Informasi

Bagaimana kesetiaan tinggi replikasi DNA bergantung pada pembentukan ikatan hidrogen?

Bagaimana kesetiaan tinggi replikasi DNA bergantung pada pembentukan ikatan hidrogen?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Replikasi memiliki tingkat kesalahan kurang dari 1 dalam 100 juta. DNA polimerase membentuk ikatan-H dengan atom akseptor ikatan-H di alur kecil. <-- tingkatkan kesetiaan di sini?

Pengikatan gugus trifosfat ke situs aktif DNA polimerase memicu perubahan konformasi. Mengubah residu Tyr yang dilestarikan meningkatkan tingkat kesalahan hingga 40 kali lipat.

Saya kurang paham dengan dua pernyataan di atas. Adakah yang bisa menjelaskan secara rinci kepada saya? Terima kasih!


DNA polimerase harus mengkatalisis penambahan 4 nukleotida yang berbeda ke untai yang sedang tumbuh. Ini berarti bahwa ia tidak dapat secara langsung menentukan basis mana yang akan dimasukkan pada titik tertentu (bagaimana ia 'mengetahui' basis mana yang akan dimasukkan dan bagaimana ia akan mengubah kekhususannya untuk basis yang berbeda). Ini berarti bahwa spesifisitas pasangan basa mana yang akan digabungkan bergantung pada untai DNA cetakan.

Pasangan basa Watson-Crick yang benar (yaitu, ikatan hidrogen) antara untai templat dan nukleotida yang akan digabungkan memicu penutupan domain jari DNAP di sekitar persimpangan templat-primer dan memposisikan yang terakhir pada posisi optimal untuk katalisis (dengan $ce{alpha-PO_4}$ dari nukleotida yang masuk di dekat $ce{3'-OH}$ primer untuk serangan nukleofilik yang dikatalisis oleh dua ion $ce{Mg^{2+}}$ ). Di sinilah residu tirosin yang Anda sebutkan berperan. Nukleotida yang tidak dipasangkan dengan benar tidak akan memicu perubahan konformasi ini dan tidak akan diposisikan secara optimal, sehingga kemungkinan katalisis lebih kecil.

Selanjutnya, DNA polimerase membuat kontak dengan alur kecil dari sambungan primer-templat melalui ikatan hidrogen. Interaksi ini tidak spesifik-basa (semua pasangan basa Watson-Crick memiliki pola akseptor ikatan hidrogen yang sama di alur minor) tetapi hanya terjadi bila nukleotida yang benar digabungkan, sehingga menstabilkan kompleks.

Akhirnya, diskriminasi antara ribonukleotida dan deoksiribonukleotida dilakukan dengan pengecualian sterik dari $ce{2'-OH}$ oleh residu asam amino dalam kantong pengikat.

Faktor-faktor ini dapat dianggap sebagai proofreading kinetik karena mereka hanya memperlambat laju reaksi dan memberikan waktu untuk nukleotida yang dipasangkan secara tidak benar untuk berdisosiasi. Namun, mereka masih dapat digabungkan dan banyak DNA polimerase memiliki exonuclease proofreading $ce{3'->5'}$ yang dapat menghilangkan pasangan nukleotida yang salah. Pengoreksian ini sekali lagi dimediasi oleh interaksi antara DNAP dan sambungan primer-templat (yaitu ikatan hidrogen dengan alur kecil). Interaksi yang melemah karena basa yang dipasangkan secara tidak benar mengurangi afinitas antara DNA dan situs katalitik dan meningkatkan afinitas antara DNA dan situs proofreading (karena memiliki preferensi untuk membelah ssDNA dari ujung 3').


Polimerase DNA dengan ketelitian tinggi memiliki beberapa perlindungan untuk melindungi dari kesalahan membuat dan menyebarkan kesalahan saat menyalin DNA.

Enzim tersebut memiliki preferensi pengikatan yang signifikan untuk nukleosida trifosfat yang benar versus yang salah selama polimerisasi.

Jika nukleotida yang salah tidak mengikat di situs aktif polimerase, penggabungan diperlambat karena arsitektur sub-optimal dari kompleks situs aktif. Jeda waktu ini meningkatkan peluang nukleotida yang salah untuk berdisosiasi sebelum perkembangan polimerase, sehingga memungkinkan proses untuk memulai lagi, dengan nukleosida trifosfat yang benar (1,2).

Jika nukleotida yang dimasukkan salah, proofreading DNA polimerase memiliki garis pertahanan ekstra

Gangguan yang disebabkan oleh basa yang tidak berpasangan terdeteksi, dan polimerase memindahkan ujung 3' dari rantai DNA yang sedang tumbuh ke domain eksonuklease 3'→5' proofreading. Di sana, nukleotida yang salah dihilangkan oleh aktivitas eksonuklease 3'→5', di mana rantai dipindahkan kembali ke domain polimerase, di mana polimerisasi dapat berlanjut.

Dari: biolab New England:

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr


Kedua kalimat tersebut dapat dipahami dari penjelasan di bawah ini.

Dalam untai DNA yang baru disintesis, DNA polimerase membentuk ekstensif ikatan hidrogen dengan basa yang baru ditambahkan setiap kali nukleotida baru ditambahkan. (Kalimat pertama) Polimerase juga membentuk ikatan dengan tulang punggung DNA dari fosfat dan gula. (kalimat kedua)

Kalimat pertama berbicara tentang bagaimana polimerase akan membentuk ikatan melalui alur kecil dari DNA yang baru disintesis. Kalimat kedua berbicara tentang perubahan asam amino dari DNA polimerase (yang penting untuk membentuk ikatan dengan tulang punggung DNA). Perubahan asam amino ini akan menyebabkan kesalahan dalam penambahan nukleotida (karena Polimerase tidak diposisikan dengan benar yang akan Anda pahami dalam penjelasan berikut)

Ikatan polimerase dan basa ini bersama dengan ikatan antara tulang punggung DNA dan polimerase posisi DNA polimerase.

Ketika nukleotida yang baru ditambahkan dipasangkan dengan benar, struktur basa yang dipasangkan akan sedemikian rupa sehingga ikatan yang terbentuk antara polimerase dan basa akan memungkinkan DNA polimerase diposisikan untuk penambahan nukleotida baru berikutnya. Jika nukleotida yang salah ditambahkan, posisi DNA polimerase sedemikian rupa sehingga situs eksonukleasenya berada pada posisi untuk mengkatalisis aktivitas eksonuklease.

Jadi, ikatan hidrogen antara basa dan Polimerase diperlukan untuk penentuan posisi polimerase yang benar untuk memungkinkan nukleotida berikutnya ditambahkan (jika basa yang benar ditambahkan) atau memungkinkan aktivitas eksonuklease Polimerase (jika basa yang salah ditambahkan). Ini akan membantu dalam proofreading dan dengan demikian memberikan kesetiaan yang tinggi.


6 Proses dan Jenis yang Terlibat dalam Replikasi DNA (Dengan Diagram)

Sekarang sudah lebih dari 30 tahun sejak J. D. Watson, F. H. C. Crick, dan M. H. F. Wilkins menetapkan sifat heliks beruntai ganda dari molekul DNA dan menyarankan bagaimana DNA berfungsi dalam replikasinya sendiri.

Menurut model aslinya untuk replikasi DNA, dua rantai polinukleotida dari heliks ganda “induk” terpisah dan masing-masing berfungsi sebagai “templat” untuk sintesis rantai polinukleotida komplementer baru.

Selama pemisahan untai, basa nitrogen dari setiap untai asli terpapar dan membentuk tempat untuk asosiasi nukleotida bebas.

Nukleotida ini kemudian secara enzimatik dihubungkan bersama untuk membentuk untai komplementer baru. Karena asam deoksiadenilat (dAMP) dapat membentuk ikatan hidrogen hanya dengan timin dari untai cetakan (dan dGMP hanya dapat berikatan dengan sitosin, dCMP hanya dengan guanin, dan dTMP hanya dengan adenin), untai yang baru disintesis akan identik dengan untai komplementer asli. .

Akibatnya, dua heliks ganda baru terbentuk, masing-masing terdiri dari satu untai polinukleotida dari heliks ganda induk dan untai polinukleotida yang baru disintesis. Karena masing-masing dari dua heliks ganda hanya menyimpan satu untai polinukleotida induk, prosesnya dikatakan semikonservatif.

Replikasi sebagai Proses “Semikonservatif”:

Meskipun replikasi DNA semikonservatif diprediksi oleh model Watson-Crick asli, itu tidak diverifikasi sampai studi klasik M. S. Meselson dan F. W. Stahl. Pada saat eksperimen mereka, dua mode replikasi lainnya dianggap sama layaknya (Gbr. 21-1):

(1) Replikasi konservatif, di mana kedua untai heliks ganda induk akan dilestarikan dan molekul DNA baru akan terdiri dari dua untai yang baru disintesis dan

(2) Replikasi dispersif, di mana replikasi akan melibatkan fragmentasi heliks ganda induk dan penyelingan potongan-potongan untai induk dengan potongan-potongan yang baru disintesis, sehingga membentuk dua heliks ganda baru.

Meselson dan Stahl memverifikasi sifat semikonservatif replikasi DNA dalam serangkaian percobaan elegan menggunakan DNA berlabel isotop dan bentuk sentrifugasi gradien kepadatan isopik (lihat Bab 12). Mereka membiakkan sel Escherichia coli dalam media di mana nitrogen adalah 15 N (isotop nitrogen 'berat', tetapi bukan radioisotop) daripada yang umum dan lebih ringan 14 N.

Dalam waktu, purin dan pirimidin DNA dalam sel baru mengandung 15 N (di mana 14 N biasanya terjadi) dan dengan demikian molekul DNA lebih padat. DNA dengan atom nitrogen 15 N dapat dibedakan dari DNA yang mengandung 14 N karena selama sentrifugasi isopik, dua DNA yang berbeda pita pada posisi kepadatan yang berbeda dalam tabung sentrifus (Gbr. 21-2).

Meselson dan Stahl disentrifugasi DNA diisolasi dari sel selama 2-3 hari pada kecepatan rotasi yang sangat tinggi dalam tabung centrifuge yang awalnya berisi larutan CsCl yang seragam. Selama sentrifugasi, gradien densitas secara otomatis terbentuk di dalam tabung sebagai akibat dari keseimbangan yang terbentuk antara sedimentasi CsCl ke bagian bawah tabung dan difusi garam ke bagian atas tabung. Bentuk sentrifugasi ini, yang disebut sentrifugasi isopiknik kesetimbangan,

Tergantung pada kandungan 15 N dan 14 N, pita DNA pada posisi tertentu dalam gradien densitas. Karena DNA yang disintesis oleh sel-sel yang ditumbuhkan dalam 15 N akan lebih padat daripada DNA yang mengandung 14 N, DNA itu akan mengikat lebih jauh ke bawah tabung (Gbr. 21-2).

Sel yang ditumbuhkan selama beberapa waktu dengan adanya media 15 N dicuci bebas dari media dan dipindahkan ke media yang mengandung 14 N dan dibiarkan terus tumbuh untuk jangka waktu tertentu (yaitu, untuk berbagai jumlah waktu generasi). DNA yang diisolasi dari sel yang ditumbuhkan selama satu generasi waktu dalam media 14 N memiliki kepadatan menengah dengan DNA dari sel yang tumbuh hanya dalam media yang mengandung 15 N (diidentifikasi sebagai generasi 0 pada Gambar 21-3) dan DNA dari sel yang tumbuh hanya dalam media yang mengandung 14 N (kontrol dari Gambar 21-3).

Hasil seperti itu segera mengesampingkan kemungkinan bahwa replikasi DNA bersifat konservatif, karena replikasi konservatif akan menghasilkan dua pita DNA dalam gradien densitas untuk sel generasi 1 (yaitu, F,). Pita tunggal dengan kepadatan menengah (diidentifikasi sebagai DNA “hibrida” pada Gambar 21-3) terdiri dari molekul DNA di mana satu untai mengandung 15 N dan yang lainnya mengandung 14 N.

Ketika inkubasi dalam medium 14 N dilakukan selama dua generasi waktu (yaitu, generasi 2), dua pita DNA terbentuk—satu pada posisi kepadatan yang sama dengan DNA dari sel yang ditumbuhkan secara eksklusif dalam medium 14 N (yaitu, &# 8220kontrol cahaya”) dan salah satu kepadatan menengah. Generasi berikutnya menghasilkan lebih banyak molekul DNA yang terikat pada posisi “light” (14 N-mengandung DNA) dalam gradien densitas. Hasil ini hanya konsisten dengan model replikasi semikonservatif.

Replikasi dispersif akan menghasilkan pita tunggal untuk setiap generasi dan pita akan ditemukan pada posisi kerapatan yang lebih ringan berturut-turut dalam gradien. Studi menggunakan prokariota lain serta eukariota menunjukkan bahwa replikasi semikonservatif DNA mungkin merupakan mekanisme universal.

Replikasi dengan Penambahan Nukleotida di 5′3′ Arah:

Setiap nukleotida dari untai DNA bergabung dengan nukleotida berikutnya oleh ikatan fosfodiester yang menghubungkan karbon 3′ dari deoksiribosanya dengan karbon 5′ dari deoksiribosa dari nukleotida berikutnya. Pada salah satu ujung rantai polinukleotida, terdapat gugus hidroksil yang terikat pada karbon 3′ dari nukleotida terakhir, dan pada ujung lainnya terdapat gugus fosfat yang terikat pada karbon 5′.

Dua rantai heliks ganda memiliki polaritas yang berlawanan dan dikatakan antiparalel, yaitu, setiap ujung heliks ganda mengandung ujung 5′ dari satu untai dan ujung 3′ dari yang lain. Selama replikasi, perlekatan nukleotida ke untai yang sedang tumbuh selalu terjadi pada posisi terminal 3′ dari untai tersebut. Dengan kata lain, rantai polinukleotida pembentuk “tumbuh” dari ujung 5′ ke ujung 3′.

Replikasi Searah dan Dua Arah:

Replikasi dimulai pada titik pada kromosom di mana dua untai induk mulai memisahkan titik ini disebut titik asal. Penambahan nukleotida komplementer untuk membentuk dua untai baru terjadi di sepanjang kedua templat untai induk mulai dari titik itu (Gbr. 21-4).

Dalam replikasi searah, pertumbuhan berlangsung di sepanjang kedua untaian ke arah yang sama dari asalnya. Sepanjang salah satu untai cetakan induk, sintesis untai komplementer baru berlangsung dengan penambahan nukleotida secara terus menerus ke ujung 3′ yang tersedia dari untai pembentuk. Untai yang tumbuh disebut untai utama atau untai kontinu. Ujung 5′ dari untaian ini terletak di titik asal dan ujung ke-3′ pada garpu replikasi yang bergerak (yaitu, titik lanjut pemisahan untaian induk).

Untai polinukleotida lain yang terbentuk disebut untai tertinggal atau untai terputus. Perpanjangan untai ini terjadi dengan mekanisme yang agak dimodifikasi. Berbeda dengan untai terdepan, untai tertinggal memiliki posisi 3′ di titik asal dan posisi 5′ di garpu replikasi. Jika nukleotida ditambahkan secara berurutan ke ujung untai tertinggal di garpu replikasi, maka pertumbuhan untai ini akan berlanjut ke arah 3’→5′.

Ini tidak terjadi. Sebaliknya, pertumbuhan terjadi dengan sintesis sejumlah rantai polinukleotida pendek antara garpu replikasi dan asal. Setiap rantai pendek diletakkan pada arah 5′ hingga 3′ dan ini kemudian dihubungkan bersama dan ke ujung 5′ dari untai yang tertinggal.

Akibatnya, arah pertumbuhan keseluruhan untai tertinggal sama dengan untai utama. Pola pertumbuhan yang tidak biasa yang menjadi ciri sintesis untai tertinggal menjelaskan mengapa ini juga disebut sebagai untai “discontinuous”.

Dalam replikasi dua arah (Gbr. 21-5), dua garpu replikasi terbentuk di titik asal dan ini bergerak menjauh dari titik asal di kedua arah saat heliks ganda induk dipisahkan. Sintesis untai komplementer juga terjadi di kedua arah. Di belakang setiap garpu ada satu set untaian terkemuka dan tertinggal. Seperti dalam kasus replikasi satu arah, pemanjangan dua untai terdepan adalah kontinu, sedangkan pemanjangan dua untai tertinggal adalah terputus-putus.

Perlu dicatat bahwa terlepas dari apakah replikasi itu satu arah atau dua arah, penambahan nukleotida selalu terjadi dalam arah dari 5′ ke 3′, karena nukleotida baru ditambahkan ke ujung 3′ yang tersedia baik dari untai kontinu atau untai terputus-putus. Sintesis terputus-putus dari untaian lagging pertama kali ditunjukkan oleh R. Okazaki. Okazaki menginkubasi sel E. coli dalam media yang mengandung 3 H-timidin untuk waktu yang sangat singkat (denyut hanya 15 detik) dan kemudian memeriksa distribusi radioisotop dalam DNA yang baru disintesis.

Radioisotop ditemukan dalam sejumlah polinukleotida (panjang 1000-2000 nukleotida), sekarang disebut sebagai fragmen Okazaki (Gbr. 21-4 dan 21-5). Ketika sel-sel berdenyut dipindahkan ke media yang tidak berlabel untuk jangka waktu yang bervariasi sebelum analisis, label radioaktif ditemukan dalam bentangan DNA yang jauh lebih lama. Ini karena fragmen Okazaki yang dihasilkan selama pulsa tritium pendek telah dihubungkan bersama dan terhubung ke ujung 5′ dari untai tertinggal.

Dalam sel eukariotik, fragmen Okazaki biasanya lebih kecil (panjangnya sekitar 100-200 nukleotida). Replikasi dua arah DNA adalah mekanisme yang digunakan di semua sel eukariotik dan sebagian besar sel prokariotik. Replikasi searah jarang terjadi dan tampaknya hanya terjadi pada sejumlah kecil prokariota.

Visualisasi Replikasi pada E. coli:

Pada tahun 1963, J. Cairns mengembangkan prosedur yang menggunakan kombinasi mikroskop dan autoradiografi yang memungkinkan untuk memvisualisasikan replikasi kromosom E. coli. Cairns menempelkan sel E. coli dalam media yang mengandung 3 H-timidin untuk berbagai periode waktu sehingga timidin radioaktif dimasukkan ke dalam DNA saat kromosom direplikasi dalam generasi sel yang berurutan.

Sel dikeluarkan dari media setelah berbagai periode inkubasi dan dengan lembut dilisiskan untuk melepaskan kromosom dari sel (gaya geser yang diciptakan oleh lisis yang keras memecah kromosom menjadi potongan-potongan kecil). Kromosom kemudian dipindahkan ke slide kaca dan dilapisi dengan emulsi fotografi yang sensitif terhadap partikel beta berenergi rendah yang dipancarkan oleh 3H-timidin.

Setelah memaparkan emulsi ke sinar beta, emulsi dikembangkan dan diperiksa dengan mikroskop cahaya. Di mana pun pembusukan timidin berlabel telah terjadi dalam kromosom, emulsi terpapar dan menciptakan butiran yang terlihat.

Sebuah kromosom yang tidak terlibat dalam replikasi muncul sebagai struktur melingkar yang terbentuk dari suksesi yang dekat dari titik-titik paparan. Kromosom “terperangkap dalam tindakan” replikasi memunculkan apa yang disebut struktur theta karena mereka memiliki penampilan huruf Yunani theta (yaitu, 0) (Gbr. 21-6). Struktur theta mengungkapkan posisi garpu replikasi dalam kromosom melingkar.

Replika dan Urutan Replikasi:

Urutan peristiwa yang terjadi selama replikasi DNA paling baik dipahami untuk prokariota dan tampaknya sebagai berikut (Gbr. 21-7). Pemisahan untai induk dimulai di tempat yang disebut asal yang berisi urutan nukleotida khusus dan mengarahkan asosiasi sejumlah protein. Enzim pelepasan yang bergantung pada ATP (juga disebut helikase) mendorong pemisahan dua untai induk dan membentuk garpu replikasi yang secara progresif akan menjauh dari titik asal (Gbr. 21-7a) helikase memisahkan untai induk pada sekitar 1000 pasangan basa per detik.

Di belakang garpu replikasi, untaian DNA tunggal dicegah dari rewinding sekitar satu sama lain (atau membentuk loop jepit rambut untai ganda di setiap untai tunggal) oleh tindakan satu set protein yang disebut protein destabilisasi heliks atau protein pengikat untai tunggal (mis. , “SSB”) (Gbr. 21-7b). Tindakan helikase memperkenalkan superkoil positif ke dalam DNA dupleks di depan garpu replikasi. Enzim yang disebut topoisomerase mengendurkan superkoil dengan menempel pada dupleks superkoil sementara, memotong salah satu untai, dan memutarnya melalui untai yang tidak terputus. Nick kemudian disegel kembali.

Sebelum sintesis DNA dimulai dari asal, polinukleotida RNA pendek terbentuk yang melengkapi cetakan DNA. Peregangan RNA ini disebut primer dan juga diletakkan dalam arah 5′ hingga 3′. Nukleotida DNA kemudian ditambahkan satu per satu ke ujung 3′ bebas dari primer RNA. Karena pertumbuhan untai tertinggal terputus-putus, beberapa primer RNA dan fragmen Okazaki terbentuk. Perhatikan bahwa primer RNA harus dibentuk untuk setiap fragmen Okazaki yang akan diletakkan (Gbr. 21-7c). Enzim yang diperlukan untuk sintesis primer RNA adalah kelas khusus RNA polimerase yang disebut RNA primase.

Pemanjangan untai utama dan sintesis fragmen Okazaki dikatalisis oleh enzim yang disebut DNA polimerase III. Substrat DNA polimerase III adalah deoksinukleosida trifosfat (misalnya, dATP, dGTP, dCTP, dan dTTp). Penambahan nukleotida ke posisi 3′ yang tersedia dari untai utama yang terus tumbuh atau fragmen Okazaki dari untai tertinggal melibatkan penghilangan pirofosfat untuk menghasilkan deoksinukleosida monofosfat (misalnya, dAMP, dGMP, dCMP, dan dTMP).

Pada penyelesaian fragmen Okazaki, primer RNA dipotong oleh DNA polimerase I, yang kemudian mengisi celah yang dihasilkan dengan DNA (Gbr. 21-7d). Setelah DNA polimerase I menambahkan deoksiribonukleotida akhir pada celah yang ditinggalkan oleh primer yang dipotong, enzim DNA ligase membentuk ikatan fosfodiester yang menghubungkan ujung 3′ bebas pengganti primer ke ujung 5′ fragmen Okazaki (Gbr. 21-7f).

Polimerase DNA dan “Prosesivitas”:

Secara umum, tiga enzim DNA polimerase yang berbeda ditemukan dalam sel. Pada prokariota, ini disebut DNA polimerase I, DNA polimerase II, dan DNA polimerase III. Seperti disebutkan di atas, DNA polimerase I mengeluarkan primer RNA dan mengisi celah dengan DNA, sedangkan DNA polimerase III menambahkan nukleotida ke untai utama yang sedang tumbuh dan ke ujung 3′ primer RNA.

Fungsi DNA polimerase II masih belum diketahui. Dalam sel eukariotik, DNA polimerase adalah DNA polimerase a, DNA polimerase II, dan DNA polimerase 7 fungsinya dibandingkan dengan enzim prokariotik pada Tabel 21-1. Kecepatan dan efisiensi dengan mana DNA polimerase memperluas rantai yang sedang tumbuh disebut sebagai prosesivitas. Sebagai contoh, prosesivitas DNA polimerase III yang bekerja pada ujung 3′ dari untai utama sangat tinggi karena enzim tetap berhubungan dengan ujung rantai yang sedang tumbuh dan untai cetakan.

Selama replikasi searah, garpu replikasi sepenuhnya melingkari kromosom dan molekul DNA yang dihasilkan dipisahkan. Untuk prokariota di mana replikasi adalah dua arah, garpu replikasi berjalan di sekitar kromosom sampai mereka bertemu. Dalam kromosom eukariotik, di mana ada banyak unit replikasi atau replika, semua replika dihubungkan bersama sebelum kromatid dapat dipisahkan. Replika terdiri dari segmen kromosom yang mencakup titik asal dan dua titik terminasi (yaitu titik di mana replikasi berakhir).

NK Sinha dan A. Kornberg telah menyarankan bahwa DNA polimerase, RNA primase, dan helicases dapat dikaitkan satu sama lain untuk membentuk kompleks multienzim, replisom yang melakukan sintesis untai terkemuka dan tertinggal secara terkoordinasi (Gbr. 21-8). Kompleks seperti itu akan sangat proses dan menjamin replikasi DNA yang cepat.

Kesetiaan Replikasi Tinggi:

Terlepas dari kerumitan proses dan kecepatan prosesnya, sangat sedikit kesalahan yang dibuat selama replikasi DNA. Misalnya, diperkirakan bahwa untuk setiap kesalahan yang terjadi, 109 pasangan basa direplikasi dengan tepat. Ketepatan replikasi DNA yang tinggi sebagian disebabkan oleh sifat khusus dari polimerase DNA.

DNA polimerase akan menambahkan nukleotida ke ujung 3′-OH yang tersedia dari untai DNA yang sedang tumbuh (atau primer RNA) hanya jika nukleotida sebelumnya berpasangan dengan benar dengan nukleotida templat. Jika ada nukleotida yang tidak cocok, pertumbuhan untai dihentikan sementara sementara segmen untai yang mengandung kesalahan dipotong. Dengan ujung 3′ yang dikoreksi terbentuk kembali, pemanjangan oleh DNA polimerase dilanjutkan.

Masih banyak yang harus dipelajari tentang enzim yang mengkatalisis reaksi replikasi. Sejauh ini, kendala utama untuk studi tersebut adalah kesulitan mengisolasi dan memurnikan enzim, baik secara individu atau dalam kompleks. Hal ini sebagian disebabkan oleh fakta bahwa beberapa di antaranya mungkin terkait dengan membran. Pada sel prokariotik, garpu replikasi terikat pada membran plasma.

Sekitar dua lusin protein berbeda telah terbukti terlibat dengan replikasi DNA dalam sel E. coli. Beberapa protein E. coli terlibat dalam reaksi prepriming, yaitu reaksi yang terjadi sebelum pembentukan primer RNA.


14.1 | Dasar Sejarah Pemahaman Modern

Pada akhir bagian ini, Anda akan dapat:

  • Menjelaskan transformasi DNA.
  • Jelaskan eksperimen kunci yang membantu mengidentifikasi bahwa DNA adalah materi genetik.
  • Nyatakan dan jelaskan aturan Chargaff

Pemahaman modern tentang DNA telah berevolusi dari penemuan asam nukleat hingga pengembangan model heliks ganda. Pada tahun 1860-an, Friedrich Miescher (Gambar 14.2), berprofesi sebagai dokter, adalah orang pertama yang mengisolasi bahan kimia kaya fosfat dari sel darah putih atau leukosit. Dia menamai bahan kimia ini (yang pada akhirnya akan dikenal sebagai RNA dan DNA) nuklein karena mereka diisolasi dari inti sel.

Gambar 14.2 Friedrich Miescher (1844-1895) menemukan asam nukleat.

Setengah abad kemudian, ahli bakteriologi Inggris Frederick Griffith mungkin adalah orang pertama yang menunjukkan bahwa informasi herediter dapat ditransfer dari satu sel ke sel lain “secara horizontal”, bukan melalui keturunan. Pada tahun 1928, ia melaporkan demonstrasi pertama bakteri transformasi, suatu proses di mana DNA eksternal diambil oleh sel, sehingga mengubah morfologi dan fisiologi. Dia bekerja dengan Streptokokus pneumonia, bakteri penyebab pneumonia. Griffith bekerja dengan dua strain, kasar (R) dan halus (S). Strain R bersifat non-patogen (tidak menyebabkan penyakit) dan disebut kasar karena permukaan luarnya berupa dinding sel dan tidak memiliki kapsul akibatnya permukaan sel tampak tidak rata di bawah mikroskop. Strain S bersifat patogen (penyebab penyakit) dan memiliki kapsul di luar dinding selnya. Akibatnya, ia memiliki penampilan yang halus di bawah mikroskop. Griffith menyuntikkan galur R hidup ke tikus dan mereka selamat. Dalam percobaan lain, ketika dia menyuntikkan tikus dengan strain S yang dibunuh dengan panas, mereka juga selamat. Dalam rangkaian percobaan ketiga, campuran galur R hidup dan galur S yang dibunuh dengan panas disuntikkan ke tikus, dan—yang mengejutkannya—tikus itu mati. Setelah mengisolasi bakteri hidup dari tikus mati, hanya bakteri strain S yang ditemukan. Ketika galur S yang diisolasi ini disuntikkan ke tikus segar, tikus mati. Griffith menyimpulkan bahwa sesuatu telah berpindah dari galur S yang dimatikan panas ke galur R hidup dan mengubahnya menjadi galur S patogen, dan dia menyebutnya prinsip transformasi (Angka 11.3). Eksperimen ini sekarang dikenal sebagai eksperimen transformasi Griffith.

Gambar 14.3 Dua galur S.pneumoniae digunakan dalam eksperimen transformasi Griffith. Strain R tidak patogen. Strain S bersifat patogen dan menyebabkan kematian. Ketika Griffith menyuntikkan tikus dengan galur S yang dimatikan panas dan galur R hidup, tikus itu mati. Strain S ditemukan dari tikus mati. Jadi, Griffith menyimpulkan bahwa sesuatu telah berpindah dari galur S yang dimatikan panas ke galur R, mengubah galur R menjadi galur S dalam prosesnya. (kredit “tikus hidup”: modifikasi karya oleh NIH kredit “tikus mati”: modifikasi karya Sarah Marriage)

Ilmuwan Oswald Avery, Colin MacLeod, dan Maclyn McCarty (1944) tertarik untuk mengeksplorasi prinsip transformasi ini lebih lanjut. Mereka mengisolasi galur S dari tikus mati dan mengisolasi protein dan asam nukleat, yaitu RNA dan DNA, karena ini adalah kandidat yang mungkin untuk molekul hereditas. Mereka melakukan studi eliminasi sistematis. Mereka menggunakan enzim yang secara khusus mendegradasi setiap komponen dan kemudian menggunakan setiap campuran secara terpisah untuk mengubah strain R. Mereka menemukan bahwa ketika DNA terdegradasi, campuran yang dihasilkan tidak lagi mampu mengubah bakteri, sedangkan semua kombinasi lainnya mampu mengubah bakteri. Hal ini membuat mereka menyimpulkan bahwa DNA adalah prinsip transformasi.

Eksperimen yang dilakukan oleh Martha Chase dan Alfred Hershey pada tahun 1952 memberikan bukti konfirmasi bahwa DNA adalah materi genetik dan bukan protein. Chase dan Hershey sedang mempelajari bakteriofag, yaitu virus yang menginfeksi bakteri. Virus biasanya memiliki struktur sederhana: mantel protein, yang disebut kapsid, dan inti asam nukleat yang berisi materi genetik, baik DNA atau RNA. Bakteriofag menginfeksi sel bakteri inang dengan menempel pada permukaannya, dan kemudian menyuntikkan asam nukleatnya ke dalam sel. DNA fag membuat banyak salinan dari dirinya sendiri menggunakan mesin inang, dan akhirnya sel inang meledak, melepaskan sejumlah besar bakteriofag. Hershey dan Chase memberi label satu batch fag dengan sulfur radioaktif, 35 S, untuk memberi label pada lapisan protein. Kumpulan fag lainnya diberi label dengan fosfor radioaktif, 32 P. Karena fosfor ditemukan dalam DNA, tetapi bukan protein, DNA dan bukan proteinnya akan ditandai dengan fosfor radioaktif.

Setiap batch fag diizinkan untuk menginfeksi sel secara terpisah. Setelah infeksi, suspensi bakteri fag dimasukkan ke dalam blender yang menyebabkan selubung fag terlepas dari sel inang. Fag dan suspensi bakteri dipintal dalam centrifuge. Sel bakteri yang lebih berat mengendap dan membentuk pelet, sedangkan partikel fag yang lebih ringan tetap berada di supernatan (cairan di atas pelet). Dalam tabung yang berisi fag berlabel 35 S, supernatan berisi fag berlabel radioaktif, sedangkan tidak ada radioaktivitas yang terdeteksi dalam pelet. Pada tabung yang berisi fag berlabel 32 P, terdeteksi radioaktivitas pada pelet yang berisi sel bakteri lebih berat, dan tidak terdeteksi radioaktivitas pada supernatan. Hershey dan Chase menyimpulkan bahwa DNA fag yang disuntikkan ke dalam sel dan membawa informasi untuk menghasilkan lebih banyak partikel fag, sehingga memberikan bukti bahwa DNA adalah materi genetik dan bukan protein (Angka 14.4).

Gambar 14.4 Dalam percobaan Hershey dan Chase, bakteri terinfeksi dengan radiolabel fag dengan 35S, yang memberi label protein, atau 32P, yang memberi label DNA. Hanya 32P yang masuk ke dalam sel bakteri, menunjukkan bahwa DNA adalah materi genetik.

Sekitar waktu yang sama, ahli biokimia Austria Erwin Chargaff memeriksa kandungan DNA pada spesies yang berbeda dan menemukan bahwa jumlah adenin, timin, guanin, dan sitosin tidak ditemukan dalam jumlah yang sama, dan bervariasi dari satu spesies ke spesies lainnya, tetapi tidak antara satu spesies dengan spesies lainnya. individu dari spesies yang sama. Dia menemukan bahwa jumlah adenin sama dengan jumlah timin, dan jumlah sitosin sama dengan jumlah guanin, atau A = T dan G = C. Ini juga dikenal sebagai aturan Chargaff. Temuan ini terbukti sangat berguna ketika Watson dan Crick bersiap-siap untuk mengusulkan model heliks ganda DNA mereka, yang dibahas dalam Bab 5.


Keterarahan

Untaian ini memiliki dua ujung yang ditunjuk yang disebut 5&rsquo dan 3&rsquo (Anda dapat membacanya sebagai 5 ujung prima dan 3 ujung prima). Angka-angka ini menunjukkan orientasi kimia ujung ke ujung. Angka 5 dan 3 masing-masing mewakili atom karbon kelima dan ketiga dari cincin gula. 5 adalah ujung, yang bergabung dengan gugus fosfat yang menempel pada nukleotida lain. Ujung ke-3 penting karena selama replikasi nukleotida baru ditambahkan ke ujung ini.

Dalam hal arah, jika satu untai adalah 5&rsquo hingga 3&rsquo saat membaca dari kiri ke kanan, untaian lainnya akan menjadi 3&rsquo hingga 5&rsquo. Sederhananya, untaian berjalan ke arah yang berlawanan. This orientation is kept for easy binding between nucleotides of the opposite strands.

The chemical structure of a four base pair fragment of a DNA double helix. (Photo Credit : Thomas Shafee / Wikimedia Commons)


How does high-fidelity of DNA replication depend on the formation of hydrogen bonds? - Biologi

We have characterized the role of Watson-Crick hydrogen bonding in the 3′-terminal base pair on the 3′-5′ exonuclease activity of the human mitochondrial DNA polymerase. Nonpolar nucleoside analogs of thymidine (dF) and deoxyadenosine (dQ) were used to eliminate hydrogen bonds while maintaining base pair size and shape. Exonuclease reactions were examined using pre-steady state kinetic methods. The time dependence of removal of natural nucleotides from the primer terminus paired opposite the nonpolar analogs dF and dQ were best fit to a double exponential function. The double exponential kinetics as well as the rates of excision (3–6 s –1 fast phase, 0.16–0.3 s –1 slow phase) are comparable with those observed during mismatch removal of natural nucleotides even when the analog was involved in a sterically correct base pair. Additionally, incorporation of the next correct base beyond a nonpolar analog was slow (0.04–0.22 s –1 ), so that more than 95% of terminal base pairs were removed rather than extended. The polymerase responds to all 3′-terminal base pairs containing a nonpolar analog as if it were a mismatch regardless of the identity of the paired base, and kinetic partitioning between polymerase and exonuclease sites failed to discriminate between correct and incorrect base pairs. Thus, sterics alone are insufficient, whereas hydrogen bond formation is essential for proper proofreading selectivity by the mitochondrial polymerase. The enzyme may use the alignment and prevention of fraying provided by proper hydrogen bonding and minor groove hydrogen bonding interactions as critical criteria for correct base pair recognition.


Hydrogen bonding revisited: Geometric selection as a principal determinant of DNA replication𠂟idelity

That hydrogen bonds play a central role in forming Watson𠄼rick (W𠄼) A⋅T and G𢱜 base pairs is a fundamental paradigm dating from the discovery of the structure of DNA in 1953. In addition to interstrand H bonding, intrastrand base-stacking and interstrand cross-stacking interactions are important in maintaining the bases in a stacked structure along the length of the DNA backbone. In general, H bonds between W𠄼 base pairs are viewed as “informational,” whereas the base-stacking interactions are regarded as “noninformational,” merely stabilizing the double helix. Consequently, it is a common perception that the H bonds pairing A with T and G with C are primarily responsible for the ability of DNA polymerases to synthesize DNA with high fidelity.

Difluorotoluene, a nonpolar isosteric analog of thymine (T), contains fluorine atoms in place of oxygens on the pyrimidine ring and thus cannot form H bonds with A (1). Nevertheless, A𢱟 base pairs are formed almost as well as A⋅T pairs by Escherichia coli proofreading-defective DNA polymerase I (KF exo − ), as Moran dkk. (2) report in this issue of the Proceedings [the chemical structures of F and T and space-filling models of each are shown in Moran dkk. (2), figure 1]. The observation that KF exo − fails to discriminate strongly against A𢱟 pairs applies when F is present either as a template base on DNA (3) or as a dFTP substrate (2). The apparently inescapable conclusion is that H bonds are not absolutely required for polymerase to form W𠄼 base pairs selectively.

These results provide an impetus to reconsider what role H bonds actually play in stabilizing DNA and enhancing DNA polymerase fidelity. Mismatched base pairs in a duplex DNA oligomer do cause marked reductions in DNA melting temperatures (4). The loss of H bonds upon replacement of T with F has this type of destabilizing effect (2). However, the notion that H bonds alone keep the two strands of a DNA double helix together, which is found in many textbooks, seems inadequate. When one considers that duplex alternating copolymers poly d(A,T) or poly d(G,C) have melting temperatures in aqueous solution that differ substantially from their respective homopolymer counterparts poly dA⋅poly dT or poly dG⋅poly dC, it becomes clear that base-stacking interactions have an important, perhaps dominant, sequence-dependent effect on duplex stability.

Furthermore, the free-energy differences (ΔΔG 0 ) between matched and mismatched base pairs deduced from melting data are in a range of about 0.2𠄴.0 kcal/mol (4𠄶), depending on the identity of the mispair, the surrounding sequence context, and its location near the center or at the DNA terminus. These ΔΔG 0 values, as measured in solution, are insufficient to account for the high nucleotide insertion fidelities of virtually all polymerases, including those that seem to be especially 𠇎rror prone” such as eukaryotic Pol β (7) or HIV-1 reverse transcriptase (8�). For example, ΔΔG 0 𢒃.7 kcal/mol measured for the natural base pairs A⋅T versus A𢱜 (6) should result in an A𢱜 misinsertion frequency of about 2 × 10 𢄣 . However, dAMP𢱜 and dCMP𢱚 misinsertion frequencies are typically about one to two orders of magnitude lower than that (11).

The recognition that base-pairing free-energy differences are too small to completely account for polymerase insertion selectivities prompted H. Echols and me to propose a “geometric selection” mechanism as a key component of insertion specificity (12, 13). The idea is that geometrical and electrostatic properties of the polymerase active site are likely to have a profound influence on nucleotide-insertion specificities. This influence would strongly favor insertion of bases having an optimal geometry, such that the C1′ distances and bond angles most closely approximate those of the Watson𠄼rick base pairs. For example, G⋅T, G𢱚, and C𢱚 mispairs have markedly different bond angles than A⋅T and G𢱜 pairs (Fig. ​ (Fig.1) 1 ) (14).

Geometric properties of Watson𠄼rick and mismatched base pairs. This figure is based on x-ray crystallography of duplex B-DNA oligonucleotides. The striking geometric identity of the Watson𠄼rick A⋅T and G𢱜 base pairs is not matched by the A𢱜 protonated wobble and G⋅T wobble base mispairs or by the G(anti)𢱚(sin) base mispair. [Reproduced with permission from ref. 14 (copyright 1987, Springer, Heidelberg).]

The observation by Moran dkk. (2) that insertion of the base analog F opposite A is reduced by only 40-fold compared with its isosteric parent compound T opposite A suggests that the geometrical alignment of the substrate and template bases is a major determinant of polymerase fidelity. This result can be compared with earlier studies using the base analog 2-aminopurine (2AP), which forms 2AP⋅T base pairs with two H bonds in a proper W𠄼 geometry and is reduced by 7-fold compared with A⋅T (15, 16). Thus, the absence of H bonds in the incorporation of F opposite A decreases selectivity only about 6-fold relative to incorporation of 2AP opposite T. Considering that mispairs assuming non-W𠄼 geometries such as G⋅T (wobble), A𢱜 (protonated wobble), G𢱚 (antisin) (Fig. ​ (Fig.1) 1 ) are misinserted with frequencies on the order of 10 𢄣 � 𢄦 (11), geometric constraints imposed at the polymerase active site may improve selectivities by perhaps three orders of magnitude or more.

There are at least three possible check points for proper geometric alignment during base insertion by polymerases: initial dNTP binding (16, 17), postbinding selection for the correct geometry (12, 18) by an induced-fit mechanism (19�), and the chemical step of phosphodiester formation. Previous data suggest there are significant differences in the extent to which different polymerases use each of the check points. We have suggested that the remarkable base-insertion fidelity of DNA polymerases derives from the sequential application of each check point to provide exquisite sensitivity to Watson𠄼rick geometry at the transition state for phosphodiester formation (13).

Taking the geometrical constraints imposed by the polymerase active site into consideration in conjunction with the active site electrostatic environment, it may be possible to relate the polymerase-insertion selectivity to solution free-energy differences between matched and mismatched base pairs. Measurements of ΔG 0 = ΔH 0 − TΔS 0 indicate relatively small differences between right and wrong base pairs at 37ଌ ΔΔG 0 is in a range of 0.2𠄴 kcal/mol, as mentioned above. The differences are small because ΔS 0 correlates with ΔH 0 (5, 22), a phenomenon called enthalpy𠄾ntropy compensation, which is observed in aqueous solution (23). That is, it takes more energy to melt highly stable, rigidly constrained base pairs than it does to melt less stable, weakly constrained base pairs. However, rigid base pairs having fewer degrees of freedom in the double helix will gain more degrees of freedom upon melting, whereas the opposite is true for less stable base pairs. As long as entropy and enthalpy changes are proportional, ΔΔH 0 is reduced by TΔΔS 0 , resulting in a small ΔΔG 0 (5).

How might polymerases increase free-energy differences to achieve high discrimination? Perhaps the geometric constraints imposed on the substrate and template bases in the polymerase active cleft can suppress ΔΔS enough to bring ΔΔG much closer in magnitude to ΔΔH. Typical values of ΔΔH 0 measured in aqueous solution are, by themselves, almost large enough to accommodate polymerase-insertion fidelities (5). Then, to the extent that dNTP and template bases confront each other in a lower dielectric medium that acts to partially exclude water, ΔΔH values may be even larger than in water (24). Thus, a polymerase active site that snugly accommodates correct base pairs by geometric selection and also reduces water in the vicinity of the base pair may amplify base pair free-energy differences by reducing entropy differences and increasing enthalpy differences by amounts sufficient to account for nucleotide-insertion fidelity.

In addition to discrimination during nucleotide insertion, fidelity in DNA replication is often enhanced by an associated exonuclease activity. Proofreading exonucleases increase fidelity by approximately 40- to 200-fold (25), displaying significantly less selectivity than polymerases. It is generally believed that exonuclease relies on the “melting capacity” of the 3′ terminus to distinguish between correct and incorrect insertions (26, 27). It is reasoned that polymerization and proofreading are competing reactions at a primer-3′ terminus, requiring an annealed or melted terminus, respectively (16, 17). Discrimination arises because the 3′ terminus is more likely to be annealed following correct insertions, favoring polymerization, but much more likely to be melted out following incorrect insertions, favoring excision (16, 28). It is tempting to ask if a geometric selection mechanism might be occurring in the exonuclease active site, enhancing the excision of non-Watson𠄼rick base pairs beyond what would be expected based solely on the relative stabilities of base pairs in solution.

Qualitatively, differences in base pair stabilities appear to be sufficient. Evidence comes from presteady state kinetics measurements on the excision of 2AP paired opposite T, C, A, and G using bacteriophage T4 DNA polymerase (29). The rate of excision of 2AP from a primer-3′ terminus is inversely correlated with the melting temperature of 2AP⋅N base pairs imbedded in an oligomer DNA duplex. For example, when present in the same sequence context, a “stable” 2AP⋅T Watson𠄼rick base pair is hydrolyzed much more slowly than an unstable 2AP𢱜 wobble mispair. However, a terminal 2AP⋅T in a A-T rich environment is hydrolyzed more rapidly than 2AP𢱜 in a G-C rich environment. Thus, exonuclease specificity appears to be more strongly tied to DNA stability than to terminal base pair geometry.

Nevertheless, it would be of great interest to use proofreading-proficient polymerases to measure the excision of difluorotoluene. Based on thermal denaturation measurements, Moran et al. (2) demonstrate that F pairs poorly with all of the natural bases. Significantly, the magnitude of the free energy difference between F𢱚 and T𢱚 base pairs is 3.6 kcal/mol, similar to that found for C𢱚 versus T𢱚 base pairs (6). If proofreading activities are governed primarily by primer stability and not geometric selection, then one would expect F to be excised much more rapidly than T opposite A, and, furthermore, the rate of excision of F might be the same whatever natural bases with which it paired.

The surface has barely been scratched in terms of understanding the interactions between polymerases and DNA that determine replication fidelity. The magnitude and location of mutations depend on a complex interplay between polymerases, proofreading exonucleases, processivity factors and the properties of the DNA primer-template sequences. Although models have been proposed to include polymerase steady-state kinetic parameters along with base stacking and sequence context to explain fidelity (11), precise molecular mechanisms governing mutagenic hot and cold spots remain obscure. Different polymerases copying the same primer-template DNA can exhibit markedly different mutation frequencies and spectra. The ability to separate the effects of H bonding from base stacking holds the promise of new progress in these directions. The future use of the difluorotoluene T analog along with an anticipated group of other non-H bonding base analogs should enable a precise determination of the effects of nearest-neighbor base stacking on misinsertion frequencies and proofreading efficiencies, and shed light on how different polymerase and exonuclease active sites sense the presence of nearby primer and template bases.

I acknowledge the fundamental contribution of Hatch Echols in recognizing the importance of geometric selection in the determination of polymerase fidelity, and I thank D. Kuchnir Fygenson, John Petruska, Ken Breslauer, and Sharon Wald Krauss for their insightful, intellectual contributions and generous advice. This work was supported by the National Institutes of Health (GM21422) and by the Hedco Molecular Biology Laboratory at the University of Southern California.


B. DNA Polymerases Catalyze Replication

The first of these enzymes was discovered in E. coli by Arthur Kornberg, for which he received the 1959 Nobel Prize in Chemistry. Thomas Kornberg, one of Arthur&rsquos sons later found two more of DNA polymerases! All DNA polymerases require a template strand against which to synthesize a new complementary strand. They all grow new DNA by adding to the 3&rsquo end of the growing DNA chain in successive condensation reactions. And finally, all DNA polymerases also have the odd property that they can only add to a pre-existing strand of nucleic acid, raising the question of where the &lsquopreexisting&rsquo strand comes from! DNA polymerases catalyze the formation of a phosphodiester linkage between the end of a growing strand and the incoming nucleotide complementary to the template strand. The energy for the formation of the phosphodiester linkage comes in part from the hydrolysis of two phosphates (pyrophosphate) from the incoming nucleotide during the reaction. While replication requires the participation of many nuclear proteins in both prokaryotes and eukaryotes, DNA polymerases perform the basic steps of replication, as shown in the illustration below.

Although DNA polymerases replicate DNA with high fidelity with as few as one error per 107 nucleotides, mistakes do occur. The proofreading ability of some DNA polymerases corrects many of these mistakes. The polymerase can sense a mismatched base pair, slow down and then catalyze repeated hydrolyses of nucleotides until it reaches the mismatched base pair. This basic proofreading by DNA polymerase is shown below.

After mismatch repair, DNA polymerase resumes forward movement. Of course, not all mistakes are caught by this or other repair mechanisms (see DNA Repair, below). Mutations in the eukaryotic germ line cells that elude correction can cause genetic diseases. However, most are the mutations that fuel evolution. Without mutations in germ line cells (egg and sperm), there would be no mutations and no evolution, and without evolution, life itself would have reached a quick dead end! Other replication mistakes can generate mutations somatic cells. If these somatic mutations escape correction, they can have serious consequences, including the generation of tumors and cancers.


Opsi akses

Dapatkan akses jurnal penuh selama 1 tahun

Semua harga adalah harga NETT.
PPN akan ditambahkan kemudian di checkout.
Perhitungan pajak akan diselesaikan saat checkout.

Dapatkan akses artikel terbatas atau penuh waktu di ReadCube.

Semua harga adalah harga NETT.


The diagram must show four nucleotides shown with two on each side showing phosphate-sugar backbones and nitrogen base pairs bonded between them.

Award [1] for each of the following clearly drawn and correctly labelled.
phosphate – shown connected to deoxyribose
deoxyribose – shown connected to phosphate
(nitrogenous) bases – shown bonded to deoxyribose
base pairs – shown with labels adenine/A bonded to thymine/T and cytosine/C bonded to guanine/G
hydrogen bonds – shown connecting bases
covalent bonds – shown connecting deoxyribose to phosphates
nucleotide – clearly identified by the candidate
Award [4 max] if diagram is not shown double stranded.

DNA samples are taken from crime scene, suspects and victims
polymerase chain reaction/PCR used to increase the amount of DNA
restriction enzymes used to cut DNA
electrophoresis involves electric field/placing sample between electrodes
used to separate DNA fragments according to size
creating DNA profiles/unique patterns of bands
comparison is made between the patterns
criminals/victims can be identified in this way
DNA is (quite) stable / DNA can be processed long after the crime

DNA codes for a specific sequence of amino acids/polypeptide
the DNA code for one polypeptide is a gene
DNA is transcribed into mRNA
mRNA moves to a ribosome
where mRNA is translated into a polypeptide
originally it was thought that one gene always codes for one polypeptide
some genes do not code for a polypeptide
some genes code for transfer RNA/tRNA/ribosomal RNA/rRNA
some sections of DNA code for regulators that are not polypeptides
antibody production does not follow this pattern (of simple transcription-translation) (allow other examples)
change in the gene/mutation will affect the primary structure of the polypeptide


Lesson Explainer: DNA Replication Biologi

In this explainer, we will learn how to describe the process of semiconservative DNA replication, including the role of different enzymes, and recall how errors made during DNA replication can be corrected.

One of the key characteristics of any living organism is its ability to grow and reproduce. Both of these processes, at the cellular level, involve simple cell division, or the splitting of one cell into two. We know that every living cell carries genetic material in the form of DNA (deoxyribonucleic acid). The genetic material controls every characteristic of a living cell, from its size and appearance to the functions it performs.

When one cell divides into two, therefore, each new cell must contain a copy of the DNA in its nucleus for it to be able to function properly. For example, when a liver cell divides into two new liver cells, each new cell must receive a copy of the original cell’s DNA, so that it can perform its role to support the natural functions of the liver.

Key Term: Deoxyribonucleic acid (DNA)

DNA is the molecule that carries the genetic instructions for life. It is composed of two strands of deoxynucleotides that coil around each other to form a double helix.

DNA replication is the process by which a dividing cell generates a copy of its DNA. As we know, in eukaryotes, a molecule of DNA resides in the nucleus and is made of two individual strands that coil around one another to form a “twisted ladder” shape called the double helix as we can see in Figure 1. The process of DNA replication takes place in the nucleus of the cell and is controlled by a set of enzymes, each of which performs a specific function. In this explainer, we will learn how DNA replication takes place and understand the roles played by each of the enzymes involved.

Key Term: Double Helix

A double helix is a “twisted ladder” shape, specifically the shape of a molecule of DNA.

Key Term: DNA Replication

DNA replication is the process by which two identical DNA molecules are produced from a single original DNA molecule.

Before we begin learning about DNA replication, let’s quickly go over the basic structure of a DNA molecule.

As we mentioned earlier, a molecule of DNA contains two strands coiled around one another. These two strands are called polynucleotide chains, and they are made of repeating smaller units called nucleotides. As we can see in Figure 1, each nucleotide has three components: a pentose sugar, a phosphate group, and a nitrogenous base. Each nucleotide links to the next through covalent bonds called phosphodiester bonds.

Key Term: Nucleotide

A nucleotide is a monomer of a nucleic acid polymer. Nucleotides consist of a pentose sugar, a phosphate group, and a nitrogenous base.

The two polynucleotide chains connect to one another through the pairing of the nitrogenous bases facing each other on the inside of the ladder. In DNA, there are four different types of nitrogenous bases: adenine (A), guanine (G), thymine (T), and cytosine (C).

When the nitrogenous bases on one strand pair with the nitrogenous bases on the opposite strand, they follow certain base-pairing rules. In a molecule of DNA, adenine can only bind to thymine on the opposite strand, and guanine can only bind to cytosine. This rule is called “complementary base-pairing” and is one of the defining features of DNA. Adenine binds to thymine through two hydrogen bonds, while guanine binds to cytosine through three hydrogen bonds, as shown in Figure 2.

Key Term: Complementary Base-Pairing

DNA bases can pair according to specific rules, where adenine (A) binds to thymine (T), while guanine (G) binds to cytosine (C). In RNA, uracil (U) is substituted for thymine (T). These rules of complementary base-pairing are critical for DNA replication and transcription.

Another important feature of DNA is its antiparallel nature. Each DNA strand has two ends: one end is called the

end, and the other end is called the

akhir. These two ends are named for the last carbon atoms of the nucleotide at each end. The two strands are antiparallel as one strand runs in the

direction, while the other runs in the

direction, as shown in Figure 3.

carbon atom of every nucleotide is bonded to a hydroxyl group (

end of a strand of DNA, therefore, ends with a hydroxyl group, as you can see in Figure 3. The

carbon atom of every nucleotide is bonded to a phosphate group. NS

end of a strand of DNA, therefore, ends with a phosphate group, represented by the yellow circles in Figure 3.

A molecule of DNA carries genetic information in the form of a genetic code, formed by the sequence of nitrogenous bases. A type of RNA called messenger RNA or mRNA is synthesized according to the sequence of DNA. This sequence encodes the information needed for the synthesis of proteins, which then go on to control the cell’s functions and characteristics.

Key Term: Genetic Code

The genetic code is formed by the sequence of nitrogenous bases in a strand of messenger RNA (mRNA) molecule that is synthesized from the DNA and codes for the information needed for a cell to synthesize specific proteins.

So how is this genetic code read? When we read English, we always read from left to right. Similarly, when a cell “reads” the sequence of nitrogenous bases to interpret the genetic code, it is read from the

end of the DNA strand to the

In 1953, when James Watson and Francis Crick proposed the double helix model of DNA that we are familiar with today, they also made an interesting observation about DNA replication. Their model was based on the base pair specificity of the two strands in a DNA molecule. They realized that the two strands carry complementary versions of the same sequence. Because of this feature, both strands of DNA in a molecule could potentially be used as templates to synthesize complementary strands creating two new double helices with the same information! The sequence of nitrogenous bases on each strand is used as a guide for the sequence of new, complementary bases required to make up the new strand.

In eukaryotes, which are organisms with a well-organized nucleus, the DNA within the nucleus is present in the form of highly coiled, linear structures called chromosomes. Each chromosome contains one molecule of DNA, and within each molecule, replication begins at several different points.

In prokaryotes, on the other hand, the genetic material is present in the form of a single, circular molecule of DNA in the central area of the cell but is not surrounded by a nuclear membrane. In this case, replication begins at one point, called the origin of replication.

Now that we have had a quick recap of the structure of a molecule of DNA, let’s take a look at the mechanism of DNA replication. This process is controlled by three main enzymes. Let’s walk through the steps of this process and learn about each of the enzymes as we go along.

In order for the two strands of a DNA molecule to be used to make two new DNA molecules in the nucleus, the two strands must unwind and separate, making their nitrogenous bases accessible. We know that the strands are held together by hydrogen bonds between the nitrogenous bases of the two strands. In order for the strands to separate, these hydrogen bonds must be broken. This is accomplished by an enzyme called DNA helicase.

Key Term: DNA Helicase

DNA helicase is the enzyme responsible for separating or unwinding two complementary strands of DNA by breaking the hydrogen bonds between them, creating the replication fork in preparation for DNA replication.

Figure 4 shows how the strands of DNA separate through the action of DNA helicase. As the hydrogen bonds between the two strands are broken, a “replication fork” is formed, which is so named because the two unwinding strands of DNA have a forked appearance. The replication fork is the point at which the DNA molecule unwinds into two separate strands. You can picture the DNA helicase enzyme “unzipping” the molecule of DNA, beginning at the replication fork.

Key Term: Replication Fork

The replication fork is formed by the two separated or unwound strands of DNA in preparation for DNA replication.

Example 1: Understanding the Role of DNA Helicase

In the process of DNA replication, what is the primary role of DNA helicase?

  1. DNA helicase detects and repairs any errors that are made by incorrect base-pairing during DNA replication.
  2. DNA helicase breaks the hydrogen bonds between base pairs, separating the two strands of DNA.
  3. DNA helicase forms phosphodiester bonds between nucleotides to form a strand of DNA.
  4. DNA helicase adds nucleotides to a growing DNA chain, synthesizing a strand of DNA complementary to the template strand.
  5. DNA helicase joins the gaps in the backbone between newly formed DNA fragments.

Menjawab

When a cell undergoes division, its DNA replicates itself, so as to provide each new cell with a copy of DNA, which can control the cell’s characteristics and functions. We know that a single molecule of DNA is composed of two complementary polynucleotide strands. Each of these strands is made up of multiple individual units called nucleotides that form a sequence of nitrogenous bases. The order or sequence of nitrogenous bases along a strand of DNA encodes the “genetic information” that needs to be replicated when a cell divides.

When two strands of DNA bind together to form the familiar double helix shape, they do so by pairing their nitrogenous bases according to the rules of complementary base-pairing, in which adenine binds to thymine through two hydrogen bonds and guanine binds to cytosine through three hydrogen bonds.

The sequence of nitrogenous bases on each strand of DNA in the double helix acts as a template for the formation of a new strand of DNA. In order for this to happen, the two strands of DNA must unwind and separate, so that their nitrogenous bases are accessible. This function is carried out by the enzyme DNA helicase. DNA helicase breaks the hydrogen bonds between the nitrogenous bases on each strand, “unzipping” the DNA and separating the two strands.

Now that we have this information, let’s take a look through the options in the question. The one that best fits what we have learned is “DNA helicase breaks the hydrogen bonds between base pairs, separating the two strands of DNA,” and therefore, this is the correct option.

Once the strands have unwound, new strands of DNA that are complementary to each of the original strands can be synthesized. This is where an enzyme called DNA polymerase comes into play. The word “polymerase” is used to describe an enzyme that binds individual small units (nucleotides, in the case of DNA) together to form a long, repeating chain or polymer (a DNA strand). As we have learned, a molecule of DNA is a polymer made of multiple individual units called nucleotides.

Key Term: DNA Polymerase

DNA polymerase is an enzyme that adds nucleotides complementary to the template strand to synthesize a new strand. This enzyme plays an essential role in DNA replication.

DNA polymerase generates a new strand of DNA along each original strand by adding nucleotides to the new strand, ensuring that the rules of complementary base-pairing, which we learned about earlier, are followed. To build the new strand of DNA, the DNA polymerase uses a pool of free-floating nucleotides that remain available in the cell. Figure 5 represents a simple diagram of the action of DNA polymerase.

The DNA polymerase enzyme is a highly efficient one it synthesizes complementary strands very rapidly and with a high level of accuracy. Another important feature of this enzyme is that it can only synthesize a new strand of DNA in the

arah. This feature poses a problem in a dividing cell. You might be wondering how! Well, let’s take a look at a replication fork in a strand of DNA. As we know, the two strands of DNA run antiparallel to one another. As you can see in Figure 6, the strand at the top of the image has a

open end at the fork, while the strand at the bottom has a

As new strands of DNA are synthesized, they must also run antiparallel to their complementary original strand. Although the two new strands are synthesized simultaneously, let’s first consider the formation of a new strand along the strand at the top of the figure, bearing in mind the fact that DNA polymerase can only synthesize a new strand in the

arah. In this case, a new strand is able to form continuously, without any interruptions or breaks.

Let’s now consider the strand at the bottom. As the DNA molecule unwinds, DNA polymerase encounters the

end of this strand. This would require a new complementary strand to be synthesized in the

direction, which DNA polymerase cannot do!

The DNA polymerase works around this problem by moving further along the strand, as shown in the figure, and synthesizing a short fragment of new DNA in the

direction, toward the open end of the replication fork. It then moves further along, behind this fragment, and does the same, synthesizing another short fragment. As the enzyme progresses along the strand, a discontinuous complementary strand begins to take shape. In Figure 8, you can see how this happens.

These fragments are called Okazaki fragments. If you now take a look at the molecule of DNA, you can see that along one template strand, a new strand is formed continuously, in the same direction as the opening fork, with no breaks. This template strand is therefore called the “leading strand.” The opposite template strand is called the “lagging strand,” since the new strand of DNA is synthesized discontinuously in fragments.

Key Term: Leading Strand

In DNA replication, the leading strand is the strand of DNA along which the new strand is synthesized continuously, in the same direction as the fork.

Key Term: Lagging Strand

In DNA replication, the lagging strand is the strand of DNA along which the new strand is synthesized discontinuously, in fragments.

Key Term: Okazaki Fragments

Okazaki fragments are the short fragments of DNA that are synthesized discontinuously along the lagging strand during DNA replication.

Another enzyme, DNA ligase, is responsible for joining these fragments together along the lagging strand. As you can see in Figure 9, DNA ligase moves along the fragmented strand, joining or “ligating” the fragments together by forming new phosphodiester bonds between one fragment and the next.

Key Term: DNA Ligase

DNA ligase is an enzyme that can join the gaps between the sugar–phosphate backbone of DNA by forming a phosphodiester bond.

Example 2: Understanding the Role of DNA Ligase

In semiconservative DNA replication, what is the primary role of DNA ligase?

  1. DNA ligase adds nucleotides to a growing DNA chain to synthesize a strand of DNA complementary to the template strand.
  2. DNA ligase joins the backbones of fragments formed on a complementary strand during replication.
  3. DNA ligase catalyzes the breaking of phosphodiester bonds in the sugar–phosphate backbone, so the DNA can be split into fragments that are ready for replication.
  4. DNA ligase breaks the hydrogen bonds between base pairs, separating the two strands of DNA that are ready for replication.
  5. DNA ligase joins RNA primers to the

Menjawab

When a molecule of DNA replicates, it unwinds so as to separate the two individual strands. Along each of these strands, a new strand of DNA is synthesized by the enzyme DNA polymerase, following the rules of complementary base-pairing.

We know that each strand of DNA has a

end and that the two strands of DNA in a DNA molecule must always run antiparallel, or in opposite directions, to one another. When synthesizing a new strand of DNA, DNA polymerase is only capable of adding nucleotides in the

Because of this feature of DNA polymerase, the two DNA strands in the molecule are replicated using two different methods. Along the “leading strand,” whose

end is at the opening of the replication fork, DNA polymerase can synthesize a continuous, unbroken complementary DNA strand. Along the “lagging strand,” whose

end is at the opening of the replication fork, DNA polymerase must instead synthesize short fragments of DNA in the

direction, as shown in the figure.

The fragments formed along the lagging strand are called Okazaki fragments. In order for the fragments to be functional, they must be joined together to form one long, continuous strand of newly synthesized DNA. This function is accomplished by DNA ligase that joins the sugar–phosphate backbones of adjacent fragments through phosphodiester bonds.

Let’s now take a look at the options provided in the question. The sentence that best fits the information we now have about DNA ligase is “DNA ligase joins the backbones of fragments formed on a complementary strand during replication.” This is therefore the right answer.

We have now been over the roles of the three important enzymes involved in DNA replication and have understood the mechanism of this process. Figure 10 shows a simple overview of how the whole process takes place and what the result of this process will be.

Let’s take a close look at each of the new DNA molecules on the right side of Figure 10. You may notice that each new DNA molecule contains one original strand and one newly synthesized strand. Because of this feature, the process of DNA replication is called “semiconservative replication”: the older strands of DNA are conserved as the molecule of DNA replicates.

Key Term: Semiconservative Replication

Semiconservative replication describes the mechanism of DNA replication in all living cells, in which each new DNA molecule is composed of one original strand of DNA and one newly synthesized strand of DNA.

Earlier on in this explainer, we talked about the genetic code formed by the sequence of nitrogenous bases along a strand of mRNA, which is synthesized from DNA. When a cell “reads” the sequence, it can interpret this information to produce specific proteins, which then go on to control the characteristics of the organism. Sections of DNA that contain a sequence of bases that code for a specific protein are called genes, which is a word you might have heard before.

Although the process of DNA replication is accurate and highly efficient, it is not completely error free. What would happen if, during DNA replication, the DNA polymerase were to make an error in adding a new nucleotide to the new strand? At one point, instead of adding a complementary nucleotide according to rules of base-pairing, what if a different nitrogenous base were accidentally added? Can you think about what this would mean?

On the newly synthesized DNA strand, this specific point in the strand would change the genetic code. You can think of this as something similar to a spelling mistake in a sentence. These errors, which are called mutations, can sometimes have serious consequences. Let’s consider a quick example. You might remember learning about hemoglobin, the molecule that carries oxygen in our blood. If the gene that codes for hemoglobin is mutated, the hemoglobin protein will be produced incorrectly. This can cause a condition called sickle cell anemia, which distorts the shape of the red blood cells in the body.

Key Term: Mutation

A mutation is an error or an alteration in a sequence of nucleotides.

In order to prevent such errors from arising during DNA replication, the enzyme DNA polymerase performs another crucial function. As it adds nucleotides to the growing new strand, it also “proofreads” or checks its own work. In this way, if the wrong nucleotide has accidentally been added, DNA polymerase will identify the error and swap the wrong nucleotide for the right one! It does this through exonuclease activity, which means it removes incorrect nucleotides and replaces them with correct ones. You can see an example of this in Figure 11.

As we learned earlier, DNA ligase is an enzyme that joins fragments of DNA together by forming new phosphodiester bonds, linking the fragments. When DNA is physically damaged, causing breaks in the strands, DNA ligase can function as a DNA repair enzyme. It uses the complementary strand of the DNA double helix as a template to form new phosphodiester bonds.

DNA repair, therefore, depends on the presence of two strands carrying the genetic information. When one strand is damaged, the intact information on the complementary strand can be used by DNA repair enzymes to replace the damaged sections. This is why it is so important for DNA replication to be an accurate, error-free process!

Example 3: Understanding how Proofreading Eliminates Errors During DNA Replication

When errors in DNA replication occur, the newly formed strand can be proofread and be recognized as not being complementary to the original strand. Which enzyme is responsible for correcting these errors during replication?

Menjawab

When a cell undergoes division, its DNA replicates itself, so as to provide each new cell with a copy of DNA which can control the cell’s characteristics and functions. We know that a single molecule of DNA is composed of two complementary polynucleotide strands. Each of these strands is made up of multiple individual units called nucleotides, which form a sequence of nitrogenous bases. The order or sequence of nitrogenous bases along a strand of DNA encodes the “genetic information” that needs to be replicated when a cell divides.

The enzyme DNA polymerase synthesizes new strands of DNA that are complementary to each of the original strands, by following the rules of complementary base-pairing: adenine binds to thymine through two hydrogen bonds, and guanine binds to cytosine through three hydrogen bonds.

The genetic information carried in these strands is crucially important to the normal functioning of a cell, as it forms a genetic code that provides the cell with instructions for the production of proteins. The process of DNA replication, though accurate, is not foolproof, which means that sometimes errors can arise in the new sequence, when a noncomplementary nitrogenous base is accidentally added.

Every word in the English language has a specific meaning. If a word is written down with a spelling mistake in it, the meaning of this word would be lost! This is similar to what happens when errors arise in a DNA sequence, which are also called mutations. Mutations in DNA can lead to several different diseases and disorders.

In order to prevent mutations during DNA replication, the enzyme DNA polymerase “proofreads” its own work, checking that each new nucleotide is complementary to the original strand as it goes along. If it detects an error, or a noncomplementary nucleotide, it quickly replaces this with the correct one!

The answer to this question is, therefore, DNA polymerase.

Let’s summarize the key points we have learned from this explainer.

Poin Kunci

  • When a living cell divides, its DNA must replicate so that each new cell receives a copy of DNA.
  • DNA replication is a semiconservative process.
  • In order for a molecule of DNA to replicate, the two strands must first unwind. DNA helicase is responsible for this and “unzips” the DNA molecule by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous bases.
  • DNA polymerase synthesizes new strands of DNA along each template strand by adding complementary nucleotides to the chain.
  • DNA polymerase can only synthesize DNA in the


Tonton videonya: REPLIKASI DNA +Pembahasan soal OSN tingkat nasional IPA SMP 2018 Essay (Februari 2023).