk situs katalitik yang terletak pada antarmuka dimer. Homodimer BfiI memotong untai bawah terlebih dahulu, menghasilkan gugus bermuatan yang membantu enzim menyerang untai atas (1).


Ligasi Kromatin Bertarget, Teknik Profil Epigenetik yang Kuat untuk Jumlah Sel Kecil

Agar investigasi epigenetik populasi sel langka dilakukan secara rutin oleh para peneliti dari berbagai tingkat keterampilan, tanpa perangkat dan prosedur yang mahal dan rumit, kami telah mengembangkan teknik baru untuk membuat profil lanskap epigenetik yang meningkatkan sensitivitas dan menyederhanakan alur kerja.

Kami menyajikan pendekatan sederhana, baru, bebas manik untuk mendeteksi pola modifikasi histone lebar genom menggunakan ligasi kromatin (TCL) yang ditargetkan. Strategi kami menggunakan ligasi kedekatan adaptor terikat antibodi, diikuti dengan amplifikasi selektif kromatin yang diikat untuk meningkatkan sinyal relatif terhadap latar belakang. Pendekatan kami menggunakan strategi fragmentasi kromatin sederhana, menghilangkan kebutuhan akan imunopresipitasi dan pencucian berbasis manik, dan memurnikan semua DNA, memungkinkan nukleotida yang tidak terikat untuk memberikan efek pembawa alih-alih menggunakan bahan tambahan. Seluruh prosedur memiliki langkah-langkah pemrosesan dan penanganan yang lebih sedikit, dan waktu pelaksanaan yang lebih sedikit daripada ChIP-seq konvensional, sehingga memberikan kompleksitas metodologi yang sangat berkurang sekaligus menghasilkan peningkatan sensitivitas dan kemudahan penggunaan.

Ligasi Kromatin yang Ditargetkan.

Reagen: Chromatin Digestion Buffer (CBD): 33 mM Tris-acetate, pH 7,9, 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 0,25% Triton X-100, 1 mM EGTA, 10 mM sodium butyrate. 2× TCL (dan N-ChIP) dilution buffer (TDB): (220 mM KCl, 50 mM Tris-acetate, pH 7,9, 0,2% Sarkosyl (Teknova S3376), 0,2% natrium deoksikolat, 1,75% Triton X-100, 40 mM EDTA, 1 mM EGTA). Campuran enzim (EM) yang digunakan untuk memecah kromatin mengandung volume yang sama dari SaqAI (MseI), FspBI (BfaI), Csp6I, dan NdeI dari Thermo Fisher (FD2174, FD1764, FD0214, FD0583). Larutan koktail Protease Inhibitor (PI) (Roche #4693159001 dilarutkan dalam PBS untuk menghasilkan stok 20x) ditambahkan ke dalam destruksi kromatin.

Antibodi yang digunakan antara lain: Anti H3K4me3 (Abcam ab8580), anti-H3K27me3 (Motif Aktif #39155), anti-H3K36me3 (Abcam ab9050), dan anti-H3K27ac (Motif Aktif #39133), dan dikonjugasi dengan kit konjugasi Abcam streptavidin (ab102921 ). Setelah konjugasi, antibodi dipekatkan dengan kolom konsentrator Pierce (100 MWCO 0,5 ml), kemudian diencerkan menjadi 1 g/μl dengan PBS dan konsentrasi akhir 150 mM NaCl dan 30% gliserol. Untuk menyiapkan stok kerja kompleks Adaptor Antibodi, 5 g antibodi (˜33 pmol) diinkubasi dalam 25 l 1× TCL buffer (volume yang sama CBD+TDB) dengan adaptor TCL 41,25 pmol (Tabel 3, dipesan dari Integrated DNA Technologies) selama 2+ jam pada suhu 4°C. Stok Adaptor Antibodi kemudian diencerkan hingga 25-50 ng/μl jika sesuai, dengan 1x buffer TCL. Kami menggunakan T4 DNA ligase (EL0011) dan Ligation Buffer (Fisher FERB69). Q5 High Fidelity 2× master mix digunakan untuk amplifikasi PCR (New England Biolabs M0492). Untuk konstruksi perpustakaan berbasis transposisi, kit persiapan DNA NEXTERA (IIlumina FC-121-1031) digunakan. Kami juga menggunakan manik-manik Axygen untuk memurnikan / memilih ukuran perpustakaan setelah pengindeksan (Fisher MAGPCRCLS).

Protokol: Fragmentasi kromatin dilakukan dengan menambahkan 10 l campuran destruksi (150 l CDB+8 l PI+4 l EM) ke pelet sel (spin down pada 1000 G selama 10 menit) dalam tabung 1,7 ml (Axygen MCT-175 -C). Sel disuspensikan kembali dengan pemipetan 10×. Sampel kemudian ditempatkan dalam penangas air selama 30 menit pada suhu 37°C. Pencernaan dihentikan dengan penambahan volume TDB yang sama.

3-5 l kompleks antibodi-adaptor ditambahkan ke setiap sampel TCL, dicampur dengan pemipetan 10x, dan kemudian sampel ditempatkan pada suhu 4°C semalaman di rak tanpa pencampuran. Untuk TCL MCF7, jumlah antibodi yang direkomendasikan yang diikat oleh adaptor adalah: 200 ng anti-H3K27me3, 80 ng anti-H3K36me3, 40 ng anti-H3K4me3, atau 100 ng anti-H3K27ac. Untuk neurosfer atau sel tikus normal lainnya, jumlah yang disarankan adalah: 80 ng anti-H3K27me3, 40 ng anti-H3K36me3, atau 20 ng anti-H3K4me3). Untuk jenis/garis sel lain, disarankan untuk menguji jumlah adaptor-antibodi, dimulai dengan jumlah yang sebanding dengan kandungan DNA/sel relatif terhadap MCF7 atau sel tikus normal.

Keesokan harinya, sampel ditempatkan di meja kerja dan dibiarkan mencapai suhu kamar (˜15 menit). 180 l campuran ligasi (1x buffer ligasi+1 unit ligase) kemudian ditambahkan ke masing-masing sampel dan dicampur dengan pemipetan 2x, kemudian sampel diinkubasi selama 10 menit di RT. 20 l larutan Sarkosyl 10% ditambahkan ke setiap sampel, diikuti oleh 10 l proteinase K (10 mg/ml). Sampel diinkubasi selama 1+ jam pada 65°C untuk mencerna protein. DNA dimurnikan kolom (ZYMO DNA clean dan konsentrator-5) dan dielusi dalam 15 WEB.

DNA TCL yang dimurnikan selanjutnya digunakan dalam reaksi amplifikasi PCR 60 l dengan campuran polimerase 2× Q5 (98° C selama 10 detik, 63° C selama 30 detik, 72° C selama 2 menit). Untuk reaksi TCL dengan dua adaptor, siklus 15-18 digunakan. Untuk reaksi TCL dengan adaptor tunggal, 25-30 siklus amplifikasi digunakan. Amplifikasi adaptor/primer tunggal adalah 40% seefisien PCR standar, sebagaimana ditentukan oleh qPCR, dan dengan demikian setara dengan 15-18 siklus PCR standar. Setelah amplifikasi, sampel dimurnikan dengan kolom ZYMO (30 l WEB) kemudian dikuantifikasi dengan kit uji Qubit 3.0 dan HS dsDNA. Amplifikasi biasanya menghasilkan 100-700 ng DNA untuk 2000 sel TCL. Semua sampel TCL yang digunakan dalam manuskrip ini diproduksi menggunakan reaksi TCL adaptor tunggal (A).

Imunopresipitasi Kromatin. 1 juta sel MCF7 disuspensikan kembali dalam 0,25 ml CBD+PI+10 l campuran enzim. Pencernaan Kromatin dilakukan pada 37°C selama 30 menit, diikuti dengan pengenceran dengan TDB 0,25 ml. Bahan yang tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi pada 10.000 G selama 10 menit diikuti dengan mentransfer larutan kromatin terlarut ke tabung baru. Kromatin kemudian dibersihkan sebelumnya dengan 50 l Magnetic Protein A-Dynabeads selama 2 jam (Invitrogen 10002D). Dynabeads disiapkan dengan mencuci dan resuspensi dengan buffer 1x TCL sebelum digunakan. 50 l larutan kromatin disimpan untuk Input. 50 l Dynabeads lainnya, dengan 1 g anti-H3K36me3, 2 g anti-H3K27me3, atau 1 g anti-H3K27ac, ditambahkan ke larutan kromatin dan kemudian diinkubasi semalaman pada 4° C dengan rotasi. Kromatin terikat manik dicuci dua kali dengan 1x buffer TCL, sekali dengan 1x buffer TCL yang mengandung 0,3 M NaCl, dan dua kali dengan TE. DNA dielusi oleh manik-manik resuspending dalam 100 l TE yang mengandung 1% SDS dan 10 g Proteinase K (10 mg/ml), diikuti dengan inkubasi pada 65 ° C selama dua jam, dengan pencampuran setiap 15 menit. Manik-manik dihilangkan dengan magnet dan DNA dimurnikan kolom menggunakan kolom Zymo dan buffer elusi 30 l. DNA yang diperkaya ChIP dikuantifikasi menggunakan uji Qubit 3.0 dan dsDNA HS. N-ChIPs menghasilkan 200-300 ng (H3K36me3), 30-60 ng (H3K27me3), dan 60-140 ng DNA (H3K27ac).

Untuk ChIP dengan jumlah sel rendah, 200.000 sel dicerna seperti dijelaskan di atas, dalam volume pencernaan 0,2 ml, dan diproses secara identik untuk menghasilkan 0,4 ml kromatin yang telah dibersihkan sebelumnya pada 500 sel/W. 10.000, 2000, 400, atau 200 ekuivalen sel kemudian diakuot ke tabung PCR dan diencerkan menjadi 200 l dengan buffer 1x TCL. Kami menggunakan 125 ng anti-H3K36me3, 250 ng anti-H3K27me3, atau 125 ng anti-H3K27ac untuk setiap ChIP, dengan 15 l manik-manik. Setelah inkubasi semalam, sampel dicuci seperti dijelaskan di atas, kemudian dielusi dalam 50 l TE untuk pencernaan PK. Setelah pemurnian kolom, sampel dielusi dalam 10 l.

analisis QPCR. Primer dipilih untuk digunakan setelah diverifikasi memiliki kurva amplifikasi yang serupa pada rentang input 10.000 kali lipat, tanpa amplifikasi tanpa kontrol templat, sebelum melakukan analisis qPCR. 20-50 ng dari Amplified TCL DNA dan ChIP DNA untuk sampel H3K27me3 dianalisis dengan qPCR (reaksi 10 l, dilakukan dalam rangkap tiga) menggunakan AB 7900HT dan SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems 4309155). Perangkat lunak SDS versi 2.4 digunakan untuk menganalisis data qPCR. Standar 40 kondisi reaksi siklus digunakan (95°C selama 10 detik, 60°C selama 10 detik, 72°C selama 1 menit). Primer (lihat Tabel 2) digunakan pada 250 nM. Data dilaporkan sebagai Sinyal Lipatan Normalisasi dengan terlebih dahulu menghitung rasio input, kemudian menormalkan semua titik data terhadap wilayah kontrol negatif yang dipilih.

Pembangunan perpustakaan. 25-40 ng DNA TCL yang diperkuat atau DNA yang diperkaya N-ChIP dengan jumlah sel tinggi digunakan untuk konstruksi perpustakaan menggunakan NEXTERA berbasis transposisi (mengikuti protokol pabrikan dengan 8 siklus PCR untuk pengindeksan). Sampel input dibuat ke perpustakaan menggunakan NEXTERA dengan 10 siklus PCR untuk pengindeksan. Pustaka untuk sampel ChIP dengan jumlah sel rendah (dan input) yang dihasilkan dari 10.000-200 sel dibuat menggunakan NEXTERA XT (mengikuti protokol pabrikan dengan 14 siklus PCR untuk pengindeksan). Sampel yang diindeks dikuantifikasi oleh Qubit 3.0, kemudian dikumpulkan untuk menghasilkan sampel 5 nM yang siap untuk diserahkan ke fasilitas pengurutan. Pustaka TCL dan N-ChIP diurutkan pada NextSeq500 untuk mendapatkan pembacaan ujung tunggal 75 bp dengan kedalaman baca 30-60 juta pembacaan.

Persiapan Sel. Sel MCF7 (ATCC HTB-22) dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi dan penisilin-streptomisin-glutamin. Sel-sel ditripsinisasi, dibuat pelet, dicuci 2x dengan PBS, kemudian disuspensikan kembali dan dihitung dengan hemositometer. Untuk TCL, sel kemudian diencerkan menjadi 100 sel/μl dan 2000 sel dibagi menjadi 1,7 ml tabung yang berisi 200 l PBS. Sel kemudian dipelet pada 1000G selama 5-10 menit untuk TCL. Untuk TCL dengan 10.000-200 sel, setelah menghitung sel, mereka diencerkan menjadi 500 sel/μl, kemudian diencerkan secara serial menjadi 100 sel/l, dan 20 sel/l, sebelum membuat 10.000-200 alikuot sel untuk TCL.

Untuk menghasilkan neurosfer, tikus (Black6 dari latar belakang campuran C57B16 dan B6C3) di-eutanasia oleh CO2, dipenggal, dan otak mereka segera dikeluarkan. Zona subventrikular (SVZ) dibedah mikro dan disimpan dalam PBS sedingin es untuk diproses lebih lanjut. Jaringan dicerna menggunakan Liberase DH (Roche) dan DNase I (250 U ml -1 ) pada 37°C selama 20 menit diikuti dengan triturasi. Jaringan yang dicerna dicuci dalam HBSS sedingin es tanpa kalsium dan magnesium, disaring melalui filter 40 m dan FACS diurutkan sebagai sel Lineage CD24 ke dalam media pertumbuhan neurosfer yaitu, Neurobasal-A (Invitrogen) yang dilengkapi dengan Glutamax (Life Technologies ), 2% B27-A (Invitrogen), faktor pertumbuhan epidermal rekombinan tikus (EGF 20 ng ml 1 ) dan faktor pertumbuhan fibroblas dasar (bFGF 20 ng ml 1 ) (Bioteknologi Shenandoah). Sel silsilah habis menggunakan CD45 mouse, CD31, dan Ter119 (Biolegend).

Setelah neurosfer terbentuk, mereka disortir FACS menjadi sel CD15 + Egfr + dan CD15 Egfr + atau CD15 Egfr . Secara total, sekitar 7.000 sel diurutkan untuk setiap populasi sebelum secara individual memproses 1000 peristiwa/sel yang diurutkan untuk setiap TCL, seperti yang dijelaskan untuk sel MCF7. Untuk analisis FACS, sel diwarnai dengan anti-CD15-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MMA BD), dan EGF dikomplekskan dengan Alexa647-streptavidin (Life Technologies).

MENGKODE data. Pembacaan selaras MCF7 dari kumpulan data GEO GSM945854, GSM970218, GSM970217, dan GSM945859 diunduh dari genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=wgEncodeSydhHistone.

Analisis urutan. Pembacaan urutan mentah diunggah ke Galaxy (usegalaxy.org) dan disejajarkan dengan genom manusia (hg19) atau genom tikus (mm9) menggunakan Bowtie (−1,15 e, 40 v, 2 m, 1) dan Bowtie2 ( -sangat-cepat-lokal), masing-masing. Hanya bacaan yang dipetakan secara unik yang dipertahankan untuk analisis lebih lanjut. File penyelarasan digunakan untuk menghasilkan trek sinyal dengan DeepTools (tempat sampah 100 bp dengan ekstensi baca 500 bp dan normalisasi RPKM). Kami juga memfilter wilayah yang masuk daftar hitam ENCODE (diunduh dari sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists). File sinyal yang dihasilkan digunakan untuk Analisis Komponen Utama dan analisis korelasi. File sinyal dimuat ke browser IGV Broad Institute untuk memvisualisasikan data. Data neurosphere H3K4me3 disaring lebih lanjut untuk menunjukkan hanya pembacaan di dalam promotor (didefinisikan sebagai 5.000 bp di sekitar TSS berdasarkan RefSeq). Untuk menghitung fraksi pembacaan di puncak, kami menggunakan MACS2 (-nomodel, p=0,01, -broad, cuttoff 0,1, duplikat=otomatis, ekstensi 200) untuk memanggil puncak menggunakan data ENCODE MCF7 ChIP. File Broad Peak BED yang dihasilkan digunakan dengan Samtools untuk mengekstrak semua pembacaan yang terletak di wilayah puncak dan membandingkan jumlah pembacaan dengan file penyelarasan tanpa filter. Plot korelasi silang dihasilkan untuk file BAM yang tidak terduplikasi menggunakan Phantompeakqualtools (Marinov et al. (2014) G3 (Bethesda) 4 (2): 209-223), dengan pergeseran untai mulai dari 0 hingga 1000 bp pada ukuran langkah 5 bp, dan parameter default lainnya. Kami menggunakan ngs.plot (Shen et al. (2014) BMC Genomics 15:284) dengan parameter default untuk menghasilkan plot agregasi di semua interval TSS dalam genom referensi hg19.

Ketersediaan data urutan. Semua file data mentah (FASTQ) dan file sinyal (BigWig) yang digunakan untuk produksi naskah ini telah disimpan ke dalam Arsip Baca Urutan (SRA) dan tersedia melalui nomor aksesi Gene Expression Omnibus GSE94804.

Pengembangan Ligasi Kromatin Tertarget

Pengembangan prosedur TCL (Gambar 1A) dimulai dengan menentukan kondisi pencernaan kromatin yang sesuai untuk menghasilkan tangga DNA yang luas. Teknik ChIP-seq menggunakan salah satu dari dua strategi untuk memecah kromatin, sonikasi atau pencernaan enzimatik dengan nuklease mikrokokus. Sonikasi adalah metode yang disukai saat menggunakan kromatin tetap, tetapi membutuhkan volume kerja yang lebih besar yang meningkatkan kehilangan material melalui penyerapan yang lebih besar dan menghancurkan beberapa epitop, berkontribusi pada hilangnya material dan sensitivitas pengujian yang terbatas. Nuklease mikrokokus adalah metode yang disukai saat bekerja dengan kromatin asli, tetapi seperti sonikasi, ujung kromatin tidak seragam dan memerlukan pemrosesan yang tidak efisien dan melelahkan. Selain itu, titrasi nuklease mikrokokus yang hati-hati diperlukan untuk mencegah pencernaan yang berlebihan. Kami berusaha untuk menyederhanakan langkah persiapan kromatin sehingga eksperimen dapat menghindari kehilangan material, menghilangkan kebutuhan akan peralatan sonikasi, dan dengan mudah menghindari pencernaan yang berlebihan. Oleh karena itu kami memutuskan untuk menggunakan campuran enzim restriksi (tiga pemotong 4-basis dan satu pemotong 6-basis) yang menghasilkan overhang dinukleotida identik. Overhang tersebut dapat secara efisien diikat relatif terhadap ujung tumpul atau overhang nukleotida tunggal yang dihasilkan dengan memproses kromatin yang terfragmentasi oleh sonikasi atau nuklease mikrokokus. Kami mencerna sel-sel yang tidak tetap dalam volume 10 l buffer yang meresap ke dalam sel, diikuti oleh pengenceran dua kali lipat dalam buffer yang mengakhiri pencernaan dengan EDTA dan melisiskan sel. Karena prosedur TCL kami tidak menggunakan manik-manik, kami tidak perlu membuang serpihan dan memindahkan material ke tabung baru, langkah yang diperlukan oleh prosedur ChIP yang mengurangi latar belakang, tetapi berkontribusi pada hilangnya material. Setelah menguji kondisi pencernaan, kami mampu menghasilkan tangga DNA yang konsisten untuk TCL dan ChIP (Gbr. 1B).

Setelah menentukan kondisi pencernaan kromatin yang sesuai, kami melanjutkan untuk menguji berbagai parameter reaksi ligasi kromatin yang ditargetkan: konsentrasi antibodi, konsentrasi adaptor, konsentrasi garam, dan kondisi ligasi (volume, suhu, jumlah ligase). Kami menggunakan 2.000 sel MCF7 untuk setiap reaksi TCL selama pengujian, dan semua pengujian awal menggunakan antibodi anti-H3K27me3 yang terkonjugasi dengan streptavidin. Setelah fragmentasi kromatin, 3-5 l antibodi terkonjugasi streptavidin dengan adaptor terikat ditambahkan ke dalam 20 l larutan kromatin terfragmentasi, kemudian diinkubasi semalaman (Gbr. 1A). Karena rotasi atau agitasi sampel encer volume kecil dapat berkontribusi pada hilangnya material secara signifikan melalui penyerapan ke permukaan, kami menginkubasi sampel TCL tanpa pencampuran selama inkubasi semalam. Hari berikutnya, 180 l campuran ligasi ditambahkan ke sampel untuk memungkinkan adaptor mengikat ujung kromatin. Kami menemukan parameter paling penting untuk reaksi TCL yang berhasil adalah adaptor 1:1 terhadap rasio antibodi dan pemilihan PCR hanya kromatin ligasi ganda.

Awalnya, kami menganggap bahwa sebagian besar fragmen kromatin yang diikat mungkin diikat hanya pada satu ujung, jadi promotor T7 disertakan pada adaptor. Reaksi TCL kemudian dianalisis dengan amplifikasi RNA berbasis T7, diikuti dengan transkripsi balik dan qPCR. Ketika kami menguji berbagai kondisi reaksi, kami mengamati sinyal yang sangat kuat namun terbatas yang tidak sensitif terhadap konsentrasi antibodi dan adaptor (Gambar 1C), atau kondisi lain yang diuji (data tidak ditampilkan). Pentingnya menggunakan sejumlah kecil adaptor menjadi jelas ketika kami memeriksa hanya kromatin ligasi ganda yang diamplifikasi dengan PCR (Gbr. 2A). Combining selection for double ligations and reducing the ratio of adapter to antibody to 1:1 increased signal to noise detected by TCL-qPCR and made signal sensitive to antibody titration. To evaluate these optimizations, we compared the performance of TCL-qPCR using only 2,000 cells with native chromatin ChIPs (N-ChIP) performed with one million cells and identical reagents as TCL. Both methods yielded comparable signals (FIGS. 2B and 2C).

Adapter and Library Construction Considerations

During the initial development of TCL, we performed reactions using antibodies loaded with two adapters, an “A” adapter and a “B” adapter. We were concerned that using two adapters would limit sensitivity when nearing the lower limit of input cell numbers for TCL reactions. Two adapters lead to formation of four species of double ligation, but PCR amplification would only efficiently amplify half those species of ligation products, potentially leading to drop out of signal during amplification (FIGS. 5A-5B). We therefore switched to using a single adapter for TCL reactions and found that one adapter is preferable, in part due to elimination of PCR generated primer dimer artefacts (FIGS. 5C-5D, arrows). However, as head to tail annealing of denatured double ligated DNA having the same adapter on either end suppressed PCR amplification efficiency (˜35-45% efficiency based on qPCR, data not shown), we needed to increase the number of PCR cycles during amplification to compensate.

Having validated TCL reactions with either one or two adapters by qPCR, we proceeded with library construction to evaluate genome-wide histone profiles. PCR amplified TCL DNA (FIGS. 5C-5D) requires further fragmentation to produce next generation sequencing libraries. We used transposition based tagmentation that simultaneously fragments DNA while inserting sequencing adapters, to construct sequencing libraries.

Genome-Wide Analysis of TCL Versus ChIP

After sequencing, we downloaded ENCODE data for MCF7 (Dunham et al. (2012) Nature 489:57-74) and analysed all libraries using Galaxy. We then performed both qualitative and quantitative assessments of TCL performance. First, we visually examined genome-wide data quality using normalized signal tracks. When comparing data generated from 2,000 cell TCLs and 2000 cell ChIPs to ChIP samples produced with a million or more cells, H3K27me3 chromatin profiles generated with TCL were virtually indistinguishable across a range of genomic intervals (FIG. 3A). Genomic windows comparing H3K36me3 marks between 2,000 cell TCLs and ChIP were also highly concordant (FIG. 3B). While 2000 cell ChIPs were able to produce signal reminiscent of one million cell ChIPs and 2000 cell TCLs, the signal was clearly reduced (FIGS. 3A and 3B). To further evaluate the sensitivity of TCL, we then compared H3K27ac chromatin landscapes produced with high cell number ChIPs to TCL and ChIP data generated with decreasing cell numbers (10,000-200 cells). Strikingly, the TCL signal was consistently retained even as the number of cells used was reduced to 200, while the ChIP signal dropped sharply even at 10,000 cells, and continued to decrease with less cells (FIG. 3C). While we did not perform N-ChIPs for H3K4me3 and there is no equivalent ENCODE data for that histone mark to make a comparison, we did generate highly reproducible 2,000 MCF7 cell TCLs for H3K4me3 visual examination relative to other histone marks revealed high feature specificity with clearly reproducible peak patterns. Since MCF7 is a human cancer cell line with an abnormal karyotype and high DNA content (˜10 pg/cell), we sought to test TCL on a normal low DNA content (˜5 pg/cell) cell type. We also sought to ensure that TCL works in the context of sorting limited cell numbers. To accomplish this, we sorted mouse brain derived neurosphere cells and performed TCLs on ˜1,000 sorted events (<1,000 actual cells). The resulting epigenetic profiles were highly concordant (FIG. 3D).

To quantitatively evaluate the robustness of genome wide TCL data, both across biological replicates and in comparison, to ChIP data, we used several approaches, including: examination of signal to noise represented by the fraction of reads in peaks (FRIP, Landt et al. (2012) Genome Res. 9:1813-1831, Kellis et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(17):6131-6138), correlation analysis, and principal component analysis (PCA). First, we calculated the FRIP for all MCF7 data profiled by both TCL and ChIP, and found that low cell number TCL samples had superior FRIPs when compared to low cell number ChIPs, and nearly equivalent FRIPs compared to ENCODE ChIPs (Table 1). Notably, the FRIPs generated with 200 and 400 cell H3K27ac TCLs averaged 25.1% and 30.5%, respectively, compared to ENCODE ChIPs that averaged 27.1% (Table 1). In contrast, ChIP samples produced with 2000, 400, or 200 cells had FRIP scores 3-9% less than comparable TCLs, consistent with the visually inferior signal to noise observed (FIGS. 3A-3C). We also evaluated signal to noise ratios by strand cross-correlation analysis (Landt et al. (2012) Genome Res. 9:1813-1831, Marinov et al. (2014) G3 (Bethesda) 4(2):209-223) and found the results to be consistent with FRIP, as low cell TCLs had higher normalized strand coefficients (NSCs) and higher relative strand correlations (RSC) compared to equivalent cell number ChIPs. Aggregation plots (Shen et al. (2014) BMC Genomics 15:284) of H3K27ac around TSS intervals also suggest that TCLs are more similar to one million cell N-ChIPs than low cell N-ChIPs. Next, we produced genome-wide Pearson correlation plots using 2 kb genomic windows. Strong correlations between TCL and ChIP data were observed (FIG. 4A). Genome-wide correlations for TCL versus high cell number N-ChIP averaged r=0.69 for H3K27me3, r=0.83 for H3K36me3, and r=0.6 for H3K27ac. Correlations between biological replicates of TCLs were high and comparable to ChIPs, with nearly all replicates having r>0.8 using 2 kb genomic bins (FIG. 4A). Biological replicates of 2000 cell H3K4me3 TCLs were also highly correlated with r=0.88. Additionally, analysis of the 10,000-200 cell H3K27ac TCLs demonstrated high correlations between biological replicates and comparing 10,000 cell TCLs to 400 cell TCLs revealed high correlations. Genome wide correlations for the <1000 cell neurosphere TCLs were also very high with r=0.71-0.97 (FIG. 4B). Finally, we performed PCA analysis on the TCL and ChIP data from MCF7 samples using various bin sizes, from 500 bp to 20 kb, and found that the TCL data and ChIP data clustered together based on histone marks. Increasing the bin size had a negligible effect as data was already well clustered using small 500 bp windows (FIG. 4C). Notably, the TCL samples appeared to cluster more tightly than the ChIP samples, indicating strong reproducibility (FIG. 4C).

The simple workflow of the TCL technique, outlined in FIG. 1, begins with resuspension of unfixed cells in digestion buffer containing enzymes that generate native chromatin fragments with identical dinucleotide overhangs. While ChIP-seq methods seek to fragment chromatin into small fragments (250-500 bp), which reduces background chromatin binding to beads, facilitates library construction, and maximizes data resolution, our bead-free strategy and library construction method obviate the need for small fragments and allows the strategic use of larger chromatin fragments for greater sensitivity.

The large chromatin fragments facilitate relatively symmetrically distributed background binding events, presumably to unmodified histones, that likely drives most ligation events detected in FIG. 1C. Since our technique eliminates washing to improve stringency, and most background appears to be driven by background antibody binding and not reaction parameters, signal specificity was limited when examining all ligation events. We took advantage of the apparent background binding by hypothesizing that if the initial ligation of chromatin ends is driven by specific or nonspecific antibody binding, secondary ligation events should be driven by higher locally concentrated adapters as a function of antibody specificity and concentration. Therefore, using enough antibody to have at least one nonspecific binding event per chromatin fragment, but not two, should facilitate capturing more frequent specificity driven double ligations when limiting the amount of adapter bound to the antibody, and producing increased signal to noise while also maintaining sufficient depth of coverage for regions with lower abundancy of modified histone targets across multinucleosome fragments that might fail to produce double ligations without nonspecific binding events. Since double ligations should occur more frequently with bigger fragments that can support both specific and nonspecific antibody binding, amplification of double ligated chromatin should select for larger fragments. The data presented in FIG. 2D supports this interpretation and shows that ligations in the presence of IgG or no antibody selects smaller fragments where ligations are driven by diffusion and intermolecular ligation, not intramolecular proximity ligation.

As cell numbers used for epigenetic profiling decrease, it may be expected that methods will become increasingly sensitive to antibody quality. For example, we originally tested three ChIP-seq validated antibodies against H3K27me3, including Millipore #07-499, used by ENCODE, and found all three worked well for high cell number ChIP. Indeed, all three produced similar results for TCL-qPCR, but one produced sequence data that better matched ENCODE H3K27me3 signal tracks (data not shown). Thus, researchers should not assume all ChIP validated antibodies are compatible with TCL or any other low cell genome wide profiling technique.

While amplification of ligated material prior to transposase based library construction masks the duplication rate, and single end reads do not support accurate estimation of duplication rates, we did assess duplication rates and found that ˜17-27% of unique reads map to identical 5′ sequences. That likely overestimates the real duplication rate, suggesting the library complexity produced by TCL remains high, and is superior to other low cell epigenetic profiling techniques. For example, the single end data from ChIP-seq with 10,000-100 cells, produced by a microfluidic ChIP-seq device (Brind'Amour et al., supra), had duplication rates calculated to be in the range of 55-80%. The apparent low duplication, along with the robustness demonstrated by our principal component analysis and correlation analysis clearly indicate that TCL produces high quality robust data.

We have demonstrated a greatly simplified approach for producing high quality histone modification profiles that is unique and distinct from ChIP. Key advantages of TCL include greatly reduced handling through elimination of inefficient immunoprecipitation, washing, and the subsequent need for inefficient enzymatic end repair and single nucleotide or blunt-end ligation steps with picogram quantities of starting material. These qualities should make TCL more amenable to microfluidic adaptation, automation, and further optimization with even less than the 200 cells tested here. While the current iteration of TCL was designed and tested only for mapping histone modifications, we are currently working to adapt TCL for use with transcription factors. We also believe TCL offers the opportunity for studies beyond what is possible for ChIP, such as multiplexing of histone modifications or transcription factor co-occupancy without re-ChIP. For example, it may be possible to preload antibodies against H3K27me3 and H3K4me3 with different barcoded adapters so that their simultaneous use can allow direct amplification and detection of true bivalent chromatin. TCL thus provides robust epigenetic profiles from low cell numbers in an easy to execute approach with the potential for novel applications.


DISKUSI

Despite only ∼27% aa sequence identity, the structures of the two BbvCI subunits are quite similar. Analysis of the more precisely modeled R2 subunit using the Vector Alignment Search Tool (VAST) at NCBI revealed close structural matches to NgoMIV and related enzymes, several of which have been crystallized bound to their DNA targets ( 26) ( 62, 70). The similarities are especially close at the protein–DNA interfaces formed by the catalytic and specificity residues, and allow us to tentatively infer the amino acids of BbvCI involved in DNA sequence-recognition.

In Type II REases of these kinds, the subunit that cleaves the ‘bottom’ DNA strand primarily specifies the left half of the target sequence, as conventionally written, and the subunit that cleaves the ‘top’ strand primarily specifies the right half (Figure 9). Extrapolating this to BbvCI, we expect the R1 subunit to specify mainly the left side of the target sequence, 5′-CCTN or 5′-CCTC, and the R2 subunit to specify mainly the right side, 5′-GCTN or 5′-GCTG. (Sequence recognition by REases usually involves contacts to both bases of each base pair, but following convention, only the 5′-to-3′ strands are shown here.)

NgoMIV recognizes the symmetric sequence G|CCGGC, and each of its identical subunits specifies 5′-GCC ( 26). The inner two C:G base pairs of these half-sites are contacted in the major DNA groove by a loop-helix motif, R-S-D-R (Arg191-Ser192-Asp193-Arg194) 3-aa away from K187, the terminal lysine of the PD-(D/E)XK catalytic site (Figure 9A). A similar arrangement occurs in the closely related REases SgrAI, Cfr10I and Bse634I ( 62, 70, 71). The equivalent residues of BbvCI are D-K-N-K (Asp173-Lys174-Asn175-Lys176) in R1, and E-R-N-M (Glu183-Arg184-Asn185-Met186) in R2. Given the close structural similarities in this part of the proteins, we expect that these residues likewise make major-groove contacts to the inner base pairs of the BbvCI half-sites. There are numerous ways in which this could occur ( 72), and one such possibility is shown in Figure 9B. The 7-bp recognition sequence of BbvCI is one bp longer than that of NgoMIV. This difference likely stems from the dimerization interfaces, which position the BbvCI subunits slightly further apart than those of NgoMIV, and in so doing reduce the 4-base cleavage offset of NgoMIV to 3 bases in BbvCI.

We demonstrate above that Lys176 of the R1 subunit is the major determinant of the central C:G bp of the recognition sequence. We speculate that Lys176 specifies the G of this base pair, in part by donating H-bonds to the guanine HAI6 and/or N7 atoms, and that the corresponding, symmetrically opposed, Met186 of the R2 subunit juxtaposes the cytosine (Figure 9B). Due to its limited capacity to form H-bonds, methionine plays a more passive role in sequence-recognition than lysine. Consistent with this interpretation, we find that Bsu36I (CC|TNAGG), BlpI (GC|TNAGC), and Bpu10I (CC|TNAGC), REases related to BbvCI that do not specify the central bp, all have methionine at this position ( Supplementary Figure S7 ).

In proteins with very high fidelity of sequence-recognition such as REases, discrimination of A:T and T:A base pairs is often augmented by a residue in the minor DNA groove that obstructs the 2-amino group of guanine, preventing G:C and C:G bp from fitting there (unpublished observations). Modeling suggests that both BbvCI subunits have minor groove residues that might act in this way at the T:A bp in each half-site, namely Arg85 (or Trp84) of R1 and Gln83 (or Glu84) of R2. Arg and Gln also occur at the equivalent positions in the Bsu36I, BlpI, and Bpu10I subunits which specify T:A at the same position in their half-sites ( Supplementary Figure S7 ).

The outer G:C bp of each NgoMIV half-site is specified by Arg227 and Asp34, amino acids distant from each other in the linear protein sequence, and distant from the R-S-D-R motif that recognizes the inner base pairs ( 26). Structural similarities with the BbvCI subunits are poor in these regions, complicating identification of the residues that might specify the outer base pairs of the BbvCI half-sites. Notwithstanding, structural superimposition and sequence co-variation suggest that Asp204 and Arg227 of the R1 subunit might together specify the outer C:G of the left half-site (CCTC), and Lys214 and Asn236 of the R2 subunit might together specify the outer G:C of the right half-site (Figure 9B).

Most Type II restriction endonucleases act as homo-multimers composed of two or more copies of the same protein subunit. Because such enzymes are symmetric, they recognize DNA sequences that are also symmetric, and they cleave the two strands symmetrically at equivalent positions. Type II REases composed of different subunits—hetero-multimers— are relatively rare. And those like BbvCI, whose subunits are similar in size and sequence, are even more rare. It is tempting to speculate that the subunits of BbvCI share common ancestry, and descend from symmetric enzymes that recognized slightly different sequences. Candidates for such predecessors can found in Bsu36I (CC|TNAGG), whose subunits recognize the left half of the BbvCI sequence, BlpI (GC|TNAGC), whose subunits recognize the right half, and Bpu10I, a chimaera of the two that recognizes the hybrid sequence, CC|TNAGC. As shown above, a change of only one or two amino acids could be sufficient to change this specificity to that of BbvCI:CC|TCAGC. That the subunits of these four enzymes have similar sizes, cleave at the same position, and share significant aa sequence similarity lends support to this idea, as too, perhaps, does the observation that the BbvCI subunits attach to each other rather weakly.


Tonton videonya: DPNI ou ADNflc: Test IONA - Dépistage trisomie 13,18 et 21 (Februari 2023).