Informasi

Dari mana unit fosfat berasal ketika unit EGF dimerize?

Dari mana unit fosfat berasal ketika unit EGF dimerize?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Setelah EGF mengikat, unit EGFR dimerize dan cross-phosphorylate. Gugus fosfat ditransfer ke daerah kaya tirosin c-terminal intraseluler. Dari mana unit fosfat berasal dalam reaksi silang ini? Apakah dari unit GTP terikat?


Dalam fosforilasi protein, gugus fosfat yang ditransfer dari kinase ke substrat hampir secara universal berasal dari ATP. Namun, ada bukti beberapa protein kinase menggunakan GTP sebagai sumber fosfatnya, meskipun jumlahnya sedikit dan jarang.


Faktor pertukaran nukleotida guanin

Faktor pertukaran nukleotida guanin (GEF) adalah protein atau domain protein yang mengaktifkan GTPase monomer dengan merangsang pelepasan guanosin difosfat (GDP) untuk memungkinkan pengikatan guanosin trifosfat (GTP). [1] Berbagai domain struktural yang tidak terkait telah terbukti menunjukkan aktivitas pertukaran nukleotida guanin. Beberapa GEF dapat mengaktifkan beberapa GTPase sementara yang lain khusus untuk satu GTPase.


Isi

Awalnya, transkripsi varian sambatan alternatif yang berasal dari gen INSR diterjemahkan untuk membentuk salah satu dari dua isomer monomer IR-A di mana ekson 11 dikecualikan, dan IR-B di mana ekson 11 disertakan. Penyertaan ekson 11 menghasilkan penambahan 12 asam amino di hulu situs pembelahan proteolitik furin intrinsik.

Setelah dimerisasi reseptor, setelah pembelahan proteolitik menjadi rantai dan , 12 asam amino tambahan tetap ada di terminal-C dari rantai (ditunjuk CT) di mana mereka diprediksi akan mempengaruhi interaksi reseptor-ligan. [9]

Setiap monomer isometrik secara struktural diatur ke dalam 8 domain berbeda yang terdiri dari domain berulang kaya leusin (L1, residu 1-157), wilayah kaya sistein (CR, residu 158-310), domain berulang kaya leusin tambahan (L2, residu 311-470), tiga domain fibronektin tipe III FnIII-1 (residu 471-595), FnIII-2 (residu 596-808) dan FnIII-3 (residu 809-906). Selain itu, domain sisipan (ID, residu 638-756) berada di dalam FnIII-2, berisi situs pembelahan furin /β, dari mana proteolisis menghasilkan domain IDα dan IDβ. Dalam rantai , hilir domain FnIII-3 terletak heliks transmembran (TH) dan wilayah juxtamembrane (JM) intraseluler, tepat di hulu domain katalitik tirosin kinase (TK) intraseluler, yang bertanggung jawab untuk jalur pensinyalan intraseluler berikutnya. [10]

Setelah pembelahan monomer ke masing-masing rantai dan , reseptor hetero atau homo-dimerisasi dipertahankan secara kovalen antara rantai dengan tautan disulfida tunggal dan antara monomer dalam dimer oleh dua tautan disulfida yang memanjang dari setiap rantai . Struktur ektodomain 3D keseluruhan, yang memiliki empat situs pengikatan ligan, menyerupai 'V' terbalik, dengan masing-masing monomer diputar kira-kira 2 kali lipat pada sumbu yang berjalan sejajar dengan domain 'V' dan L2 dan FnIII-1 terbalik dari setiap monomer yang terbentuk. puncak 'V terbalik. [10] [11]

Ligan endogen reseptor insulin termasuk insulin, IGF-I dan IGF-II. Menggunakan cryo-EM, wawasan struktural tentang perubahan konformasi pada pengikatan insulin disediakan. Pengikatan ligan ke rantai dari ektodomain dimer IR menggesernya dari bentuk V terbalik ke konformasi berbentuk T, dan perubahan ini disebarkan secara struktural ke domain transmembran, yang semakin dekat, akhirnya mengarah ke autofosforilasi berbagai tirosin residu dalam domain TK intraseluler dari rantai . [12] Perubahan ini memfasilitasi perekrutan protein adaptor spesifik seperti protein substrat reseptor insulin (IRS) selain SH2-B (Src Homology 2 - B), APS dan protein fosfatase, seperti PTP1B, yang akhirnya mendorong proses hilir yang melibatkan homeostasis glukosa darah. [14]

Sebenarnya hubungan antara IR dan ligan menunjukkan sifat alosterik yang kompleks. Hal ini ditunjukkan dengan penggunaan Scatchard plot yang mengidentifikasi bahwa pengukuran rasio ligan terikat IR terhadap ligan tidak terikat tidak mengikuti hubungan linier terhadap perubahan konsentrasi ligan terikat IR, menunjukkan bahwa IR dan masing-masing ligan terikat ligan berbagi hubungan ikatan kooperatif. [15] Selanjutnya, pengamatan bahwa laju disosiasi IR-ligan dipercepat pada penambahan ligan tidak terikat menyiratkan bahwa sifat kerjasama ini negatif dikatakan berbeda, bahwa pengikatan awal ligan ke IR menghambat pengikatan lebih lanjut ke aktif kedua. situs - pameran penghambatan alosterik. [15]

Model-model ini menyatakan bahwa setiap monomer IR memiliki 2 situs pengikatan insulin situs 1, yang berikatan dengan permukaan pengikatan 'klasik' insulin: terdiri dari domain L1 plus CT dan situs 2, terdiri dari loop di persimpangan FnIII-1 dan FnIII- 2 diprediksi akan berikatan dengan situs pengikatan wajah hexamer 'baru' dari insulin. [5] Karena setiap monomer yang berkontribusi pada ektodomain IR menunjukkan komplementaritas 'cermin' 3D, situs terminal-N 1 dari satu monomer akhirnya menghadap situs terminal-C 2 dari monomer kedua, di mana ini juga berlaku untuk setiap komplemen cermin monomer ( sisi berlawanan dari struktur ektodomain). Literatur saat ini membedakan situs pengikatan komplemen dengan menunjuk nomenklatur situs 1 dan situs 2 monomer kedua sebagai situs 3 dan situs 4 atau sebagai situs 1' dan situs 2' masing-masing. [5] [14] Dengan demikian, model ini menyatakan bahwa setiap IR dapat mengikat molekul insulin (yang memiliki dua permukaan pengikatan) melalui 4 lokasi, menjadi situs 1, 2, (3/1') atau (4/2' ). Karena setiap situs 1 menghadap ke situs 2 secara proksimal, pada saat insulin berikatan dengan situs tertentu, 'tautan silang' melalui ligan antara monomer diprediksi akan terjadi (yaitu sebagai [monomer 1 Situs 1 - Insulin - monomer 2 Situs (4/2')] atau sebagai [monomer 1 Situs 2 - Insulin - monomer 2 situs (3/1')]). Sesuai dengan pemodelan matematis kinetika IR-insulin saat ini, ada dua konsekuensi penting dari peristiwa pengikatan silang insulin 1. bahwa dengan pengamatan kerjasama negatif antara IR dan ligan tersebut di atas, pengikatan ligan berikutnya ke IR berkurang dan 2 bahwa aksi fisik pengikatan silang membawa ektodomain ke dalam suatu konformasi yang diperlukan untuk terjadinya peristiwa fosforilasi tirosin intraseluler (yaitu peristiwa ini berfungsi sebagai persyaratan untuk aktivasi reseptor dan akhirnya pemeliharaan homeostasis glukosa darah). [14]

Menerapkan cryo-EM dan simulasi dinamika molekul dari reseptor yang dilarutkan dalam nanodiscs, struktur seluruh ektodomain reseptor insulin dimer dengan empat molekul insulin yang terikat divisualisasikan, oleh karena itu mengkonfirmasi dan secara langsung menunjukkan prediksi secara biokimia 4 lokasi pengikatan. [13]

Agonis Sunting

Reseptor Insulin adalah jenis reseptor tirosin kinase, di mana pengikatan ligan agonis memicu autofosforilasi residu tirosin, dengan masing-masing subunit memfosforilasi pasangannya. Penambahan gugus fosfat menghasilkan situs pengikatan untuk substrat reseptor insulin (IRS-1), yang kemudian diaktifkan melalui fosforilasi. IRS-1 yang diaktifkan memulai jalur transduksi sinyal dan mengikat fosfoinositida 3-kinase (PI3K), yang pada gilirannya menyebabkan aktivasinya. Ini kemudian mengkatalisis konversi Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate menjadi Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). PIP3 bertindak sebagai pembawa pesan sekunder dan menginduksi aktivasi protein kinase yang bergantung pada fosfatidilinositol, yang kemudian mengaktifkan beberapa kinase lainnya – terutama protein kinase B, (PKB, juga dikenal sebagai Akt). PKB memicu translokasi transporter glukosa (GLUT4) yang mengandung vesikel ke membran sel, melalui aktivasi protein SNARE, untuk memfasilitasi difusi glukosa ke dalam sel. PKB juga memfosforilasi dan menghambat glikogen sintase kinase, yang merupakan enzim yang menghambat glikogen sintase. Oleh karena itu, PKB bertindak untuk memulai proses glikogenesis, yang pada akhirnya mengurangi konsentrasi glukosa darah. [16]

Pengaruh insulin pada penyerapan glukosa dan metabolisme. Insulin mengikat reseptornya (1), yang, pada gilirannya, memulai banyak kaskade aktivasi protein (2). Ini termasuk: translokasi transporter Glut-4 ke membran plasma dan masuknya glukosa (3), sintesis glikogen (4), glikolisis (5), dan sintesis asam lemak (6).

Transduksi sinyal insulin: Pada akhir proses transduksi, protein yang diaktifkan berikatan dengan PIP2 protein yang tertanam dalam membran.

Regulasi ekspresi gen Sunting

IRS-1 yang diaktifkan bertindak sebagai pembawa pesan sekunder di dalam sel untuk merangsang transkripsi gen yang diatur insulin. Pertama, protein Grb2 mengikat residu P-Tyr dari IRS-1 dalam domain SH2-nya. Grb2 kemudian mampu mengikat SOS, yang pada gilirannya mengkatalisis penggantian GDP terikat dengan GTP pada Ras, protein G. Protein ini kemudian memulai kaskade fosforilasi, yang berpuncak pada aktivasi mitogen-activated protein kinase (MAPK), yang memasuki nukleus dan memfosforilasi berbagai faktor transkripsi nuklir (seperti Elk1).

Stimulasi sintesis glikogen Sunting

Sintesis glikogen juga dirangsang oleh reseptor insulin melalui IRS-1. Dalam hal ini, domain SH2 dari PI-3 kinase (PI-3K) yang mengikat P-Tyr dari IRS-1. Sekarang diaktifkan, PI-3K dapat mengubah lipid membran phosphatidylinositol 4,5-bifosfat (PIP2) menjadi fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfat (PIP3). Ini secara tidak langsung mengaktifkan protein kinase, PKB (Akt), melalui fosforilasi. PKB kemudian memfosforilasi beberapa protein target, termasuk glikogen sintase kinase 3 (GSK-3). GSK-3 bertanggung jawab untuk memfosforilasi (dan dengan demikian menonaktifkan) glikogen sintase. Ketika GSK-3 difosforilasi, ia dinonaktifkan, dan dicegah dari menonaktifkan glikogen sintase. Dengan cara memutar ini, insulin meningkatkan sintesis glikogen.

Degradasi insulin Sunting

Setelah molekul insulin telah merapat ke reseptor dan mempengaruhi aksinya, mungkin dilepaskan kembali ke lingkungan ekstraseluler atau mungkin didegradasi oleh sel. Degradasi biasanya melibatkan endositosis kompleks reseptor insulin diikuti oleh aksi enzim pendegradasi insulin. Sebagian besar molekul insulin didegradasi oleh sel hati. Diperkirakan bahwa molekul insulin tipikal akhirnya terdegradasi sekitar 71 menit setelah pelepasan awalnya ke dalam sirkulasi. [17]

Sunting sistem kekebalan

Selain fungsi metabolisme, reseptor insulin juga diekspresikan pada sel imun, seperti makrofag, sel B, dan sel T. Pada sel T, ekspresi reseptor insulin tidak terdeteksi selama keadaan istirahat tetapi diatur ke atas pada aktivasi reseptor sel T (TCR). Memang, insulin telah ditunjukkan ketika dipasok secara eksogen untuk mempromosikan in vitro Proliferasi sel T pada model hewan. Sinyal reseptor insulin penting untuk memaksimalkan efek potensial sel T selama infeksi akut dan peradangan. [18] [19]

Aktivitas utama aktivasi reseptor insulin adalah menginduksi ambilan glukosa. Untuk alasan ini "insensitivitas insulin", atau penurunan sinyal reseptor insulin, menyebabkan diabetes mellitus tipe 2 - sel tidak dapat mengambil glukosa, dan hasilnya adalah hiperglikemia (peningkatan glukosa yang bersirkulasi), dan semua gejala sisa yang terjadi. hasil dari diabetes.

Beberapa pasien dengan mutasi homozigot pada INSR gen telah dijelaskan, yang menyebabkan sindrom Donohue atau Leprechaunism. Gangguan resesif autosomal ini menghasilkan reseptor insulin yang sama sekali tidak berfungsi. Pasien-pasien ini memiliki telinga yang rendah, sering menonjol, lubang hidung melebar, bibir menebal, dan retardasi pertumbuhan yang parah. Dalam kebanyakan kasus, prospek pasien ini sangat buruk, dengan kematian terjadi dalam tahun pertama kehidupan. Mutasi lain dari gen yang sama menyebabkan sindrom Rabson-Mendenhall yang tidak terlalu parah, di mana pasien memiliki karakteristik gigi yang abnormal, hipertrofi gingiva (gusi), dan pembesaran kelenjar pineal. Kedua penyakit muncul dengan fluktuasi kadar glukosa: Setelah makan glukosa awalnya sangat tinggi, dan kemudian turun dengan cepat ke tingkat rendah yang tidak normal. [20] Mutasi genetik lain pada gen reseptor insulin dapat menyebabkan Resistensi Insulin Parah. [21]


Isi

DIA2 dinamakan demikian karena memiliki struktur yang mirip dengan reseptor faktor pertumbuhan epidermal manusia, atau HER1. Neu dinamakan demikian karena berasal dari garis sel glioblastoma hewan pengerat, sejenis tumor saraf. ErbB-2 dinamai karena kemiripannya dengan ErbB (avian erythroblastosis onkogen B), onkogen kemudian ditemukan mengkode EGFR. Kloning molekuler dari gen menunjukkan bahwa HER2, Neu, dan ErbB-2 semuanya dikodekan oleh ortolog yang sama. [9]

ERBB2, sebuah proto-onkogen yang dikenal, terletak di lengan panjang kromosom manusia 17 (17q12).

Keluarga ErbB terdiri dari empat reseptor tirosin kinase yang terikat membran plasma. Salah satunya adalah erbB-2, dan anggota lainnya menjadi reseptor faktor pertumbuhan epidermal, erbB-3 (pengikatan neuregulin tidak memiliki domain kinase), dan erbB-4. Keempatnya mengandung domain pengikatan ligan ekstraseluler, domain transmembran, dan domain intraseluler yang dapat berinteraksi dengan banyak molekul pensinyalan dan menunjukkan aktivitas yang bergantung pada ligan dan tidak bergantung pada ligan. Khususnya, tidak ada ligan untuk HER2 yang telah diidentifikasi. [10] [11] HER2 dapat heterodimerisasi dengan salah satu dari tiga reseptor lainnya dan dianggap sebagai mitra dimerisasi yang disukai dari reseptor ErbB lainnya. [12]

Dimerisasi menghasilkan autofosforilasi residu tirosin dalam domain sitoplasma reseptor dan memulai berbagai jalur pensinyalan.

Transduksi sinyal Sunting

Jalur pensinyalan yang diaktifkan oleh HER2 meliputi: [13]

Singkatnya, pensinyalan melalui keluarga reseptor ErbB mendorong proliferasi sel dan menentang apoptosis, dan oleh karena itu harus diatur dengan ketat untuk mencegah terjadinya pertumbuhan sel yang tidak terkendali.

Kanker Sunting

Amplifikasi, juga dikenal sebagai ekspresi berlebih dari ERBB2 gen, terjadi pada sekitar 15-30% dari kanker payudara. [8] [14] Ini sangat terkait dengan peningkatan kekambuhan penyakit dan prognosis yang buruk Namun, agen obat yang menargetkan HER2 pada kanker payudara telah secara signifikan mengubah riwayat alami kanker payudara positif-HER2 dengan prognosis buruk. [15] Over-ekspresi juga diketahui terjadi pada ovarium, [16] perut, adenokarsinoma paru-paru [17] dan bentuk agresif kanker rahim, seperti karsinoma endometrium serosa uteri, [18] [19] mis. HER2 diekspresikan secara berlebihan pada sekitar 7-34% pasien dengan kanker lambung [20] [21] dan pada 30% karsinoma duktus saliva. [22]

HER2 terlokalisasi dan sebagian besar waktu, digabungkan dengan gen GRB7, yang merupakan proto-onkogen yang terkait dengan tumor payudara, sel germinal testis, lambung, dan esofagus.

Protein HER2 telah terbukti membentuk kelompok di membran sel yang mungkin berperan dalam tumorigenesis. [23] [24]

Bukti juga melibatkan pensinyalan HER2 dalam resistensi terhadap obat kanker cetuximab yang ditargetkan EGFR. [25]

Mutasi Sunting

Lebih lanjut, perubahan struktural yang beragam telah diidentifikasi yang menyebabkan penembakan reseptor ini yang tidak bergantung pada ligan, melakukannya tanpa adanya ekspresi berlebih reseptor. HER2 ditemukan dalam berbagai tumor dan beberapa tumor ini membawa mutasi titik dalam urutan yang menentukan domain transmembran HER2. Substitusi valin untuk asam glutamat dalam domain transmembran dapat mengakibatkan dimerisasi konstitutif protein ini tanpa adanya ligan. [26]

Mutasi HER2 telah ditemukan pada kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC) dan dapat mengarahkan pengobatan. [27]

HER2 adalah target trastuzumab antibodi monoklonal (dipasarkan sebagai Herceptin). Trastuzumab hanya efektif pada kanker di mana HER2 diekspresikan secara berlebihan. Satu tahun terapi trastuzumab direkomendasikan untuk semua pasien dengan kanker payudara HER2-positif yang juga menerima kemoterapi. [28] Terapi trastuzumab selama dua belas bulan sudah optimal. Percobaan acak telah menunjukkan tidak ada manfaat tambahan di luar 12 bulan, sedangkan 6 bulan telah terbukti lebih rendah daripada 12. Trastuzumab diberikan secara intravena setiap minggu atau setiap 3 minggu. [29]

Efek hilir penting dari pengikatan trastuzumab ke HER2 adalah peningkatan p27, protein yang menghentikan proliferasi sel. [30] Antibodi monoklonal lain, Pertuzumab, yang menghambat dimerisasi reseptor HER2 dan HER3, telah disetujui oleh FDA untuk digunakan dalam kombinasi dengan trastuzumab pada Juni 2012.

Pada November 2015, ada sejumlah uji klinis yang sedang berlangsung dan baru saja selesai dari agen target baru untuk kanker payudara metastatik HER2+, mis. margetuximab. [31]

Selain itu, NeuVax (Galena Biopharma) adalah imunoterapi berbasis peptida yang mengarahkan sel T "pembunuh" untuk menargetkan dan menghancurkan sel kanker yang mengekspresikan HER2. Sudah memasuki uji klinis fase 3.

Telah ditemukan bahwa pasien dengan ER+ (Estrogen receptor positive)/HER2+ dibandingkan dengan ER-/HER2+ kanker payudara sebenarnya dapat memperoleh manfaat lebih dari obat yang menghambat jalur molekuler PI3K/AKT. [32]

Ekspresi berlebih dari HER2 juga dapat ditekan oleh amplifikasi gen lain. Penelitian saat ini sedang dilakukan untuk menemukan gen mana yang mungkin memiliki efek yang diinginkan ini.

Ekspresi HER2 diatur oleh sinyal melalui reseptor estrogen. Biasanya, estradiol dan tamoxifen yang bekerja melalui reseptor estrogen menurunkan regulasi ekspresi HER2. Namun, ketika rasio koaktivator AIB-3 melebihi koaktivator PAX2, ekspresi HER2 diregulasi dengan adanya tamoxifen, yang mengarah ke kanker payudara yang resistan terhadap tamoxifen. [33] [34]

Biopsi kanker Sunting

Pengujian HER2 dilakukan pada pasien kanker payudara untuk menilai prognosis dan menentukan kesesuaian untuk terapi trastuzumab. Penting bahwa trastuzumab dibatasi untuk individu yang positif HER2 karena mahal dan telah dikaitkan dengan toksisitas jantung. [35] Untuk tumor HER2-positif, risiko trastuzumab jelas lebih besar daripada manfaatnya.

Tes biasanya dilakukan pada sampel biopsi payudara yang diperoleh baik dengan aspirasi jarum halus, biopsi jarum inti, biopsi payudara dengan bantuan vakum, atau eksisi bedah. Imunohistokimia digunakan untuk mengukur jumlah protein HER2 yang ada dalam sampel. Contoh pengujian ini termasuk HercepTest, Dako, Glostrup, dan Denmark. Sampel diberi skor berdasarkan pola pewarnaan membran sel.

  • Pewarnaan membran lengkap yang intensitasnya tidak seragam atau lemah, tetapi memiliki distribusi melingkar di setidaknya 10% sel. [37][38]

Spesimen dengan hasil IHC samar-samar kemudian harus divalidasi menggunakan hibridisasi fluoresensi in situ (FISH). IKAN dapat digunakan untuk mengukur jumlah salinan gen yang ada dan dianggap lebih dapat diandalkan daripada IHC. [39]

Pengeditan Serum

Domain ekstraseluler HER2 dapat dilepaskan dari permukaan sel tumor dan memasuki sirkulasi. Pengukuran serum HER2 dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) menawarkan metode yang jauh lebih invasif untuk menentukan status HER2 daripada biopsi dan akibatnya telah diselidiki secara ekstensif. Hasil sejauh ini menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi serum HER2 mungkin berguna dalam memprediksi respon terhadap terapi trastuzumab. [40] Namun, kemampuannya untuk menentukan kelayakan untuk terapi trastuzumab kurang jelas. [41]


Isi

RTK pertama yang ditemukan adalah EGF dan NGF pada tahun 1960-an, tetapi klasifikasi reseptor tirosin kinase tidak dikembangkan sampai tahun 1970-an. [5]

Sekitar 20 kelas RTK yang berbeda telah diidentifikasi. [6]

  1. RTK kelas I (keluarga reseptor EGF) (keluarga ErbB)
  2. RTK kelas II (keluarga reseptor insulin) (keluarga reseptor PDGF)
  3. RTK kelas IV (keluarga reseptor VEGF)
  4. RTK kelas V (keluarga reseptor FGF)
  5. RTK kelas VI (keluarga reseptor CCK)
  6. RTK kelas VII (keluarga reseptor NGF)
  7. RTK kelas VIII (keluarga reseptor HGF)
  8. RTK kelas IX (keluarga reseptor Eph)
  9. RTK kelas X (keluarga reseptor AXL)
  10. RTK kelas XI (keluarga reseptor TIE)
  11. RTK kelas XII (keluarga reseptor RYK)
  12. RTK kelas XIII (keluarga reseptor DDR)
  13. RTK kelas XIV (keluarga reseptor RET)
  14. RTK kelas XV (keluarga reseptor ROS)
  15. RTK kelas XVI (keluarga reseptor LTK)
  16. RTK kelas XVII (keluarga reseptor ROR)
  17. RTK kelas XVIII (keluarga reseptor MuSK)
  18. RTK kelas XIX (reseptor LMR)
  19. RTK kelas XX (Belum ditentukan)

Sebagian besar RTK adalah reseptor subunit tunggal tetapi beberapa ada sebagai kompleks multimerik, misalnya, reseptor insulin yang membentuk dimer terkait disulfida dengan adanya hormon (insulin). Selain itu, pengikatan ligan ke domain ekstraseluler menginduksi pembentukan dimer reseptor. [7] Setiap monomer memiliki domain hidrofobik transmembran-spanning tunggal yang terdiri dari 25 hingga 38 asam amino, wilayah terminal N ekstraseluler, dan wilayah terminal C intraseluler. [8] Wilayah terminal N ekstraseluler menunjukkan berbagai elemen yang dilestarikan termasuk domain seperti imunoglobulin (Ig) atau domain seperti faktor pertumbuhan epidermal (EGF), pengulangan fibronektin tipe III, atau wilayah kaya sistein yang merupakan karakteristik untuk setiap subfamili RTK domain ini terutama mengandung situs pengikatan ligan, yang mengikat ligan ekstraseluler, misalnya, faktor pertumbuhan atau hormon tertentu. [2] Wilayah terminal C intraseluler menampilkan tingkat konservasi tertinggi dan terdiri dari domain katalitik yang bertanggung jawab atas aktivitas kinase reseptor ini, yang mengkatalisis autofosforilasi reseptor dan fosforilasi tirosin substrat RTK. [2]

Dalam biokimia, kinase adalah jenis enzim yang mentransfer gugus fosfat (lihat di bawah) dari molekul donor berenergi tinggi, seperti ATP (lihat di bawah) ke molekul target spesifik (substrat) prosesnya disebut fosforilasi. Sebaliknya, enzim yang menghilangkan gugus fosfat dari target, dikenal sebagai fosfatase. Enzim kinase yang secara khusus memfosforilasi asam amino tirosin disebut tirosin kinase.

Ketika faktor pertumbuhan mengikat domain ekstraseluler dari RTK, dimerisasinya dipicu dengan RTK lain yang berdekatan. Dimerisasi menyebabkan aktivasi cepat dari domain kinase sitoplasma protein, substrat pertama untuk domain ini menjadi reseptor itu sendiri. Reseptor yang teraktivasi sebagai hasilnya kemudian menjadi autofosforilasi pada beberapa residu tirosin intraseluler spesifik.

Melalui berbagai cara, pengikatan ligan ekstraseluler biasanya akan menyebabkan atau menstabilkan dimerisasi reseptor. Hal ini memungkinkan tirosin di bagian sitoplasma dari setiap monomer reseptor trans-difosforilasi oleh reseptor pasangannya, menyebarkan sinyal melalui membran plasma. [9] Fosforilasi residu tirosin spesifik dalam reseptor yang diaktifkan menciptakan situs pengikatan untuk domain yang mengandung domain Src homologi 2 (SH2) dan pengikatan fosfotirosin (PTB). [10] [11] Protein spesifik yang mengandung domain ini termasuk Src dan fosfolipase Cγ. Fosforilasi dan aktivasi kedua protein ini pada pengikatan reseptor mengarah pada inisiasi jalur transduksi sinyal. Protein lain yang berinteraksi dengan reseptor teraktivasi bertindak sebagai protein adaptor dan tidak memiliki aktivitas enzimatik intrinsiknya sendiri. Protein adaptor ini menghubungkan aktivasi RTK ke jalur transduksi sinyal hilir, seperti kaskade pensinyalan MAP kinase. [2] Contoh jalur transduksi sinyal vital melibatkan reseptor tirosin kinase, c-met, yang diperlukan untuk kelangsungan hidup dan proliferasi mioblas yang bermigrasi selama miogenesis. Kurangnya c-met mengganggu miogenesis sekunder dan—seperti pada LBX1—mencegah pembentukan otot tungkai. Aksi lokal FGF (Fibroblast Growth Factors) dengan reseptor RTK-nya diklasifikasikan sebagai pensinyalan parakrin. Sebagai reseptor RTK memfosforilasi beberapa residu tirosin, mereka dapat mengaktifkan beberapa jalur transduksi sinyal.

Keluarga reseptor faktor pertumbuhan epidermal Sunting

Keluarga protein ErbB atau keluarga reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) adalah keluarga dari empat reseptor tirosin kinase yang terkait secara struktural. Pensinyalan ErbB yang tidak mencukupi pada manusia dikaitkan dengan perkembangan penyakit neurodegeneratif, seperti multiple sclerosis dan Penyakit Alzheimer. [12] Pada tikus, hilangnya sinyal oleh anggota keluarga ErbB menyebabkan kematian embrio dengan cacat pada organ termasuk paru-paru, kulit, jantung, dan otak. Pensinyalan ErbB yang berlebihan dikaitkan dengan perkembangan berbagai jenis tumor padat. ErbB-1 dan ErbB-2 ditemukan pada banyak kanker manusia dan sinyal yang berlebihan dapat menjadi faktor penting dalam perkembangan dan keganasan tumor ini. [13]

Keluarga reseptor faktor pertumbuhan fibroblas (FGFR) Sunting

Faktor pertumbuhan fibroblas merupakan famili ligan faktor pertumbuhan terbesar dengan 23 anggota. [14] Penyambungan alternatif alami dari empat gen reseptor faktor pertumbuhan fibroblas (FGFR) menghasilkan produksi lebih dari 48 isoform FGFR yang berbeda. [15] Isoform ini bervariasi dalam sifat pengikatan ligan dan domain kinasenya Namun, semua berbagi wilayah ekstraseluler umum yang terdiri dari tiga domain mirip imunoglobulin (Ig) (D1-D3), dan dengan demikian termasuk dalam superfamili imunoglobulin. [16] Interaksi dengan FGF terjadi melalui domain FGFR D2 dan D3. Setiap reseptor dapat diaktifkan oleh beberapa FGF. Dalam banyak kasus, FGF sendiri juga dapat mengaktifkan lebih dari satu reseptor. Namun, tidak demikian halnya dengan FGF-7, yang hanya dapat mengaktifkan FGFR2b. [15] Sebuah gen untuk protein FGFR kelima, FGFR5, juga telah diidentifikasi. Berbeda dengan FGFR 1-4, ia tidak memiliki domain tirosin kinase sitoplasma, dan satu isoform, FGFR5γ, hanya berisi domain ekstraseluler D1 dan D2. [17]

Keluarga reseptor faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGFR)

Faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) adalah salah satu penginduksi utama proliferasi sel endotel dan permeabilitas pembuluh darah. Dua RTK mengikat VEGF pada permukaan sel, VEGFR-1 (Flt-1) dan VEGFR-2 (KDR/Flk-1). [18]

Reseptor VEGF memiliki bagian ekstraseluler yang terdiri dari tujuh domain mirip Ig sehingga, seperti FGFR, termasuk dalam superfamili imunoglobulin. Mereka juga memiliki satu transmembran spanning region dan bagian intraseluler yang mengandung domain tirosin-kinase split. VEGF-A berikatan dengan VEGFR-1 (Flt-1) dan VEGFR-2 (KDR/Flk-1). VEGFR-2 tampaknya memediasi hampir semua respons seluler yang diketahui terhadap VEGF. Fungsi VEGFR-1 kurang terdefinisi dengan baik, meskipun diperkirakan memodulasi pensinyalan VEGFR-2. Fungsi lain dari VEGFR-1 mungkin bertindak sebagai reseptor dummy/umpan, mengasingkan VEGF dari pengikatan VEGFR-2 (ini tampaknya sangat penting selama vaskulogenesis dalam embrio). Reseptor ketiga telah ditemukan (VEGFR-3) namun, VEGF-A bukanlah ligan untuk reseptor ini. VEGFR-3 memediasi limfangiogenesis sebagai respons terhadap VEGF-C dan VEGF-D.

Keluarga reseptor RET Sunting

Penyambungan alternatif alami dari MEMBASAHI gen menghasilkan produksi 3 isoform protein RET yang berbeda. RET51, RET43, dan RET9 masing-masing mengandung 51, 43, dan 9 asam amino di ujung terminal-C. [19] Peran biologis isoform RET51 dan RET9 adalah yang paling banyak dipelajari in-vivo, karena ini adalah isoform paling umum di mana RET terjadi.

RET adalah reseptor untuk anggota keluarga glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) dari molekul atau ligan sinyal ekstraseluler (GFL). [20]

Untuk mengaktifkan RET, GFL pertama harus membentuk kompleks dengan co-reseptor berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI). Co-reseptor itu sendiri diklasifikasikan sebagai anggota keluarga protein GDNF receptor-α (GFRα). Anggota keluarga GFRα yang berbeda (GFRα1-GFRα4) menunjukkan aktivitas pengikatan spesifik untuk GFL tertentu. [21] Setelah pembentukan kompleks GFL-GFRα, kompleks kemudian menyatukan dua molekul RET, memicu trans-autofosforilasi residu tirosin spesifik dalam domain tirosin kinase dari setiap molekul RET. Fosforilasi tirosin ini kemudian memulai proses transduksi sinyal intraseluler. [22]

Keluarga reseptor Eph Sunting

Reseptor Ephrin dan Eph adalah subfamili RTK terbesar.

Keluarga reseptor domain diskoidin (DDR) Sunting

DDR adalah RTK unik karena mereka mengikat kolagen daripada faktor pertumbuhan yang larut. [23]

Jalur reseptor tirosin kinase (RTK) diatur secara hati-hati oleh berbagai loop umpan balik positif dan negatif. [24] Karena RTK mengoordinasikan berbagai fungsi seluler seperti proliferasi dan diferensiasi sel, mereka harus diatur untuk mencegah kelainan parah pada fungsi seluler seperti kanker dan fibrosis. [25]

Protein tirosin fosfatase Sunting

Protein Tirosin Fosfatase (PTPs) adalah sekelompok enzim yang memiliki domain katalitik dengan aktivitas fosfohidrolase spesifik fosfotirosin. PTP mampu memodifikasi aktivitas reseptor tirosin kinase baik secara positif maupun negatif. [26] PTP dapat mendefosforilasi residu tirosin terfosforilasi yang diaktifkan pada RTKs [27] yang hampir mengarah pada penghentian sinyal. Studi yang melibatkan PTP1B, PTP yang dikenal luas terlibat dalam regulasi siklus sel dan sinyal reseptor sitokin, telah menunjukkan defosforilasi reseptor faktor pertumbuhan epidermal [28] dan reseptor insulin. [29] Beberapa PTP, di sisi lain, adalah reseptor permukaan sel yang memainkan peran positif dalam proliferasi pensinyalan sel. Cd45, glikoprotein permukaan sel, memainkan peran penting dalam defosforilasi yang distimulasi antigen dari fosfotirosin spesifik yang menghambat jalur Src. [30]

Herstatin Sunting

Herstatin adalah autoinhibitor dari keluarga ErbB, [31] yang mengikat RTK dan memblokir dimerisasi reseptor dan fosforilasi tirosin. [27] Sel CHO yang ditransfeksi dengan herstatin menghasilkan penurunan oligomerisasi reseptor, pertumbuhan klonal dan fosforilasi tirosin reseptor sebagai respons terhadap EGF. [32]

Reseptor endositosis Sunting

RTK yang diaktifkan dapat mengalami endositosis yang mengakibatkan penurunan regulasi reseptor dan akhirnya kaskade pensinyalan. [3] Mekanisme molekuler melibatkan menelan RTK oleh endositosis yang dimediasi clathrin, yang menyebabkan degradasi intraseluler. [3]

RTK telah menjadi target yang menarik untuk terapi obat karena implikasinya dalam berbagai kelainan seluler seperti kanker, penyakit degeneratif dan penyakit kardiovaskular. Badan Pengawas Obat dan Makanan Amerika Serikat (FDA) telah menyetujui beberapa obat anti kanker yang disebabkan oleh RTK yang diaktifkan. Obat telah dikembangkan untuk menargetkan domain ekstraseluler atau domain katalitik, sehingga menghambat pengikatan ligan, oligomerisasi reseptor. [33] Herceptin, antibodi monoklonal yang mampu mengikat domain ekstraseluler RTK, telah digunakan untuk mengobati overekspresi HER2 pada kanker payudara. [34]

Inhibitor molekul kecil dan antibodi monoklonal (disetujui oleh US Food and Drug Administration) terhadap RTK untuk terapi kanker [3]
Molekul Kecil Target Penyakit Tahun Persetujuan
Imatinib (Gleevec) PDGFR, KIT, Abl, Arg CML, GIST 2001
Gefitinib (Iressa) EGFR Kanker kerongkongan, Glioma 2003
Erlotinib (Tarceva) EGFR Kanker kerongkongan, Glioma 2004
Sorafenib (Nexavar) Raf, VEGFR, PDGFR, Flt3, KIT Karsinoma sel ginjal 2005
Sunitinib (Sutent) KIT, VEGFR, PDGFR, Flt3 Karsinoma sel ginjal, GIST, Kanker pankreas endokrin 2006
Dasatinib (Sprycel) Abl, Arg, KIT, PDGFR, Src Imatinib-resistant CML 2007
Nilotinib (Tasigna) Abl, Arg, KIT, PDGFR Imatinib-resistant CML 2007
Lapatinib (Tykerb) EGFR, ErbB2 Mammary carcinoma 2007
Trastuzumab (Herceptin) ErbB2 Mammary carcinoma 1998
Cetuximab (Erbitux) EGFR Colorectal cancer, Head and neck cancer 2004
Bevacizumab (Avastin) VEGF Lung cancer, Colorectal cancer 2004
Panitumumab (Vectibix) EGFR Kanker kolorektal 2006

+ Table adapted from "Cell signalling by receptor-tyrosine kinases," by Lemmon and Schlessinger's, 2010. Sel, 141, P. 1117–1134.


Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor

Epidermal growth factor receptor (EGFR) has been detected in the nucleus in many tissues and cell lines. However, the potential functions of nuclear EGFR have largely been overlooked. Here we demonstrate that nuclear EGFR is strongly correlated with highly proliferating activities of tissues. When EGFR was fused to the GAL4 DNA-binding domain, we found that the carboxy terminus of EGFR contained a strong transactivation domain. Moreover, the receptor complex bound and activated AT-rich consensus-sequence-dependent transcription, including the consensus site in cyclin D1 promoter. By using chromatin immunoprecipitation assays, we further demonstrated that nuclear EGFR associated with promoter region of cyclin D1 in vivo. EGFR might therefore function as a transcription factor to activate genes required for highly proliferating activities.


Hasil

ßTCP binding peptides identified by phage display

Three rounds of panning yielded plaques for three of the six conditions: ßTCP blocked with BSA ßTCP blocked with OBB buffer (non-mammalian blocking buffer) and ßTCP-PLGA composite blocked with OBB buffer. Mock conditions (tubes only) and ßTCP-PLGA blocked with albumin (BSA) did not yield plaques at the 2 nd and 3 rd round respectively. The sequence Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr was identified in a total of 28% (8/29) of the clones: 5 from ßTCP blocked with BSA 2 from ßTCP blocked with OBB protein buffer and 1 from composite ßTCP-PLGA blocked with OBB buffer, ( Fig 2A ). The remaining 21 clones showed only modest sequence similarity based on the BLOSUM62 scores ( Fig 2A ).

The 12-amino acid consensus sequence (Mw = 1448 Da) includes one negatively charged residue (Asp), one positively-charged residue (Arg), and has a predicted pI of 6.92. Interestingly, the sequence includes two histidines (nominal pK of 6.1), which may become protonated in the low-pH environment of post-surgical inflammation or abstract protons from the calcium phosphate surface. The peptide is predicted to be relatively soluble based on a grand average of hydropathicity (GRAVY) score in the moderately negative range (-0.800). The extinction coefficient (water) at 280 nm was determined to be 5500 M -1 cm -1 .

Binding affinities of EGF fusion proteins with single and concatameric ßTCP binding peptides

Based on the biophysics of interactions between the EGFR and tethered EGF, it is desirable to present the EGF moiety using a spacer to enhance accessibility of the ligand [31,50,51]. We therefore fused the binding peptide sequences to the N-terminus of human EGF (53 amino acids MW = 6.2KDa) with an intervening 106 amino acid sequence comprising a coiled-coil sequence (46 amino acids, MW = 5.4 KDa) flanked on both ends by a flexible, protease-resistant spacer (25 amino acids MW = 1.9KDa) along with several restriction enzyme sites for cloning (See S1 Table for protein sequence). In previous work, we used paired high-affinity heterospecific coiled-coil sequences with the same protease-resistant spacer in order to dimerize EGF and other EGFR family ligands, and had determined that the fusion proteins and their dimers were active when constructed as either N-terminal or C-terminal fusions [48].

Further, we reasoned that the binding affinity of the peptide to ßTCP might be further enhanced by concatamerization of the binding sequence. We used mutagenesis (see Methods) to concatamerize the 12-mer ßTCP binding peptide, yielding protein fusions with 3, 5, and 10 repeats of the 12 amino acid ßTCP binding unit (LLADTTHHRPWT) flanked by other relevant protein domains as depicted in Fig 1 (see Methods). We first examined the relative binding affinities of the fusion proteins as a function of the number of repeats of the binding domain in the fusion protein using a semi-quantitative approach based on eluting proteins followed by western blot analysis ( Fig 2B and 2C ). We titrated the adsorption concentrations across a range of 0� μM and found that binding exhibited a profound dependence on the number of 12-mer repeats (3, 5 or 10) in the binding domain ( Fig 2B and 2C ). Based on these results, we selected the fusion protein with the 10x linear concatamer, referred to as BP10-T-EGF (See Fig 1 ), to perform all subsequent cell interaction experiments.

BP10-T-EGF in solution exhibits wild-type soluble EGF activity

After selecting BP10-T-EGF as the best binder, we confirmed the purity and activity of each recombinantly-produced 10-mer protein batch prior to use in cell phenotypic assays. Western blots of samples subjected to SDS-PAGE showed that the EGF is co-localized with the 73 kDa band ( Fig 3A ), as expected for intact BP10-T-EGF. Biological activity of BP10-T-EGF compared to control wild type EGF was assessed by analyzing activation of Erk-1 and Erk-2 (Erk1/2), a signaling pathway that shows maximal phosphorylation 7� min after stimulation of EGFR in MSC [20,30,31,50�]. Compared to unstimulated controls, a 2.5 to 3-fold increase in ERK1/2 phosphorylation was observed 10 min after stimulation of MSC by either wild type EGF or BP10-T-EGF ( Fig 3B ). Results were normalized to the loading control GAPDH (N = 3 per condition one-way ANOVA pπ.0001 *pairwise comparisons with control were p𢙀.001 using Tukey’s multiple comparisons test all data was log-transformed before analysis). There was no statistical difference between the pairwise comparisons of wild type EGF and soluble BP10-T-EGF (pϠ.05 Tukey’s test). Thus, the EGF domain in BP10-T-EGF appears to be fully competent to activate the EGFR.

Binding and release of BP10-T-EGF tethered to ßTCP scaffolds

Comparable binding isotherms for BP10-T-EGF were observed for crosses of 3 mm and 5 mm using concentrations of 0.2𠄹 μM soluble protein ( Fig 4A ). The resulting range of tEGF surface densities was estimated as 4,000�,000 EGF/μm 2 (see Methods), well within and above the value of 500𠄵,000 EGF/μm 2 found to provide maximal stimulation to epithelial and mesenchymal cells in previous studies employing EGF tethered to polymer substrates [31,50,51]. However, because these previous studies employed tethering schemes that fostered local clustering of tethered EGF, and the binding peptide approach would not necessarily lead to such localized clustering, a tethering concentration of 2 μM (

10,000 EGF/μm 2 ) was chosen for further studies. After a 7-day long incubation of treated (2 μM) scaffolds in 1xPBS at 37C, a

25% release of tethered BP10-T-EGF protein was observed (N = 4 per condition, Fig 4B ). Another stability experiment performed at lower temperatures (4C) using the same buffer revealed there was no statistically significant release of BP10-T-EGF protein from 3mm ßTCP scaffolds (Normalized protein amounts were 1.02 +- 0.09 (day 0) and 1.02 +- 0.11 (day 5) both were normalized to t = 0 N = 3 per condition).

Tethered EGF stimulates an increase in hBMSC number on scaffolds following 7-day culture

After establishing that the EGF domain of the BP10-T-EGF fusion protein induced bioactivity when it was used in soluble form for MSC stimulation (activation of signaling pathways downstream of activated EGFR), we investigated phenotypic responses of low passage primary hBMSC cultured on ßTCP scaffolds modified with BP10-T-EGF fusion protein for three different densities of adsorbed BP10-T-EGF fusion protein. We have previously shown that EGF tethered to polymer substrates via polyethylene oxide (PEO) tethers can enhance proliferation of hBMSC maintained in both expansion and osteogenic media [34] We used day 7 as a metric for comparison in order to allow for several MSC population doublings [54].

Scaffolds (ßTCP crosses, see Methods) were pre-incubated with BP10-T-EGF solutions at concentrations of 0.4 μM, 2 μM, and 9 μM in order to achieve a range of surface densities (estimated as 4,000�,000 BP10-T-EGF per μm 2 ) and to determine dose response. Human BMSCs were seeded onto the treated and control scaffolds and cultured for 7 days in expansion medium. After 7 days, the relative cell numbers were quantified using the Alamar Blue reagent, using cells seeded on standard plates at different densities as a calibration to ensure the assay was in the linear range. All scaffolds treated with BP10-T-EGF had a 2𠄲.3 fold greater number of hBMSC number compared to surfaces without BP10-T-EGF ( Fig 5A N = 3 per condition one-way ANOVA p-valueπ.05 (p-value = 0.02) all pairwise p-values of BP10-T-EGF vs control were π.05 using Tukey’s multiple comparison test). No statistical differences were observed between the different BP10-T-EGF surface densities (All pairwise p-valuesϠ.05 using Tukey’s test). These results indicate that EGF-tethered onto ßTCP scaffolds does not impair expansion of hBMSCs, as the final cell number was greater than the initial number (data not shown), but these data are not sufficient to conclude that tethered EGF enhances proliferation, as differences in initial plating efficiencies together with comparable expansion rates may account for the observed differences at day 7. To parse these mechanisms, we next examined plating efficiencies.

Tethered EGF does not alter plating efficiency of hBMSCs seeded on ßTCP scaffolds

The Alamar Blue assay and other similar kinds of proliferation assays do not have sufficient sensitivity to detect the relatively small number of cells present on scaffolds immediately after seeding. Hence, we developed an approach to directly count cells seeded on scaffolds by embedding scaffolds in agarose, demineralizing to reveal an optically-clear mold, then staining cells and observing them with confocal microscopy. Using this method, we found no statistical differences between the direct count of P3 hBMSCs in the control or BP10-T-EGF conditions for both the 12hr and 24hr time point ( Fig 5B ). This suggests that the increase in hBMSC number observed after a 7-day culture under BP10-T-EGF conditions was most likely due to induction of proliferation and not due to differential plating efficiency.


Where do the phosphate units come from when EGF units dimerize? - Biologi

C2006/F2402 '10 Outline for Lecture 24 -- (c) 2010 D. Mowshowitz -- Lecture updated 04/26/10

Handouts From last time: 23C -- Stress Response & TK receptors

New this time: 24A -- Basic Processes in Kidney Tubule
24B -- Kidney Structure

Recent NPR story on oxytocin: When the 'Trust Hormone' is out of balance. http://www.npr.org/templates/story/story.php?storyId=126141922

A. Lactation -- done last time see handout 23A.

B. Stress response (Handout 23C.)

1. Phase one -- Nerve (Sympathetic) activity stimulates target organs (that are not glands) → Direct response of heart, liver, lungs, etc.

2. Phase two -- Nerve (Sympathetic activity) → activation of glands

A. Stimulate pancreas → glucagon release stimulated insulin release inhibited → secretion of glucagon → additional stimulation of some of same target organs

B. Stimulate adrenal medulla → release of epinephrine → stimulation of same targets as sympathetic nerve activity & some additional targets -- hormones can reach where nerves can't go.

3. Phase three -- stimulate HT/AP axis to produce cortisol

HT in brain → releases CRH → AP → releases ACTH → adrenal cortex → produces cortisol → target organs → stimulation of breakdown of fats & protein for energy (sparing glucose for brain) inhibition of immune system.

Note that each additional phase is slower but involves additional degrees of amplification due to second messengers, transcription, etc.

II. Signaling with RTK's. How do RTK's Work?

A. Importance of Catalytic Receptors

  • Many growth factors (such as EGF) and other paracrines, autocrines and juxtacrines act through TK receptors.
  • Insulin, PL, and GH, but not most other endocrines, act through TK receptors. (See Sadava 15.6)

B. Important Properties of Receptor TKs -- See handout 23C & chart below.

1. Receptor is usually a single pass protein

2. Ligand binding usually leads to dimerization of receptors (Sadava fig. 15.6 or Becker 14-17). Why does it matter that TK receptor monomers (or any protein) must dimerize in order to act?

A. Function: If 1/2 the receptors (1/2 the monomers) are abnormal, most of the dimers that form are abnormal.

B. Inheritance: "lack of function" mutations in TK receptors are often dominant. (For an example see Becker figs. 14-20 & 14-21 (14-19 & 14-20). Dimers form, but they are inactive. See below for more details.

  • Example? PLC. Ligand binding to TK-linked receptor can activate a type of PLC → IP3 & DAG → etc.
  • This means that the IP3 pathway can be activated by both types of receptors -- GPCRs and TKs.
  • The cAMP pathway (as far as we know) can only be activated by GPCRs.

C. SH2 domains. Proteins that bind directly to TK have certain types of domains -- usually called SH2 binding domains.

D. Recruitment. Note that the initial target protein(s) to be activated come to or are "recruited by" the TK this is the opposite of the situation with most 2nd messengers where the messenger diffuses throughout the cytoplasm and "seeks out" the target protein to be activated. The recruitment method may be important in localizing the response to a particular part of the cell.

C. A human example of TK receptor signaling: FGF (Fibroblast growth factor) and FGF Receptor. Significance of dimerization. See Becker figs.14-20 & 14-21 (14-19 & 14-20).

1. FGFR is a TK receptor

2. FGF & FGFR needed for proper development as described in Becker chap.14. Failure of signal transmission (or premature transmission) causes developmental abnormalities. Lihat gambar Becker. 14-20 (10-20).

3. Achondroplasia (a type of dwarfism), is due to a defective FGF receptor.

4. Achondroplasia is dominant. In a heterozygote for achondroplasia, 1/2 the FGF receptor (monomers) are defective, therefore dimers that form are defective.

A. Example #1: In the example shown in Becker & on handout, the cytoplasmic domain of the defective receptors is missing. Dimers form, but most dimers are never activated -- the two monomers can not phosphorylate each other. (Fig. 14-19) Therefore the signaling is badly disrupted. (In the example shown in Fig. 14-20, the FGF is needed to menyalakanformation of certain embryonic tissues, so the mutant fails to form these tissues. This type of mutation is called a 'dominant negative' as explained below.)

B. (FYI) Example #2: In most cases of human achondroplasia, the molecular explanation is different. In these cases, the mutation is in the transmembrane domain of FGF3 Receptor and dimers form, but act abnormally. (In these cases, the FGF signal is needed to turn on bone differentiation and matikan cell growth. Mutant dimers signal prematurely, so differentiation starts -- and cell growth stops -- before bones are long enough. This type of mutation is called a 'gain of function' mutation, because it works when it shouldn't.)

5 . Significance of a 'Dominant Negative'

A. Recessive (ordinary) negative mutations. 'Negative' mutations (those that produce inactive protein) are usually NOT dominant. Most negative or "lack of function" alleles (or mutations) are recessive. If there is a mixture of normal and abnormal protein in the heterozygote, the normal, active, protein usually works (in spite of the presence of abnormal, inactive, protein). So usually, overall, there is NO lack of function in the heterozygote.

B. 'Dominant negative' mutations. Sometimes negative mutations are dominant. How does this occur? There is a mixture of normal and abnormal protein present, as usual. What's unusual is that the abnormal, inactive, protein 'gets in the way' and interferes with the working of the normal, active, protein. So overall, there is a lack of function in the heterozygote.

C. Definition: An abnormal allele like the one that produces the FGF receptor without a cytoplasmic domain is called a "dominant negative mutation." A dominant negative allele (or mutation) makes an inactive protein that disrupts function even in the presence of a normal allele (and normal protein). 'Dominant negative' means that the heterozygote is negative for function, not that it doesn't produce any protein.

D. Implications: What does the existence of a dominant negative mutation imply? It indicates that the gene involved probably codes for a protein that must polymerize in order to act.

D. How do GPLR's and RTK's Compare? -- See table below for reference for comparison of basic features of TK or TK linked receptors and G protein linked receptors. For TK's, see Sadava figs. 15.6 & 15. 10 (15.9) or Becker fig. 14-17 for structure and Becker 14-18 for signaling pathway.

# See Becker Fig. 14-4.
## See Becker fig. 14-17 or Sadava 15.6 & 15.3.
*Either part, alpha or beta + gamma may be activator/inhibitor G proteins can also be inhibitory
**SH2 = sarc homology 2 domain

Review problems 6-1 & 6-3

E. Signaling Pathways all interrelate

1. Different 2nd messengers can influence the same enzyme/pathway. See problem 6-20.

2. Each signaling system can affect the others -- For example, Ca ++ levels can affect kinases/phosphatases and phosphorylations can affect Ca ++ transport proteins (& therefore Ca ++ levels). See an advanced text if you are interested in the details.

3. The same signal (same activated TK receptor) may trigger more than one signaling pathway . For example, EGF can trigger both the IP3 pathway and the ras pathway. (Becker fig. 14-18).


IV. Intro to Kidney Function (Handout 24A). See also Sadava Sect. 51.4. & 51.5.

Here's an article from the LA Times on a recent artificial kidney.

A. Overall Function -- what does the kidney do?

  • Penyaringan

  • tubular secretion (addition of substances to the filtrate) = secretion ke dalam the tubule

  • tubular reabsorption (removal of substances from filtrate) = reabsorption dari the tubule

  • control of volume of urine

B. Details of Basic Processes

1 . Basic set up

A. Capillaries: Artery (from heart) → afferent arteriole → glomerular capillaries → efferent arteriole → peritubular capillaries → venule → vein (back to heart)

B. Filtration: Material moves from glomerular capillaries into tubule.

C. Secretion & Reabsorption: Materials moves between inside of tubule and inside of peritubular capillaries (surrounding kidney tubule).

2. The 4 Basic Processes

A. Penyaringan:

(1). Occurs in glomerulus

(2). About 20% of blood liquid (plasma) enters Bowman's capsule = filtrate

(3). Filtrate contains no large proteins or cells

B. Tubular (selective) secretion: Material is ditambahkan ke the filtrate.

  • Secretion = extruded by the cells into extracellular space (into filtrate, lumen, etc.).

  • Excretion = carried out of body in urine or feces.

C. Tubular (selective) reabsorption: Material is removed fromthe filtrate.

(1). Result of reabsorption: Filtrate does NOT carry certain materials (which are selectively reabsorbed) -- conserves valuable materials returns them to circulation.

(2). Aldosterone affects Na + reabsorption (& K + secretion). Details below.

(1). Water loss is adjusted at the end of the tubule using ADH. (See below.)

(2). Urine can be more -- or less -- concentrated than the plasma. Concentration and/or volume can be varied to suit need.

(3). Water loss or conservation in tubule controls volume of body fluids (not just urine volume). Controls volume of plasma, extra cellular fluid, etc. (& blood pressure).

3. How does tubular secretion/reabsorption occur? Structure of cells lining tubules -- see handout 24A bottom or Sadava fig. 51.12 (for a different example).

A. Tubules are lined by layer of polarized epithelial cells (similar to those lining intestine)

B. Materials must cross epithelial cells to enter or exit lumen of tubules.

C. Interstitial fluid separates epithelial cells and peritubular capillaries.

D. Epithelial cells have different proteins/channels/transporters on their two surfaces -- the apical or luminal surface (facing lumen) and basolateral surface (facing interstitial fluid and capillaries).

e. Cells in different parts of the tubule have different transporters/channels on their luminal permukaan.

F. All cells in tubule that absorb Na + have the Na + /K + pump on their basolateral surface. Other transporters may vary.

G. What cells transport (& in which direction) depends primarily on which transport proteins are on the luminal surface. Depending on transporters, cells can secrete materials ke dalam lumen or reabsorb material dari lumen.

h. Cells lining tubule do actual secretion/reabsorption but peritubular capillaries remove reabsorbed material or provide material to be secreted. Therefore (as shown on handout 24A, top left):

(1). Result of tubular reabsorption = net transfer from filtrate to capillary.

(2). Result of tubular secretion = net transfer from capillary to filtrate.

Try problem 12-3.

3. Example of reabsorption -- see 24A upper right. (Fig. 14-18). How Na + is reabsorbed.

Q: How could K + be secreted? What would you have to add/remove from the diagram?

  • aldosterone affects Na + reabsorption (& K + secretion)

  • ADH affects water reabsorption

B. Role of aldosterone in Na + reabsorption

(1). Promotes reabsorption of Na +

(2). Stimulates virtually all steps of reabsorption -- all steps shown in 24A, upper right.

C. Role/Mech. of action of ADH

  • Are they in the luminal membrane, BL membrane, or both?

  • Are they inserted or removed in response to hormone?

  • Why are cells in only some areas of tubule responsive to ADH (or aldosterone)?

D. Questions to think about: Where are the receptors for ADH? Aldosterone? Which hormone elicits a faster response?

See problems 12-8 to 12-10.(See below for location of cells affected by each hormone.)

A. Overall structure -- see handout 24B or Sadava fig. 51.9. Alternatively, see Kimball's biology pages.

1. Kidney has medulla (inner part) and cortex (outer)

2. Functional unit = nephron (Sadava 51.7 )

3. Visible unit (in medulla) = Renal Pyramid = bottoms of many nephrons

4. Tops of nephrons in cortex

B. Structure of Nephron -- see handout 24B or Sadava fig. 51.7 & 51.9 . For EM pictures see Sadava 51.8. (We may do the parts as we need them, but all are summarized here.)

1. Nephron itself -- parts in cortex

A. Bowman's capsule
B. proximal (convoluted) tubule
C. distal (convoluted) tubule

A. Loop of Henle
B. Collecting duct (shared by many nephrons)

3. Capillaries (discussed last time)

A. 2 sets in series

(1). Glomerulus
(A). form glomerulus inside Bowman's capsule
(B). function in penyaringan

(2). Peritubular
(A). surround tubules
(B). fyi: part in medulla (surrounding loop of Henle) is called the vasa recta
(C). function in sekresi & reabsorpsi

B. How capillaries connected. Circulation goes as follows:

Artery (from heart) → afferent arteriole → glomerular capillaries → efferent arteriole → peritubular capillaries → venule → vein (back to heart)


V I. Kidney Function, revisited.

A. Function of Nephron -- Let's follow some liquid through.

2. Reabsorption & secretion (of most substances) occurs in proximal tubule

3. Loop of Henley -- overall picture of state of filtrate

A. Definition: Osmolarity (Osm) = total solute concentration = concentration of dissolved particles = osmol/liter. (One osmol = 1 mole of solute particles.)

Examples: 1M solution of glucose = 1 Osm 1M solution of NaCl = 2 Osm.

(1). Descending: Osmolarity increases as filtrate descends due to loss of water

(2). Ascending: Osmolarity decreases as filtrate ascends due to loss of salt reaches min. value less than that of blood. Therefore can excrete urine that is hypo-osmotic (less concentrated) than blood.

(3). Overall: Net effect of going through countercurrent loop -- less volume, less total salt to excrete (even if filtrate and blood are iso-osmotic when done).

4. Distal Tubule & Collecting Ducts

A. Control of removal from filtrate (reabsorption) of remaining Na + (Role of aldosterone.)

B. Volume Control -- occurs in collecting ducts. (Role of ADH.)

B. Details for Proximal Tubule

1. Many substances removed from lumen by secondary act. mengangkut

A. examples: glucose and amino acids

B. AA etc. cross apical/luminal surface of epithelial cell by Na + co-transport -- therefore a lot of Na + removed from filtrate (along with glucose, AA, etc.)

C. Exit basolateral side of cells into intersit. fluid by facilitated diffusion

C. Process is similar to absorption in cells lining intestine

2. Na+/K+ pump on basolateral side keeps internal Na+ low.

4. Secretion of most materials (except K + ) occurs here -- toxins etc. transported to filtrate

C. Details of Transport Events in Loop of Henley (See Sadava 51.10)

1. Water permeability. Luminal cell membranes in descending loop and lower part of ascending loop are permeable to water.

2. Generating the Na + gradient in the medulla.

A. Luminal cell membranes in rest of ascending are impermeable to water and pump NaCl from lumen to interstitial fluid.

B. NaCl pumped out from naik loop accumulates in medulla, forming a gradient of increasing osmolarity (outside the tubule) as reach bottom of loop = core of medulla.

3. Water loss: Filtrate from proximal tubule loses water as it descends into medulla → NaCl stays in tubule → high concentration NaCl in tubule → to be removed in ascending. (Na + not pumped out of these cells on BL side.)

4. Escalator Effect: If NaCl diffuses into descending loop, it is carried around and pumped out in ascending = escalator effect.

5. Why called countercurrent? Because flow in two sides of loop is in opposite directions -- physically and with respect to osmolarity.

A. First leg (descending) of loop removes water → higher osmolarity in filtrate as it proceeds (on the way down).

B. Second leg (ascending) removes salt → lower osmolarity in filtrate as it proceeds (on the way up).

C. Net effect is higher osmolarity toward the bottom on both legs.

D. Why doesn't flow in peritubular capillaries (vasa recta) wash out the salt gradient in the medulla? Because capillaries exit out the top of the nephron, carrying a low amount of salt.

See problems 12-1 to 12-3.

D . Distal Tubule and Collecting Ducts -- A few more Details

1. Overall

A. Reminder: Filtrate entering distal tubule is at minimum osmolarity

B. This is the only part of the tubule affected by ADH and aldosterone

(1). Events in distal convoluted tubule (& first part of coll. ducts) depend on aldosterone

(2). Events in collecting duct (volume control) depend on ADH

C. Hormones cause water and/or remaining Na + to be removed (reabsorbed from filtrate)

(1). aldosterone affects Na + reabsorption (& K + secretion) -- See handout 24B, top right.

(2). ADH affects water reabsorption

2. Importance of aldosterone (in water/Na+ balance)

A. Promotes reabsorption of Na + water follows (not necessarily in same part of tubule).

B. Amount of Na + reabsorbed due to aldosterone is small % of total, but adds up affects blood pressure.

C. Aldosterone promotes K + secretion -- this may be of major importance, but we are focusing on role of hormone in Na + balance.

3. Importance of ADH. Controls water retention in body. Osmolarity of filtrate will increase (and volume decrease) in collecting duct if ADH (vasopressin) present and water removed. (See above for mechanism.)

4. Where do the hormones come from? What triggers their production/release?

A. ADH produced by HT (& released in PP) primarily in response to high osmolarity of blood.

B. Aldosterone produced by adrenal cortex in response to inadequate blood flow through kidney, not primarily in response to ACTH.

See problems 12-8 to 12-13 & 12-15.

Next Time: Last Lecture! How Kidney Function & Blood Pressure are Regulated Cancer & Control of Cell Growth


Regulation of Cell Proliferation by Receptor Tyrosine Protein Kinases

Cross-linking of receptors causes activation

Tyrosine kinase -containing receptors come in several different forms but they are unified by the presence of a single membrane-spanning domain and an intracellular kinase catalytic domain. The extracellular chains vary considerably as indicated in Figure 10-3 . A general feature of these receptors is that ligand binding causes dimerization, first discovered for the EGF receptor ( Yarden and Schlessinger, 1987 Sternberg and Gullick, 1990 ). In addition to activation by the natural peptide ligands, some (but not all) of the functions of the EGF receptor can be elicited by crosslinking with antibodies ( Defize et al., 1986 Spaargaren et al., 1991 ). Within the family of the receptor tyrosine kinases, ligand-mediated crosslinking is achieved in a number of ways. Platelet-derived growth factor (PDGF) is itself a disulfide-linked dimeric ligand which cross-links two receptors upon binding. FGF uses a heparin oligosaccharide to bring two receptors together. In the case of the insulin receptors, they are already dimerized through a disulfide bridge but nevertheless require insulin in order to signal into the cell ( Ottensmeyer et al., 2000 Yip and Ottensmeyer, 2003 ). EGF is different, its binding causes the receptor to unfold, exposing a dimerization motif that allows the occupied monomers to recognize each other (or to recognize unliganded unfolded ERBB2) ( Yamanaka et al., 2002 Gerrett et al., 2002 ) ( Figure 10-5 ). Since truncated EGF receptors that lack the extracellular ligand-binding domain are constitutively active ( Thiel and Carpenter, 2007 ), it follows that the unoccupied extracellular domain acts to prevent kinase activation. Indeed, dimerization of the receptor brings about a change in the relative position of the transmembrane domains that, in turn, promotes dimerization and activation of the intracellular protein kinase segment ( Endres et al., 2013 ).

Figure 10-5 . Dimerization of the EGF-receptor extracellular segment. (a) The EGF receptor is composed of four extracellular domains, L1, CR, L2, and GH. L1 and L2 carry leucine-rich repeats that function in ligand binding, CR1 is a furin-like cysteine-rich domain and GH is a growth factor receptor domain IV. The intracellular segment contains a tyrosine kinase domain and a long unstructured C-terminal sequence that harbors numerous phosphorylation sites. The C-terminal tail is the substrate of a neighboring receptor (phosphorylation in trans). Note that in the receptor structure on the left, the extracellular segment folds onto itself the dimerization arm of the CR domain (indicated by a green surface) docks onto the GF domain. The receptor shown is bound to EGF but only to the L1 domain. (b) Binding of EGF to both L1 and L2 causes unfolding and dimerization of the extracellular segment. The dimerization arm of CR now binds to a docking site in the CR domain of the partner (and vice versa). As a consequence, the two transmembrane domains associate with their N-terminal sequences and this, in turn, brings about a change in the position of the kinase domains leading to their activation (not shown, see Figure 10-6 ).

Normally, the kinase domain of the EGFR is inactive because both the activation segment and the αC- helix are wrongly positioned. Moreover, the kinase is tethered to the plasma membrane through both its N-terminal juxtamembrane sequence, which three leucines (motif LLRRL), and through interactions of surface lysines and arginines (positively charged) with negatively charged phospholipids ( Figure 10-6 ) ( Arkhipov et al., 2013 ). Membrane-tethered kinases cannot form dimers. Receptor crosslinking disrupts the membrane binding and allows the two kinases to align asymmetrically, with the C-lobe (activator kinase) binding to the N-lobe (receiver). This causes an outward movement of the activation segment and inward movement of the αC-helix of the receiver kinase ( Figure 10-6 ). The other, activator kinase, remains catalytically incompetent. The EGFR is rendered competent through an allosteric interaction between kinase domains (in other words, an activating “shape change” is caused by protein–protein interaction) ( Jura et al., 2009 Brewer et al., 2009 ). The interaction between the two EGFR-kinase domains is reinforced by the antiparallel association of the helices carrying the –LRRLL motif and by the juxtamembrane region of the receiver kinase which latches onto the activator (juxtamembrane latch). The mode of activation is unique among the tyrosine protein kinases, which otherwise often involves phosphorylation of the activation segment (further discussed in Chapter 15, “Activating the Adaptive Immune System: Role off Non-receptor Tyrosine Kinases” and Chapter 16, “Signaling through the Insulin Receptor” ). However, the mechanism is similar to the one observed with cyclin-dependent protein kinases (CDKs), which are serine/threonine protein kinases. Here allosteric regulation is brought about by a regulatory subunit, named cyclin, that binds the kinase domain.

Figure 10-6 . Allosteric regulation of the EGFR kinase domains through the formation of an asymmetric kinase dimer. In the inactive state (monomer) the kinase domain is tethered to the membrane through an interaction of the LRRLL motif in the juxtamembrane sequence and through binding of lysine residues of the kinase domain to negatively charged lipids. Ligand-mediated dimerization of the extracellular segment leads to dimerization of the transmembrane helix and this disrupts membrane attachment of the kinase domain. Two protein kinase domains now associate head-to-tail (asymmetric dimer) bringing about a conformational change of one kinase only, named the “receiver kinase.” As a consequence, the multiple residues on the adjacent C-terminal tail are phosphorylated. As the kinase domain may change roles, where the activator becomes the receiver kinase, with time both tails will be fully phosphorylated. The phosphate symbol indicates a phosphorylation site (threonine-678) in the juxtamembrane region which inactivates the receptor (part of a negative feedback mechanism).The residues of the human EGFR are numbered according to the sequence information in UniProtKB (with inclusion of the signal peptides, 1–24).

It is likely that the receiver and activator positions can be interchanged, so that the kinases alternate their activity. Indeed EM studies of EGF-treated receptors have revealed that the dimeric extracellular segment is associated with intracellular segments of different conformations, ranging from asymmetric dimers (active), symmetric dimers (inactive) to nonassociated kinase domains ( Mi et al., 2011 ). Importantly, as a consequence of asymmetric dimerization, the C-terminal tails of the two kinases are trans-phosphorylated (one kinase phosphorylates the tail of the other) on multiple tyrosine residues. The phosphorylated dimer then constitutes the active receptor. For more information about protein kinase activation, return to Chapter 2, “An Introduction to Signal Transduction,” Section “Protein kinase activation mechanisms” ( Figures 2-43 and 2-44 Figure 2-43 Figure 2-44 ).

While certain proteins serve as substrates of the activated EGF receptors, what really matters is the recruitment of signaling partners through the phosphotyrosine residues in the C terminal tail. These phosphotyrosines, within a specific context of five amino acids, bind proteins bearing SH2 or PTB domains ( Liu et al., 2010 ). The recruited proteins can be effectors or adaptors, which serve to bind effectors indirectly ( Anderson et al., 1990 Jones et al., 2006 ) (see Figure 10-4 for a list of such effectors and adaptors, and see Figure 10-8 for more detail about the interaction).

Growth factor receptor dimers can further aggregate into oligomers of several hundreds or even thousands of units. This phenomenon, already recorded at the time when receptor dimerization first came to light ( Yarden and Schlessinger, 1987 ), has now been visualized by the use of fluorescent protein tagging ( Carter and Sorkin, 2006 ). Different types of receptors can be recruited, so that PDGF receptors have been found associated with EGF receptors ( Saito et al., 2001 ) and these aggregates give rise to multiprotein signaling platforms that may contain numerous effectors.


Lectins are carbohydrate-binding proteins. Individual lectins show specificity for particular sugar structures.

This is a homology unit of ∼ 110 amino acids. Although there is variation in primary sequence, the structure of this domain is conserved and organized into two β-sheets, one of three and the other of four strands, which are stabilized by disulphide bonds in most of the cases. Ig domains are found in several proteins, including cell-adhesion molecules and signalling receptors, and have been implicated in protein–protein interactions.

Fibronectin type III (FNIII) domain

FNIII motifs, originally described in the extracellular matrix protein fibronectin, comprise ∼ 90 amino acids. Their three-dimensional structure is similar to that of the immunoglobulin domain. In fibronectin itself, a RGD sequence in the loop that connects the β-sheets in FNIII motif 10 has been implicated in promoting adhesion by binding to integrins. This motif is also found in a wide variety of signalling proteins.

The pKα (also known as pKa) is a measure of the uptake/release of protons by amino acids. It is the negative log to the base 10 of the acid-dissociation constant, which reflects the equilibrium between protonation and deprotonation and indicates the extent of proton dissociation. The log scale is used because this constant differs over orders of magnitude between individual acids the smaller the pKα value, the stronger the acid.


Tonton videonya: Top 5 Misconceptions About Vitamin C You Must Know - Doctor Reviews The TRUTH (November 2022).