Informasi

Masalah dengan SDS-PAGE, tidak ada pemisahan - apa masalahnya?

Masalah dengan SDS-PAGE, tidak ada pemisahan - apa masalahnya?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya bekerja di lab jika kami memiliki stok umum 30% Acrylamide, TEMED, TRIS-HCl (pH6.8 dan pH 8.8.) dan larutan SDS 10% (b/v) pH 7.2.

Kami menggunakan resep untuk memuat buffer (yang tentu saja kami campur dengan BME sebelum digunakan):

  • 3,15 mL air MilliQ
  • 1,25 mL 0,5M Tris-HCl
  • 2.9 mL 85% Gliserol
  • 2 mL 10% SDS
  • 0,4 mL 0,5% (b/v) bromofenol biru

Masalah kita adalah tidak ada pemisahan.

Saya telah mencoba membuat 2 gel karena saya pikir saya mungkin telah mencampurkan gel pemisah dan gel susun, tetapi saya memastikan saya tidak melakukan ini untuk kedua kalinya. Kemudian saya meminta orang lain untuk membuat gel, dan itu tidak berhasil untuk mereka juga (tidak ada di gel, tidak ada sampel, tidak ada tangga).

Kemudian saya membuat ulang solusi SDS 10% dan kedua buffer TRIS, tetapi sekali lagi sesuatu yang aneh terjadi karena kami tidak mendapatkan apa pun pada gel.

Gel jelas dipolimerisasi sebagai gel padat ketika Anda mengeluarkannya untuk diwarnai dan dihilangkan, dan saya tidak mengerti bagaimana buffer pemuatan dapat melakukan ini bahkan jika Anda mengacaukannya (karena Anda akan melihat sesuatu pada gel selama sampel Anda dalam sumur, bahkan tanpa denaturasi). Kami jelas membuat ulang pewarna pemuatan dan mencoba lagi, tetapi ini tidak berhasil.

Saya tahu ada protein dalam sampel, karena saya meletakkan pelet sel dan protein murni (yang telah saya uji aktivitas katalitiknya) pada gel yang sama.

Adakah yang punya penjelasan rasional untuk ini, atau saran tentang apa yang biasanya salah.

Di bawah ini adalah gambar gel seperti yang terlihat ketika hampir selesai berjalan pada 200V (80mAmp) selama sekitar 40 menit. Saat kita menodai dan menodai tidak ada apa pun di gel. Juga menurut saya warnanya (bromophenol blue) terlihat agak aneh di gel, tidak seperti biasanya, lihat gambar di bawah, tapi mungkin saya agak paranoid.


Setelah menyesuaikan kembali pH semuanya dan membuat buffer berjalan baru dengan larutan SDS baru, pemisahan tampaknya kembali.


SDS-PAGE "Hall of Shame"

Anda mungkin telah menyiapkan gel yang hampir sempurna, dan akan mengalami kesulitan untuk menyempurnakan produk. Jika demikian, maka dengan segala cara menertawakannya! Jika Anda tidak melakukan pekerjaan panas seperti itu, jangan putus asa. Semua ilmuwan yang baik belajar dari kesalahan mereka, pada kenyataannya, tanpa membuat kesalahan kebanyakan dari kita tidak akan belajar banyak sama sekali!

"Hall of Shame" menyajikan contoh beberapa gel terburuk yang pernah dilakukan siswa (dan instruktur) di lab sebelumnya, dengan satu atau dua contoh dari lab penelitian. Mereka mewakili banyak cara seseorang dapat mengacaukan gel (tetapi tidak semuanya - kami masih menemukan cara baru!). Lihat fitur apa dari gel Anda sendiri yang tidak memuaskan - atau setidaknya kurang dari sempurna - dan gunakan ilustrasi untuk mencari tahu apa yang mungkin Anda lakukan untuk meningkatkan teknik Anda.


Tangga protein tidak memisahkan - (Mar/10/2013 )

Saya telah menjalankan beberapa SDS-PAGE dengan penyelesaian 10% dan penumpukan 5%. Saya selalu tidak bisa menyelesaikan tangga protein 25kb. Setelah penanda 50kb, sisanya tampaknya menumpuk dan tidak memisahkan. Ada satu kali, pewarna depan malah berhenti lebih awal meski arus sedang berjalan.
Apakah itu masalah dengan gel atau buffer saya?

Kebanyakan pewarna protein sensitif terhadap pH. Apakah Anda memuat pewarna atau tangga berubah warna saat bermigrasi ke gel? Apakah Anda menggunakan gel yang sudah jadi atau Anda menyiapkan gel sendiri? Jika Anda menggunakan yang sudah jadi, apakah gel kedaluwarsa, apakah sudah disimpan dengan benar? Jika Anda membuat gel sendiri, kemungkinan salah satu buffer Anda terkontaminasi atau pH-nya tidak aktif. Sudahkah Anda membuat modifikasi pada buffer berjalan western blot Anda? Apakah Anda menggunakan stok bahan kimia baru (yaitu SDS, Tris, Glycine, dll.).

Apakah ada orang di lab yang memiliki masalah serupa dengan rig western blot itu? Apakah Anda yakin peralatan Anda mempertahankan voltase yang benar? Berapa suhu buffer berjalan Anda di rig western blot Anda (hangat, panas panas)?

Pikirkan tentang beberapa pertanyaan ini dan itu akan memulai pemecahan masalah Anda.

Terima kasih pewarna loading tidak berubah warna. Saya menyiapkan gel sendiri. Ada satu teman lab yang memiliki masalah yang sama. Saya berpikir itu mungkin masalah menjalankan buffer karena satu-satunya kesamaan yang kami gunakan adalah buffer yang berjalan. Running buffer biasanya 700ml H2O, 200ml 10X running buffer dan 100ml metanol. Tegangan yang biasanya saya gunakan adalah 60V selama 30 menit, dan 120V selama 1,5 jam hingga bagian depan pewarna hampir habis.

Karena penumpukan tangga protein, terkadang bagian depan pewarna saya berhenti lebih awal.

Ya, coba buat ulang buffer Anda dan lihat apa yang terjadi. Anda menambahkan metanol ke buffer berjalan Anda?

metanol dalam buffer yang berjalan akan menghilangkan sds dari protein dan akan menyebabkan masalah migrasi.

kami telah melihat pewarna pelacakan berhenti di awal proses. kami menemukan bahwa jika kami melanjutkan proses pewarna akan "melompat" ke dasar gel, menajamkan dan terus bermigrasi. gel bernoda yang dihasilkan tampak normal. kami pikir itu disebabkan oleh penuaan komponen dalam buffer yang berjalan (kemungkinan besar sds).

jika Anda perlu melihat pemisahan berbagai ukuran protein maka Anda mungkin ingin mempertimbangkan untuk menjalankan gel gradien.

informasi yang disertakan dengan standar ukuran (atau dapat ditemukan di situs web produsen) akan menunjukkan kepada Anda bagaimana standar akan muncul saat dijalankan pada berbagai konsentrasi gel.

Erm, jadi buffer larimu konsentrasinya 2x? Anda hanya perlu menambahkan 100ml 10X buffer ke dalam larutan 1L.

Dan saya belum pernah mendengar menambahkan metanol ke buffer yang berjalan, ke buffer transfer, tentu saja, itu umum, tetapi tidak ke buffer yang sedang berjalan. Sudahkah Anda mencampuradukkan protokol Anda?


Gel poliakrilamida untuk SDS-PAGE

Banyak sistem untuk elektroforesis protein telah dikembangkan, dan peralatan yang digunakan untuk SDS-PAGE sangat bervariasi. Metodologi yang digunakan pada halaman ini menggunakan metode Laemmli. Referensi ke metode Laemmli di bagian bahan dan metode menghilangkan kebutuhan untuk mendeskripsikan buffer, pengecoran gel, peralatan, dll. Kecuali jika makalah menggunakan beberapa modifikasi pada metode ini, satu-satunya detail SDS-PAGE yang harus dilaporkan dalam a bagian metode adalah persen total akrilamida (%T) dalam gel, persentase relatif dan jenis pengikat silang (%C), dan mungkin referensi ke dimensi gel. Kami menggunakan sistem "mini-gel", dengan 3 1/4" x 4" gel kaset.

SDS-PAGE dapat dilakukan pada gel pra-cetak, menghemat masalah dan bahaya bekerja dengan akrilamida. Uraian berikut berlaku untuk peralatan casting dan running buatan toko yang jauh lebih murah daripada peralatan yang tersedia secara komersial. Selain efektivitas biaya, keuntungan membuat gel sendiri untuk pertama kalinya adalah pemahaman yang lebih dalam tentang prosesnya.

Terlepas dari sistemnya, persiapan memerlukan pengecoran dua lapisan akrilamida yang berbeda di antara pelat kaca. Lapisan bawah (pemisah, atau penyelesaian, gel) bertanggung jawab untuk benar-benar memisahkan polipeptida berdasarkan ukuran. Lapisan atas (susun gel) termasuk sumur sampel. Ini dirancang untuk menyapu protein dalam sampel di antara dua batas yang bergerak sehingga mereka dikompresi (ditumpuk) menjadi lapisan tipis mikrometer ketika mereka mencapai gel pemisah.


Protokol

1. Persiapan Gel

Timbang massa agarosa yang sesuai ke dalam labu Erlenmeyer. Gel agarosa dibuat menggunakan larutan persentase b/v. Konsentrasi agarosa dalam gel akan tergantung pada ukuran fragmen DNA yang akan dipisahkan, dengan sebagian besar gel berkisar antara 0,5% -2%. Volume buffer tidak boleh lebih besar dari 1/3 kapasitas labu.

Tambahkan running buffer ke dalam labu yang mengandung agarosa. Putar untuk mencampur. Gel running buffer yang paling umum adalah TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) dan TBE (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA).

Lelehkan campuran agarose/buffer. Ini paling sering dilakukan dengan memanaskan dalam microwave, tetapi juga bisa dilakukan di atas api Bunsen. Pada interval 30 detik, keluarkan labu dan putar isinya agar tercampur rata. Ulangi sampai agarosa benar-benar larut.

Tambahkan etidium bromida (EtBr) hingga konsentrasi 0,5 μg/ml. Sebagai alternatif, gel juga dapat diwarnai setelah elektroforesis dalam running buffer yang mengandung 0,5 μg/ml EtBr selama 15-30 menit, diikuti dengan destaining dalam running buffer untuk jangka waktu yang sama.

Catatan: EtBr dicurigai sebagai karsinogen dan harus dibuang dengan benar sesuai peraturan institusi. Sarung tangan harus selalu dipakai saat menangani gel yang mengandung EtBr. Pewarna alternatif untuk pewarnaan DNA tersedia namun EtBr tetap menjadi yang paling populer karena sensitivitas dan biayanya.

Biarkan agarosa menjadi dingin baik di atas meja atau dengan inkubasi dalam penangas air 65 ଌ. Jika tidak dilakukan, baki gel akan melengkung.

Tempatkan baki gel ke dalam peralatan pengecoran. Sebagai alternatif, seseorang juga dapat merekatkan tepi terbuka baki gel untuk membuat cetakan. Tempatkan sisir yang sesuai ke dalam cetakan gel untuk membuat sumur.

Tuang agarosa cair ke dalam cetakan gel. Biarkan agarosa mengeras pada suhu kamar. Lepaskan sisir dan masukkan gel ke dalam kotak gel. Sebagai alternatif, gel juga dapat dibungkus dengan plastik dan disimpan pada suhu 4 ଌ sampai digunakan (Gambar 1).

2. Penyiapan Perangkat Gel dan Pemisahan Fragmen DNA

Tambahkan loading dye pada sampel DNA yang akan dipisahkan (Gambar 2.). Pewarna pemuatan gel biasanya dibuat pada konsentrasi 6X (0,25% bromphenol blue, 0,25% xilena cyanol, 30% gliserol). Pewarna yang dimuat membantu melacak seberapa jauh sampel DNA Anda telah bergerak, dan juga memungkinkan sampel meresap ke dalam gel.

Program catu daya ke tegangan yang diinginkan (1-5V/cm antara elektroda).

Tambahkan running buffer secukupnya untuk menutupi permukaan gel. Penting untuk menggunakan buffer berjalan yang sama dengan yang digunakan untuk menyiapkan gel.

Pasang ujung kotak gel ke catu daya. Nyalakan catu daya dan pastikan kotak gel dan catu daya berfungsi.

Lepaskan tutupnya. Perlahan dan hati-hati memuat sampel DNA ke dalam gel (Gambar 3). Penanda ukuran DNA yang sesuai harus selalu dimuat bersama dengan sampel eksperimental.

Pasang kembali tutup kotak gel. Katoda (lead hitam) harus lebih dekat dengan sumur daripada anoda (lead merah). Periksa kembali apakah elektroda dicolokkan ke slot yang benar di catu daya.

Nyalakan daya. Jalankan gel sampai pewarna berpindah ke jarak yang sesuai.

3. Mengamati Fragmen DNA yang Terpisah

Ketika elektroforesis selesai, matikan catu daya dan lepaskan tutup kotak gel.

Keluarkan gel dari kotak gel. Tiriskan buffer berlebih dari permukaan gel. Tempatkan baki gel di atas tisu untuk menyerap buffer ekstra yang sedang berjalan.

Keluarkan gel dari baki gel dan paparkan gel ke sinar uv. Ini paling sering dilakukan dengan menggunakan sistem dokumentasi gel (Gambar 4). Pita DNA harus muncul sebagai pita fluoresen oranye. Ambil gambar gel (Gambar 5).

Buang gel dan running buffer dengan benar sesuai peraturan institusi.

4. Hasil Representatif

Gambar 5 merupakan hasil khas setelah elektroforesis gel agarosa dari produk PCR. Setelah pemisahan, fragmen DNA yang dihasilkan terlihat sebagai pita yang terdefinisi dengan jelas. Standar atau tangga DNA harus dipisahkan sampai tingkat yang memungkinkan penentuan ukuran pita sampel yang berguna. Dalam contoh yang ditunjukkan, fragmen DNA 765 bp, 880 bp dan 1022 bp dipisahkan pada gel agarosa 1,5% bersama dengan tangga DNA 2-log.

Gambar 1. Gel agarosa yang dipadatkan setelah sisir dilepas.

Gambar 2. Seorang siswa menambahkan pewarna pemuatan ke sampel DNA-nya.

Gambar 3. Seorang siswa memasukkan sampel DNA ke dalam sumur di dalam gel.

Gambar 4. Contoh sistem dokumentasi gel.

Gambar 5. Gambar elektroforesis pasca gel. EtBr ditambahkan ke dalam gel sebelum dielektroforesis hingga konsentrasi akhir 0,5 μg/ml, diikuti dengan pemisahan pada 100 V selama 1 jam. Gel tersebut terkena sinar uv dan gambar diambil dengan sistem dokumentasi gel.


Sistem Penyangga Terputus dan Gel Penumpukan – Melapisinya di Garis Awal

Untuk menghantarkan arus dari katoda (negatif) ke anoda (positif) melalui gel, jelas diperlukan buffer. Sebagian besar kami menggunakan sistem buffer Laemmli yang terputus-putus. “Discontinuous” berarti buffer dalam gel dan tangki berbeda.

Biasanya, sistem diatur dengan gel susun pada pH 6,8, buffer Tris-HCl, gel berjalan buffer hingga pH 8,8 oleh Tris-HCl dan buffer elektroda pada pH 8,3. Gel susun memiliki konsentrasi akrilamida yang rendah dan gel berjalan dengan konsentrasi yang lebih tinggi yang mampu memperlambat pergerakan protein.


Jadi ada apa dengan semua pH yang berbeda itu?

Nah, glisin bisa ada dalam tiga keadaan muatan yang berbeda, positif, netral atau negatif, tergantung pada pH. Hal ini ditunjukkan pada diagram di bawah ini. Kontrol status muatan glisin oleh buffer yang berbeda adalah kunci untuk keseluruhan gel susun.

Jadi, inilah cara kerja gel susun. Ketika daya dihidupkan, ion glisin bermuatan negatif dalam buffer elektroda pH 8,3 dipaksa masuk ke stacking gel, di mana pH 6,8. Dalam lingkungan ini, glisin beralih terutama ke keadaan zwitterionic (bermuatan netral). Kehilangan muatan ini menyebabkan mereka bergerak sangat lambat di medan listrik.

Ion Cl- (dari Tris-HCl) di sisi lain, bergerak jauh lebih cepat dalam medan listrik dan mereka membentuk bagian depan ion yang bermigrasi di depan glisin. Pemisahan Cl- dari counter-ion Tris (yang sekarang bergerak menuju anoda) menciptakan zona sempit dengan gradien tegangan curam yang menarik glisin di belakangnya, menghasilkan dua bagian depan migrasi ion yang sangat mobile. - depan, diikuti oleh bagian depan glisin yang lebih lambat, sebagian besar netral.

Semua protein dalam sampel gel memiliki mobilitas elektroforesis yang berada di antara mobilitas ekstrem glisin dan Cl-, jadi ketika dua front menyapu sampel dengan baik, protein terkonsentrasi ke zona sempit antara Cl - dan front glisin.


Jelajahi Pembedahan Kumbang
Bagian luar kumbang bisa mengkilap, kusam, atau sangat berwarna. Tapi apa yang terjadi di dalam kumbang? Lihat bagian dalam tubuh kumbang secara virtual dengan Alat Pembedahan Kumbang ini.
Jelajahi sendiri atau ikuti Aktivitas Diseksi Kumbang kami. Kunjungi Beetle Dissection Central untuk informasi lebih lanjut.


Pusat Sumber Daya Digital Spektrometri Massa

Tingkatkan hasil spektrometri massa Anda
Jelajahi pusat sumber daya digital spesifikasi massal baru untuk mendapatkan informasi praktis dan tips untuk membantu Anda mencapai tujuan Anda. Akses situs untuk mendapatkan akses ke sumber daya gratis ini:

  • Buku Pegangan dan Kuantitas Sampel Protein Ilmiah Thermo yang Dapat Diunduh untuk Spektrometri Massa Buku Pegangan tentang alat dan teknik untuk pemrosesan sampel yang lebih kuat dan dapat direproduksi, kuantisasi protein, dan kalibrasi instrumen
  • Kertas putih yang bermanfaat dan poster yang terlambat untuk aplikasi tertentu seperti fraksinasi subselular, fraksinasi peptida, pelabelan isobarik, dan banyak lagi
  • Webinar sesuai permintaan yang membahas metode kuantisasi protein

Analisis proteomik yang berhasil menekankan pada preparasi sampel, instrumentasi, dan perangkat lunak.

Persiapan sampel yang benar berarti hasil yang lebih baik

Protein yang menarik bagi peneliti biologi umumnya hadir dalam campuran kompleks protein lain, yang menghadirkan dua masalah signifikan dalam analisis MS:

  1. Teknik ionisasi yang digunakan untuk molekul besar bekerja dengan baik ketika campuran mengandung jumlah konstituen yang kira-kira sama. Namun, rentang dinamis konsentrasi protein dalam sampel biologis dapat melebihi 10 kali lipat. Jika campuran seperti itu diionisasi menggunakan electrospray ionization (ESI), misalnya, spesies yang lebih banyak memiliki kecenderungan untuk "menenggelamkan" atau menekan sinyal dari yang kurang melimpah.
  2. Spektrum massa campuran kompleks sangat sulit untuk dianalisis sepenuhnya karena jumlah komponennya yang sangat banyak. Masalah ini diperburuk oleh pencernaan enzimatik sampel protein menjadi sejumlah besar produk peptida. Keberhasilan kromatografi cair MS (LC-MS) dan MS tandem (LC-MS/MS) bergantung pada sampel yang bersih dengan kompleksitas sampel yang terbatas untuk meminimalkan penekanan ionisasi oleh spesies dengan kelimpahan tinggi dan mencegah MS yang kurang sampel dari peptida eluting.

Persiapan protein untuk analisis MS dapat dilakukan dengan banyak metode, jadi penting untuk memahami langkah-langkah yang mengarah ke analisis. Sementara protein utuh biasanya dipelajari dengan elektroforesis gel, alur kerja spektrometri massa yang paling umum untuk sampel protein kompleks menganalisis peptida, yang lebih mudah difraksinasi daripada protein oleh LC. Peptida juga terionisasi dan terfragmentasi lebih efisien daripada protein utuh, menghasilkan spektrum yang lebih mudah diinterpretasikan untuk identifikasi protein. Persiapan peptida melibatkan reduksi dan alkilasi sistein, pencernaan sampel menjadi peptida, penghilangan garam dan konsentrasi peptida dan analisis akhir peptida ini dengan ionisasi (misalnya, ESI) ditambah MS berbasis orbitrap.

Keputusan untuk menggunakan MALDI-MS atau LC-MS atau LC-MS/MS untuk analisis proteomik bergantung pada sejumlah faktor, termasuk tingkat preparasi sampel dan potensi throughput. Misalnya, karena beberapa sampel dapat dikeringkan ke dalam satu matriks MALDI, 96 sampel dapat dianalisis dalam satu jam dibandingkan dengan hanya satu sampel dengan LC-MS atau LC-MS/MS. Sebaliknya, semua pengurangan kompleksitas sampel harus dilakukan secara off-line dengan MALDI-MS, dan oleh karena itu persiapan sampel jauh lebih penting untuk pendekatan ini daripada untuk LC-MS atau LC-MS/MS, yang memerlukan persiapan sampel minimal karena -line reverse-phase LC digunakan untuk mengurangi kompleksitas sampel sebelum analisis MS.

Alur kerja persiapan sampel. Sampel lisat dibuat dari spesimen biologis atau sel yang dikultur dengan protokol khusus yang dapat mencakup lisis sel, fraksinasi subselular, penipisan protein yang melimpah, pengayaan protein target, dialisis, dan penghilangan garam. Pencernaan dalam larutan memerlukan pemutusan ikatan disulfida secara ireversibel melalui reduksi dan alkilasi diikuti oleh pencernaan protein menjadi fragmen peptida. Pendekatan alternatif adalah pertama menyelesaikan protein dengan elektroforesis 1D atau 2D (masing-masing 1DE atau 2DE) dan kemudian mengumpulkan irisan gel yang mengandung pita yang diinginkan. Protein dalam sumbat gel ini kemudian direduksi, dialkilasi, dan dicerna di tempat. Setelah peptida diekstraksi dari matriks gel, peptida diperkaya dan garam serta deterjen dihilangkan dan disiapkan untuk analisis MS. Meskipun diagram ini mencakup langkah-langkah preparasi sampel yang paling umum, protokol harus disesuaikan dengan sampel spesifik dan teknik MS untuk hasil yang optimal.

Belajarlah lagi

Pilih produk


Pemecahan Masalah Kromatografi Pertukaran Ion

Jika hanya puncak tertentu yang menarik dalam pemisahan yang diselesaikan dengan baik ini, mungkin menguntungkan untuk mentransfer ke elusi langkah untuk menghemat waktu dan buffer. Sisa bagian ini berfokus pada masalah praktis yang dapat menyebabkan pemisahan IEX yang tidak ideal.

Gambar 2. Sampel terelusi sebelum gradien garam dimulai

Pastikan buffer berada dalam wadah yang benar. Kurangi kekuatan ionik sampel dengan menghilangkan garam, halaman 156, atau pengenceran dengan buffer awal. Untuk penukar anion, naikkan pH buffer, untuk penukar kation, turunkan pH buffer. Jika protein masih tidak mengikat pada pH berapa pun, kemungkinan kolom telah terkontaminasi oleh deterjen.

Gambar 3. Sampel masih mengelusi saat gradien dimulai

Setelah aplikasi sampel jejak UV harus kembali ke garis dasar sebelum elusi dimulai, jika tidak, protein yang tidak mengikat kolom mengganggu pemisahan. Tingkatkan volume buffer awal (langkah ekuilibrasi) sebelum memulai elusi gradien.

Gambar 4. Sampel terelusi selama pencucian dengan garam tinggi

Protein mengikat terlalu kuat. Pastikan buffer berada dalam wadah yang benar. Jika menggunakan penukar anion, turunkan pH buffer, jika menggunakan penukar kation, naikkan pH buffer.

Protein yang diinginkan mengelusi di akhir gradien

Protein mengikat terlalu kuat. Meningkatkan kekuatan ion gradien. Lebih disukai untuk mengubah pH jika konsentrasi garam yang sangat tinggi diperlukan untuk elusi. Untuk penukar anion, turunkan pH buffer dan untuk penukar kation, naikkan pH buffer. Rujuk juga ke Tabel 6.

Protein yang diinginkan mengelusi terlalu dini dalam gradien:

Protein tidak mengikat kuat. Periksa kekuatan ion gradien. Mengubah pH, ​​untuk penukar anion, meningkatkan pH buffer dan untuk penukar kation, menurunkan pH buffer. Rujuk juga ke Tabel 6.

Protein yang diminati tidak cukup terpecahkan

Lihat isi bab ini untuk meninjau parameter kunci untuk meningkatkan resolusi. Rujuk juga ke Tabel 6.

*Pelarut organik polar seperti metanol, etanol, isopropanol, dan asetonitril dapat digunakan pada konsentrasi dari 0–20%, tetapi ingat bahwa beberapa protein dapat kehilangan aktivitas biologisnya secara permanen dengan adanya pelarut organik. Periksa kelarutan sampel dan buffer, pH buffer dan stabilitas kimia media sebelum menjalankan kolom.
Perhatikan bahwa tekanan balik dapat meningkat saat bekerja dengan larutan organik.


Pencegahan gangguan perilaku yang mengganggu

Tidak diketahui secara pasti mengapa beberapa anak mengalami gangguan perilaku yang mengganggu. Banyak faktor yang mungkin berperan, termasuk faktor biologis dan sosial. Diketahui bahwa anak-anak berada pada risiko yang lebih besar ketika mereka terpapar pada jenis kekerasan dan perilaku kriminal lainnya, ketika mereka mengalami penganiayaan atau pengasuhan yang keras atau tidak konsisten, atau ketika orang tua mereka memiliki kondisi kesehatan mental seperti gangguan penggunaan zat ikon eksternal , ikon eksternal depresi , atau attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD). Kualitas pengasuhan anak usia dini juga dapat mempengaruhi apakah seorang anak mengembangkan masalah perilaku.

Meskipun faktor-faktor ini tampaknya meningkatkan risiko gangguan perilaku yang mengganggu, ada beberapa cara untuk mengurangi kemungkinan anak-anak mengalaminya. Pelajari tentang pendekatan kesehatan masyarakat untuk mencegah risiko ini:


Tonton videonya: এসডএস পইজ ক? SDS PAGE Principle and Step-by-Step Procedure with Explanation (Februari 2023).