Informasi

13.8: Hasil Pertumbuhan Bakteri dan Jamur dan Pekerjaan Rumah - Biologi

13.8: Hasil Pertumbuhan Bakteri dan Jamur dan Pekerjaan Rumah - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Morfologi Koloni

Koloni bakteri tumbuh dari satu sel bakteri. Siswa akan mengamati bahwa setiap koloni memiliki ciri-ciri bentuk, ukuran, tekstur, dan warna.

Prosedur

Dapatkan pelat agar yang disiapkan di bagian 14.3. Biarkan selimut tetap menyala. Amati koloni dengan mata dan di bawah mikroskop bedah. Lengkapi tabel data

pertanyaan

Jika satu sel bakteri berukuran mikroskopis, bagaimana bakteri ini dapat diamati dengan mata telanjang?

pertanyaan

Bagaimana penampilan koloni jamur berbeda dari bakteri?

pertanyaan

Apakah hasil eksperimen ini mendukung hipotesis Anda? Jelaskan secara rinci.


Beranda/ MCB137/237 - Biologi Fisik Sel

Biologi sedang direvolusi dengan teknik eksperimental baru yang memungkinkan untuk mengukur cara kerja bagian dalam molekul, sel, dan organisme multiseluler dengan presisi yang belum pernah terjadi sebelumnya. Tujuan dari modul singkat ini adalah untuk mengeksplorasi banjir data kuantitatif ini melalui penggunaan numerasi biologis. Kami akan mensurvei contoh penelitian yang menarik dari departemen kami dan seterusnya untuk mengembangkan model teoretis yang membuat prediksi yang tepat tentang fenomena biologis. Prediksi ini akan diuji melalui analisis langsung dari data eksperimen dan dengan melakukan simulasi numerik menggunakan Matlab.

Biologi fisik akan diperkenalkan sebagai alat baru yang menarik untuk melengkapi pendekatan lain dalam biologi seperti genetika, genomik, dan biologi struktural. Modul ini akan memperkenalkan siswa pada kekuatan yang memungkinkan dari numerasi biologis dalam penemuan ilmiah dan memungkinkan mereka untuk menggunakan alat-alat ini dalam penelitian mereka sendiri.

Instruktur kursus: Hernan Garcia ([email protected]). Jam kerja: Rabu 13:30 hingga 14:30 @ 501C LSA. Silakan lihat pengumuman di Piazza untuk jam kantor terbaru.

Kursus GSI: Elizabeth Eck ([email protected], Jam kantor: Senin 11:00 hingga 12:00 @ 349 LSA) & Gabriella Martini ([email protected], Jam kantor: Selasa 16:00 hingga 17:00 @ 349 LSA).

Materi kelas:

    (dapat berubah sewaktu-waktu)
  • Unduh dan instal Matlab dengan masuk ke UC Berkeley Software Central. Sangat penting Anda melakukan ini setidaknya seminggu sebelum kelas dimulai!

Jadwal: Kelas bertemu hari Selasa dari pukul 14:00-16:00 di Gedung Genetika &amp Biologi Tumbuhan 107 dan Kamis dari pukul 14:00-16:00 di Gedung Genetika & Biologi Tanaman 103. Tidak ada bagian Diskusi independen karena Ceramah, Lab, dan diskusi D terintegrasi dalam kuliah mingguan.

Kebijakan pekerjaan rumah: Pekerjaan rumah dikumpulkan di awal kelas satu minggu setelah mereka diposting. Solusi akan diposting dua hari setelah pekerjaan rumah diserahkan, dan pekerjaan rumah akan dikembalikan seminggu setelah diserahkan. TIDAK ada pekerjaan rumah yang terlambat akan diterima (terlambat berarti kapan saja setelah kelas dimulai pada hari pekerjaan rumah jatuh tempo) kecuali jika Anda memiliki catatan dari seseorang seperti dokter atau Dekan. Anda dapat mendiskusikan pekerjaan rumah dengan orang lain, tetapi penjelasan dan turunan Anda harus menjadi milik Anda sendiri. Logika Anda dan pentingnya hasil Anda juga harus dijelaskan.

Perasaan untuk angka dalam biologi: Estimasi dan berhitung biologis

Makalah: Matematika Adalah Mikroskop Biologi Berikutnya, Hanya Biologi yang Lebih Baik Adalah Fisika Berikutnya Matematika, Hanya Lebih Baik (Cohen2004), Teori dalam Biologi: Gambar 1 atau Gambar7? (Phillips2015b), Distribusi biomassa di Bumi (Bar-ON2018 dan SI) dan Jumlah gen dalam genom manusia, The Tragic Matter (Schatz2003), Polymerase and the Replisome (Baker1998)

Bahan bacaan: PBoC bab 1 sampai 3

Membuat plot sederhana: Kode Matlab (di kelas)

Skala temporal dalam biologi

Pertumbuhan Bakteri: Simulasi menggunakan metode Euler

E. coli dengan angka - Pertumbuhan bakteri: Presentasi Powerpoint

Simulasi pertumbuhan bakteri: Kode Matlab (di kelas)

Makalah: Obsesi dengan dN/dt (Neidhardt1999)

Bahan Bacaan: PBoC bab 2 dan 3

Pertumbuhan Bakteri: Batas pertumbuhan bakteri, Bagian I

E. coli dengan angka - Batas pertumbuhan bakteri, Bagian I: Presentasi Powerpoint

Bahan Bacaan: PBoC bab 2 dan 3

Pertumbuhan Bakteri: Batas pertumbuhan bakteri, Bagian II

Pekerjaan rumah 1 jatuh tempo

E. coli dengan angka - Batas pertumbuhan bakteri: Bagian II: Presentasi Powerpoint

Bahan Bacaan: PBoC bab 2 dan 3, MBoC bab XX (ATP Sintase, Spektrometri Massa)

PR 2 Kode MATLAB

Difusi: Transpor aksonal dan menurunkan persamaan difusi

Bahan bacaan: PBoC bab 13

Pertumbuhan Bakteri: Menganalisis film tentang koloni yang tumbuh dan data yang pas

PR 2 jatuh tempo

Pekerjaan rumah 3 selesai, jatuh tempo 14/2

Mengukur pertumbuhan bakteri menggunakan mikroskop: Data, MatlabCode

Bahan Bacaan: PBoC bab 2 dan 3

Difusi: Memecahkan persamaan difusi menggunakan lemparan koin

Bahan bacaan: PBoC bab 13

Difusi dan FRAP: Memecahkan persamaan difusi menggunakan persamaan induk, Bagian I

Pekerjaan rumah 3 jatuh tempo (kirim abstrak untuk perkiraan melalui email ke Hernan, Gabriella dan Liz)

Pekerjaan rumah 4 selesai, jatuh tempo 21/2

Difusi dan FRAP: Memecahkan persamaan difusi menggunakan persamaan induk, Bagian II

Oleskan mentega untuk difusi: kode Matlab

Lalat dengan Angka: Batas fisik untuk replikasi dan transkripsi DNA dalam pengembangan, Bagian I

PR 4 jatuh tempo

Rekombinasi dan pemetaan pertama kromosom: Sturtevant1913.

Lalat dengan Angka: Batas fisik untuk replikasi dan transkripsi DNA dalam pengembangan, Bagian II

Perpanjangan transkripsi pada lalat: Data dan kode Matlab

Pola perkembangan: Model Bendera Prancis dan cara membuat gradien morfogen, Bagian I

Bilangan tanpa dimensi dan analisis dimensi

PR 5 jatuh tempo

Makalah: Menguji model Bendera Prancis (Driever1989 dan 2013) mengukur degradasi Bicoid (Drocco2011), difusi (Abu-Arish2011), bikoid lokalisasi (Little2011), dan terjemahan (Petkova2014)

Pola perkembangan: Model Bendera Prancis dan cara membuat gradien morfogen, Bagian II

Diskusi: Memikirkan konsentrasi dan ATP dalam sel

Biologi regulasi dan promotor konstitutif, Bagian I: Diagram fase dan penyelesaian untuk level mRNA rata-rata

Pekerjaan rumah 6 jatuh tempo

Tidak ada pekerjaan rumah minggu ini - Saatnya mengerjakan sketsa perkiraan Anda (jatuh tempo 14/3)

Dinamika promotor konstitutif: kode Matlab

Promotor konstitutif: Slide Powerpoint

Biologi regulasi dan promotor konstitutif, Bagian II: Persamaan master dan kebisingan transkripsi, pendekatan analitis

Diskusi: Perkiraan difusi

Clarke1946: Serangan bom terbang di London dan distribusi Poisson

Jones2014: Kebisingan transkripsi di operon lac

Biologi regulasi dan promotor konstitutif, Bagian III: Persamaan master dan kebisingan transkripsi, pendekatan numerik

Perkirakan sketsa karena (kirim email ke Hernan, Gabriella dan Liz)

Pekerjaan rumah 7 selesai, jatuh tempo 21/3: Taniguchi2010, Petkova2014, Gunawardena2014 (Model dalam biologi: `deskripsi akurat dari pemikiran menyedihkan kita')


Bahan dan metode

Situs dan tanah

Sampel tanah dikumpulkan pada bulan Agustus 2006 sepanjang gradien ketinggian di atas 1030 m (subalpin: 1500 m dan 1900 m alpine: 2300 m dan 2530 mdpl) di Pegunungan Alpen Tengah Austria (daerah Hohe Tauern/Grossglockner) baik di selatan maupun di lereng utara. Rincian lokasi, vegetasi, iklim dan karakteristik tanah disajikan pada Tabel 1 dan 2. Bahan induk (Chorizon) didominasi gneiss (silikat) untuk semua tanah. Dari setiap lokasi, 10 sampel tanah (sub-sampel) diambil secara acak dari area 100 m × 100 m dari 5 cm atas, dibulatkan untuk menghasilkan sampel komposit, diangkut dalam kotak dingin ke laboratorium, diayak (<2 mm) dan disimpan di 2 °C.

Karakteristik lingkungan dari lokasi yang diteliti

Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175
Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175

Rata-rata tahunan, diukur pada kedalaman 5 cm.

Karakteristik lingkungan dari lokasi yang diteliti

Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175
Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175

Rata-rata tahunan, diukur pada kedalaman 5 cm.

Sifat-sifat tanah yang dipelajari

Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5
Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5

Sifat-sifat tanah yang dipelajari

Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5
Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5

Sifat fisik dan kimia tanah

Analisis tanah meliputi pengukuran massa kering, pH (CaCl2), kandungan karbonat [penentuan volumetrik gas (setelah Scheibler) CO2 dilepaskan setelah penambahan 10% HCl], kandungan humus (pembakaran kering karbon), nitrogen total (metode Kjeldahl: pencernaan dengan H2JADI4), C/N, konduktivitas dan distribusi ukuran partikel (sedimentasi) menurut metode standar ( Schinnerdkk., 1996 NORM L1084, 1999 NORM L1061-2, 2002 NORM L1080, 2005 NORM L1082, 2005).

Pencacahan bakteri tanah yang dapat dikultur

Jumlah bakteri tanah yang dapat dikultur ditentukan dengan metode penghitungan pelat untuk sel yang hidup. Pengenceran suspensi tanah yang sesuai dioleskan ke permukaan agar-agar. Pelat R2A yang mengandung sikloheksimida (400 g mL -1 ) digunakan untuk menentukan jumlah bakteri heterotrofik. CFU dihitung setelah 7 hari pada 25 °C dan setelah 21 hari pada 1 °C.

Jumlah bakteri total

Sampel tanah (5 g massa segar) dikocok selama 30 menit pada 180 r.p.m. dengan 45 mL larutan natrium pirofosfat (0,1% b/v), diencerkan lebih lanjut (1 : 5) dan disaring. Jumlah total bakteri ditentukan dalam filtrat dengan pewarnaan nonselektif 4′,6′-diamino-2-phenylindole (DAPI 1,5 g mL 1) menggunakan DAPI/Vectashield ® dan mikroskop epifluoresensi seperti dijelaskan di bawah.

Filtrat tanah yang digunakan untuk menentukan jumlah bakteri total digunakan untuk fiksasi. Fiksasi bakteri tanah dilakukan pada 4% paraformaldehida fiksasi etanol digunakan untuk kelompok sasaran Gram-positif (Zardadkk., 1997 Daimsdkk., 2005). IKAN dilakukan menurut Daimsdkk. (2005), menggunakan probe oligonukleotida untuk kelompok filogenetik yang berbeda dari domain Bakteri ( Loydkk., 2007): EUB338 (Eubacteria Stahl & amp Amann, 1991), ALF1b (Alphaproteobacteria Manzodkk., 1992), BET42a (Betaproteobakteri Manzodkk., 1992), GAM42a (Gammaproteobacteria Manzodkk., 1992), CF319a (SitofagaFlavobakteri Manzodkk., 1996), HGC69a (Aktinobakteri Roldkk., 1994) dan LGC354mix (BasilKlostridium Meierdkk., 1999). Penyelidikan NONEUB ( Wallnerdkk., 1993) digunakan sebagai kontrol negatif. Hibridisasi dilakukan secara paralel. Setelah hibridisasi selama 1,5 jam pada 46 °C, slide dicuci, dikeringkan di udara dan dipasang di DAPI/Vectashield ® . Formulasi ini mengandung DAPI sebagai counterstain nonselektif untuk DNA. Jumlah sel spesifik grup dilakukan dengan sampel yang diwarnai DAPI ini secara bersamaan dihibridisasi dengan probe berlabel Cy3 EUB338 dan probe berlabel Fam-6 spesifik grup masing-masing, untuk memungkinkan pewarnaan tiga kali lipat dari sel target ( Kobabedkk., 2004). Probe NONEUB digunakan sebagai kontrol negatif. Karena partikel tanah terganggu karena autofluoresensi dengan penghitungan dengan metode otomatis ( Kobabedkk., 2004 Lidkk., 2004), penghitungan dilakukan secara manual menggunakan mikroskop epifluoresensi (Leica DM5000B) yang dilengkapi dengan kamera digital dengan menghitung setidaknya 20-30 gambar per pendekatan hibridisasi. Jumlah sel bakteri dihitung pada massa kering oven (105 ° C) kuantifikasi dasar kelompok sel tertentu dilakukan relatif terhadap jumlah sel eubakteri yang berafiliasi.

Fosfolipid diekstraksi dari 2 g (masa segar) tanah, difraksinasi dan dikuantifikasi menggunakan prosedur yang dijelaskan ( Frostegarddkk., 1993 Bardgettdkk., 1996). Metil-ester asam lemak yang terpisah diidentifikasi menggunakan kromatografi gas dan detektor ionisasi nyala. Tata nama asam lemak digunakan seperti yang dijelaskan ( Frostegarddkk., 1993). Asam lemak i15 : 0, a15 : 0, 15 : 0, i16 : 0, 16 : 1ω7c, 17 : 0, i17 : 0, cy17 : 0, 18 : 1ω7c dan cy19 : 0 dipilih untuk mewakili biomassa bakteri (bakteri PLFA), dan 18 : 2ω6,9c (PLFA jamur) dipilih untuk mengindikasikan biomassa jamur (Federle, 1986 Zelles, 1999). Rasio PLFA bakteri terhadap PLFA jamur dihitung untuk menunjukkan pergeseran rasio antara biomassa bakteri dan jamur. Asam lemak spesifik Gram positif i15 : 0, a15 : 0, i16 : 0 dan i17 : 0 dan asam lemak spesifik Gram negatif cy17 : 0 dan cy19 : 0 ( Haubertdkk., 2006) diambil sebagai ukuran rasio antara bakteri Gram-positif dan Gram-negatif. Asam lemak 20 : 5ω3c digunakan sebagai indikator alga tanah ( Fleurencedkk., 1994 Khotimchenkodkk., 2002). Konsentrasi PLFA (nmol g -1 tanah) dihitung berdasarkan massa kering oven (105 °C).

Biomassa jamur

Kandungan ergosterol ditentukan sebagai ukuran biomassa jamur seperti yang dijelaskan oleh Schinnerdkk. (1996) dengan tiga ulangan.Secara singkat, ergosterol disaponifikasi dengan KOH, diekstraksi dengan n-heksana, dilarutkan dalam metanol setelah dikeringkan pada suhu 40 °C dalam rotavapor dan diukur dengan HPLC pada 282 nm (Zellesdkk., 1987).

Pengaruh suhu terhadap aktivitas dehidrogenase tanah

Aktivitas dehidrogenase tanah dilakukan dengan tiga ulangan seperti yang dijelaskan secara rinci oleh Schinnerdkk. (1996) dan Margesin & Schinner (2005), menggunakan iodonitrototetrazoliumklorida sebagai substrat dan 1 M Tris-HCl, pH 7, sebagai buffer. Setelah 1 jam inkubasi pada suhu mulai dari 10 hingga 40 °C, formazan iodonitrototetrazoliumklorida tereduksi diekstraksi dan diukur secara spektrofotometri.

Perlakuan data statistik

Sifat masing-masing sampel komposit dianalisis dengan tiga penentuan ulangan, dan nilai rata-rata dari penentuan ulangan digunakan untuk perhitungan statistik. Distribusi normal dikonfirmasi oleh uji Kolmogorov-Smirnov. Sifat, aktivitas, dan komunitas tanah di ketinggian subalpin (1500–1900 m) dan alpine (2300–2530 m) serta di lereng selatan dan utara dibandingkan dengan T-tes analisis (P<0,05). Korelasi antara sifat-sifat yang ditentukan diuji dengan korelasi Pearson.


Metode

Desain eksperimental

Kami membangun sebelas mikrokosmos lingkungan binaan yang identik yang mensimulasikan kondisi pencahayaan, reflektansi, suhu, dan kelembaban di ruangan dalam ruangan yang khas. Kotak-kotak ini adalah model skala 1:32 dari sebuah ruangan berukuran lebar 4,3 m, dalam 7,9 m, dan tinggi 3,3 m, dengan jendela pandang tunggal 3,5 m × 1,2 m dan ambang 1 m—dimensi dan proporsi yang baik dalam standar kamar residensial dan non residensial. Mikrokosmos ini ditempatkan di bukaan bangunan yang menghadap ke selatan dengan sedikit penghalang matahari sehingga jendela setiap mikrokosmos terbuka ke luar dan disegel ke pelat dasarnya dengan gasket karet untuk mencegah pertukaran udara. Lantai mikrokosmos dibatasi oleh kisi 3 × 5 (Gbr. 1a).

Salah satu dari tiga perawatan kaca diterapkan pada jendela sembilan mikrokosmos, mentransmisikan sebagian besar (i) terlihat, (ii) ultraviolet, atau (iii) tidak ada cahaya (yaitu pelat aluminium gelap). Kaca pemancar tampak memiliki profil spektral yang dimaksudkan untuk mewakili kaca arsitektur biasa yang digunakan dalam bangunan [26], menghalangi sebagian besar UVA dan UVB tetapi menerima inframerah yang paling terlihat dan dekat (Gbr. 1b). Kaca pemancar UV memiliki profil yang berlawanan, menerima sebagian besar radiasi UVA dan UVB tetapi menghalangi sebagian besar inframerah yang terlihat dan dekat (Gbr. 1b). Ini melayani dua tujuan. Pertama, ini memungkinkan kami untuk membandingkan struktur komunitas debu di ruangan yang terang dengan yang tidak (yaitu, kontras antara komunitas debu terang dan gelap). Kedua, ini memungkinkan kami untuk menentukan sejauh mana panjang gelombang ultraviolet bertanggung jawab atas pola yang diamati dalam struktur mikrobioma jika dibandingkan dengan ruangan yang menerima cahaya tampak. Ini adalah perbedaan penting karena penelitian sebelumnya telah menyarankan efek yang kuat dari panjang gelombang sinar ultraviolet pada kematian taksa bakteri [16].

Dua mikrokosmos tambahan dilengkapi dengan sensor cahaya di dalam setiap sel dari kisi 3 × 5: satu mikrokosmos untuk panjang gelombang terlihat (LI-COR 210SZ, Lincoln, Nebraska, USA) dan UV (Apogee SU-100, Logan, Utah, USA), untuk mengukur dosis sinar tampak dan sinar UV setiap jam di seluruh mikrokosmos. Satu sensor tambahan dari setiap jenis ditempatkan di atap gedung untuk memantau total cahaya eksterior. Sensor suhu (Onset, Bourne, Massachusetts, AS) dipasang di langit-langit setiap mikrokosmos untuk memantau kondisi sekitar guna memastikan bahwa sensor tersebut berada dalam rentang yang diamati di gedung. Mikrokosmos ditempatkan dalam selungkup kayu lapis dengan sistem iklim yang dikontrol secara termostatik dan kipas kecil untuk pencampuran udara untuk memberikan pengaturan suhu tambahan. Temperatur dipertahankan antara 18,19 dan 22,34 C selama eksperimen, tipikal kondisi di gedung-gedung, dengan rata-rata 20,28 C. Kami memastikan bahwa baik suhu harian maksimum maupun minimum tidak bervariasi secara signifikan antar ruangan, terlepas dari perlakuan cahaya, menggunakan model efek campuran linier (P=0.58, P=0,09 masing-masing) [35]. Kelembaban relatif di semua mikrokosmos dipertahankan antara 23 dan 64% selama percobaan. Rentang ini konsisten dengan ruang dunia nyata sesuai dengan standar desain untuk periode musim dingin dan musim panas [36].

Mikrokosmos menghasilkan rasio cahaya tampak rata-rata dari interior ke cahaya eksterior yang tersedia dari kira-kira 2,7% selama percobaan. Sebagai referensi, sekolah dan ruang kelas sering dirancang dengan rasio 2 hingga 4%, sedangkan bangunan seperti gudang biasanya berkisar antara 2 hingga 10% [37]. Dengan demikian, distribusi siang hari yang dicapai dalam mikrokosmos kami konsisten dengan ruang dunia nyata. Mikrokosmos ultraviolet karena itu mengalami kondisi cahaya yang konsisten dengan apa yang diharapkan jika kaca arsitektur mengakui panjang gelombang ini.

Debu dikumpulkan dari tujuh rumah sukarelawan perumahan keluarga tunggal di Eugene, OR, USA. Warga diinstruksikan untuk menggunakan penyedot debu pribadi untuk mengumpulkan dan mengumpulkan debu dari setiap ruangan di rumah mereka. Debu yang terkumpul dicampur dan dihomogenkan menggunakan gunting di laboratorium gelap. Enam sampel debu ulangan dengan berat 0,25 g dikumpulkan dari kumpulan debu yang dihomogenisasi dan diaplikasikan dalam lapisan tipis ke cawan petri steril individu untuk setiap mikrokosmos. Kami mendemonstrasikan bahwa sampel berulang dari kumpulan debu homogen ini menghasilkan komunitas bakteri yang relatif serupa dalam file tambahan 1. Mikrokosmos disterilkan dengan etanol sebelum dimulainya percobaan, dan cawan petri ditempatkan pada kisi penggambaran (Gbr. 1a) di masing-masing dari sembilan mikrokosmos (6 inokulum debu × 3 mikrokosmos per perawatan × 3 perawatan = total 54 komunitas bakteri). Percobaan dilakukan mulai 21 Desember 2015 hingga 18 Maret 2016.

Pengumpulan sampel dan analisis molekuler

Setelah periode paparan 90 hari, sampel debu dikumpulkan dari semua mikrokosmos dan dibagi lagi menjadi dua alikuot yang sama yaitu 0,125 g. Periode 90 hari dipilih berdasarkan perkiraan waktu tinggal partikel debu di bangunan nyata dengan frekuensi pembersihan normal [38] dan karena memungkinkan kami untuk mengkarakterisasi perubahan jangka panjang dalam mikrobioma debu relatif terhadap waktu generasi bakteri. Salah satu dari alikuot debu ini ditempatkan ke dalam tabung 15 mL untuk pengobatan propidium monoazide (PMA), untuk memisahkan komunitas bakteri yang layak dari total (yaitu, gabungan hidup dan mati) [39] yang lain tidak menerima pengobatan PMA dan sebagai gantinya diekstraksi menggunakan Kit Ekstraksi DNA MoBio PowerSoil (MoBio, Carlsbad, CA, USA). Setelah aktivasi foto, PMA link ke DNA ekstraseluler, menghalangi amplifikasi oleh reaksi berantai polimerase [39, 40]. Dua mililiter 1x phosphate-buffered saline (PBS) ditambahkan ke setiap tabung 15 mL untuk menangguhkan debu. Setiap tabung menerima 5 μL dari 20 mM PMA (Biotium, Fremont, CA, USA) berdasarkan instruksi pabrik, divorteks selama 5 detik, ditempatkan dalam gelap selama 5 menit, dan akhirnya ditempatkan di atas lapisan es untuk aktivasi foto. PMA diaktifkan menggunakan dua lampu halogen 500-W yang ditempatkan di atas sampel selama 15 menit. Pada tanda 5 dan 10 menit, tabung divorteks dan ditempatkan kembali di atas lapisan es. Setelah aktivasi PMA dengan perlakuan ringan, tambahan 2 mL PBS ditambahkan ke setiap sampel. Sampel kemudian disentrifugasi (Eppendorf 5810R) pada 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan menghilangkan sisa bolus debu diekstraksi dari tabung dan dipindahkan ke MoBio PowerLyzer Glass Bead Tube untuk ekstraksi DNA.

Baik DNA yang diobati dengan PMA dan non-PMA diamplifikasi dalam pengayaan PCR dari daerah V3 dan V4 (319F-806R) dari gen 16S rRNA mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Kembel et al. [41]: PCR dimurnikan dengan protokol pembersihan DNA berbasis manik menggunakan Mag-Bind RxnPure Plus (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA), diukur menggunakan kit uji Quant-iT dsDNA, dan dikumpulkan dengan konsentrasi yang sama amplikon menggunakan robot Eppendorf epMotion 5075. DNA dari semua sampel diekstraksi secara manual menggunakan MoBio PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit sesuai dengan instruksi pabrik dengan modifikasi sebagai berikut: 0,125 ± 0,01 g sampel debu digunakan, 1 mL larutan manik digunakan, sampel divortex menggunakan BioSpec Mini-BeadBeater 96 selama 1 menit, dan larutan C4 dan C5 diganti dengan larutan PW3 dan PW4/PW5 dari kit isolasi DNA PowerWater dari pabrikan yang sama seperti pada [41]. Perpustakaan diurutkan pada Illumina MiSeq yang menghasilkan pembacaan akhir berpasangan 250 bp.

Kami memperkirakan jumlah total salinan gen 16S rRNA per miligram debu (proksi untuk kelimpahan bakteri absolut) dari komunitas hidup dan total menggunakan PCR kuantitatif waktu-nyata (qPCR Applied Biosystems StepOnePlus System). Campuran reaksi (50 μL) berisi ABS PowerUp SYBR Green PCR Master Mix (25 μL), 10 μM Total Bakteri F SYBR Primer 5 -gtgStgcaYggYtgtcgtca-3 (2 μL), 10 μM Total Bakteri R SYBR Primer 5 -acgtcRtccMcaccttcctc-3 (2 μL), air tingkat PCR (16 μL), dan 5 μL dari 1:10 template DNA encer [42]. Plat dibuat menggunakan robot Eppendorf epMotion 5075. Program thermocycling adalah sebagai berikut: denaturasi awal selama 2 menit pada 50 C, 2 menit pada 95 C 40 siklus 15 detik pada 95 C, 15 detik pada 60 C, dan 60 detik pada 72 C diikuti oleh kurva leleh dalam kisaran 60 C hingga 95 C. Kurva standar dihasilkan menggunakan pengenceran serial Fragmen Gen gBlocks sintetis 167 bp (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA) dengan nomor salinan urutan gen yang diketahui.

Analisis statistik

Data urutan Illumina mentah disaring, dipangkas, dan dihilangkan menggunakan algoritma inferensi statistik DADA2 v1.7.0 [43, 44], yang mengidentifikasi varian urutan ribosom (RSV) dan memiliki manfaat lebih sedikit urutan palsu dibandingkan dengan pendekatan berbasis cluster yang digunakan untuk menyimpulkan unit taksonomi operasional. Pembacaan ke depan dipotong pada 200 nt, dan setiap pembacaan harus memiliki kurang dari dua kesalahan yang diharapkan berdasarkan skor kualitas. Taksonomi ditugaskan ke RSV menggunakan pengklasifikasi RDP Bayesian yang diimplementasikan di DADA2 terhadap database referensi Silva [45] versi 128, dengan ambang bootstrap 75% untuk mempertahankan klasifikasi. Sebelum analisis, kami menghapus varian yang diklasifikasikan sebagai mitokondria atau kloroplas, serta varian yang tidak diklasifikasikan di luar tingkat kerajaan. Jumlah RSV dinormalisasi dengan memperhalus dataset ke kedalaman sekuensing 50.000 urutan per sampel dan dikonversi ke kelimpahan absolut (salinan gen 16S rRNA × mg 1 debu) dengan menskalakan jumlah RSV yang dinormalisasi relatif di setiap komunitas dengan perkiraan total kelimpahan bakteri per miligram debu yang dihasilkan oleh tes qPCR [46]. Untuk menghilangkan kontaminan diduga, kami mengikuti saran dari Nguyen et al. [47] dan mengurangi jumlah urutan setiap RSV yang ada dalam PCR negatif dan kontrol kit ekstraksi DNA dari jumlah urutan dalam sampel eksperimental, pendekatan ini hanya menghilangkan empat RSV langka.

Perbedaan komunitas bakteri kuantitatif, atau β-keanekaragaman, dihitung menggunakan ukuran jarak Canberra [48] dan log101+x-mengubah kelimpahan RSV absolut. Efek dari perlakuan cahaya yang berbeda pada komposisi komunitas debu dikuantifikasi menggunakan analisis varians multivariat permutasi (PERMANOVA). Kontras berpasangan antara kelompok perlakuan dicapai dengan melakukan analisis PERMANOVA dengan 10.000 permutasi matriks untuk setiap pasangan tingkat faktor dan menyesuaikan P nilai untuk beberapa perbandingan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg [49]. Perbedaan varians kelompok diuji dengan menggunakan analisis homogenitas multivariat dispersi kelompok (prosedur permdisp2 [50]) dengan ANOVA dan uji post hoc Tukey. Perbedaan antara perkiraan berbasis qPCR dari total dan kelimpahan bakteri hidup antara komunitas yang mengalami cahaya tampak, ultraviolet, atau tanpa cahaya dinilai menggunakan ANOVA dan uji post hoc Tukey. Semua analisis dilakukan dengan bahasa pemrograman statistik, R [51].

Ketidaksamaan komunitas divisualisasikan menggunakan t-distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) [52, 53]. t-SNE adalah teknik embedding nonlinier yang berguna untuk memvisualisasikan data berdimensi tinggi yang terletak di dekat manifold berdimensi rendah [52] teknik visualisasi ini dipilih karena sejumlah kecil varian dengan kelimpahan absolut yang besar (lihat Hasil) yang dihasilkan efek lengkungan yang tidak informatif [54, 55] ketika β-keanekaragaman divisualisasikan dengan analisis koordinat utama yang tidak dibatasi (PCoA). Kami menyelesaikan visualisasi t-SNE dengan menginisialisasi implementasi algoritma Barnes-Hut [53] dalam paket Rtsne menggunakan koordinat titik yang dihasilkan oleh PCoA.

Pelacakan sumber bakteri

Kami mengklasifikasikan jenis komunitas mikroba hidup dan mati yang tersisa dalam debu setelah paparan 90 hari menggunakan pengklasifikasi pelacakan sumber Bayesian (SourceTracker v1.0.1 [56]). Tujuan kami adalah untuk memperkirakan kontribusi relatif mikrobioma yang berasal dari manusia dan lingkungan untuk setiap komunitas debu yang bertahan setelah perawatan ringan. Kami mengumpulkan kumpulan data pelatihan yang terdiri dari mikrobioma manusia dan lingkungan lokal yang, seperti sampel debu kami, dikumpulkan di atau dekat Eugene, OR, AS. Data pelatihan mikrobioma manusia termasuk komunitas bakteri dari satu set penyeka kulit lengan dan kaki manusia (n=94) dari sukarelawan lokal dan subset komunitas tinja dari [57] penduduk Oregon American Gut Project (n=83). Data pelatihan mikrobioma lingkungan termasuk piring pengendapan udara luar ruangan (n=27) ditempatkan di luar rumah tempat tinggal lokal dan satu set inti tanah (n=21) dikumpulkan dari hutan Oregon untuk Proyek Mikrobioma Bumi [58]. Detail tentang kumpulan data yang digunakan untuk pelacakan sumber disediakan di File tambahan 1.

Untuk memperhitungkan variasi dalam pengumpulan sampel, pemrosesan, dan kedalaman pengurutan di antara studi individu dan proses pengurutan, kumpulan data pelatihan akhir yang digunakan untuk pelacakan sumber dikumpulkan pada tingkat genus bakteri dan dijernihkan hingga kedalaman 2500 urutan per taksa sampel yang genusnya -klasifikasi tingkat tidak memenuhi ambang bootstrap 75% terhadap database referensi Silva versi 128 dikumpulkan pada tingkat taksonomi tertinggi berikutnya. Model terlatih kemudian diuji pada sampel eksperimental yang dikumpulkan menggunakan prosedur yang sama, menghasilkan prediksi yang lebih kasar daripada analisis tingkat RSV.

Analisis filogenetik

Kami menggunakan analisis diskriminan linier jarang berbasis pohon filogenetik (sLDA) sebagai alat pemilihan fitur, untuk mengidentifikasi apakah RSV individu atau kelompok RSV terkait membedakan antara komunitas debu eksperimental di bawah rezim pencahayaan yang berbeda. Rincian analisis ini dijelaskan oleh Fukuyama et al. [59] dan diringkas di bawah ini. Secara singkat, kami membuat pohon filogenetik de novo RSV menggunakan model filogenetik GTR+ Gamma kemungkinan maksimum di FastTree [60] mengikuti Callahan et al. [44]. Pohon itu digunakan untuk menghasilkan dua set fitur: satu terdiri dari log101+x-mengubah kelimpahan absolut dari setiap daun RSV, dan yang lain terdiri dari setiap simpul di pohon. Untuk set terakhir, nilai yang terkait dengan setiap node adalah log101+x-mengubah kelimpahan jumlah semua daun RSV yang turun. Ini diskalakan dan digunakan sebagai masukan untuk implementasi sLDA dalam paket sparseLDA, jumlah optimal prediktor model dan parameter sparsitas ditentukan oleh lima pengulangan dari validasi silang lima kali lipat. Pendekatan ini mengabaikan panjang cabang dan sebaliknya menggabungkan informasi filogenetik dengan menggunakan kendala sparsity yang memungkinkan pemodelan simultan dan pemilihan fitur daun dan simpul dengan nilai fitur yang sangat kovariasi [59].

Teori pengambilan sampel ekologi

Kami membangun teori yang dikembangkan oleh Klein et al. [61] dan mengembangkan model null komputasi [33, 34] yang memprediksi perbedaan kualitatif dalam pola kelimpahan RSV setelah hilangnya simulasi sejumlah kecil bakteri "sensitif cahaya" yang melimpah. Model memprediksi perubahan dalam tingkat deteksi, dan oleh karena itu tampak kelimpahan, taksa berpasangan dari komunitas yang hampir identik di mana seseorang telah kehilangan sejumlah kecil anggota komunitas yang melimpah. Perubahan ini dikatakan jelas karena komunitas yang mendasarinya sebaliknya perbedaan yang identik dalam kelimpahan RSV tampaknya hanya terjadi sebagai akibat dari hilangnya taksa yang sangat melimpah, yang melonggarkan batasan pada tingkat deteksi semua yang lain [62]. Tujuan utama dari prosedur pemodelan ini adalah untuk menghasilkan harapan nol mengenai bias tersebut dan untuk mendapatkan intuisi tentang bagaimana pengaruhnya terhadap pengamatan komunitas debu setelah perlakuan ringan.

Model kami berasal dari dua pola skala komunitas. Analog dengan distribusi kelimpahan spesies dalam ekologi [63], pertama-tama kita mengasumsikan distribusi kelimpahan urutan (SAD) yang menggambarkan kelimpahan ((chi _)_^) salinan gen 16S rRNA per miligram debu yang berasal dari sel hidup dan mati dari S taksa bakteri dalam suatu komunitas. Kami mengasumsikan distribusi lognormal untuk SAD ini, yang umumnya digunakan dalam model ekologi [63], dari mana ((chi)_^) adalah sampel acak dari Lognormal(μ,σ). Kedua, kita asumsikan bahwa fraksi dari χSaya salinan gen yang berasal dari sel hidup diberikan oleh fungsi logistik

di mana φ dan λ adalah kelangsungan hidup minimum dan maksimum, k adalah parameter yang menggambarkan kecuraman kurva, dan χ0 adalah konstanta setengah jenuh. Jadi, ((alpha (chi _) chi _)_^) mewakili ukuran populasi hidup untuk koleksi taksa ini. Asumsi dasar kami adalah bahwa fraksi salinan gen yang berasal dari sel hidup hanya merupakan fungsi dari kelimpahan gen itu. Karena bentuk fungsional dari hubungan ini tidak diketahui untuk komunitas bakteri, kami mempelajari model dengan banyak derajat kebebasan (seperti yang diparameterisasi oleh φ,λ,χ0, dan k) untuk mengevaluasi berbagai struktur komunitas dan ketergantungan antara jumlah total DNA dan viabilitas.

Kami melakukan 10 4 iterasi dari prosedur simulasi ini, secara independen menggambar nilai parameter dari distribusi seragam (File tambahan 2: Tabel S1), kami kemudian mengulangi ini untuk setiap set parameter yang ditarik, kali ini mensimulasikan hilangnya sejumlah kecil "sensitif cahaya" yang melimpah ” dengan menghapus antara 10 dan 65 sekuens paling banyak dari SAD. Rentang ini dipilih karena mencerminkan hasil eksperimen (lihat “Hasil”). Untuk mensimulasikan pengurutan komunitas dengan SAD yang mendasari ini, kami memperhitungkan fakta bahwa studi mikrobioma biasanya mengumpulkan perpustakaan pengurutan dalam konsentrasi amplikon yang sama dengan melakukan pengambilan sampel acak yang bias ukuran dari ((alpha (chi _) chi _)_^) pada kedalaman tetap 50.000 bacaan. Prosedur ini menghasilkan distribusi kelimpahan yang dimaksudkan untuk meniru yang diperoleh dari sekuensing throughput tinggi, untuk pasangan komunitas yang layak yang mengalami inaktivasi taksa dominan tetapi sebaliknya identik. Prediksi model dirangkum menggunakan plot dari perubahan nyata 10 kali lipat yang diharapkan dalam kelimpahan urutan yang disimulasikan untuk setiap pasangan komunitas, sebagai fungsi dari kelimpahan sebenarnya dari urutan tersebut.


Bahan dan metode

Desain Studi

Untuk membandingkan efektivitas ekstraksi DNA bakteri dan jamur secara simultan, kami menggunakan dua jenis bahan tinja, (i) kotoran tikus bebas kuman, karena tidak adanya mikrobiota yang layak dan beban DNA mikroba latar belakang yang sangat rendah yang berasal dari makanan dan tempat tidur yang disterilkan dengan iradiasi (Fontaine et al., 2015 Schwarzer et al., 2017), dikonfirmasi juga dalam percobaan kami (Tabel Tambahan S1), dan (ii) stok tinja manusia tunggal yang mewakili kontrol jenis sampel alami untuk memastikan komposisi mikroba yang identik di semua sampel. Kotoran bebas kuman diinokulasi dengan jumlah bakteri klinis yang diketahui (Enterococcus faecalis) dan jamur (Candida albicans dan Aspergillus fumigatus) untuk mengevaluasi hasil metode ini menggunakan PCR waktu-nyata. Strain dipilih sebagai perwakilan khas dari mikroorganisme gram positif, ragi dan filamen. Kotoran manusia yang berfungsi sebagai kontrol kendaraan dianalisis untuk membandingkan metode ekstraksi DNA dalam hal integritas, kemurnian, kuantitas DNA dan komposisi mikroba. Penggunaan sampel tinja manusia tunggal dimaksudkan untuk menghindari efek variabilitas antar individu yang diamati di tempat lain (Huseyin et al., 2017). Detail desain penelitian ditunjukkan pada Gambar 1.

Gambar 1. Desain studi eksperimental. Gambar tersebut merangkum langkah-langkah yang diambil dan jumlah sampel yang diproses pada setiap langkah. Dua jenis bahan tinja digunakan untuk tiga set ekstraksi DNA, berbeda dalam proses spiking. DNA diekstraksi dari semua sampel tinja berduri dan tidak berduri dalam rangkap tiga (Set kontrol dasar 2 diproses dalam duplikat) menggunakan lima metode ekstraksi yang berbeda. Kemudian sampel DNA dikuantifikasi menggunakan real-time PCR. Sampel DNA yang diekstraksi dari tinja manusia dianalisis lebih lanjut untuk kemurnian, integritas, hasil, dan komposisi mikroba.

Persiapan dan Pengumpulan Sampel

Sampel feses tikus bebas kuman diperoleh dari Laboratorium Gnotobiologi, Institut Mikrobiologi, Akademi Ilmu Pengetahuan Republik Ceko. Laboratorium ini mapan dalam penelitian hewan bebas kuman (Kozakova et al., 2016 Schwarzer et al., 2016). Satu sampel tinja manusia disumbangkan oleh sukarelawan sehat yang menandatangani persetujuan sesuai dengan Komite Etik Pusat Bedah Kardiovaskular dan Transplantasi (Protokol no. 201603).

Segera setelah melahirkan, dua gram feses mencit dihomogenkan menggunakan TissueRuptor ® (Qiagen, Jerman) dalam 18 mL PBS yang diautoklaf, dibagi menjadi 160 μl aliquot (n = 85) dan dibekukan pada -80ଌ hingga digunakan. Kemudian, alikuot tinja dipisahkan menjadi beberapa kelompok untuk dua set ekstraksi DNA independen. Untuk set pertama, aliquot (n = 30) secara bersamaan dibubuhi dengan 20 μl dari dua yang berbeda C. albicans konsentrasi (6,9 × 10 4 atau 6,9 × 105 sel/ml konsentrasi rendah atau tinggi, masing-masing) dan 20 μl E. faecalis konsentrasi (7,7 × 10 5 atau 7,7 × 10 7 sel/ml), menghasilkan total volume sampel 200 μl (Gambar 1). Untuk set kedua, aliquot (n = 30) dibubuhi 20 μl dari dua jumlah yang berbeda A. fumigatus (10 6 atau 108 sel/ml kira-kira) dan 20 μl air steril (B. Braun Medical, Inc., Jerman) untuk mengawetkan volume sampel yang sama. Alikuot tinja dibubuhi dengan 40 μl air steril (n = 25) dimasukkan dalam kedua kelompok sebagai kontrol beban DNA mikroba dasar.

Selain itu, kami menggunakan 200 mg kotoran manusia, yang berfungsi sebagai kontrol tipe sampel alami untuk set ekstraksi DNA independen ketiga. Feses dihomogenkan dalam 4 mL PBS yang diautoklaf, dibagi menjadi 200 μl aliquot (n = 15), dan dibekukan pada -80ଌ hingga digunakan. Pengenceran dilakukan untuk membuat sampel homogen dan dapat dipipet untuk memastikan volume yang persis sama (jumlah mikrobiota yang sama) di semua sampel dan dengan demikian, kondisi yang identik untuk setiap metode ekstraksi diuji.

Metode yang Digunakan untuk Ekstraksi DNA

Lima metode ekstraksi DNA tinja yang berbeda dievaluasi dalam penelitian ini: QIAamp DNA Stool Mini Kit dengan langkah pra-perawatan (QIA Qiagen, Jerman), PureLink TM Microbiome DNA Purification Kit (PL Thermo Fisher Scientific, Amerika Serikat), ZR Fecal DNA MiniPrep TM Kit (ZR Zymo Research, Amerika Serikat), NucleoSpin ® DNA Stool Kit (NS MacheREY-NAGEL GmbH & Co., KG, Inggris Raya) dan protokol non-komersial Q, direkomendasikan oleh International Human Microbiome Consortium ( disingkat IHMS). Semua prosedur protokol dilakukan sesuai dengan instruksi pabrikan dengan perbedaan kecil (protokol terperinci ditunjukkan dalam Materi Tambahan). Tiga set ekstraksi DNA independen dilakukan (Gambar 1), dan semua sampel eksperimental diproses dalam rangkap tiga untuk evaluasi reproduktifitas. Sampel dengan air steril digunakan sebagai reagen negatif dan kontrol kontaminasi proses. Secara keseluruhan, 115 sampel dan kontrol reagen diekstraksi di semua set.

Kualitas dan Kuantifikasi DNA yang Diekstraksi

Konsentrasi DNA ditentukan secara fluorometri pada Qubit ® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Amerika Serikat) menggunakan Qubit TM dsDNA HS Assay Kit. Kemurnian DNA ditentukan melalui rasio 260/280 dan 260/230 yang diukur pada NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Amerika Serikat). Integritas DNA ditentukan dengan elektroforesis gel agarosa 0,6% dan divisualisasikan (Gambar Tambahan S1).

Kuantifikasi Real-Time DNA Bakteri dan Jamur

Kit PCR real-time komersial untuk spesifik E. faecalis deteksi (PrimerDesign TM Genesig, Inggris) digunakan untuk mengevaluasi hasil bakteri menggunakan Sistem PCR Real-Time cepat ABI 7500 (Applied Biosystems, Amerika Serikat).

Hasil jamur dievaluasi menggunakan uji PCR real-time rentang luas seperti yang dijelaskan sebelumnya (Nemcova et al., 2015) menggunakan Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Austria). Secara singkat, amplifikasi wilayah ITS2 menggunakan primer UNF1 (5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′) dan UNF2 (5′-TTGATATGCTTAAGTTCAGCGG-3′) dilakukan dengan campuran 2 × SensiFAST HRM (Bioline, Inggris) dan Air Bebas RNase (Qiagen, Jerman).

Dalam kedua uji PCR waktu nyata, semua sampel yang dianalisis dilakukan dalam duplikat dengan kurva kalibrasi yang diencerkan secara serial. Air steril tidak berfungsi sebagai kontrol template. Ekstrak kultur murni berfungsi sebagai kontrol positif untuk verifikasi spesies. Secara keseluruhan, 394 reaksi PCR real-time untuk sampel tinja bebas kuman dan 60 reaksi PCR real-time untuk sampel tinja manusia (termasuk kontrol) dilakukan.

Analisis statistik dilakukan dan divisualisasikan dalam R (3.4.2). Analisis varian satu arah (ANOVA, fungsi aov di R) diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey (fungsi Tukey HSD di R) digunakan untuk mengevaluasi hasil DNA dan data PCR waktu nyata. P-nilai lebih rendah dari 0,05 dianggap signifikan. Data transformasi log digunakan untuk analisis perubahan lipatan.

Analisis Komposisi Bakteri dan Jamur Menggunakan NGS Sequencing

Komunitas mikroba diprofilkan oleh 16S rDNA dan ITS1 rDNA pengurutan amplikon menggunakan platform pengurutan Illumina MiSeq. Primer dengan urutan kode batang unik untuk amplifikasi PCR di atas bakteri 16S rDNA wilayah gen V3/V4 dirancang seperti yang dijelaskan sebelumnya (Kubasova et al., 2017). Pasangan primer ITS1F/ITS2, yang direkomendasikan oleh Earth Microbiome Project 1 , digunakan dengan urutan kode batang unik yang dirancang dalam penelitian ini, untuk memperkuat wilayah spacer transkripsi internal jamur 1 (ITS1) dari operon rRNA (Tabel Tambahan S2).

Perpustakaan 16S dibangun sesuai dengan �S protokol Persiapan Perpustakaan Urutan Metagenomik” yang direkomendasikan oleh Illumina, dengan sedikit perbedaan. Secara singkat, PCR dilakukan dengan 2 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems, Inc., Amerika Serikat) dalam kondisi berikut: denaturasi awal pada 95ଌ selama 15 menit, diikuti oleh 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95ଌ selama 40 detik, anil pada 55ଌ selama 45 detik dan ekstensi pada 72ଌ selama 60 detik, dengan langkah ekstensi akhir pada 72ଌ selama 5 menit. Dari setiap reaksi, 5 μl dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 2%. Produk PCR dimurnikan menggunakan manik-manik magnetik AMPure XP (Beckman Coulter Inc., Amerika Serikat) yang diencerkan menjadi konsentrasi equimolar dan dikumpulkan sesuai dengan urutan kode batang uniknya, yang memungkinkan multiplexing. Hanya sampel dengan urutan kode batang yang berbeda yang dikumpulkan bersama. Selanjutnya, kode batang indeks ganda Illumina ditambahkan ke produk PCR yang dikumpulkan dengan Kit Indeks XT Nextera (Illumina, Amerika Serikat). Produk PCR yang diindeks dimurnikan dan digabungkan ke dalam konsentrasi equimolar sebelum pengurutan ujung berpasangan dengan MiSeq Reagent Kit v3 (siklus 600 –) (Illumina), mengikuti petunjuk pabrikan.

Perpustakaan ITS1 dibangun dengan cara yang mirip dengan Perpustakaan 16S, dengan modifikasi berikut: PCR dilakukan dengan HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Jerman), 4 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific, Amerika Serikat), Air Bebas RNase dalam kondisi berikut: denaturasi awal pada 95ଌ selama 15 menit, diikuti oleh 40 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95ଌ selama 30 detik, annealing pada 56ଌ selama 45 s dan ekstensi pada 72ଌ selama 60 detik, dengan langkah ekstensi terakhir pada 72ଌ selama 10 menit. Pada langkah pembersihan pertama, kami meningkatkan jumlah manik menjadi 35 μl per sampel agar sesuai dengan volume input. Kemudian produk PCR yang dimurnikan diencerkan hingga konsentrasi ekuimolar dan sampel dengan urutan kode batang yang berbeda dikumpulkan bersama. Selanjutnya, kode batang indeks ganda Illumina ditambahkan ke kumpulan dengan Kit Indeks XT Nextera (Illumina, Amerika Serikat). Kumpulan PCR yang diindeks dimurnikan dan digabungkan ke dalam konsentrasi equimolar sebelum pengurutan ujung berpasangan dengan MiSeq Reagent Kit v3 (siklus 600 –) (Illumina) mengikuti petunjuk pabrikan.

Bioinformatika dan Analisis Statistik Data NGS

Untuk kedua perpustakaan, analisis data urutan mentah dilakukan menggunakan pipa QIIME (v. 1.9.1.) (Caporaso et al., 2010). Pasangan baca 16S dan ITS1 didemultipleks berdasarkan urutan kode batang unik dan kemudian digabungkan menggunakan skrip QIIME default (join_paired_end.py). Urutan chimeric diidentifikasi menggunakan VSEARCH (v. 2.6.1) (Rognes et al., 2016) dengan database referensi Greengenes (v. 4feb2011) untuk bakteri dan dataset referensi UCHIME (v. 7.2) untuk jamur. Urutan dikelompokkan ke dalam OTU pada ambang 97% menggunakan VSEARCH 2.6.1 de novo. Satu set urutan yang mewakili OTU telah dibuat, dan taksonomi ditetapkan (menggunakan skrip: assign_taxonomy.py) ke setiap urutan menggunakan database Greengenes (v. gg_13_8_otus) dan Uclust (v. 1.2.22q) (Edgar, 2010) untuk bakteri, dan menggunakan BLAST dan UNITE (v. 7.2) 2 untuk jamur (urutan input dicari berdasarkan database BLAST dari urutan referensi yang ditentukan sebelumnya dari UNITE). Proses ini menghasilkan tabel OTU dalam format BIOM dengan singletons dibuang. Tabel OTU bakteri disaring untuk OTU, dengan jumlah sekuens kurang dari 0,005% dari total jumlah sekuens (Bokulich et al., 2013). Tabel OTU jamur tidak disaring lebih lanjut. PyNAST (v. 1.2.2.) digunakan untuk menyelaraskan urutan perwakilan untuk membangun pohon filogenetik menggunakan FastTree (v. 2.1.3) dalam analisis bakteri. Metrik non-filogenetik (yaitu, jarak perbedaan Bray𠄼urtis) dihitung untuk jamur karena tidak dapat diterapkannya metrik berbasis filogenetik (yaitu, jarak UniFrac Tertimbang/Tidak Tertimbang) untuk analisis urutan ITS1 (Halwachs et al., 2017). Perhitungan keragaman alfa dan beta dilakukan dan divisualisasikan dengan skrip QIIME core_diversity_analyses.py.

Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak Calypso online (versi 8.82) (Zakrzewski et al., 2017). Data dinormalisasi menggunakan penskalaan kumulatif-jumlah (CSS) dan transformasi log2. Perhitungan keragaman beta divisualisasikan menggunakan plot analisis koordinat utama (PCoA), berdasarkan jarak UniFrac yang tidak berbobot, UniFrac (data bakteri) dan Bray𠄼urtis (data jamur), dan dibandingkan menggunakan uji analisis kesamaan nonparametrik (ANOSIM). Selain itu, uji Kruskal–Wallis dan generalized linear model (GLM) nonparametrik yang diterapkan dalam uji ALDEx2 diterapkan untuk mendeteksi perbedaan kelimpahan taksa pada tingkat genera. Tes ini dilakukan hanya dengan taksa kelimpahan yang lebih tinggi (>0,01% dari total). NS P-nilai disesuaikan menurut prosedur Benjamini–Hochberg. P-nilai lebih rendah dari 0,05 dianggap signifikan. Untuk mengkarakterisasi profil komposisi spesifik metode, pengukuran 𠇌ore microbiome” dilakukan.


Bahan dan metode

Situs dan tanah

Sampel tanah dikumpulkan pada bulan Agustus 2006 sepanjang gradien ketinggian di atas 1030 m (subalpin: 1500 m dan 1900 m alpine: 2300 m dan 2530 mdpl) di Pegunungan Alpen Tengah Austria (daerah Hohe Tauern/Grossglockner) baik di selatan maupun di lereng utara. Rincian lokasi, vegetasi, iklim dan karakteristik tanah disajikan pada Tabel 1 dan 2. Bahan induk (Chorizon) didominasi gneiss (silikat) untuk semua tanah. Dari setiap lokasi, 10 sampel tanah (sub-sampel) diambil secara acak dari area 100 m × 100 m dari 5 cm atas, dibulatkan untuk menghasilkan sampel komposit, diangkut dalam kotak dingin ke laboratorium, diayak (<2 mm) dan disimpan di 2 °C.

Karakteristik lingkungan dari lokasi yang diteliti

Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175
Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175

Rata-rata tahunan, diukur pada kedalaman 5 cm.

Karakteristik lingkungan dari lokasi yang diteliti

Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175
Lokasi Ketinggian (m dpl) Lereng Jenis vegetasi Suhu udara (°C) Suhu tanah (°C) Curah hujan (mm) Hari es (Tmin 0 °C) per tahun Hari-hari beku (Tmaksimal 0 °C) per tahun
Minimum/ Maksimum/ Rata-rata
Heiligenblut 1500 Selatan Hay padang rumput −15.2/24.5/3.1 12.1 1380 67 157
usus 1900 Selatan padang rumput Alpen −15.6/20.7/1.6 10.5 1602 116 211
Kelengkungan 2300 Selatan Tikar sedge alpine −19.4/16.1/−2.1 6.8 1915 156 240
Hochtor Sud 2530 Selatan Tingkat tanaman bantal −25.2/14.7/−3.3 4.1 2100 205 290
Hochtor Nord 2530 Utara Tingkat tanaman bantal −27.0/10.2/−3.8 2.8 2250 220 300
Fuschertörl 2300 Utara Tikar sedge alpine −21.5/12.5/−2.5 4.9 2100 180 265
Hochmais 1900 Utara padang rumput Alpen −18.1/17.1/1.1 8.2 1780 132 230
Piffalpe 1500 Utara Hay padang rumput −17.2/20.6/2.9 10.1 1520 85 175

Rata-rata tahunan, diukur pada kedalaman 5 cm.

Sifat-sifat tanah yang dipelajari

Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5
Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5

Sifat-sifat tanah yang dipelajari

Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5
Ketinggian (m) Lereng pH CaCO3 (%) Humus (%) Jumlah N (%) C/T Konduktivitas (μs cm 1) Pasir (%, (<2000–63 m) Lumpur (%, <63–2 m) Tanah Liat (%, <2 m)
1500: subalpin Selatan 5.5 9.7 4.6 0.26 10.2 59 70 27 3
1900: subalpin Selatan 5.3 <1 10.6 0.52 11.9 41 74 21 5
2300: pegunungan Selatan 4.4 1.2 8.7 0.34 15.0 31 73 23 4
2530: pegunungan Selatan 5.5 1.2 3.7 0.16 13.6 29 65 33 2
2530: pegunungan Utara 5.8 <1 0.7 0.06 7.4 33 76 23 1
2300: pegunungan Utara 5.9 10.6 3.8 0.14 15.7 29 73 26 2
1900: subalpin Utara 4.3 <1 8.4 0.37 13.3 30 64 30 6
1500: subalpin Utara 5.8 <1 16.7 0.64 15.3 59 67 28 5

Sifat fisik dan kimia tanah

Analisis tanah meliputi pengukuran massa kering, pH (CaCl2), kandungan karbonat [penentuan volumetrik gas (setelah Scheibler) CO2 dilepaskan setelah penambahan 10% HCl], kandungan humus (pembakaran kering karbon), nitrogen total (metode Kjeldahl: pencernaan dengan H2JADI4), C/N, konduktivitas dan distribusi ukuran partikel (sedimentasi) menurut metode standar ( Schinnerdkk., 1996 NORM L1084, 1999 NORM L1061-2, 2002 NORM L1080, 2005 NORM L1082, 2005).

Pencacahan bakteri tanah yang dapat dikultur

Jumlah bakteri tanah yang dapat dikultur ditentukan dengan metode penghitungan pelat untuk sel yang hidup. Pengenceran suspensi tanah yang sesuai dioleskan ke permukaan agar-agar. Pelat R2A yang mengandung sikloheksimida (400 g mL -1 ) digunakan untuk menentukan jumlah bakteri heterotrofik. CFU dihitung setelah 7 hari pada 25 °C dan setelah 21 hari pada 1 °C.

Jumlah bakteri total

Sampel tanah (5 g massa segar) dikocok selama 30 menit pada 180 r.p.m. dengan 45 mL larutan natrium pirofosfat (0,1% b/v), diencerkan lebih lanjut (1 : 5) dan disaring. Jumlah total bakteri ditentukan dalam filtrat dengan pewarnaan nonselektif 4′,6′-diamino-2-phenylindole (DAPI 1,5 g mL 1) menggunakan DAPI/Vectashield ® dan mikroskop epifluoresensi seperti dijelaskan di bawah.

Filtrat tanah yang digunakan untuk menentukan jumlah bakteri total digunakan untuk fiksasi. Fiksasi bakteri tanah dilakukan pada 4% paraformaldehida fiksasi etanol digunakan untuk kelompok sasaran Gram-positif (Zardadkk., 1997 Daimsdkk., 2005). IKAN dilakukan menurut Daimsdkk. (2005), menggunakan probe oligonukleotida untuk kelompok filogenetik yang berbeda dari domain Bakteri ( Loydkk., 2007): EUB338 (Eubacteria Stahl & amp Amann, 1991), ALF1b (Alphaproteobacteria Manzodkk., 1992), BET42a (Betaproteobakteri Manzodkk., 1992), GAM42a (Gammaproteobacteria Manzodkk., 1992), CF319a (SitofagaFlavobakteri Manzodkk., 1996), HGC69a (Aktinobakteri Roldkk., 1994) dan LGC354mix (BasilKlostridium Meierdkk., 1999). Penyelidikan NONEUB ( Wallnerdkk., 1993) digunakan sebagai kontrol negatif. Hibridisasi dilakukan secara paralel. Setelah hibridisasi selama 1,5 jam pada 46 °C, slide dicuci, dikeringkan di udara dan dipasang di DAPI/Vectashield ® . Formulasi ini mengandung DAPI sebagai counterstain nonselektif untuk DNA. Jumlah sel spesifik grup dilakukan dengan sampel yang diwarnai DAPI ini secara bersamaan dihibridisasi dengan probe berlabel Cy3 EUB338 dan probe berlabel Fam-6 spesifik grup masing-masing, untuk memungkinkan pewarnaan tiga kali lipat dari sel target ( Kobabedkk., 2004). Probe NONEUB digunakan sebagai kontrol negatif. Karena partikel tanah terganggu karena autofluoresensi dengan penghitungan dengan metode otomatis ( Kobabedkk., 2004 Lidkk., 2004), penghitungan dilakukan secara manual menggunakan mikroskop epifluoresensi (Leica DM5000B) yang dilengkapi dengan kamera digital dengan menghitung setidaknya 20-30 gambar per pendekatan hibridisasi. Jumlah sel bakteri dihitung pada massa kering oven (105 ° C) kuantifikasi dasar kelompok sel tertentu dilakukan relatif terhadap jumlah sel eubakteri yang berafiliasi.

Fosfolipid diekstraksi dari 2 g (masa segar) tanah, difraksinasi dan dikuantifikasi menggunakan prosedur yang dijelaskan ( Frostegarddkk., 1993 Bardgettdkk., 1996). Metil-ester asam lemak yang terpisah diidentifikasi menggunakan kromatografi gas dan detektor ionisasi nyala. Tata nama asam lemak digunakan seperti yang dijelaskan ( Frostegarddkk., 1993). Asam lemak i15 : 0, a15 : 0, 15 : 0, i16 : 0, 16 : 1ω7c, 17 : 0, i17 : 0, cy17 : 0, 18 : 1ω7c dan cy19 : 0 dipilih untuk mewakili biomassa bakteri (bakteri PLFA), dan 18 : 2ω6,9c (PLFA jamur) dipilih untuk mengindikasikan biomassa jamur (Federle, 1986 Zelles, 1999). Rasio PLFA bakteri terhadap PLFA jamur dihitung untuk menunjukkan pergeseran rasio antara biomassa bakteri dan jamur. Asam lemak spesifik Gram positif i15 : 0, a15 : 0, i16 : 0 dan i17 : 0 dan asam lemak spesifik Gram negatif cy17 : 0 dan cy19 : 0 ( Haubertdkk., 2006) diambil sebagai ukuran rasio antara bakteri Gram-positif dan Gram-negatif. Asam lemak 20 : 5ω3c digunakan sebagai indikator alga tanah ( Fleurencedkk., 1994 Khotimchenkodkk., 2002). Konsentrasi PLFA (nmol g -1 tanah) dihitung berdasarkan massa kering oven (105 °C).

Biomassa jamur

Kandungan ergosterol ditentukan sebagai ukuran biomassa jamur seperti yang dijelaskan oleh Schinnerdkk. (1996) dengan tiga ulangan. Secara singkat, ergosterol disaponifikasi dengan KOH, diekstraksi dengan n-heksana, dilarutkan dalam metanol setelah dikeringkan pada suhu 40 °C dalam rotavapor dan diukur dengan HPLC pada 282 nm (Zellesdkk., 1987).

Pengaruh suhu terhadap aktivitas dehidrogenase tanah

Aktivitas dehidrogenase tanah dilakukan dengan tiga ulangan seperti yang dijelaskan secara rinci oleh Schinnerdkk. (1996) dan Margesin & Schinner (2005), menggunakan iodonitrototetrazoliumklorida sebagai substrat dan 1 M Tris-HCl, pH 7, sebagai buffer. Setelah 1 jam inkubasi pada suhu mulai dari 10 hingga 40 °C, formazan iodonitrototetrazoliumklorida tereduksi diekstraksi dan diukur secara spektrofotometri.

Perlakuan data statistik

Sifat masing-masing sampel komposit dianalisis dengan tiga penentuan ulangan, dan nilai rata-rata dari penentuan ulangan digunakan untuk perhitungan statistik. Distribusi normal dikonfirmasi oleh uji Kolmogorov-Smirnov. Sifat, aktivitas, dan komunitas tanah di ketinggian subalpin (1500–1900 m) dan alpine (2300–2530 m) serta di lereng selatan dan utara dibandingkan dengan T-tes analisis (P<0,05). Korelasi antara sifat-sifat yang ditentukan diuji dengan korelasi Pearson.


Proyek Cetakan Roti

Untuk mempelajari pertumbuhan jamur pada sampel roti setiap hari alternatif, selama 2 minggu.

Peringatan

Jika Anda alergi terhadap jamur, maka hindari melakukan percobaan ini atau gunakan masker dan sarung tangan untuk keselamatan. Mintalah izin dari orang tua dan guru Anda sebelum Anda memulai eksperimen. Juga, setelah Anda selesai mencatat hasil percobaan, buang kantong berisi roti berjamur dengan aman, tanpa membukanya.

Peralatan

Berikut adalah daftar bahan yang Anda perlukan untuk melakukan percobaan.

  • 5 potong roti
  • 5 tas transparan yang dapat ditutup
  • Sarung tangan
  • Sebuah topeng
  • Label lengket
  • Sebuah penanda
  • Kaca pembesar
  • 5 – 7 penyeka kapas
  • Sebuah sendok makan
  • Jus lemon/air/jus apel/garam/gula (setidaknya dua item ini diperlukan)

Prosedur

Menumbuhkan jamur bisa menjadi eksperimen sederhana, dan dilakukan pada sepotong roti. Namun, untuk membuatnya menarik dan lebih detail Anda bisa mengerjakan 5 sampel roti bukan hanya satu. Jadi, kumpulkan peralatan di atas dan ikuti langkah-langkah di bawah ini.

  1. Ambil kapas dan usapkan pada area yang berdebu, seperti di bawah meja, tempat tidur, atau ruang bawah tanah.
  2. Kemudian gosokkan debu dari kapas di atas irisan roti pertama.
  3. Ulangi langkah 2 untuk empat potong roti lainnya.
  4. Segel tiga irisan roti di dalam tiga kantong transparan yang bisa ditutup.
  5. Tempelkan stiker pada ketiga tas tersebut, dan tulislah dengan menggunakan spidol di atasnya.
  6. Pada stiker pertama tulis “Sample #1 – Dark Closet” pada kedua tulis “Sample #2 – Refrigerator”, dan pada yang ketiga tulis “Sample #3 – Under Light”.
  7. Jadi, simpan sampel pertama di lemari yang gelap, yang kedua di sudut lemari es agar tidak terganggu, dan yang ketiga di area rumah yang paling sering terang benderang.
  8. Sekarang, ambil dua sampel yang tersisa. Sebelum Anda menyegelnya di dalam tas dan menandainya dengan stiker, tambahkan salah satu dari lima item yang disebutkan di atas. Misalnya, pada sampel roti keempat Anda bisa menambahkan sedikit garam, sedangkan pada sampel kelima Anda bisa menambahkan 2 sendok makan air. Simpan kedua sampel ini di tempat yang tidak mengganggu mereka.

Pengamatan

Kenakan masker dan sarung tangan setiap kali mengamati sampel cetakan roti. Pastikan Anda mengamati lima sampel roti setiap hari bergantian pada waktu yang tetap, misalnya pukul 2 siang. Penting bagi Anda untuk mengamatinya setiap hari bergantian tanpa gagal, dan catat pengamatan Anda dalam sebuah tabel. Anda dapat mencatat penampilan fisik mereka seperti warna, bentuk, jumlah pertumbuhan per hari, tekstur, dll. Kolom lain dari meja Anda dapat menjadi pengamatan cetakan di bawah kaca pembesar. Jika mau, Anda dapat mengambil video atau gambar cetakan setiap hari. Ini akan membantu dalam menyimpulkan eksperimen Anda.

Diagram

Jika Anda melakukan percobaan ini di rumah, Anda mungkin tidak memiliki akses ke mikroskop. Namun, ketika percobaan ini dilakukan di sekolah berkali-kali siswa diminta untuk mengamati cetakan di bawah mikroskop. Catat, munculnya jamur di bawah mikroskop, ini bisa menjadi bagian dari pengamatan. Biasanya, orang melihat struktur seperti benang yang di atasnya ada bentuk lingkaran. Berikut adalah diagram cetakan roti secara detail.

Kesimpulan

Anda akan mengamati kesimpulan yang berbeda untuk sampel yang berbeda. Jamur yang disimpan dalam kondisi hangat, gelap, dan lembab akan tumbuh paling baik. Namun, sampel yang berada di lemari es akan memiliki pertumbuhan yang lebih lambat. Selain itu, zat seperti garam cenderung memperlambat pertumbuhan jamur roti. Kesimpulan adalah bagian penting dari percobaan, jadi pastikan Anda membaca pengamatan Anda dengan cermat sebelum Anda meletakkan kesimpulan yang tepat dari proyek tersebut. Berikut adalah gambar pertumbuhan jamur pada berbagai jenis roti.


13.8: Hasil Pertumbuhan Bakteri dan Jamur dan Pekerjaan Rumah - Biologi

Semua artikel yang diterbitkan oleh MDPI segera tersedia di seluruh dunia di bawah lisensi akses terbuka. Tidak diperlukan izin khusus untuk menggunakan kembali seluruh atau sebagian dari artikel yang diterbitkan oleh MDPI, termasuk gambar dan tabel. Untuk artikel yang diterbitkan di bawah lisensi Creative Common CC BY akses terbuka, bagian mana pun dari artikel dapat digunakan kembali tanpa izin asalkan artikel aslinya dikutip dengan jelas.

Makalah Fitur mewakili penelitian paling maju dengan potensi signifikan untuk dampak tinggi di lapangan. Makalah Fitur diajukan atas undangan individu atau rekomendasi oleh editor ilmiah dan menjalani tinjauan sejawat sebelum dipublikasikan.

Makalah Fitur dapat berupa artikel penelitian asli, studi penelitian baru yang substansial yang sering melibatkan beberapa teknik atau pendekatan, atau makalah tinjauan komprehensif dengan pembaruan singkat dan tepat tentang kemajuan terbaru di lapangan yang secara sistematis meninjau kemajuan paling menarik dalam bidang ilmiah. literatur. Jenis makalah ini memberikan pandangan tentang arah penelitian di masa depan atau kemungkinan penerapannya.

Artikel Pilihan Editor didasarkan pada rekomendasi dari editor ilmiah jurnal MDPI dari seluruh dunia. Editor memilih sejumlah kecil artikel yang baru-baru ini diterbitkan dalam jurnal yang mereka yakini akan sangat menarik bagi penulis, atau penting dalam bidang ini. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang beberapa karya paling menarik yang diterbitkan di berbagai bidang penelitian jurnal.


2. BAHAN-BAHAN DAN METODE-METODE

2.1 Pencarian literatur dan ekstraksi data

Data dikumpulkan dari makalah yang diterbitkan yang menjelaskan respons struktural dan fungsional komunitas mikroba tanah terhadap aplikasi biochar menggunakan Web of Science, Google Scholar, dan Infrastruktur Pengetahuan Nasional China. Studi yang memenuhi kriteria berikut dimasukkan dalam meta-analisis ini. (a) Setidaknya tiga ulangan dalam setiap perlakuan dan perlakuan kontrol dimasukkan. (b) Beban penambahan Biochar diberikan sebagai persentase berat atau dalam satuan ton/ha atau kg/m 2 . Ketika tingkat aplikasi diberikan sebagai massa per area, data dikonversi ke persentase berat dengan asumsi berat jenis tanah 1,5 g/cm3 (Biederman & Harpole, 2013 ). (c) Hanya data kontrol dan perlakuan aplikasi biochar yang dipilih jika percobaan menyertakan penambahan pupuk lainnya. (d) Data variabel yang dipilih tersedia atau dapat ditemukan atau dihitung dari publikasi terkait. (e) Data dari studi yang berfokus pada arang daripada biochar tidak dipertimbangkan dalam penelitian ini. Sumber data diekstraksi terutama dari teks, tabel, gambar, dan lampiran publikasi. Ketika data disajikan secara grafis, perangkat lunak digitizer digunakan untuk mengekstrak data yang efektif (http://digitizer.sourceforge.net Zhang, Chen, et al., 2018). Ketika beberapa data hilang dalam artikel, mereka dikumpulkan dari penulis yang sesuai secara langsung. Secara total, 148 studi pada awalnya diperiksa, tetapi hanya 107 studi yang dimasukkan dalam meta-analisis akhir. Makalah ini diterbitkan dari 2008 hingga 2019. (Lampiran 1).

2.2 Pemilihan karakteristik dan deskripsi data

Jenis percobaan, lokasi, dan koordinat dicatat sebagai data latar belakang, sedangkan beban aplikasi biochar, nilai pH, suhu pirolisis, dan waktu sejak aplikasi dicatat sebagai variabel yang berpotensi independen. Biomassa mikroba tanah (MBC, MBN) dan kelimpahan mutlak kelompok masyarakat (AMF, ACT, G+, dan G−) dimasukkan dalam analisis kami. Biomassa mikroba tanah terutama ditentukan dengan metode fumigasi-ekstraksi dengan hanya sedikit yang ditentukan oleh metode respirasi yang diinduksi substrat (Anderson & Domsch, 1978 Lu et al., 2015 Xu et al., 2018). Kelimpahan gugus fungsi yang berbeda berasal dari metode PLFA atau metil ester asam lemak (Moeskops et al., 2010 Schutter & Dick, 2000). Aktivitas metabolisme C tanah dan keragaman fungsional termasuk pemerataan dan kekayaan diukur dengan teknik Biolog menggunakan inkubasi Eco-plate. Pelat ini menguji 31 ​​jenis substrat C (dikategorikan menjadi enam kelompok: amina/amida, asam amino, karbohidrat, asam karboksilat, polimer, dan lain-lain Tabel S2 Zak et al., 1994). Perkembangan warna sumur rata-rata mencerminkan jumlah relatif C yang dikonsumsi oleh mikroba tanah dan merupakan indikator aktivitas metabolisme secara keseluruhan. Respirasi tanah ditentukan oleh CO2 pengukuran aliran keluar.

Data meliputi tiga jenis percobaan: pot, inkubasi, dan lapangan, dan lokasi sampel tanah terutama Amerika Utara, Eropa, Asia Tenggara, dan Australia (Gambar S1). Dataset akhir mencakup total tujuh variabel independen dan 23 variabel dependen (Lampiran 2).

2.3 Analisis data dan pemilihan model

(1) (2) (3) dimana ,belajar, dan ɛ adalah koefisien, faktor efek acak dari "studi," dan kesalahan pengambilan sampel, masing-masing. Biochar dan Periode mewakili beban biochar dan periode aplikasi, dan lnRR mewakili rasio respons log alami dari biochar dan kelompok kontrol. Efek acak secara eksplisit menjelaskan autokorelasi di antara pengamatan dalam setiap "penelitian." Estimasi kemungkinan maksimum dilakukan dengan menggunakan lme4 paket (Bates et al., 2017). Kecuali untuk jenis eksperimen, prediktor lainnya adalah prediktor kontinu, yaitu, Biochar, Periode, yang distandarisasi atau diskalakan untuk mengurangi varians statistik karena unit atau skala yang berbeda. β0 adalah nilai intersep, yang mencerminkan rata-rata keseluruhan lnRR berarti Biochar dan ln(Periode) (Cohen et al., 2003). β1 dan β2 adalah kemiringan dari beban biochar dan istilah periode, yang mewakili perubahan lnRR ketika biochar dan periode bertambah satu satuan. Contohnya, β1 mewakili respons dengan peningkatan 1% biochar, yaitu, lnRR sifat spesifik akan meningkat β1 unit. Hasil Gambar 2 kami didasarkan pada β1 dan β2. Untuk menyederhanakan interpretasi hasil grafik, 23 variabel lnRR dan interval kepercayaan yang sesuai ditransformasikan kembali ke persentase perubahan sebagai . Semua analisis statistik dilakukan dalam R (versi 3.6.3) menggunakan kode yang tersedia di Lampiran.

2.4 Model persamaan struktural

Untuk mengetahui hubungan antara respon fungsional mikroba tanah, kondisi tanah, sifat biochar, dan metode aplikasi, SEM dibangun berdasarkan jalur dampaknya. Model konseptual (model penuh) dan model tereduksi dilakukan untuk menemukan model yang relatif cocok, dan model tersebut dipilih dengan membandingkan indeks kecocokan (GFI) dan kesalahan pendekatan kuadrat rata-rata akar (RMSEA Chen et al., 2019). Kami memilih model akhir dengan GFI tertinggi dan nilai RMSEA terendah (Chen et al., 2019 Grace, 2006). Model akhir terdiri dari satu variabel laten endogen dan satu variabel respon dengan tiga variabel penjelas. Variabel laten endogen adalah respon bakteri yang direpresentasikan dengan log respon rasio bakteri G+ dan G−. SEM diimplementasikan menggunakan paket “lavvan” (Rosseel, 2012).


4. DISKUSI

4.1 Respon struktur dan fungsi komunitas mikroba tanah terhadap biochar

Analisis ini menguji tiga hipotesis mengenai peran biochar dalam tanah. Hipotesis pertama menyatakan bahwa perubahan kelimpahan mikroba dan struktur komunitas pada penambahan biochar mempengaruhi pemanfaatan C oleh mikroba. Hipotesis ini tidak didukung secara kuat. Meskipun peningkatan kelimpahan AMF dan MBC pada penambahan biochar, pemanfaatan enam kategori sumber C tidak terpengaruh oleh pengobatan biochar. Diduga, perubahan jenis pemanfaatan C tidak mengelompok pada salah satu dari enam kategori tetapi tersebar dan tersebar di antara enam kategori tersebut (Liao et al., 2016 Xu et al., 2016 Zhang et al., 2016). Selain itu, karena hanya ada sedikit penelitian yang menyediakan data pemanfaatan C menggunakan teknik Biologi (11 pasang data dari enam artikel), yang jumlah replikasinya sangat kecil dibandingkan dengan kategori lain, hasil ini mungkin bias karena kurangnya replikasi. dan kekuatan analisis meta-analisis.

Namun, penambahan biochar secara signifikan berkorelasi dengan peningkatan kekayaan fungsional, yang menunjukkan bahwa lebih banyak jenis sumber C dikonsumsi oleh mikroba tanah setelah aplikasi biochar. Hasil ini diharapkan karena abu dan C labil yang diintroduksi oleh biochar akan memfasilitasi pertumbuhan mikroba yang memakan lebih banyak jenis sumber C dan akan menghasilkan pola pemanfaatan C yang lebih beragam (Singh & Cowie, 2014). Inferensi ini didukung oleh peningkatan MBC, yang menunjukkan bahwa biochar memfasilitasi pertumbuhan mikroba (Ambihai et al., 2013 Bargmann et al., 2014 Bruun et al., 2011 Domene et al., 2015 ) dan meningkatkan kemungkinan bahwa mikroba memakan berbagai jenis substrat C.Selain itu, hal ini juga bergantung pada waktu sejak aplikasi, karena mayoritas biochar C bersifat rekalsitran dan tidak langsung digunakan oleh komunitas mikroba (Jenkins et al., 2017 Zhu et al., 2017 ). Faktanya, data kami menunjukkan bahwa peningkatan kekayaan fungsional terutama terjadi pada tahap awal aplikasi (dalam 132 hari). Kekayaan fungsional lebih rendah dalam studi inkubasi daripada percobaan lapangan dan pot (Gambar S2). Dengan demikian, C eksogen yang dibawa oleh biochar menghasilkan pertumbuhan mikroba dan pola pemanfaatan C yang beragam pada tahap awal.

Hipotesis kedua mengusulkan bahwa respons fungsional mikroba tanah lebih sensitif terhadap beban biochar daripada waktu sejak aplikasi, yang didukung oleh hasil kami. Ada enam atribut (AMF, ACT, MBC, amina/amida, polimer, dan kekayaan fungsional) yang secara signifikan terkait dengan beban biochar, sementara hanya dua atribut (ACT dan respirasi tanah) yang terkait dengan waktu sejak aplikasi (Gambar 2). Pengamatan bahwa hanya dua atribut mikroba yang berubah secara signifikan seiring waktu sejak aplikasi tidak berarti bahwa atribut lainnya tidak berubah. Perubahan mereka mungkin terjadi pada tahap awal aplikasi biochar tetapi tidak berlanjut seiring waktu. Faktanya, beberapa penelitian menemukan bahwa pada tahap awal aplikasi biochar, struktur dan fungsi komunitas mikroba berubah dengan cepat tetapi kemudian menjadi stabil setelah waktu yang singkat (Hu et al., 2014 Xu et al., 2016). Fenomena ini mungkin disebabkan oleh efek priming dimana introduksi bahan organik eksogen dari biochar menyebabkan perubahan suplai hara secara tiba-tiba, pertumbuhan mikroba yang cepat, dan peningkatan respirasi tanah segera setelah amandemen (Luo et al., 2011 Zimmerman et al. al., 2011). Efek ini mungkin menjelaskan penurunan yang diamati pada respirasi tanah dan kelimpahan ACT dengan periode aplikasi. Juga, ada peningkatan yang signifikan dalam kelimpahan AMF dengan beban biochar, mungkin terkait dengan penyerapan senyawa sinyal, detoksifikasi alelokimia, dan efek tidak langsung dari populasi mikroba tanah lainnya yang disebabkan oleh aplikasi biochar (Elmer & Pignatello, 2011 Warnock et al., 2007).

4.2 Pengaruh sifat tanah dan biochar

Hipotesis ketiga menyatakan bahwa sifat biochar lebih berpengaruh daripada beban atau periode aplikasi biochar dalam mengatur respon struktur dan fungsi komunitas mikroba tanah. Misalnya, sifat biochar yang penting mungkin termasuk pH biochar, suhu pirolisis biochar, dan desain eksperimental (Zhang, Jing, et al., 2018 Zhou, et al., 2017). ACT, bakteri, jamur, kelimpahan G+, G−, dan pemanfaatan C lain-lain secara simultan dipengaruhi oleh pH biochar dan suhu pirolisis (Tabel 1), yang menunjukkan bahwa pH biochar berkorelasi positif dengan suhu pirolisisnya. Faktanya, koefisien Pearson antara keduanya sangat signifikan, dan setiap kenaikan 100℃ suhu pirolisis meningkatkan pH biochar sebesar 0,46 (Gambar 4). Hasil serupa telah dilaporkan oleh orang lain (Al-Wabel et al., 2013 Cantrell et al., 2012).

lnRR bakteri dan jamur menurun dengan meningkatnya pH tanah, menunjukkan bahwa pH tanah yang tinggi menekan perbedaan kelimpahan bakteri dan jamur antara kontrol dan perlakuan biochar. Karena biochar biasanya memiliki pH yang lebih tinggi daripada tanah, efeknya akan terlihat pada tanah yang lebih asam dimana perubahan pH akan lebih dramatis setelah aplikasi biochar (Paz-Ferreiro et al., 2015 Xu et al., 2018). Namun, peningkatan rasio bakteri/jamur dengan pH tanah mungkin disebabkan oleh fakta bahwa jamur pada umumnya menghuni lingkungan yang agak asam (Vylkova, 2017 ) dan peningkatan pH tanah setelah aplikasi biochar dapat menyebabkan penurunan total jumlah jamur. Faktanya, pH biochar yang tinggi berkorelasi dengan penurunan kelimpahan jamur.

PH biochar yang tinggi dan suhu pirolisis menurunkan kelimpahan ACT. Ini tidak mengherankan karena ACT menyukai lingkungan pH asam dan netral (Hamid et al., 2015 Vylkova, 2017). Selain itu, kelimpahan jamur menurun lebih cepat dibandingkan bakteri dengan pH biochar dan suhu pirolisis. Karena suhu pirolisis juga akan mempengaruhi struktur berpori biochar (Al-Wabel et al., 2013), penurunan jamur yang lebih cepat mungkin terkait dengan perubahan struktur berpori biochar. Suhu pirolisis yang tinggi meningkatkan luas permukaan mikro dan volume pori, sedangkan pertumbuhan hifa jamur diuntungkan dengan luas permukaan mikro dan volume pori yang kecil (Muhammad et al., 2016 Rillig et al., 2010 ), sehingga peningkatan ukuran pori setelah suhu pirolisis tinggi mungkin kurang rumah sakit untuk jamur. Juga, pH biochar mempengaruhi rasio G− dan G+ dan G+/G− yang menunjukkan bahwa pH biochar mengubah struktur komunitas bakteri tanah. Terakhir, pemanfaatan C lain-lain menurun dengan meningkatnya pH biochar yang menunjukkan bahwa tiga jenis C yang termasuk dalam kategori ini: d, l-α-gliserol fosfat, glukosa-1-fosfat, dan metilester asam piruvat kurang dimanfaatkan.

4.3 SEM menggambarkan respons mikroba terhadap banyak variabel

Pemodelan persamaan struktur telah banyak digunakan untuk menggambarkan hubungan multivariat antara beberapa variabel dependen dan independen dalam penelitian ekologi dan lingkungan (Jucker et al., 2018 Vile et al., 2006 Wang & Huang, 2020). Selain itu, meta-analisis yang dikombinasikan dengan analisis SEM dapat membantu menguraikan variabel multivariat yang mempengaruhi atribut mikroba tanah dalam skala global (Chen & Chen, 2019 Zhang, Chen, et al., 2018). Sementara hasil kami menunjukkan bahwa respons bakteri terhadap biochar dipengaruhi oleh pH tanah dan kelimpahan jamur, pengaruh jamur jauh lebih kuat daripada pH tanah. Hal ini menunjukkan bahwa biochar mempengaruhi komunitas bakteri melalui pengaturan kelimpahan jamur. Mekanisme dan kemungkinan proses ekologi tanah adalah bahwa biochar mempengaruhi jamur mikoriza, yang mempengaruhi eksudat akar dan kemudian mempengaruhi struktur bakteri di rizosfer. Secara khusus, proses tersebut terkait dengan interaksi jamur mikoriza dan rhizobakteri pemacu pertumbuhan tanaman, bakteri penolong mikoriza, bakteri pengikat nitrogen, atau bakteri perusak di bawah biochar (Hashem et al., 2019 Miransari, 2011 ). Selain itu, beban biochar dan suhu pirolisis memiliki efek langsung pada jamur daripada kelimpahan bakteri, yang menunjukkan jamur lebih sensitif terhadap biochar daripada bakteri. Ini mungkin menunjukkan bahwa aplikasi biochar secara keseluruhan memiliki efek langsung pada komunitas jamur (Dai et al., 2018), tetapi efek tidak langsung pada struktur komunitas bakteri (Dai et al., 2016 Meynet et al., 2014).

Beban biochar memiliki efek positif pada lnRR jamur, yang konsisten dengan penelitian lain (Bamminger et al., 2014 Taskin et al., 2019 ). Hal ini menunjukkan bahwa ketika konsentrasi biochar meningkat, pertumbuhan jamur meningkat. Hal ini tidak mengherankan karena hifa jamur mendapat manfaat dari struktur berpori yang dihasilkan oleh biochar, dan peningkatan beban biochar kemudian akan menyebabkan peningkatan porositas tanah. Namun, suhu pirolisis yang lebih tinggi merugikan pertumbuhan jamur, yang konsisten dengan hasil kedua kami. Karena respons kelimpahan jamur terhadap sifat-sifat biochar menghasilkan perubahan respons komunitas bakteri, pengendalian bahan biochar dan kondisi produksi adalah salah satu metode penting untuk mengatur komunitas mikroba tanah dan fungsinya.

Secara keseluruhan, struktur dan fungsi komunitas mikroba tanah sensitif terhadap gangguan yang mengubah sifat tanah dan memasukkan C dengan menambahkan biochar (Bamminger et al., 2018 Hu et al., 2014). Selain itu, respon komunitas mikroba terhadap aplikasi biochar tergantung pada kondisi tanah dan dipengaruhi oleh sifat-sifat biochar. Pengenalan yang lebih baik tentang bagaimana biochar mempengaruhi struktur dan fungsi komunitas mikroba akan membantu efisiensi penggunaan teknologi biochar untuk mengurangi degradasi tanah dan perubahan iklim.


Tonton videonya: PEMBUATAN PREPARAT DAN PEWARNAAN JAMUR (Februari 2023).