Informasi

Mengapa oxLDL terakumulasi membentuk sel busa?

Mengapa oxLDL terakumulasi membentuk sel busa?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pada aterosklerosis, mengapa makrofag menyimpan semua kolesterol dari oxLDL di dalam, dan berubah menjadi sel busa, dan tidak hanya menurunkannya dan kembali ke darah? (ada beberapa yang meninggalkan plak, tetapi lebih banyak yang tertinggal (J Clin Invest. 2011 Mei;121(5):2025-36. doi: 10.1172/JCI43802. Epub 2011 18 April.))

Banyak membaca tentang aterosklerosis, tetapi tidak ada penjelasan tentang mengapa makrofag tinggal di sana dan membentuk plak, malah meninggalkan atau setidaknya menghancurkan kolesterol.


Singkatnya, tingkat ekspresi protein penghilang kolesterol intraseluler seperti ABCA1 dalam makrofag dan molekul air terjun sitokin dalam limfosit T di samping sitokin anti-inflamasi lainnya memiliki peran penting dalam AS dan mengapa oxLDL terakumulasi dalam intima.

Ketika kadar oxLDL tinggi, kecepatan mekanisme pembuangan harus meningkat untuk mengeluarkan kolesterol ekstra dari makrofag dan setelah itu ke hati. Dan itu (meningkatkan laju mekanisme balik) dapat dilakukan dengan inhibitor atau regulator (bila cara alami tidak dapat cukup berusaha ekskresi). => obat-obatan seperti TONSHINONE

Ada sejumlah besar informasi tentang bagaimana regulasi molekul adhesi, molekul kostimulatori, molekul penyaji antigen dan molekul anti-inflamasi atau inflamasi dapat berpengaruh pada akumulasi oxLDL dalam makrofag dan limfosit-T yang menyebabkan kerusakan yang disebabkan oleh hidrogen proksida.

Jadi akumulasi molekul oxLDL dalam Makrofag memiliki alasan genetik dan mengapa manusia berevolusi dengan cara ini adalah pertanyaan bagi ahli genetika tetapi bagaimana hal ini terjadi dapat dijelaskan dengan menelusuri molekul adhesi dan sinyal.

Ini adalah salah satu teks tentang akumulasi oxLDL dan AS.

Makrofag mengambil, sejumlah besar lipoprotein densitas rendah (oxLDL) teroksidasi di bawah intima dan kemudian menjadi sel busa, yang merupakan salah satu tanda awal lesi aterosklerotik.

Pengangkut kaset pengikat ATP A1 (ABCA1) adalah protein membran integral yang mengangkut lipid dari sel ke hati dengan ekskresi lipid berikutnya oleh empedu pada akhirnya. Transportasi terbalik ini menghambat pembentukan lipid.

Teks ini menunjukkan bagaimana mengatur air terjun sitokin dan sitokin pro-inflamasi dapat berdampak pada penciptaan atau penghapusan sel busa.

Mereka bereksperimen bahwa Tanshinone IIA (molekul yang diekstraksi dari akar Salvia miltiorrhiza) secara signifikan meningkatkan ekspresi ABCA1 dalam sel busa turunan makrofag, meningkatkan aliran kolesterol intraseluler, dan menghambat pembentukan sel busa yang diinduksi oxLDL.

Selanjutnya, reseptor X hati (LXR) dan reseptor teraktivasi proliferator peroksisom (PPAR) yang merupakan anggota superfamili reseptor nuklir dapat meningkatkan ekspresi ABCA1 melalui jalur kopling. Tan IIA menghambat pembentukan sel busa. Mekanismenya mungkin bahwa Tan IIA meningkatkan ekspresi PPARa, LXRa, dan ABCA1, memfasilitasi transpor kolesterol pembalikan, dan akhirnya mendorong penghabisan kolesterol.

Limfosit T pada plak sebagian besar merupakan limfosit T CD4+ yang termasuk dalam subtipe Th1. Sebagian besar limfosit T CD4+ aktif dan dapat menginduksi “cytokine waterfall” serta mensekresikan sitokin proinflamasi interferon-gamma (IFN-y), IL-12, dan sitokin lainnya, yang pada akhirnya menyebabkan inflamasi. Eksperimen menunjukkan bahwa Tanshinone secara signifikan menghambat produksi IL-12 dan IFN-y yang diturunkan dari Th1 dengan cara yang bergantung pada dosis. Limfosit T berperan dalam pembentukan AS, terutama karena sitokin proinflamasi yang disekresikan oleh T helper tipe (Th) 1 atau Th2. Oleh karena itu, Tanshinone dapat menghambat pembentukan AS dan menstabilkan plak melalui pengurangan sekresi Th1 atau Th2. Selain itu, T-limfosit diaktifkan untuk mengekspresikan CD40L, dan ekspresi faktor jaringan dan matriks metaloproteinase (MMPs) kemudian dipromosikan oleh interaksi antara CD40L dan CD40. TanIIA dapat meningkatkan aktivitas superoksida dismutase (SOD), menurunkan kadar malondialdehid (MDA), dan menurunkan ekspresi CD40 dan aktivitas MMP-2.

Jadi biasanya makrofag dapat mengeluarkan kolesterol tetapi masalah terjadi ketika diet Anda mengandung kadar kolesterol tinggi dan oxLDL menjadi tinggi dalam darah Anda.

Pengobatan Komplementer dan Alternatif Berbasis Bukti Volume 2014 (2014), ID Artikel 267976, 6 halaman http://dx.doi.org/10.1155/2014/267976


Akumulasi kolesterol bebas dan lipoprotein densitas rendah teroksidasi dikaitkan dengan peradangan portal dan fibrosis pada penyakit hati berlemak nonalkohol

Makrofag menelan LDL teroksidasi (oxLDL) yang menyebabkan akumulasi kolesterol seluler dan pembentukan sel busa, yang merupakan ciri khas aterosklerosis. Selain itu, penelitian terbaru menunjukkan bahwa akumulasi kolesterol bebas dalam makrofag yang mengarah ke aktivasi inflammasome NLRP3 dan produksi interleukin-1β (IL-1β) telah dikaitkan dengan peradangan terkait aterosklerosis. Namun, tidak jelas apakah akumulasi kolesterol dikaitkan dengan peradangan hati dan fibrosis di hati. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki hubungan kolesterol bebas dan akumulasi oxLDL di vena portal dengan peradangan, aterosklerosis, dan fibrosis pada penyakit hati berlemak nonalkohol manusia (NAFLD).

Metode

Bagian serial yang berasal dari spesimen bedah NAFLD diwarnai dengan filipin dan antibodi terhadap IL-1β, CD68, -smooth muscle actin (α-SMA), oxLDL dan lectin-like oxLDL receptor-1 (LOX-1).

Hasil

Kami menunjukkan bahwa kolesterol bebas terlokalisasi dengan oxLDL di dinding vena portal, dan berhubungan dengan penyempitan lumen, pembentukan plak, deformasi endotel, dan inflamasi vena portal. Peradangan dibuktikan dengan kolokalisasi sel Kupffer dan IL-1β dan ekspresi LOX-1. Khususnya, plak yang pecah berhubungan erat dengan peradangan vena portal. Selain itu, akumulasi kolesterol bebas dan oxLDL pada fibrosis periportal dan sinusoidal, yang dikaitkan dengan aktivasi sel stellata regional dan fibrosis kawat ayam.

Kesimpulan

Temuan ini mengungkapkan hubungan langsung antara akumulasi kolesterol, peradangan vena portal dan fibrosis di NAFLD.


Pengantar

75% dari semua kematian terkait kardiovaskular di Amerika Serikat terkait dengan aterosklerosis [1], gangguan progresif arteri ukuran sedang hingga besar yang ditandai dengan pembentukan dan kalsifikasi plak ateromatosa di dinding pembuluh arteri. Aterosklerosis dikenal sebagai kondisi inflamasi kronis yang dimulai dengan disfungsi atau aktivasi endotel arteri. Peningkatan ekspresi molekul adhesi pada permukaan sel endotel yang diaktifkan menyebabkan sejumlah besar monosit melekat pada endotel. Sel-sel yang melekat ini akhirnya bertransmigrasi melalui endotelium dan menumpuk di lapisan intima dinding arteri, di mana mereka berdiferensiasi menjadi makrofag dan, dengan adanya faktor-faktor tertentu, menjadi sel busa [2]. Sel busa adalah komponen utama dari lapisan lemak [3].

Beberapa bukti menunjukkan bahwa low-density lipoprotein (LDL) dan terutama bentuk teroksidasinya (oxLDL) memainkan peran kunci dalam disfungsi endotel dan aterogenesis [4, 5]. LDL dapat dioksidasi oleh sel endotel pembuluh darah, sel otot polos atau makrofag. OxLDL mengikat reseptornya yang mirip lektin LOX-1 di sel endotel [7, 8] dan memicu jalur pensinyalan CD40/CD40L [9], yang pada gilirannya mengarah pada sintesis kemokin [10, 11] dan molekul adhesi sel [ 12, 13] terlibat dalam adhesi monosit ke endotelium. Monosit dan makrofag mengambil oxLDL melalui reseptor pemulung [14] melepaskan faktor nekrosis tumor-α (TNF-α) [15]. Penyerapan oxLDL oleh makrofag mengubah sel-sel ini menjadi sel busa [2].

Sel mast, yang memainkan peran penting dalam alergi dengan melepaskan histamin selama degranulasinya [16], telah ditemukan dalam jumlah yang meningkat di dekat lesi aterosklerotik [17]. Pada tahap awal aterosklerosis, mereka lebih disukai terletak di lapisan adventisia dinding arteri, tetapi mereka bermigrasi lebih dekat ke makrofag intima pada tahap selanjutnya, di mana mereka membantu mengubah makrofag menjadi sel busa [18] dan, bersama dengan makrofag, mendegradasi ekstraseluler. protein matriks di daerah bahu dari plak aterosklerotik [19]. Aktivitas terakhir membuat plak tidak stabil atau rentan, akhirnya menyebabkan kejadian tromboemboli yang sering mengakibatkan serangan jantung atau stroke. Histamin yang dilepaskan dari sel mast yang terdegranulasi adalah mediator utama inflamasi alergi, tetapi juga dapat meningkatkan permeabilitas dinding vaskular untuk LDL dan mendorong pembentukan lesi aterosklerotik [20]. Histamin menyebabkan proliferasi sel otot polos dan migrasinya ke lesi [21]. Aktivasi sistemik sel mast meningkatkan perkembangan plak dan, pada aterosklerosis lanjut, menyebabkan perdarahan intraplaque karena pelepasan histamin [22].

Partikel LDL berdiameter 21-27 nm [23], yaitu cukup kecil untuk diangkut melalui dinding arteri. Menurut pengukuran in vivo [24], mereka terakumulasi di lapisan intimal dan adventisia dinding. Ketika teroksidasi, mereka bersentuhan dengan dan mengaktifkan makrofag intima, yang kemudian melepaskan TNF-α [15]. Kemudian, beberapa partikel oxLDL pindah ke adventitia, di mana mereka berinteraksi dengan sel mast adventisia. Pengetahuan saat ini adalah bahwa sel mast dapat diaktifkan oleh kompleks imun oxLDL-IgG [25]. Namun, oxLDL dapat mensensitisasi sel mast bahkan tanpa kompleks dengan molekul IgG [26]. Kami berhipotesis bahwa LDL, teroksidasi di dinding arteri, mengaktivasi makrofag dan sel mast, yang pada gilirannya menyebabkan pelepasan TNF-α dan histamin yang memiliki efek berurutan dan sinergis pada disfungsi endotel dan adhesi monosit. Penting untuk mengatakan bahwa, dalam skenario yang dijelaskan di atas, sel-sel endotel vaskular pertama-tama terpapar TNF-α dari makrofag intima teraktivasi dan kemudian ke histamin dari sel mast adventisia teraktivasi. Kami menguji hipotesis dalam eksperimen adhesi aliran statis dan mikrofluida dan dengan uji imunosorben terkait-enzim (ELISA) dan flow cytometry.


Hasil

Sel busa turunan makrofag mengekspresikan CD146

Untuk menyelidiki apakah CD146 makrofag terlibat dalam perkembangan aterosklerosis, pertama-tama kami menguji ekspresinya pada sel busa makrofag dalam plak aterosklerotik arteri karotis dari tikus ApoE /− yang diberi makanan manusia dan Barat, model hewan untuk aterosklerosis. Makrofag manusia diwarnai dengan antibodi terhadap CD146 dan CD68 (penanda untuk makrofag manusia). Ekspresi CD146 diamati pada sel busa makrofag yang diberi label oleh CD68 pada plak aterosklerotik dari pasien (Gambar 1A). Konsisten dengan hasil ini, tikus ApoE /− yang telah diberi makan diet Barat selama 18 minggu, menunjukkan pola pewarnaan CD146 dan Mac-3 yang serupa (penanda untuk makrofag murine) di plak aorta mereka (Gambar 1B). Data ini menunjukkan bahwa ekspresi CD146 pada sel busa makrofag adalah ciri umum ateroma tikus dan manusia.

CD146 diregulasi dalam sel busa makrofag. (A) Arteri karotis manusia (n = 3) pewarnaan lesi aterosklerotik untuk CD146 (merah) dan CD68 (hijau) dan ko-lokalisasinya (gabungan kuning lihat panah). (B) Plak aterosklerotik dari tikus ApoE /− (n = 5) yang diberi makan diet Barat (WD) selama 18 minggu pewarnaan untuk CD146 (merah) dan Mac-3 (hijau) dan co-lokalisasi mereka (gabungan kuning lihat panah). Inti diwarnai dengan DAPI (biru). Garis putus-putus menunjukkan batas lesi. Bilah skala di A dan B adalah 50 m. (C, D) Analisis aliran cytometric (C) atau western blot (D) ekspresi CD146 dalam CD11b + F4/80 + makrofag peritoneal yang diisolasi dari tikus C57BL/6J tipe liar yang diberi diet normal (chow) atau tikus ApoE /− (n = 5) makan diet normal atau WD. Bawah, kuantifikasi intensitas fluoresen rata-rata (MFI) CD146 di setiap kelompok (n = 5). Ekspresi CD146 dalam D (bawah) disajikan relatif terhadap GAPDH (kontrol pemuatan). (E) Analisis sitometrik aliran ekspresi CD146 dalam F4/80 + makrofag peritoneal dan makrofag yang diturunkan dari sumsum tulang (BMDM) yang diobati dengan atau tanpa oxLDL (50 g/ml) selama 24 jam. Panel bawah: kuantifikasi LKM CD146 di setiap kelompok (n = 5). (F) Analisis sitometrik aliran ekspresi CD146 dalam F4/80 + BMDM yang diobati dengan LDL, asetilasi LDL (AcLDL) atau oxLDL (50 g/ml) selama 24 jam. Panel bawah: kuantifikasi LKM CD146 di setiap kelompok (n = 5). (G, H) Analisis PCR real-time tingkat mRNA CD146 (G) atau analisis western blot tingkat protein CD146 (H) dalam makrofag peritoneum dan BMDM yang diobati dengan oxLDL (50 g/ml) selama 24 jam dengan ada atau tidak adanya inhibitor NF-κB BAY11-7082 (20 M) (n = 3). (SAYA) CD146 aktivitas reporter promotor-luciferase dalam sel HEK293 yang diobati dengan oxLDL (50 g/ml) dengan ada atau tidak adanya inhibitor NF-kB, disajikan relatif terhadap aktivitas luciferase dalam sel yang tidak distimulasi, ditetapkan sebagai 1. (J) Uji luciferase ganda dari situs pengikatan NF-κB diduga di CD146 promotor. Aktivitas luciferase dari konstruksi ini diukur dan dinormalisasi dengan konstruksi tipe liar yang tidak distimulasi (pGL3-WT) (n = 5). (K) Uji CHIP dari pengikatan p65 ke CD146 promotor menggunakan antibodi anti-p65 atau kontrol isotipik, diikuti dengan amplifikasi PCR dari fragmen DNA genom yang menutupi situs pengikatan -621 dan -420. GAPDH digunakan sebagai pengendalian internal. (L) Kuantifikasi tingkat relatif produk PCR dengan input. Uji ANOVA dua arah, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Data mewakili tiga percobaan independen.

Untuk mengetahui apakah ekspresi CD146 pada makrofag diatur oleh lipoprotein, pertama-tama kami mengisolasi makrofag peritoneal (F4/80 + CD11b + ) dari tikus C57BL/6J tipe liar (WT) dan tikus ApoE /− yang diberi makan tikus biasa chow atau diet Barat yang terakhir adalah model mapan in vivo pembentukan sel busa. Seperti yang dideteksi oleh flow cytometry (Gambar 1C) dan imunoblot (Gambar 1D), CD146 diekspresikan pada tingkat yang lebih tinggi pada makrofag dari tikus /− diet-ApoE Barat daripada tikus chow diet-ApoE /− dan tikus normal, yang menyiratkan bahwa ekspresi CD146 mungkin terkait dengan akumulasi lipid dalam makrofag. Untuk menilai lebih lanjut pengamatan ini, kami menggunakan komponen utama kolesterol, termasuk LDL, oxLDL atau acetylated LDL (AcLDL) untuk mengobati makrofag peritoneal atau makrofag yang diturunkan dari sumsum tulang (BMDM) dari tikus C57BL/6J, dan memeriksa ekspresi CD146 menggunakan flow cytometry . Kami menemukan bahwa hanya oxLDL, tetapi tidak LDL atau AcLDL, yang meningkatkan ekspresi CD146 pada makrofag peritoneum (Gambar 1E) dan BMDM (Gambar 1F). Data ini menunjukkan bahwa ekspresi CD146 pada makrofag dapat diatur oleh oxLDL, kontributor penting untuk aterosklerosis.

Pengikatan oxLDL ke reseptornya CD36 mengaktifkan faktor transkripsi NF-κB, sedangkan CD146 promotor berisi dua situs pengikatan NF-κB (Informasi tambahan, Gambar S1) oleh karena itu kami menguji apakah NF-κB berkontribusi pada upregulasi CD146 yang diinduksi oxLDL. Khususnya, peningkatan regulasi CD146 mRNA (Gambar 1G) dan protein (Gambar 1H) oleh oxLDL secara nyata dihambat oleh penghambat NF-κB BAY11-7082. Untuk menentukan mekanisme upregulasi CD146 yang dimediasi NF-κB, kami menggunakan a CD146 uji reporter promotor-luciferase. Kami menemukan bahwa CD146 aktivitas promotor ditingkatkan dengan kuat oleh oxLDL dan dikurangi oleh inhibitor NF-κB (Gambar 1I). Selain itu, mutasi dari dua situs diduga menghapus aktivitas luciferase (Gambar 1J). Untuk memeriksa lebih lanjut apakah NF-κB secara langsung mengikat ke situs-situs diduga ini, kami melakukan uji ChIP yang berfokus pada subunit p65 dari NF-κB. Antibodi spesifik p65 memperkaya CD146 wilayah promotor dengan cara yang bergantung pada oxLDL (Gambar 1K dan 1L). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa pengambilan lipid teroksidasi dari makrofag menghasilkan upregulasi CD146, yang dimediasi oleh aktivasi NF-κB.

CD146 diperlukan untuk aktivasi makrofag yang diinduksi oxLDL

Untuk mengeksplorasi peran CD146 makrofag selama perkembangan aterosklerosis, kami selanjutnya menyelidiki apakah CD146 terlibat dalam aktivasi makrofag yang diinduksi oxLDL. Kami pertama kali menghasilkan tikus knockout CD146 spesifik makrofag (CD146 M-KO ) oleh sistem Cre / LoxP (Informasi tambahan, Gambar S2). Selanjutnya, kami menggunakan oxLDL sebagai stimulator untuk mengevaluasi fungsi CD146 dalam kaskade pensinyalan yang diinduksi oxLDL dalam aktivasi makrofag, termasuk NF-κB, Src dan JNK 32,33 . Studi biokimia menunjukkan bahwa oxLDL menginduksi pensinyalan IκBα/NF-κB, Src dan JNK dalam BMDM. Yang penting, sinyal yang diinduksi oxLDL diblokir dalam CD146 M-KO BMDM (Gambar 2A-2D, dan Informasi tambahan, Gambar S3), atau oleh antibodi monoklonal anti-CD146 AA98 di CD146 WT BMDM (Gambar 2E-2H), menunjukkan bahwa oxLDL mengaktifkan makrofag dengan cara yang bergantung pada CD146.

CD146 diperlukan untuk aktivasi makrofag yang diinduksi oxLDL. (A-H) Analisis Western blot dari IκBα, terfosforilasi (p-) dan total NF-κB p65, Src dan JNK dalam BMDM yang distimulasi oxLDL (50 g/ml) yang diisolasi dari tikus CD146 WT atau CD146 M-KO (A-D) atau BMDM dengan atau tanpa pretreatment dengan anti-CD146 AA98 (50 g/ml) (E-H). GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan. Panel atas menunjukkan kuantifikasi ekspresi CD146. (SAYA, J) Analisis PCR kuantitatif real-time (RT) tingkat mRNA dari faktor inflamasi Mcp-1, Mmp-9, Tnf-α, jika-γ dan Il1-β pada BMDM yang diobati dengan oxLDL (50 g/ml) selama 24 jam. (SAYA) BMDM diisolasi dari tikus CD146 WT atau CD146 M-KO dan distimulasi seperti yang ditunjukkan. (J) CD146 WT BDMD dirangsang seperti yang ditunjukkan dengan adanya kontrol mIgG atau anti-CD146 AA98 (50 g/ml). Uji ANOVA dua arah, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Data mewakili tiga percobaan independen.

Karena aktivasi makrofag yang diinduksi oxLDL terutama bergantung pada CD36, kami selanjutnya menentukan apakah CD36 terlibat dalam proses CD146 pada aktivasi NF-kB sebagai respons terhadap oxLDL. Kami mengamati gangguan aktivasi NF-kB pada BMDM yang kekurangan CD36 dan BMDM yang kekurangan CD146 setelah stimulasi dengan oxLDL (Informasi tambahan, Gambar S4A). Selain itu, knockdown CD146 dan CD36 tidak memiliki efek tambahan pada aktivasi NF-κB dibandingkan dengan knockdown CD36 dalam sel RAW264.7 (Informasi tambahan, Gambar S4B).Hasil ini menunjukkan bahwa dampak CD146 pada aktivasi NF-kB sebagai respons terhadap oxLDL bergantung pada CD36.

Untuk menguji apakah pengaruh CD146 pada aktivasi NF-κB secara spesifik bergantung pada oxLDL, kami mengulangi percobaan dengan lipopolisakarida (LPS) dan TNF-α, yang juga dapat mengaktifkan NF-κB. Kami menemukan bahwa baik defisiensi CD146 maupun AA98 tidak memiliki efek apa pun pada aktivasi NF-κB sebagai respons terhadap LPS atau TNF-α (Informasi tambahan, Gambar S5), menunjukkan bahwa jalur NF-κB yang bergantung pada CD146 secara khusus responsif terhadap oxLDL.

Untuk mengeksplorasi apakah CD146 diperlukan untuk transkripsi faktor hilir yang diinduksi oxLDL, termasuk sitokin, kemokin, dan matriks metalloproteinase, kami melakukan PCR waktu-nyata kuantitatif untuk mengukur tingkat ekspresi panel faktor inflamasi sebagai respons terhadap oxLDL. Setelah pengobatan makrofag dengan oxLDL, peningkatan kadar mRNA Mcp-1, Mmp-9, Tnf-α, jika-γ dan Il1-β dalam makrofag diamati (Gambar 2I dan 2J). Yang penting, makrofag yang diisolasi dari tikus CD146 M-KO (Gambar 2I) atau dari tikus CD146 WT yang diberi pra-perawatan dengan anti-CD146 AA98 (Gambar 2J) gagal meningkatkan regulasi gen inflamasi ini pada pengobatan oxLDL, menunjukkan peran penting CD146 dalam oxLDL- menginduksi aktivasi makrofag.

CD146 mempromosikan penyerapan oxLDL

Karena ekspresi CD146 pada sel busa terlibat dalam aktivasi yang diinduksi oxLDL, kami kemudian mengevaluasi kemungkinan keterlibatan CD146 dalam pengambilan oxLDL oleh makrofag. Pewarnaan O merah minyak menunjukkan bahwa pemblokiran CD146 dengan AA98 atau dengan knockdown genetik di makrofag mengganggu penyerapan oxLDL (Gambar 3A), menunjukkan bahwa CD146 berkontribusi pada penyerapan oxLDL oleh makrofag. Selanjutnya, kami menggunakan mikroskop confocal dan flow cytometry untuk mengkonfirmasi peran CD146 dalam penyerapan lipid. OxLDL berlabel dil digunakan untuk melacak penyerapan oxLDL. Sebelum deteksi, sel dicuci dengan buffer asam sedingin es untuk menghindari potensi kontaminasi permukaan sel dengan oxLDL "lengket". Kami menemukan bahwa penyerapan oxLDL oleh makrofag secara signifikan terganggu dalam makrofag dari tikus CD146 M-KO atau dari tikus CD146 WT yang diberi perlakuan sebelumnya dengan anti-CD146 AA98 (Gambar 3B-3D). Selain itu, pengukuran kandungan kolesterol intraseluler makrofag mengkonfirmasi peran memfasilitasi CD146 dalam penyerapan oxLDL (Gambar 3E). Semua hasil ini menunjukkan bahwa CD146 berpartisipasi dalam penyerapan oxLDL dan pembentukan sel busa.

CD146 mempromosikan pembentukan sel busa. (A) Serapan lipid diukur dengan pewarnaan O merah minyak pada CD146 WT atau CD146 M-KO BMDMs yang distimulasi dengan oxLDL (50 g/ml) selama 24 jam dengan atau tanpa pra-perawatan dengan anti-CD146 AA98 (50 g/ml). Bilah skala adalah 100 m. Panel bawah menunjukkan kuantifikasi kandungan O merah minyak melalui perangkat lunak Image-Pro Plus. (B-D) BMDM dari tikus CD146 WT atau CD146 M-KO atau BMDM dengan atau tanpa perlakuan awal dengan AA98 (50 g/ml) diinkubasi dengan Dil-oxLDL (50 g/ml). Dil-oxLDL terdeteksi oleh mikroskop confocal (B) atau flow cytometry (C, D). Panel kanan: kuantifikasi LKM Dil-oxLDL. (E) Uji kuantitatif lipid biokimia digunakan untuk mengukur total lipid seluler (dengan ANOVA dua arah ** P < 0,01, *** P < 0,001). Data mewakili tiga percobaan independen.

Namun demikian, pengurangan penyerapan oxLDL oleh penargetan CD146 bukan karena downregulasi CD36 atau gangguan pengikatan oxLDL ke makrofag karena baik keterlibatan AA98 maupun defisiensi CD146 tidak berpengaruh pada ekspresi CD36 (Informasi tambahan, Gambar S6A-S6C) atau pada pengikatan oxLDL ke makrofag (Informasi tambahan, Gambar S6D, S6E).

CD146 berinteraksi dengan CD36 untuk memfasilitasi internalisasinya

Karena CD36 adalah reseptor utama untuk penyerapan oxLDL dan selanjutnya pembentukan dan aktivasi sel busa, juga berdasarkan temuan bahwa CD146 dan CD36 mengaktifkan pensinyalan NF-κB, Src dan JNK dalam makrofag 28,34 , kami berhipotesis bahwa CD146 mungkin berinteraksi dengan CD36 untuk memediasi penyerapan oxLDL. Untuk menguji ini, pertama-tama kami melakukan eksperimen coimmunoprecipitation (co-IP) untuk menguji apakah ada interaksi antara CD146 dan CD36 dalam BMDM. Hasilnya menunjukkan bahwa CD36 dan CD146 diimmunopresipitasi baik oleh antibodi anti-CD146 atau anti-CD36, tetapi tidak mengontrol IgG (Gambar 4A), menunjukkan bahwa kedua molekul ini terkait dalam makrofag. Interaksi ini dikonfirmasi oleh in vitro pull down assay, di mana interaksi fisik langsung antara CD146 dan CD36 terdeteksi (Gambar 4B). Namun, CD146 tidak berinteraksi dengan oxLDL secara langsung, seperti yang ditunjukkan dalam uji imunosorben terkait-enzim (Informasi tambahan, Gambar S7). Lebih lanjut, kami menemukan bahwa interaksi antara CD146 dan CD36 dalam makrofag diperkuat oleh oxLDL dengan cara yang bergantung pada waktu (Gambar 4C), dan diblokir oleh anti-CD146 AA98 (Gambar 4D). Karena AA98 secara khusus mengenali epitop konformasi pada ikatan disulfida C452-C499 dalam CD146 D4-5 35 , kami berharap bahwa CD146 D4-5 dapat berikatan dengan CD36. Memang, CD146 D4-5 mudah terikat pada CD36 (Gambar 4E), dan interaksi ini dapat diblokir oleh anti-CD146 AA98 (Gambar 4F).

CD146 berinteraksi dengan CD36. (A) Uji Co-IP CD36 dan CD146 dalam BMDM. CD146 dan CD36 dari lisat sel diimmunopresipitasi dengan anti-CD146 mAb dan anti-CD36, masing-masing. (B) Interaksi langsung antara CD36 dan CD146. CD146-ECD pertama kali diinkubasi dengan CD36-ECD. CD146-ECD ditarik ke bawah oleh anti-CD146 ME-9F1, dan kemudian diendapkan oleh manik-manik protein G. Protein terikat kemudian dianalisis dengan western blotting. (C) Uji Co-IP menunjukkan bahwa interaksi CD36 dan CD146 ditingkatkan dengan adanya oxLDL di BMDM. Analisis imunoblot dari protein yang diendapkan CD146 dari BMDM yang diobati dengan oxLDL (50 g/ml) untuk waktu yang ditentukan. Panel kanan: kuantifikasi level CD36 relatif terhadap CD146. (D) Uji Co-IP menunjukkan bahwa interaksi CD36 dan CD146 diturunkan oleh antibodi anti-CD146 AA98. Panel kanan: kuantifikasi level CD36 relatif terhadap CD146. (E) Interaksi langsung CD36/CD146 atau CD36/CD146 D4-5 . CD36-ECD pertama kali diinkubasi dengan CD146-ECD dan CD146 D4-5 . CD36-ECD ditarik ke bawah oleh antibodi anti-CD36, dan kemudian diendapkan oleh manik-manik protein G. (F) AA98 memblokir interaksi CD36 dan CD146. His-CD146-ECD atau His-CD146 D4-5 pertama kali diinkubasi dengan lisat sel BMDM dengan adanya mIgG atau AA98 (50 g/ml). Protein CD36 yang terikat pada His-CD146-ECD atau His-CD146 D4-5 dideteksi oleh imunoblot dengan antibodi anti-CD36. * P < 0,05, ** P < 0,01. Data mewakili tiga percobaan independen.

Karena internalisasi CD36 merupakan langkah penting untuk aktivasi sinyal hilir dalam makrofag 23,36,37 , kami berhipotesis bahwa CD146 dapat memfasilitasi internalisasi CD36 setelah stimulasi dengan oxLDL. Immunoblotting (Gambar 5A dan 5B) dan analisis FACS (Gambar 5C dan 5D) dari fraksi membran plasma makrofag menunjukkan bahwa internalisasi membran CD36 dan CD146 dihambat pada makrofag CD146 M-KO dibandingkan dengan makrofag CD146 WT (Gambar 5A dan 5C ), menunjuk pada gangguan internalisasi CD36 oleh blokade CD146. Hasil serupa diperoleh dengan makrofag WT yang diobati dengan AA98 (Gambar 5B dan 5D).

CD146 memfasilitasi internalisasi CD36. noda barat (A, B) dan analisis FACS (C, D) membran CD146 dan CD36 dalam BMDM terstimulasi oxLDL yang diisolasi dari tikus CD146 WT atau CD146 M-KO (A, C) atau BMDM dengan atau tanpa pretreatment dengan anti-CD146 AA98 (50 g/ml) (B, D). Fraksi membran diimunisasi dengan antibodi yang ditunjukkan. SP (pompa natrium) berfungsi sebagai kontrol pemuatan untuk fraksi membran. Panel kanan: kuantifikasi level CD36 atau CD146 relatif terhadap SP (A, B). Panel bawah: kuantifikasi LKM CD36 atau CD146 (C, D). (E, F) Western blots CD146 dan CD36 dalam fraksi endosom BMDM yang diisolasi dari tikus CD146 WT atau CD146 M-KO (E) atau BMDM dengan atau tanpa pretreatment dengan anti-CD146 AA98 (50 g/ml) (F). Fraksi endosomal diimunisasi dengan antibodi yang ditunjukkan. Panel kanan: kuantifikasi CD36 atau CD146. (G, H) BMDM dari tikus CD146 WT atau CD146 M-KO atau BMDM dengan atau tanpa perlakuan awal dengan AA98 (50 g/ml) diberi label dengan antibodi penautan silang CD36. Kemudian, sel-sel diinkubasi pada suhu 37 ° C untuk menghubungkan CD36. Sel-sel kemudian dicuci dengan buffer pencuci asam dingin untuk menghabiskan CD36 permukaan. Mikroskop confocal digunakan untuk mendeteksi dan mengukur internalisasi CD36. Panel bawah: kuantifikasi LKM CD36. * P < 0,05, ** P< 0,01, *** P< 0,001. Data mewakili tiga percobaan independen.

Karena pengikatan oxLDL mengarah pada internalisasi kompleks CD36-lipoprotein ke dalam struktur seperti endosom 38,39 , kami selanjutnya menguji apakah CD146 diperlukan untuk translokasi endosom CD36 setelah stimulasi dengan oxLDL. Kami mengisolasi fraksi endosom (Informasi tambahan, Gambar S8) dan menganalisis ekspresi CD36 dan CD146 dengan imunoblotting. Kami menemukan bahwa translokasi CD36 dan CD146 yang diinduksi oxLDL ke fraksi endosom dihambat pada makrofag M-KO CD146 dan makrofag WT yang diobati dengan AA98 (Gambar 5E dan 5F). Untuk mengkonfirmasi hasil ini, kami memeriksa lokalisasi subseluler mereka di BMDM dengan mikroskop confocal. Lokalisasi intraseluler minimal CD36 dan CD146 terlihat pada sel istirahat, tetapi setelah pengobatan dengan oxLDL, CD36 dan CD146 bergeser ke vesikel seperti endosom. Sebaliknya, proses ini dihambat pada makrofag CD146 M-KO dan makrofag WT yang diobati dengan AA98 (Informasi tambahan, Gambar S9).

Untuk mengkonfirmasi fungsi CD146 dalam internalisasi CD36, kami melakukan uji penautan silang CD36. Kami menemukan bahwa setelah mengikat antibodi penautan silang CD36, internalisasi CD36 ditekan secara signifikan pada makrofag yang kekurangan CD146 dan pada makrofag WT CD146 yang diobati dengan AA98 (Gambar 5G dan 5H). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa CD146 terlibat dalam penyerapan lipid dengan berinteraksi dengan CD36 dan dengan memfasilitasi internalisasi kompleks reseptor-ligan.

CD146 berkontribusi pada retensi makrofag di ateroma

Ekspresi faktor retensi dan emigrasi berkontribusi pada retensi makrofag dalam plak 7 . Karena CD146 mempromosikan aktivasi NF-κB yang diinduksi oxLDL, dan NF-κB mengontrol ekspresi panel gen migrasi makrofag, kami selanjutnya menentukan apakah CD146 diperlukan untuk ekspresi faktor retensi makrofag (CD36, netrin-1 dan Sema3E) dan faktor emigrasi (CCR7) sebagai respons terhadap oxLDL. Kami menemukan bahwa peningkatan regulasi faktor retensi makrofag yang diinduksi oxLDL dan penurunan regulasi CCR7 dihambat oleh inhibitor NF-κB (Informasi tambahan, Gambar S10), menunjukkan bahwa NF-kB mengontrol ekspresi gen terkait migrasi makrofag. Lebih lanjut, kami mengamati penurunan ekspresi CD36, netrin-1, dan Sema3E dan peningkatan ekspresi CCR7 pada makrofag CD146 M-KO dan CD36 KO dan pada makrofag WT yang diobati dengan AA98 (Gambar 6), menunjukkan bahwa CD146 mungkin memiliki peran penting dalam retensi makrofag dalam plak dengan mengatur sebagian ekspresi faktor terkait migrasi.

CD146 mengontrol ekspresi faktor migrasi makrofag sebagai respons terhadap oxLDL. (A, B) Analisis PCR kuantitatif real-time (RT) tingkat mRNA dari faktor migrasi makrofag CD36, Netrin-1, Sem 3E dan Ccr7 dalam BMDM yang diinkubasi dengan oxLDL (50 g/ml) selama 24 jam. (A) BMDM diisolasi dari tikus WT, CD146 M-KO atau CD36 KO dan distimulasi seperti yang ditunjukkan (B) BDMD WT dirangsang seperti yang ditunjukkan dengan adanya kontrol mIgG atau anti-CD146 AA98 (50 g/ml). (C, D) Analisis western blot dari faktor migrasi makrofag CD36, Netrin-1 dan CCR7 dalam BMDM yang diperlakukan seperti yang ditunjukkan. GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan. (C) BMDM diisolasi dari tikus WT, CD146 M-KO atau CD36 KO dan distimulasi seperti yang ditunjukkan (D) BDMD WT dirangsang seperti yang ditunjukkan dengan adanya kontrol mIgG atau anti-CD146 AA98 (50 g/ml). Panel kanan: kuantifikasi tingkat ekspresi protein relatif terhadap GAPDH. * P < 0,05, ** P < 0,01. Data mewakili tiga percobaan independen.

Studi sebelumnya menunjukkan bahwa penelanan lipid yang abnormal menyebabkan retensi makrofag di ateroma 18 . Kami selanjutnya mengeksplorasi apakah CD146 berkontribusi pada retensi makrofag di bawah hiperlipidemia menggunakan sistem ruang transwell Boyden. Kami mengamati bahwa oxLDL memblokir migrasi makrofag yang diinduksi oleh kemokin (motif C-C) ligan 19 (CCL19) dan CCL21 (Gambar 7A-7D), yang merupakan ligan reseptor kemokin CCR7 dan memfasilitasi emigrasi makrofag dari plak aterosklerotik. Namun, defisiensi CD146, defisiensi CD36 (Gambar 7A dan 7B) dan antibodi anti-CD146 AA98 (Gambar 7C dan 7D) memulihkan retensi makrofag yang diinduksi oxLDL, menunjukkan bahwa CD146 penting untuk retensi makrofag yang diinduksi oxLDL.

CD146 memfasilitasi retensi sel busa makrofag. (A, B) Migrasi BMDM yang diisolasi dari tikus WT, CD146 M-KO atau CD36 KO menuju CCL19 (A) atau CCL21 (500 ng/ml) (B) selama stimulasi oxLDL (50 g/ml) diukur dalam ruang Transwell Boyden (n = 5). Jumlah sel yang bermigrasi dihitung. (C, D) Uji migrasi BMDM menuju CCL19 (C) atau CCL21 (500 ng/ml) (D) selama stimulasi oxLDL (50 g/ml) dengan atau tanpa anti-CD146 AA98 (50 g/ml) menggunakan ruang Transwell Boyden (n = 5) (uji ANOVA dua arah). (E) Fotomikrograf representatif dari bagian lesi dari tikus ApoE / pada awal di mana sel-sel yang diturunkan dari YG-bead + monosit diamati. Merah: Mac-3 + sel biru: inti bernoda DAPI hijau: manik-manik YG (lamina elastis internal juga berwarna hijau karena autofluoresensi). Panah menunjukkan sel yang mengandung manik-manik fluoresen di bagian lesi. lu, lumen aorta. Bilah skala adalah 100 m. (F, G) in vivo analisis perekrutan makrofag berlabel manik (berwarna hijau) ke dan retensi dalam plak aterosklerotik dari CD146 WT → ApoE /− dan CD146 M-KO → ApoE /− tikus (F), atau tikus ApoE /− yang diberi perlakuan AA98- atau mIgG (G) menggunakan sistem pelacakan monosit. Hasilnya disajikan sebagai manik-manik per area pada 10 hari (awal, lima tikus per kelompok) dan 14 hari (delapan tikus per kelompok) setelah injeksi manik-manik. Setidaknya 20 bagian per tikus dianalisis. Uji ANOVA dua arah. * P < 0,05, ** P< 0,01, *** P< 0,001. Data mewakili tiga percobaan independen.

Untuk mengatasi lebih lanjut peran CD146 dalam retensi makrofag yang mengandung lipid dalam plak aterosklerosis, kami melakukan percobaan pelacakan makrofag pada CD146 WT → ApoE / dan CD146 M-KO → ApoE / sumsum tulang tikus chimeric. Singkatnya, 10 hari setelah injeksi mikrosfer (didefinisikan di sini sebagai baseline, sesuai dengan titik waktu dengan perekrutan optimal monosit berlabel ke dalam plak aterosklerotik dan pembersihan monosit berlabel dari darah tepi, Informasi tambahan, Gambar S11) dan 14 hari setelah injeksi, jumlah makrofag berlabel dalam plak diukur (Gambar 7E). Kami menemukan bahwa jumlah makrofag pada plak CD146 WT → ApoE /− dan CD146 M-KO → ApoE /− mirip dengan baseline (Gambar 7F), menunjukkan bahwa migrasi makrofag ke dalam plak tidak terpengaruh setelah defisiensi CD146. Namun, jumlah makrofag berlabel manik dalam plak CD146 M-KO → ApoE /− menurun 60% pada hari ke-14 sebaliknya, CD146 WT → ApoE /− plak menunjukkan jumlah manik-manik yang sama pada awal dan hari ke 14 ( Gambar 7F), menunjukkan bahwa lebih sedikit makrofag yang tertahan pada lesi tanpa adanya CD146. Data ini menunjukkan bahwa CD146 diperlukan untuk retensi makrofag dalam plak aterosklerotik. Untuk mengonfirmasi hal ini, kami selanjutnya melakukan percobaan pelacakan makrofag pada tikus ApoE /− yang diberi anti-CD146 atau mIgG. Kami menemukan bahwa pada kelompok yang diobati dengan mIgG, jumlah makrofag berlabel manik-manik pada hari ke 10 dan hari ke 14 serupa, menunjukkan bahwa sebagian besar makrofag dipertahankan dalam lesi. Sebaliknya, tikus yang diobati dengan anti-CD146 AA98 memiliki lebih sedikit makrofag (menurun 50%) pada plak pada hari ke-14 dibandingkan dengan pada awal (Gambar 7G). Data ini menunjukkan bahwa ekspresi CD146 pada makrofag menghambat emigrasinya keluar dari plak, tanpa mempengaruhi infiltrasinya.

Penghapusan CD146 yang ditargetkan dalam makrofag mengurangi aterosklerosis

Berdasarkan temuan di atas, kami berhipotesis bahwa penghapusan CD146 dalam makrofag mungkin melemahkan perkembangan aterosklerosis yang sudah terbentuk dengan menghambat retensi makrofag di dalam plak. Untuk menguji hipotesis ini, kami membuat tikus dengan atau tanpa CD146 makrofag dengan mentransfer sel sumsum tulang CD146 WT atau CD146 M-KO ke dalam tikus ApoE /− iradiasi mematikan yang telah diberi makan diet Barat selama 12 minggu. Analisis plasma mengungkapkan tidak ada perbedaan dalam profil lipid antara kedua kelompok. Bobot tubuh pada kedua kelompok juga tidak berubah (Informasi tambahan, Gambar S12). Meskipun profil kolesterol serupa, analisis aorta en face dan kuantifikasi beban lesi dengan analisis cross-sectional aorta mengungkapkan bahwa tikus CD146 M-KO → ApoE /− memiliki area lesi aterosklerotik yang lebih kecil daripada CD146 WT → ApoE tikus /− (Gambar 8A-8E).

Penghapusan CD146 yang ditargetkan dalam makrofag menyebabkan beban aterosklerosis yang lebih rendah dan plak yang kurang kompleks. (A) Gambar representatif dari aterosklerosis di aorta di hadapan tikus CD146 WT → ApoE /− dan CD146 M-KO → ApoE /−. Aorta diwarnai dengan minyak merah O. (B) Gambar representatif dari pewarnaan minyak merah O dari lesi yang diisolasi dari CD146 WT → ApoE /− dan CD146 M-KO → ApoE /− tikus. (C) Pewarnaan H&E pada lesi aterosklerotik yang diisolasi dari CD146 WT →ApoE /− dan CD146 M-KO →ApoE /− tikus (n = 8). Garis putus-putus menunjukkan batas lesi. Bilah skala adalah 100 m. (D) Area lesi plak aterosklerotik pada akar aorta tikus CD146 WT →ApoE /− dan CD146 M-KO →ApoE /−, disajikan untuk setiap genotipe pada 400 m akar aorta (n = 8). (E) Kuantifikasi area lesi plak aorta yang diisolasi dari setiap genotipe (n = 8). (F) Distribusi plak awal, sedang dan lanjut berdasarkan stadium histologis dari lesi aterosklerotik (n = 8). (G) Kuantifikasi jumlah Mac-3 + makrofag di plak aorta (n = 8, setidaknya 10 bagian per mouse). (H) Kuantifikasi area inti nekrotik dari plak aorta (n = 8, setidaknya 20 bagian per mouse). (SAYA) Pewarnaan Masson Trichrome (kolagen) pada plak aorta (kiri). Panel kanan: kuantifikasi pewarnaan (n = 8, setidaknya 10 bagian per mouse). Bilah skala adalah 100 m. Uji ANOVA satu arah, *P < 0,05, ** P < 0,01.

Untuk memantau perkembangan aterosklerosis, lesi dikelompokkan ke dalam tiga kategori berikut seperti yang dijelaskan sebelumnya 40: lesi dengan garis-garis lemak awal, lesi sedang dengan tutup kolagen, dan lesi lanjut dengan keterlibatan media dan peningkatan area nekrotik. Analisis kami menunjukkan bahwa CD146 WT → ApoE /− plak telah mengalami perkembangan plak yang lebih parah, sedangkan tikus CD146 M-KO → ApoE /− memiliki plak yang jauh lebih sedikit (Gambar 8F), menunjukkan bahwa CD146 makrofag mendorong perkembangan lesi aterosklerotik ke tahap yang lebih lanjut. Selain itu, pewarnaan Mac-3 mengkonfirmasi lebih sedikit makrofag dalam plak tikus CD146 M-KO → ApoE /− (Gambar 8G). Beban melimpah sel busa makrofag berkontribusi pada ketidakstabilan plak aterosklerotik. Analisis morfologi plak menunjukkan bahwa tikus CD146 M-KO →ApoE /− mengandung inti nekrotik yang lebih kecil (Gambar 8H). Selain itu, kandungan kolagen dalam plak secara signifikan lebih tinggi pada tikus CD146 M-KO → ApoE /− (Gambar 8I). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi CD146 dalam makrofag lesi memfasilitasi pembentukan plak aterosklerotik dan meningkatkan kompleksitas wabah dengan meningkatkan retensi makrofag, menunjukkan CD146 makrofag dapat berfungsi sebagai target terapi potensial.

Penargetan CD146 menghambat aterosklerosis

Karena CD146 berkontribusi pada penyerapan oxLDL dan retensi sel busa makrofag, dan menargetkan CD146 makrofag dengan antibodi AA98 (yang mengenali murine CD146, Informasi tambahan, Gambar S13) menghambat penyerapan lipid dan mendorong emigrasi makrofag, CD146 makrofag dapat berfungsi sebagai terapi potensial sasaran aterosklerosis. Kami selanjutnya memeriksa efek pencegahan dan terapi AA98 dalam mengobati aterosklerosis. Pertama, kami memberi makan tikus ApoE / dengan diet Barat selama 18 minggu dan secara bersamaan memperlakukan mereka dengan AA98 atau kontrol IgG. Tikus kemudian dikorbankan, dan perkembangan lesi aterosklerotik diukur dengan melakukan analisis histologis bagian berurutan (Gambar 9A). Menariknya, dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan mIgG kontrol, ukuran plak pada tikus yang diobati dengan AA98 berkurang secara signifikan (Gambar 9B dan 9C). Analisis karakterisasi histologis dari plak mengungkapkan bahwa tikus yang diobati dengan AA98 memiliki lebih sedikit lesi lanjut (15%) dan stadium awal (65%) dibandingkan kelompok kontrol (Gambar 9D). Pewarnaan Mac-3 menunjukkan bahwa lebih sedikit makrofag yang diamati pada lesi tikus yang diobati dengan AA98 dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan mIgG (Gambar 9E). Selain itu, kami mengamati inti nekrotik yang lebih kecil (Gambar 9F) dan kandungan kolagen yang lebih tinggi (Gambar 9G) dalam plak tikus yang diobati dengan AA98. Namun, tingkat serum trigliserida, kolesterol, HDL, LDL, FFA dan oxLDL, serta berat badan serupa antara kedua kelompok (Informasi tambahan, Gambar S14A dan S14B), menunjukkan bahwa penargetan CD146 dengan antibodi menghambat perkembangan aterosklerosis tanpa mempengaruhi kolesterol serum.

CD146 sebagai target terapi aterosklerosis. (A-G) Penargetan pencegahan CD146 dengan antibodi mengurangi aterosklerosis. Tikus ApoE /− secara preventif disuntik dengan mIgG atau AA98 ketika mereka memulai diet Barat (delapan tikus per kelompok). Semua kuantifikasi dilakukan menggunakan setidaknya 15 bagian per mouse. (A) Rejimen dosis intervensi terapi bertarget CD146 menggunakan anti-CD146 AA98 atau kontrol IgG dalam aterosklerosis yang diinduksi diet tinggi lemak (HFD). (B) Area lesi plak akar aorta dari masing-masing kelompok tikus, disajikan untuk setiap kelompok di 400 m dari akar aorta (n = 8). (C) Kuantifikasi area lesi plak aorta yang diisolasi dari tikus ApoE /−. (D) Distribusi plak awal, sedang dan lanjut berdasarkan stadium histologis dari lesi aterosklerotik. (E) Kuantifikasi plak aorta immunostained untuk makrofag menggunakan penanda makrofag Mac-3. (F) Kuantifikasi area inti nekrotik dari plak aorta. (G) Kuantifikasi pewarnaan Masson's trichrome (kolagen) pada plak aorta. (H-N) Penargetan terapi CD146 dengan antibodi mengurangi aterosklerosis (lima tikus per kelompok). Semua kuantifikasi dilakukan menggunakan setidaknya 15 bagian per mouse. (H) Rejimen dosis intervensi terapi bertarget CD146 menggunakan anti-CD146 AA98 atau kontrol IgG pada aterosklerosis yang diinduksi HFD. Tikus ApoE / diberi makan HFD selama 12 minggu sebelum pengobatan antibodi selama 6 minggu tambahan, waktu di mana tikus dikorbankan. (SAYA) Area lesi plak aterosklerotik dari akar aorta dari setiap kelompok tikus, disajikan untuk setiap kelompok di 400 m dari akar aorta (n = 5). (J) Kuantifikasi area lesi plak aorta yang diisolasi dari tikus ApoE /−. (K) Distribusi plak awal, sedang dan lanjut berdasarkan stadium histologis dari lesi aterosklerotik. (L) Kuantifikasi plak aorta immunostained untuk makrofag menggunakan penanda makrofag Mac-3. (M) Kuantifikasi area inti nekrotik dari plak aorta. (N) Kuantifikasi pewarnaan Masson Trichrome (kolagen) pada plak aorta. Bilah skala adalah 100 m. Uji ANOVA satu arah, * P< 0,05, ** P< 0,01, *** P< 0,001.

Untuk menguji apakah CD146 dapat berfungsi sebagai target terapi untuk plak aterosklerotik yang sudah terbentuk, kami memperlakukan tikus ApoE /− yang telah diberi makanan kaya kolesterol selama 12 minggu (dengan plak yang tampak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 9J) dengan salah satu antibodi anti-CD146 AA98 atau antibodi kontrol selama 6 minggu tambahan (Gambar 9H). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kami mengamati ukuran plak yang lebih kecil (Gambar 9I dan 9J) serta kompleksitas plak yang jauh lebih sedikit (Gambar 9K), akumulasi makrofag yang lebih sedikit (Gambar 9L), inti nekrotik yang lebih kecil (Gambar 9M) dan kandungan kolagen yang lebih tinggi (Gambar 9M). 9N) di plak tikus yang diobati dengan AA98. Namun, profil lipid dan berat badan tidak berubah antara kedua kelompok (Informasi tambahan, Gambar S14C dan S14D). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa penargetan CD146 mungkin merupakan strategi terapi yang layak untuk menghambat perkembangan aterosklerosis melalui peningkatan emigrasi makrofag dari plak.


Masuk dan Keluar: Perekrutan Monosit Ke, Retensi Masuk, dan Keluar dari Dinding Arteri

DC dan makrofag sudah berada di dalam aorta tikus C57BL/6 sebelum perkembangan aterosklerosis (9, 10). DCs diamati di intima daerah yang memiliki kecenderungan aterosklerosis dari aorta C57BL/6, dan makrofag berlimpah ditemukan di seluruh adventitia aorta (10). Eksperimen elegan menggunakan transfer sumsum tulang antara tikus yang membawa varian alelik dari antigen leukosit umum CD45 menunjukkan bahwa sel turunan monosit dalam plak aterosklerotik berasal dari sumsum tulang (11). Mekanisme perekrutan monosit ke dalam aorta yang tidak meradang tidak didefinisikan dengan baik. Lebih banyak diketahui tentang homing monosit ke aorta selama aterogenesis (12). Penggulungan monosit pada endotelium yang meradang terjadi dengan cara yang bergantung pada P-selectin, dan tidak adanya P-selectin mengakibatkan penurunan garis lemak dengan pengurangan bersamaan dari makrofag yang beremigrasi dalam plak (13). E-selectin tumpang tindih dengan P-selectin dalam mendukung rolling. Diikuti dengan penggulungan pada endotel aorta yang meradang, monosit menggunakan molekul adhesi sel vaskular (VCAM)-1 untuk penggulungan lambat dan adhesi ketat (13). Vcam1 D4/D4 Ldlr −/− tikus yang mengekspresikan hanya 8% dari VCAM-1 normal menunjukkan penurunan pembentukan lesi dini (14). Ada beberapa bukti bahwa β2 integrin dan molekul adhesi antar sel (ICAM)-1 mungkin terlibat dalam mendukung perekrutan monosit ke dalam aorta, tetapi ini tidak ditemukan di semua penelitian (13).

Jaringan reseptor kemokin/kemokin sangat penting untuk arah migrasi leukosit dalam kondisi homeostatis dan inflamasi (Gambar 2). Sejumlah laporan menggambarkan peran penting kemokin CXCL1, CCL2, MIF (faktor penghambat migrasi makrofag), CXCL16, dan CX3CL1 dan reseptornya CXCR2, CCR2, CXCR2 dan CXCR4, CXCR6, dan CX3CR1 dalam regulasi rekrutmen leukosit selama aterosklerosis. 15).

Rekrutmen monosit ke dinding pembuluh yang rawan aterosklerosis. Monosit menggunakan jaringan molekul adhesi dan reseptor kemokin yang tumpang tindih untuk memasuki dinding arteri. P-selectin mendukung interaksi rolling dan monosit-platelet. Monosit α4β1 integrin berinteraksi dengan VCAM-1 endotel mengurangi kecepatan rolling dan menyebabkan adhesi yang kuat. Kemokin yang diimobilisasi permukaan termasuk CXCL1, CXCL2, CXCL4, CCL5, dan lainnya dapat mengaktifkan monosit saat bergulir, yang mengarah pada peningkatan daya rekat α4β1 integrin melalui pensinyalan dari dalam ke luar dan pengelompokan reseptor. Monosit tinggi Ly6C menggunakan CCR2, CX3CR1, dan CCR5 untuk bermigrasi ke aorta, sedangkan monosit rendah Ly6C menggunakan CCR5. L-selectin, berinteraksi dengan ligan yang tidak diketahui, dan CXCR6, kemungkinan berinteraksi dengan CXCL16, sebagian bertanggung jawab untuk perekrutan limfosit, kemungkinan dari vasa vasorum dan di bawah lesi dari venula endotel tinggi.

Polarisasi Makrofag

Makrofag M1 dan M2 ditemukan pada lesi aterosklerotik. Makrofag M1 adalah hasil aktivasi klasik oleh lipopolisakarida dengan adanya IFN-γ, yang mengarah pada produksi IL-12, IL-23, IL-6, IL-1, dan TNF-α tingkat tinggi. . Makrofag M2 yang diaktifkan secara alternatif berdiferensiasi dengan adanya IL-4, IL-13, IL-1, atau vitamin D3 dan cenderung menghasilkan sejumlah besar IL-10 dan mengekspresikan reseptor pemulung, reseptor mannose, dan arginase (20).


Metabolisme Lipid Usus dan Perakitan Kilomikron

Penyerapan Lipid Usus

Melalui penyerapan lipid makanan, usus adalah pengatur utama lipid yang disimpan dan beredar. Terutama enterosit di usus kecil yang secara aktif mengatur pelepasan lemak makanan ke dalam sirkulasi (503-505). Lipid utama yang berasal dari makanan adalah trigliserida, fosfolipid dan ester kolesterol. Dalam lumen usus, lipid yang tertelan diemulsikan oleh garam empedu untuk meningkatkan hidrolisisnya oleh lipase (Gambar 9) (506-509). Trigliserida merupakan persentase terbesar dari lipid usus. Lipolisis trigliserida melepaskan asam lemak bebas (asam lemak non-esterifikasi) dan monoasilgliserida (Gambar 9). Ini diserap pada permukaan luminal enterosit baik dengan difusi bebas dan secara aktif oleh transpor yang dimediasi protein ke dalam sitosol enterosit (Gambar 9) (508-510). Pengangkut utama yang diidentifikasi sampai saat ini adalah CD36 (sekarang dikenal sebagai SR-B2 (511)) dan beberapa protein pengikat dan pengangkut asam lemak (512-514).

Gambar 9.

Metabolisme Trigliserida dan Kolesterol Usus. Dalam lumen usus, trigliserida makanan (TG) dan kolesterol diemulsi oleh garam empedu yang meningkatkan penyerapannya. Lipase di lumen usus mencerna trigliserida menjadi asam lemak bebas (FFA) dan monoasilgliserida (MAG). Ini diserap ke dalam enterosit di mana mereka digunakan dalam sintesis TG, fosfolipid dan ester kolesterol (CE). Sebagian besar TG yang disintesis dalam enterosit dikemas, bersama dengan fosfolipid, kolesterol, dan protein ke dalam kilomikron, yang disekresikan pada permukaan basolateral enterosit dan memasuki sistem limfatik. Perakitan kilomikron dimulai di retikulum endoplasma. Selama sintesis apolipoprotein B48 (apoB48), protein memperoleh fosfolipid dari membran retikulum endoplasma dan juga kolesterol dan TG untuk membentuk kilomikron primordial. Akuisisi lanjutan TG dan CE dan protein yang lebih kecil dan dapat ditukar (misalnya apolipoprotein A-IV dan apolipoprotein C-III) dalam retikulum endoplasma memperbesar partikel untuk membentuk prechylomicron. Prechylomciron diangkut ke aparatus Golgi dalam vesikel COPII khusus. Dalam aparatus Golgi, prekilomikron matang menjadi kilomikron. Proses pematangan meliputi glikosilasi apoB48, perolehan protein tambahan (misalnya apolipoprotein A-I) dan lipid. Vesikel sekretori yang terbentuk dari Golgi membawa kilomikron matang ke permukaan basolateral enterosit. Fusi membran vesikel sekretorik dengan membran plasma melepaskan kilomikron ke dalam ruang ekstraseluler dimana kilomikron diambil ke dalam lakteal dekat enterosit dan, dengan demikian, memasuki sirkulasi limfatik. Kolesterol makanan dalam lumen usus dibawa ke dalam enterosit melalui proses yang melibatkan Niemann-Pick C1-like protein 1 (NPC1L1). Kolesterol enterosit dan CE dapat dimasukkan ke dalam kilomikron dan disekresikan dengan TG. Selain itu, kolesterol enterosit dapat langsung diekskresikan ke dalam lumen usus menggunakan transpor kaset pengikat ATP heterodimer G5 dan G8 (ABCG5/G8). Kolesterol enterosit juga dapat diangkut ke dan dimasukkan ke dalam membran basolateral untuk dikeluarkan ke dalam sirkulasi.

Perakitan dan Sekresi Kilomikron

Dalam enterosit, asam lemak bebas dan monoasilgliserida digunakan untuk mensintesis trigliserida, fosfolipid, dan ester kolesterol (Gambar 9) (508.509.513.515-517). Mayoritas trigliserida yang terbentuk di enterosit dikemas ulang menjadi lipoprotein besar yang mengapung, yang disebut kilomikron, dan disekresikan dari permukaan basolateral sel (Gambar 9). Partikel-partikel ini memainkan peran sentral dalam pengangkutan trigliserida dan vitamin yang larut dalam lemak ke seluruh tubuh (518).

Perakitan partikel kilomikron dari prekursor adalah proses yang kompleks. Setiap partikel mengandung satu salinan apolipoprotein B48 dan perakitan dimulai dengan sintesis protein ini di retikulum endoplasma kasar. Apolipoprotein B48 adalah bentuk terpotong dari apolipoprotein B100 yang dibentuk melalui pengeditan pascatranskripsi (519.520). Saat apolipoprotein B48 disintesis dan ditranslokasi melintasi membran retikulum endoplasma, apolipoprotein B48 menjadi lipid untuk membentuk kilomikron primordial padat yang kaya fosfolipid dalam lumen retikulum endoplasma (Gambar 9). Kilomikron primordial mengandung apolipoprotein B48, fosfolipid, kolesterol dan sejumlah kecil kolesterol ester dan trigliserida (513.521.522). Proses perakitan membutuhkan protein transfer trigliserida mikrosomal (523). Dengan tidak adanya lipid yang cukup, atau jika fungsi protein transfer trigliserida mikrosomal terganggu, apolipoprotein B48 ada di mana-mana dan ditargetkan untuk degradasi proteasome (524). Pentingnya langkah perakitan awal ini terlihat pada pasien dengan defek pada gen MTP yang mengarah ke kelainan resesif langka abetalipoproteinemia. Individu dengan abetalipoproteinemia memiliki tingkat apoB yang hampir tidak terdeteksi atau dan kadar kolesterol total yang sangat rendah dalam plasma mereka karena ketidakmampuan untuk merakit lipoprotein yang mengandung apoB dalam enterosit atau hepatosit mereka. Di antara gejala sisa yang dialami oleh pasien ini adalah akumulasi trigliserida di usus dan hati mereka dan kekurangan vitamin larut lemak dalam plasma mereka (525.526). Jika tidak diobati, pasien ini mengalami masalah neurologis parah yang sebagian besar terkait dengan kekurangan vitamin E dan A.

Setelah pembentukan, partikel primordial awal mengembang dengan perolehan trigliserida dan ester kolesterol tambahan (Gambar 9). Lipid tambahan diperoleh melalui fusi dengan partikel yang mengandung non-apolipoprotein B48 yang kaya akan trigliserida dan ester kolesterol. Asal pasti partikel lipid ini dan komposisi tepatnya saat ini masih diperdebatkan secara aktif (504.505.513.527.528), tetapi fusi kilomikron primordial dengan partikel bebas apolipoprotein B48 terjadi di retikulum endoplasma (513). Partikel yang dihasilkan adalah prechylomicron (Gambar 9). Selain apolipoprotein B48, permukaan prechylomicron dapat berisi banyak salinan apoprotein kecil lainnya yang dapat ditukar termasuk apolipoprotein A-IV dan apolipoprotein C-III. Apoprotein yang dapat ditukar adalah protein larut yang tidak melekat erat pada permukaan partikel sehingga dapat dipertukarkan antara partikel lipid.

Prechylomicrons diangkut keluar dari retikulum endoplasma dan dikirim ke aparatus Golgi untuk diproses lebih lanjut (Gambar 9). Transportasi terjadi dalam vesikel khusus yang dapat menampung ukurannya yang besar. Vesikel unik mengandung sejumlah protein spesifik yang diperlukan untuk proses transportasi dan docking. Protein membran terkait vesikel-7, protein pelapis II dan Sar1b, komponen GTPase kecil dari mesin perakitan vesikel protein pelapis II (Gambar 9) adalah di antara protein khusus pada vesikel transpor lipid (505.529-531). Pematangan partikel dalam aparatus Golgi meliputi glikosilasi lebih lanjut dari apolipoprotein B48 dan penambahan apolipoprotein A-I ke permukaan (505.532.533). Setelah diproses, kilomikron matang dikemas ke dalam vesikel sekretori yang diturunkan Golgi dan diangkut ke permukaan basolateral dan dieksositosis ke dalam getah bening (Gambar 9) (527.534.535).

Perakitan kilomikron dalam enterosit adalah proses kompleks yang membutuhkan sejumlah langkah terkoordinasi dan faktor spesifik untuk bekerja secara serempak. Kegagalan dalam salah satu dari ini dapat menyebabkan keadaan penyakit terkait lipid. Misalnya, mutasi pada gen SAR1B menyebabkan retensi prechylomicrons dalam struktur terikat membran di enterosit (529). Kondisi ini ditandai pada masa kanak-kanak dengan penurunan kadar kolesterol darah, akumulasi lipid dalam enterosit, malabsorpsi lemak kronis dengan steatorrhea, dan defisiensi vitamin larut lemak dan asam lemak esensial.

Kolesterol kilomikron

Meskipun kilomikron kaya akan trigliserida, kilomikron juga membawa sejumlah besar kolesterol (536.537). Kolesterol dalam kilomikron berasal dari kumpulan umum kolesterol enterosit. Enterosit memperoleh kolesterol dengan ambilan pada permukaan luminal, perolehan dari lipoprotein pada permukaan lateral basal, dan dengan sintesis de novo di dalam enterosit. Protein Niemann-Pick C1-Like 1 adalah komponen kunci dari mesin akuisisi luminal (Gambar 9) (538), sedangkan reseptor lipoprotein densitas rendah tampaknya menjadi mediator utama akuisisi kolesterol pada permukaan basolateral (539.540). Penggabungan kolesterol ke dalam kilomikron berkontribusi pada kadar kolesterol yang bersirkulasi, dan peningkatan sintesis kilomikron usus karena peningkatan lipid makanan berkontribusi terhadap risiko kardiovaskular dan aterosklerosis, meskipun dengan mekanisme yang kompleks (516.541.542).

Metabolisme Lipid Usus Non-Kilomikron

Enterosit juga dapat mengatur lipid yang bersirkulasi dengan cara selain sekresi kilomikron. Dengan adanya asam lemak atau kolesterol berlebih, enterosit dapat menyimpan kelebihan lipid dalam bentuk esterifikasinya (trigliserida dan ester kolesterol) di dalam tetesan lipid sitoplasma (543-545).Lipid netral dalam tetesan selanjutnya dapat dimobilisasi dengan hidrolisis sesuai kebutuhan sel. Asam lemak bebas yang dibebaskan dari tetesan penyimpanan dapat dimasukkan ke dalam jalur produksi kilomikron untuk menjadi bagian dari kilomikron yang disekresikan.

Akhirnya, usus juga mengatur kadar kolesterol yang bersirkulasi dengan mengambil kelebihan kolesterol yang bersirkulasi dan mengeluarkannya ke dalam lumen usus untuk dibersihkan dalam tinja. Proses ini dikenal sebagai ekskresi kolesterol trans-intestinal. Ini bertindak sebagai tambahan untuk sekresi bilier hati dan dapat menjelaskan sebanyak 30% dari ekskresi sterol netral (546). Ekskresi kolesterol trans-intestinal terjadi pada permukaan luminal enterosit melalui proses yang terutama menggunakan pasangan pengangkut kaset pengikat ATP ABCG5/G8 (Gambar 9) tetapi dapat menggunakan jalur lain juga (547).

Ringkasan

Jelas bahwa pemrosesan lipid usus merupakan kontributor utama pada tingkat sirkulasi trigliserida dan kolesterol. Faktor diet, genetik dan metabolik yang mengganggu proses metabolisme lipid enterosit berpotensi dapat mengubah homeostasis lipid dan menghasilkan keadaan penyakit.


Selidiki Aterosklerosis Dengan Lipoprotein Densitas Rendah yang Dimodifikasi

Perubahan dalam metabolisme lipid diketahui sebagai akar cacat pada aterosklerosis. Aterosklerosis adalah suatu bentuk arteriosklerosis di mana penebalan dan hilangnya elastisitas dinding arteri disebabkan oleh penumpukan plak lemak—terutama terdiri dari kolesterol dan lipid lain dalam pembuluh darah—yang menghambat atau menghalangi aliran darah. Mekanisme yang tepat dari aterogenesis masih menjadi bahan perdebatan, tetapi kadar lipoprotein densitas rendah (LDL) yang tinggi dianggap sebagai faktor risiko aterosklerosis, dan kadar lipoprotein densitas tinggi (HDL) yang tinggi tampaknya menawarkan beberapa perlindungan.

Sebagai salah satu kompleks lipid-protein utama dalam darah, LDL bertanggung jawab untuk transportasi dan pengiriman lipid, termasuk kolesterol, trigliserida, dan fosfolipid, ke seluruh tubuh melalui endositosis yang dimediasi reseptor. LDL yang dimodifikasi tidak lagi mengikat reseptor LDL dan biasanya dibersihkan melalui reseptor "pemulung" pada makrofag dan sel endotel. Konjugat fluoresen LDL (asli dan modifikasi) dapat digunakan untuk mempelajari jalur ini menggunakan mikroskop fluoresensi, analisis konten tinggi, dan flow cytometry. Thermo Fisher Scientific menawarkan LDL yang tidak dimodifikasi dan konjugat fluoresennya untuk mempelajari endositosis yang dimediasi reseptor LDL dan aspek lain dari metabolisme lipid. Di sini kami fokus pada dua set LDL termodifikasi berlabel fluoresensi — LDL teroksidasi dan LDL asetat — untuk menyelidiki jalur endositik yang dimediasi reseptor pemulung.

LDL teroksidasi meniru proses yang terjadi secara alami

Oksidasi LDL adalah proses yang terjadi secara alami di dalam tubuh, diduga disebabkan oleh adanya radikal bebas. Sel-sel endotel dan kemudian makrofag dipanggil untuk bertindak untuk membersihkan tubuh dari LDL teroksidasi (OxLDL), yang memicu respons inflamasi dan imunogenik. Oleh karena itu, probe OxLDL yang tidak berlabel dan berfluoresensi merupakan alat penting untuk mempelajari endositosis yang dimediasi reseptor pemulung oleh makrofag dan sel endotel (Gambar 1), serta pembentukan sel busa yang diturunkan makrofag, ciri aterogenesis awal [1].

Probe OxLDL kami yang tidak berlabel dihasilkan dengan mengoksidasi lipid permukaan LDL asli atau yang tidak dimodifikasi menggunakan inkubasi tembaga sulfat. Selama inkubasi ini, oksidasi terus dipantau dengan mengukur kerapatan optik pada 234 nm [2,3]. Inkubasi diakhiri pada kira-kira setengah jalan selama fase peroksidasi lipid (Gambar 2A). Tingkat oksidasi ini mewakili nilai TBAR (thiobarbituric acid-reactive) sekitar 25-35 nmol/mg protein. Mobilitas elektroforesis dari jenis persiapan OxLDL ini ditemukan setidaknya dua kali lipat dari LDL asli (Gambar 2B). Prosedur oksidasi yang sangat terkontrol ini memastikan bahwa terutama lipid pada permukaan LDL dioksidasi, dengan oksidasi yang sangat terbatas pada apolipoprotein permukaan, untuk menginduksi respon inflamasi yang relevan secara fisiologis dari sel.

Setelah tingkat oksidasi yang tepat tercapai dan diuji, OxLDL berlabel fluoresen dihasilkan dengan memberi label dengan interkalator membran lipid DiI (1,1´-dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethylindocarbocyanine perchlorate atau DiIC18(3)). DiI adalah pewarna lipofilik yang sangat berfluoresensi yang dapat berdifusi ke bagian hidrofobik dari kompleks LDL tanpa mempengaruhi pengikatan spesifik LDL dari apolipoprotein. Tingkat pelabelan dalam probe DiI-OxLDL telah dioptimalkan untuk menghasilkan sensitivitas yang unggul dalam aplikasi pencitraan fluoresensi (Gambar 1), serta dalam sitometri aliran dan analisis pencitraan konten tinggi. Setiap lot dianalisis untuk tingkat pelabelan dan diuji secara fungsional dengan sel endotel arteri pulmonalis bovine (BPAECs) untuk membantu memastikan bahwa probe teroksidasi dikenali oleh reseptor pemulung (Gambar 1 dan 3). Pengujian kualitas ekstensif ini memungkinkan untuk mencapai hasil yang serupa dari lot ke lot, eksperimen ke eksperimen.

Gambar 1. Endositosis DiI OxLDL oleh BPAEC. BPAEC (sel endotel arteri pulmonalis sapi) ditanam dalam pelat 96-sumur berlapis poli-D-lisin selama 24 jam dan kemudian kelaparan serum semalaman di Gibco FluoroBrite DMEM ditambah 0,3% BSA. Pada hari percobaan, 10 g/mL DiI OxLDL ditambahkan ke media dan sel diinkubasi selama 3 jam. Setelah inkubasi ini, sel dibilas dengan buffer uji ditambah 0,3% BSA dan difiksasi dalam formaldehida 4%. Setelah pewarnaan nuklir dengan Reagen Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes, gambar diperoleh pada Platform Penyaringan Konten Tinggi Thermo Scientific CellInsight CX5.

Gambar 2. Pemantauan pembentukan OxLDL secara real-time.(A) Pembentukan OxLDL terus dipantau dengan mengukur kerapatan optik pada 234 nm (OD234) dengan Thermo Scientific NanoDrop Spectrophotometer selama inkubasi LDL asli dengan tembaga sulfat. Inkubasi dihentikan selama fase peroksidasi lipid (ditunjukkan oleh panah), dan lot OxLDL dikumpulkan untuk perawatan lebih lanjut. (B) Mobilitas elektroforesis LDL teroksidasi (OxLDL) setidaknya dua kali lebih besar daripada mobilitas LDL asli.

Gambar 3. Spesifisitas DiI OxLDL untuk reseptor OxLDL, sebagaimana ditentukan oleh inhibisi kompetitif. Sel endotel arteri pulmonalis sapi (BPAECs) dilapisi dalam pelat 96-sumur berlapis poli-D-lisin selama 24 jam dan kemudian kelaparan serum semalaman di Gibco FluoroBrite DMEM ditambah 0,3% BSA. Pada hari percobaan, sel-sel diberi perlakuan awal dengan serangkaian pengenceran OxLDL yang tidak berlabel (dari 0 hingga 500 g/mL) selama 30 menit pada suhu 37°C, diberi label dengan 10 g/mL DiI OxLDL selama 3 jam dalam inkubator kultur sel , dibilas dengan buffer uji ditambah 0,3% BSA, dan difiksasi dalam formaldehida 4%. Setelah pewarnaan nuklir dengan pewarna Hoechst, gambar diperoleh dan dihitung pada Platform Penyaringan Konten Tinggi Thermo Scientific CellInsight CX5. Analisis data dilakukan dengan modul internalisasi dan penghitungan titik di Perangkat Lunak Analisis Sel Thermo Scientific HCS Studio untuk menghitung jumlah titik label-positif per sel. Lima ratus sel diambil sampelnya per sumur, dengan n = 3 sumur

LDL asetat untuk reseptor pemulung spesifik

Jalur pemulung dalam makrofag dan sel endotel, dan pembentukan sel busa, telah dipelajari secara tradisional menggunakan asetilasi LDL (AcLDL). Tidak seperti oksidasi LDL, yang terutama melibatkan modifikasi lipid permukaan, asetilasi LDL mengubah salinan tunggal apolipoprotein B100 pada permukaan LDL. Ketika kompleks AcLDL terakumulasi dalam makrofag dan sel-sel endotel, sel-sel tersebut terlihat mirip dengan sel busa yang ditemukan pada plak aterosklerotik. Namun, Wang dan rekan kerja telah melaporkan bahwa LDL asli, OxLDL, dan AcLDL masing-masing diperdagangkan ke endosom yang berbeda dan terakumulasi dalam kompartemen lisosom yang berbeda, menunjukkan jalur endositik yang berbeda [4].

Thermo Fisher Scientific menawarkan beberapa turunan AcLDL fluoresen berbeda yang dapat digunakan pada berbagai platform berbasis fluoresensi. DiI AcLDL secara rutin digunakan untuk mengidentifikasi sel endotel dan mikroglia dalam kultur sel primer.Gambar 4). Turunan Invitrogen Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, dan BODIPY FL AcLDL mungkin lebih disukai dalam beberapa aplikasi karena pewarna terikat secara kovalen dengan bagian apolipoprotein yang dimodifikasi dari kompleks LDL dan oleh karena itu tidak diekstraksi selama manipulasi sel selanjutnya. Mengingat sejarah publikasi yang kaya untuk OxLDL dan AcLDL, peneliti dapat memilih modifikasi yang sesuai untuk studi khusus dan pengaturan eksperimental mereka.

Gambar 4. Sel mikroglia dalam cryosection hippocampus tikus berlabel DiI AcLDL. Sel-sel mikroglial dalam cryosection hipokampus tikus diberi label dengan DiI AcLDL merah-oranye-fluoresen dan diwarnai menggunakan pewarnaan asam nukleat DAPI biru-fluoresen.

Tetesan lipid dalam sel busa

Studi sel busa memainkan peran penting dalam membedah mekanisme aterosklerosis dan mengembangkan obat generasi berikutnya yang mengurangi risiko penyakit jantung koroner. Tetesan lipid yang menumpuk di sel busa ini biasanya dideteksi menggunakan noda lipid netral. Dengan afinitas yang sangat tinggi untuk tetesan lipid netral, pewarnaan lipid netral Invitrogen HCS LipidTOX dikembangkan untuk mendeteksi tetesan atau globul lipid intraseluler dan mengkarakterisasi efek obat dan senyawa lain pada metabolisme lipid dalam garis sel mamalia. Reagen ini ditambahkan setelah fiksasi sel (Gambar 5), membuatnya kompatibel dengan protokol imunositokimia, dan tidak memerlukan langkah pencucian berikutnya setelah inkubasi dengan sampel. Selain itu, pewarna ini lebih sensitif dan dapat difoto daripada pewarna lipid netral tradisional seperti pewarna Invitrogen BODIPY 493/503 atau Nile Red, dan tersedia dengan emisi fluoresensi hijau, merah, dan merah tua.

Gambar 5. Akumulasi tetesan lipid dalam sel RAW diobati dengan OxLDL. Sel-sel RAW yang ditumbuhkan pada piringan MatTek dikeringkan dengan serum semalaman dan diperlakukan dengan 50 g/mL OxLDL tidak berlabel selama 24 jam. Medium serum kemudian ditambahkan kembali ke sel semalaman, dan sel difiksasi dalam formaldehida 4% dan disimpan pada suhu 4°C. Pada hari percobaan, sel dibilas dalam PBS, diwarnai dengan Reagen Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes dan Invitrogen HCS LipidTox Green Netral Lipid Stain selama 30 menit, dan dibilas lagi dalam PBS. Gambar dikumpulkan pada Sistem Pencitraan Invitrogen EVOS FL Auto 2 pada perbesaran 10x.

Pelajari lebih lanjut tentang probe LDL kami

Thermo Fisher Scientific menawarkan portofolio LDL, OxLDL, dan AcLDL asli yang tidak berlabel dan berlabel fluoresensi paling lengkap untuk studi metabolisme lipid dengan pencitraan fluoresensi, analisis konten tinggi, dan flow cytometry. Semua produk LDL kami berasal dari LDL manusia yang diisolasi dari plasma manusia, yang bersumber dari bank darah dan diuji untuk HIV, hepatitis B dan C, sifilis, dan penyakit menular lainnya.


Sifat Anti-Peradangan OxLDL

Menariknya, Lara-Guzman dkk. pada tahun 2018 menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa interaksi makrofag THP-1 dan oxLDL dapat menginduksi delapan PG dan delapan IsoP, dua di antaranya, PGE1 dan 17-trans-PGF3α memiliki sifat anti-inflamasi. Selain itu, kadarnya tidak ditingkatkan dengan pengobatan LDL tetapi secara signifikan diinduksi oleh oxLDL (Moore dan Tabas, 2011). Respon anti-inflamasi ini menunjukkan bahwa sel busa mengekspresikan jalur untuk mengurangi sitotoksisitas dan peradangan yang dipicu oleh pemuatan kolesterol dalam makrofag (Lara-Guzmán et al., 2018). Contoh lain dari konsekuensi anti-inflamasi dari aksi oxLDL adalah interaksi oxLDL dengan sel B melalui mengikat reseptor CD36. Contoh lain dari konsekuensi anti-inflamasi dari aksi oxLDL adalah interaksi oxLDL dengan sel B melalui mengikat reseptor CD36. Ini mengarah pada produksi anti-oxLDL, yang memiliki aktivitas anti-inflamasi (Rhoads and Major, 2018). Ini pertama kali dijelaskan pada tahun 1999 oleh kelompok Witztum (Hörkkö et al., 1999).


BAHAN DAN METODE

Reagen

LDL yang dibuat dari plasma manusia dimodifikasi secara oksidatif seperti yang dijelaskan sebelumnya menggunakan sistem mieloperoksidase, glukosa oksidase, nitrit. 34 Insulin sapi berasal dari Sigma dan adiponektin manusia rekombinan dari sistem R&D. Antibodi poliklonal terhadap CD36 manusia berasal dari Cayman Chemical. IgG CD36 anti-manusia monoklonal, IgG anti-CD36 terkonjugasi fikoeritrin dan antibodi terhadap SR-A, aktin dan α-tubulin berasal dari Santa-Cruz Biotechnology. Antibodi terhadap ABCA-1 dan EMR1 (F4/80) dibeli dari Abcam. Kolesterol berlabel C 14 dibeli dari American Radiolabeled Chemicals. Protein ApoA1 disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya. 35 Kit ELISA Sandwich Kolorimetri Quantikine untuk IL-6 dan monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) berasal dari sistem R&D.

Sel

Monosit manusia diisolasi dari darah tepi dengan sentrifugasi Ficoll-Hypaque dan dikultur dalam RPMI yang mengandung serum AB manusia (10%) selama 7 hari untuk memungkinkan diferensiasi makrofag. Diferensiasi monosit menjadi makrofag dikonfirmasi dengan flow cytometry dengan antibodi anti-EMR1(F4/80). Darah tepi manusia disumbangkan oleh sukarelawan sehat non-diabetes. Setiap sampel disaring dan dipastikan tidak adanya hepatitis B, hepatitis C dan infeksi HIV.

Analisis Imunoblot

Makrofag manusia diinkubasi dengan konsentrasi insulin yang berbeda (300 pM, 2 nM, 100 nM), adiponektin (2 μg/ml), oxLDL (50 μg/ml), LY294002 (10 μM) atau wartmannin (100 nM) selama 16 jam dilisiskan dengan buffer yang mengandung 1% triton X-100. Lisat dipisahkan oleh SDS-PAGE, dipindahkan ke membran PVDF (Millipore) dan diperiksa dengan antibodi terhadap CD36, ABCA-1, SR-A, aktin atau α-tubulin. Intensitas pita diukur dengan ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), perangkat lunak Image-Pro Plus (Media Cybernetics) dan Gel-Pro Analyzer (MediaCybernetics).

Aliran Sitometri

Makrofag manusia yang dilapisi pada kaca penutup kaca berlapis serum diinkubasi dengan insulin, adiponektin atau oxLDL selama 16 jam, kemudian difiksasi dengan paraformaldehida 4% dalam PBS. Makrofag yang dirawat dikikis dengan lembut dan dikumpulkan dalam mikrotube dan kemudian diwarnai dengan anti-CD36 terkonjugasi PE atau anti-SR-A IgG sebelum mengukur intensitas fluoresensi dengan flow cytometry dengan Becton-Dickinson FACScan. Data dianalisis dengan software FlowJo (Tree Star). Untuk menilai penyerapan oxLDL, oxLDL diberi label dengan probe fluoresen 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanide perchlorate (diI Molecular Probe) seperti yang dijelaskan sebelumnya. 36 Makrofag pra-inkubasi seperti di atas dengan insulin atau adiponektin selama 16 jam kemudian terkena diI-oxLDL (10 μg/ml) selama 20 menit dan kemudian difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dan dianalisis dengan mikroskop laser confocal. Penyerapan fluoresensi diukur menggunakan perangkat lunak Image-Pro Plus (Media Cybernetics).

RT-PCR

Total RNA diisolasi oleh reagen Tri dari makrofag manusia yang diobati dengan insulin, adiponektin atau oxLDL selama 16 jam dan diubah menjadi cDNA oleh reverse transcriptase (Roche) dengan primer oligo-dT. cDNA kemudian digunakan untuk PCR dengan primer 5′- IndexTerm CAG AGG CTG ACA ACT TCA CAG-3′, 5′- IndexTerm AGG GTA CGG AAC CAA ACT CAA-3′ untuk CD36 atau primer 5′- IndexTerm AAC TCT ACA TCT CCC TT CCC G -3′, 5′- IndeksTerm TGT CCT CAT ACC AGT TGA GAG AC-3′ untuk ABCA-1. PCR untuk aktin digunakan sebagai referensi dengan primer 5′- IndexTerm GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3′, 5′- IndexTerm CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′. Amplifikasi PCR adalah 22 siklus 94°C selama 1 menit, 56°C selama 1 menit, dan 72°C selama 2 menit untuk CD36, 28 siklus pada suhu yang sama untuk ABCA-1 dan 17 siklus untuk aktin.

Uji Penghabisan Kolesterol

Makrofag berlapis pada piring 24-sumur diperlakukan dengan insulin (2 nM, 100 nM) atau adiponektin (2 μg/ml) dengan atau tanpa wartmannin (100 nM) selama 16 jam. OxLDL (50 μg/ml) diinkubasi dengan kolesterol berlabel C 14 (0,2 μCi / ml) pada 37 ° C selama 30 menit dan kemudian dimuat ke makrofag. Setelah 6 jam, sel berlabel C14-kolesterol dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan media RPMI 1640 selama 16 jam. C14-kolesterol yang dilepaskan dari sel ke dalam medium diukur menggunakan pencacah sintilasi. Kolesterol seluler diekstraksi dengan heksana:isopropanol (3:2 v/v), dan radioaktivitas C14 dalam larutan ekstrak diukur dengan pencacah kilau. Persentase penghabisan dihitung sebagai radioaktivitas C14 dalam medium/(radioaktivitas C14 dalam medium + radioaktivitas C14 dalam sel) × 100%.

Pengukuran Kolesterol Intraseluler

Makrofag manusia berlapis dalam cawan 6-sumur diinkubasi dengan insulin (2 nM, 100 nM) atau adiponektin (2 μg/ml) dengan atau tanpa LY294002 (10 μM). Sel-sel diperlakukan dengan oxLDL selama 16 jam dan dilisiskan oleh 0,5% triton X-100 yang mengandung buffer di atas es. Lisat disentrifugasi pada 17.000 G selama 30 menit pada suhu 4 ° C dan supernatan dikumpulkan untuk pengukuran kolesterol. Kolesterol diukur dengan menggunakan alat uji kolesterol Cayman (Cayman chemical). Secara singkat, lisat sel dicampur dengan buffer uji yang mengandung kolesterol esterase, kolesterol oksidase, HRP dan ADHP (10-asetil-3,7-dihidroksifenoksazin). Produk fluoresen resorufin yang dihasilkan oleh reaksi antara ADHP dan hidrogen peroksida dari oksidasi kolesterol dapat diukur dengan pembaca pelat fluoresensi menggunakan panjang gelombang eksitasi 530–580 nm dan panjang gelombang emisi 585–595 nm. Kami juga mengukur kolesterol total dan kolesterol bebas makrofag dengan menggunakan kromatografi gas ditambah dengan spektrometri massa (GC-MS). Makrofag manusia diinkubasi dengan insulin (2 nM, 100 nM) atau adiponektin (2 μg/ml) dengan atau tanpa wartmannin (200 nM) dan kemudian diobati dengan oxLDL (50 μg/ml) selama 16 jam. Sel-sel ini disuspensikan kembali dengan 900 μl air dan 100 μl dari 1 μg/ml koprosterol dalam isopropanol dan diterapkan pada GC-MS seperti yang dijelaskan sebelumnya. 37 Kami mencatat spektrum massa ion total turunan trimetilsilil, mengekstraksi kromatogram GC dan menghitung kandungan kolesterol di setiap sampel. Kolesterol intraseluler dari setiap sampel dinormalisasi dengan konsentrasi protein dari setiap sampel.


Selidiki Aterosklerosis Dengan Lipoprotein Densitas Rendah yang Dimodifikasi

Perubahan dalam metabolisme lipid diketahui sebagai akar cacat pada aterosklerosis. Aterosklerosis adalah suatu bentuk arteriosklerosis di mana penebalan dan hilangnya elastisitas dinding arteri disebabkan oleh penumpukan plak lemak—terutama terdiri dari kolesterol dan lipid lain dalam pembuluh darah—yang menghambat atau menghalangi aliran darah.Mekanisme yang tepat dari aterogenesis masih menjadi bahan perdebatan, tetapi kadar lipoprotein densitas rendah (LDL) yang tinggi dianggap sebagai faktor risiko aterosklerosis, dan kadar lipoprotein densitas tinggi (HDL) yang tinggi tampaknya menawarkan beberapa perlindungan.

Sebagai salah satu kompleks lipid-protein utama dalam darah, LDL bertanggung jawab untuk transportasi dan pengiriman lipid, termasuk kolesterol, trigliserida, dan fosfolipid, ke seluruh tubuh melalui endositosis yang dimediasi reseptor. LDL yang dimodifikasi tidak lagi mengikat reseptor LDL dan biasanya dibersihkan melalui reseptor "pemulung" pada makrofag dan sel endotel. Konjugat fluoresen LDL (asli dan modifikasi) dapat digunakan untuk mempelajari jalur ini menggunakan mikroskop fluoresensi, analisis konten tinggi, dan flow cytometry. Thermo Fisher Scientific menawarkan LDL yang tidak dimodifikasi dan konjugat fluoresennya untuk mempelajari endositosis yang dimediasi reseptor LDL dan aspek lain dari metabolisme lipid. Di sini kami fokus pada dua set LDL termodifikasi berlabel fluoresensi — LDL teroksidasi dan LDL asetat — untuk menyelidiki jalur endositik yang dimediasi reseptor pemulung.

LDL teroksidasi meniru proses yang terjadi secara alami

Oksidasi LDL adalah proses yang terjadi secara alami di dalam tubuh, diduga disebabkan oleh adanya radikal bebas. Sel-sel endotel dan kemudian makrofag dipanggil untuk bertindak untuk membersihkan tubuh dari LDL teroksidasi (OxLDL), yang memicu respons inflamasi dan imunogenik. Oleh karena itu, probe OxLDL yang tidak berlabel dan berfluoresensi merupakan alat penting untuk mempelajari endositosis yang dimediasi reseptor pemulung oleh makrofag dan sel endotel (Gambar 1), serta pembentukan sel busa yang diturunkan makrofag, ciri aterogenesis awal [1].

Probe OxLDL kami yang tidak berlabel dihasilkan dengan mengoksidasi lipid permukaan LDL asli atau yang tidak dimodifikasi menggunakan inkubasi tembaga sulfat. Selama inkubasi ini, oksidasi terus dipantau dengan mengukur kerapatan optik pada 234 nm [2,3]. Inkubasi diakhiri pada kira-kira setengah jalan selama fase peroksidasi lipid (Gambar 2A). Tingkat oksidasi ini mewakili nilai TBAR (thiobarbituric acid-reactive) sekitar 25-35 nmol/mg protein. Mobilitas elektroforesis dari jenis persiapan OxLDL ini ditemukan setidaknya dua kali lipat dari LDL asli (Gambar 2B). Prosedur oksidasi yang sangat terkontrol ini memastikan bahwa terutama lipid pada permukaan LDL dioksidasi, dengan oksidasi yang sangat terbatas pada apolipoprotein permukaan, untuk menginduksi respon inflamasi yang relevan secara fisiologis dari sel.

Setelah tingkat oksidasi yang tepat tercapai dan diuji, OxLDL berlabel fluoresen dihasilkan dengan memberi label dengan interkalator membran lipid DiI (1,1´-dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethylindocarbocyanine perchlorate atau DiIC18(3)). DiI adalah pewarna lipofilik yang sangat berfluoresensi yang dapat berdifusi ke bagian hidrofobik dari kompleks LDL tanpa mempengaruhi pengikatan spesifik LDL dari apolipoprotein. Tingkat pelabelan dalam probe DiI-OxLDL telah dioptimalkan untuk menghasilkan sensitivitas yang unggul dalam aplikasi pencitraan fluoresensi (Gambar 1), serta dalam sitometri aliran dan analisis pencitraan konten tinggi. Setiap lot dianalisis untuk tingkat pelabelan dan diuji secara fungsional dengan sel endotel arteri pulmonalis bovine (BPAECs) untuk membantu memastikan bahwa probe teroksidasi dikenali oleh reseptor pemulung (Gambar 1 dan 3). Pengujian kualitas ekstensif ini memungkinkan untuk mencapai hasil yang serupa dari lot ke lot, eksperimen ke eksperimen.

Gambar 1. Endositosis DiI OxLDL oleh BPAEC. BPAEC (sel endotel arteri pulmonalis sapi) ditanam dalam pelat 96-sumur berlapis poli-D-lisin selama 24 jam dan kemudian kelaparan serum semalaman di Gibco FluoroBrite DMEM ditambah 0,3% BSA. Pada hari percobaan, 10 g/mL DiI OxLDL ditambahkan ke media dan sel diinkubasi selama 3 jam. Setelah inkubasi ini, sel dibilas dengan buffer uji ditambah 0,3% BSA dan difiksasi dalam formaldehida 4%. Setelah pewarnaan nuklir dengan Reagen Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes, gambar diperoleh pada Platform Penyaringan Konten Tinggi Thermo Scientific CellInsight CX5.

Gambar 2. Pemantauan pembentukan OxLDL secara real-time.(A) Pembentukan OxLDL terus dipantau dengan mengukur kerapatan optik pada 234 nm (OD234) dengan Thermo Scientific NanoDrop Spectrophotometer selama inkubasi LDL asli dengan tembaga sulfat. Inkubasi dihentikan selama fase peroksidasi lipid (ditunjukkan oleh panah), dan lot OxLDL dikumpulkan untuk perawatan lebih lanjut. (B) Mobilitas elektroforesis LDL teroksidasi (OxLDL) setidaknya dua kali lebih besar daripada mobilitas LDL asli.

Gambar 3. Spesifisitas DiI OxLDL untuk reseptor OxLDL, sebagaimana ditentukan oleh inhibisi kompetitif. Sel endotel arteri pulmonalis sapi (BPAECs) dilapisi dalam pelat 96-sumur berlapis poli-D-lisin selama 24 jam dan kemudian kelaparan serum semalaman di Gibco FluoroBrite DMEM ditambah 0,3% BSA. Pada hari percobaan, sel-sel diberi perlakuan awal dengan serangkaian pengenceran OxLDL yang tidak berlabel (dari 0 hingga 500 g/mL) selama 30 menit pada suhu 37°C, diberi label dengan 10 g/mL DiI OxLDL selama 3 jam dalam inkubator kultur sel , dibilas dengan buffer uji ditambah 0,3% BSA, dan difiksasi dalam formaldehida 4%. Setelah pewarnaan nuklir dengan pewarna Hoechst, gambar diperoleh dan dihitung pada Platform Penyaringan Konten Tinggi Thermo Scientific CellInsight CX5. Analisis data dilakukan dengan modul internalisasi dan penghitungan titik di Perangkat Lunak Analisis Sel Thermo Scientific HCS Studio untuk menghitung jumlah titik label-positif per sel. Lima ratus sel diambil sampelnya per sumur, dengan n = 3 sumur

LDL asetat untuk reseptor pemulung spesifik

Jalur pemulung dalam makrofag dan sel endotel, dan pembentukan sel busa, telah dipelajari secara tradisional menggunakan asetilasi LDL (AcLDL). Tidak seperti oksidasi LDL, yang terutama melibatkan modifikasi lipid permukaan, asetilasi LDL mengubah salinan tunggal apolipoprotein B100 pada permukaan LDL. Ketika kompleks AcLDL terakumulasi dalam makrofag dan sel-sel endotel, sel-sel tersebut terlihat mirip dengan sel busa yang ditemukan pada plak aterosklerotik. Namun, Wang dan rekan kerja telah melaporkan bahwa LDL asli, OxLDL, dan AcLDL masing-masing diperdagangkan ke endosom yang berbeda dan terakumulasi dalam kompartemen lisosom yang berbeda, menunjukkan jalur endositik yang berbeda [4].

Thermo Fisher Scientific menawarkan beberapa turunan AcLDL fluoresen berbeda yang dapat digunakan pada berbagai platform berbasis fluoresensi. DiI AcLDL secara rutin digunakan untuk mengidentifikasi sel endotel dan mikroglia dalam kultur sel primer.Gambar 4). Turunan Invitrogen Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, dan BODIPY FL AcLDL mungkin lebih disukai dalam beberapa aplikasi karena pewarna terikat secara kovalen dengan bagian apolipoprotein yang dimodifikasi dari kompleks LDL dan oleh karena itu tidak diekstraksi selama manipulasi sel selanjutnya. Mengingat sejarah publikasi yang kaya untuk OxLDL dan AcLDL, peneliti dapat memilih modifikasi yang sesuai untuk studi khusus dan pengaturan eksperimental mereka.

Gambar 4. Sel mikroglia dalam cryosection hippocampus tikus berlabel DiI AcLDL. Sel-sel mikroglial dalam cryosection hipokampus tikus diberi label dengan DiI AcLDL merah-oranye-fluoresen dan diwarnai menggunakan pewarnaan asam nukleat DAPI biru-fluoresen.

Tetesan lipid dalam sel busa

Studi sel busa memainkan peran penting dalam membedah mekanisme aterosklerosis dan mengembangkan obat generasi berikutnya yang mengurangi risiko penyakit jantung koroner. Tetesan lipid yang menumpuk di sel busa ini biasanya dideteksi menggunakan noda lipid netral. Dengan afinitas yang sangat tinggi untuk tetesan lipid netral, pewarnaan lipid netral Invitrogen HCS LipidTOX dikembangkan untuk mendeteksi tetesan atau globul lipid intraseluler dan mengkarakterisasi efek obat dan senyawa lain pada metabolisme lipid dalam garis sel mamalia. Reagen ini ditambahkan setelah fiksasi sel (Gambar 5), membuatnya kompatibel dengan protokol imunositokimia, dan tidak memerlukan langkah pencucian berikutnya setelah inkubasi dengan sampel. Selain itu, pewarna ini lebih sensitif dan dapat difoto daripada pewarna lipid netral tradisional seperti pewarna Invitrogen BODIPY 493/503 atau Nile Red, dan tersedia dengan emisi fluoresensi hijau, merah, dan merah tua.

Gambar 5. Akumulasi tetesan lipid dalam sel RAW diobati dengan OxLDL. Sel-sel RAW yang ditumbuhkan pada piringan MatTek dikeringkan dengan serum semalaman dan diperlakukan dengan 50 g/mL OxLDL tidak berlabel selama 24 jam. Medium serum kemudian ditambahkan kembali ke sel semalaman, dan sel difiksasi dalam formaldehida 4% dan disimpan pada suhu 4°C. Pada hari percobaan, sel dibilas dalam PBS, diwarnai dengan Reagen Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes dan Invitrogen HCS LipidTox Green Netral Lipid Stain selama 30 menit, dan dibilas lagi dalam PBS. Gambar dikumpulkan pada Sistem Pencitraan Invitrogen EVOS FL Auto 2 pada perbesaran 10x.

Pelajari lebih lanjut tentang probe LDL kami

Thermo Fisher Scientific menawarkan portofolio LDL, OxLDL, dan AcLDL asli yang tidak berlabel dan berlabel fluoresensi paling lengkap untuk studi metabolisme lipid dengan pencitraan fluoresensi, analisis konten tinggi, dan flow cytometry. Semua produk LDL kami berasal dari LDL manusia yang diisolasi dari plasma manusia, yang bersumber dari bank darah dan diuji untuk HIV, hepatitis B dan C, sifilis, dan penyakit menular lainnya.