Informasi

Perakitan data metagenomik

Perakitan data metagenomik


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya mencoba mengumpulkan data metagenomic yang berasal dari nyali rayap. Urutannya berasal dari SOLiD dan tidak berpasangan, sehingga pembacaannya sangat singkat (25bp).

Saya telah mencoba beberapa assembler (CLC, velvet, metavelvet, Meta-IDBA) tetapi semuanya menghasilkan beberapa contigs (15 contigs, rata-rata 1000bp). Output contig langka mengingat jumlah data mentah (5 Gpb).

Apakah ada yang berhasil dalam tugas seperti ini?.

Terima kasih.


Ini tergantung pada cakupan Anda dan jumlah dan proporsi relatif spesies dalam campuran. ini tampaknya tidak akan menghasilkan hasil kecuali protokol membiaskan perpustakaan (primer universal rRNA misalnya.) Saya pikir pada urutan 25 bp, bahkan cakupan 30x tidak akan memberikan urutan perakitan penuh. Biasanya saya percaya pembacaan 25 bp hanya digunakan untuk mengurutkan ulang varian yang mirip dari genom yang serupa atau referensi.


Metagenomik

Metagenomik adalah studi tentang materi genetik yang diambil langsung dari sampel lingkungan. Bidang yang luas juga dapat disebut sebagai genomik lingkungan, ekogenomik atau genomik komunitas.

Sementara mikrobiologi tradisional dan sekuensing genom mikroba dan genomik bergantung pada kultur klon yang dibudidayakan, sekuensing gen lingkungan awal mengkloning gen spesifik (seringkali gen 16S rRNA) untuk menghasilkan profil keragaman dalam sampel alami. Pekerjaan tersebut mengungkapkan bahwa sebagian besar keanekaragaman hayati mikroba telah terlewatkan oleh metode berbasis budidaya. [2]

Karena kemampuannya untuk mengungkap keragaman kehidupan mikroskopis yang sebelumnya tersembunyi, metagenomics menawarkan lensa yang kuat untuk melihat dunia mikroba yang memiliki potensi untuk merevolusi pemahaman tentang seluruh dunia kehidupan. [3] Karena harga sekuensing DNA terus turun, metagenomics sekarang memungkinkan ekologi mikroba untuk diselidiki pada skala dan detail yang jauh lebih besar daripada sebelumnya. Studi terbaru menggunakan baik "senapan" atau PCR diarahkan sequencing untuk mendapatkan sampel sebagian besar tidak bias dari semua gen dari semua anggota komunitas sampel. [4]


Metode

Di sini, kami menjelaskan MetAMOS [10], pipa perakitan modular open-source yang dibangun di atas AMOS dan dirancang khusus untuk data sekuensing generasi mendatang metagenomik. MetAMOS adalah langkah pertama menuju jalur perakitan dan analisis yang sepenuhnya otomatis, mulai dari pembacaan yang dikawinkan (Illumina dan 454) hingga perancah dan ORF. Saat ini, MetAMOS memiliki dukungan untuk empat assembler (SOAPdenovo [11], Newbler, CABOG dan Minimus [12]), tiga metode anotasi (BLAST, PhymmBL dan MetaPhyler), dua alat prediksi gen metagenomic (MetaGeneMark dan Glimmer-MG) dan satu unitig scaffolder yang dirancang khusus untuk data metagenomik (Bambus 2). Kami juga menyediakan algoritme berbasis grafik baru untuk menyebarkan anotasi dengan cepat ke semua contigs dalam perakitan menggunakan, misalnya, hanya contigs terbesar atau contigs dengan klasifikasi kepercayaan tinggi. MetAMOS memiliki tiga keluaran utama: subdirektori yang berisi urutan FASTA dari motif contigs/scaffolds/varian milik tingkat taksonomi tertentu, kumpulan semua contigs yang tidak terklasifikasi/berpotensi baru yang terkandung dalam rakitan, dan laporan HTML dengan statistik rakitan terperinci dan bagan ringkasan .


Pengantar

Meningkatnya minat ilmiah dan praktis dalam dunia mikroba yang mengelilingi kita, serta munculnya pendekatan molekuler-biologis dan bioinformatika baru untuk analisis keragaman dan potensi genetik komunitas mikroba dari lingkungan yang beragam memunculkan apa yang sekarang dikenal sebagai metagenomik.

Sementara urutan parsial DNA mikrobiotal (komunitas mikroorganisme) cukup untuk menilai informasi tentang keragaman komunitas sampel, untuk mengungkap potensi genetik, kita perlu menganalisis wilayah genom yang diperluas, atau bahkan lebih baik, genom yang dipulihkan sepenuhnya dari mikrobioma. (gabungan genom mikrobiota). Jenis wilayah yang diperluas ini dapat diperoleh dengan merakit fragmen DNA pendek yang dihasilkan oleh teknologi pengurutan modern.

Merakit genom adalah tugas yang sulit baik karena kompleksitas genom spesifik dan banyak kekhasan teknologi pengurutan yang digunakan untuk mencapai tujuan ini. Dalam kasus data metagenomik, tugas ini semakin diperumit oleh (1) volume besar data yang dihasilkan (2) kualitas urutannya (3) representasi anggota komunitas mikroba yang tidak setara (4) kehadiran yang terkait erat mikroorganisme dengan genom yang sama (5) adanya beberapa galur dari mikroorganisme yang sama dan (6) jumlah data yang tidak mencukupi untuk anggota komunitas kecil (Kunin et al., 2008 Sczyrba et al., 2017).

Untuk mengatasi (atau setidaknya memecahkan sebagian) masalah ini, sejumlah pendekatan dan alur analitis telah dibuat dan diterapkan, dengan yang baru terus dikerjakan (Ayling et al., 2020).

Di sini, kami menjelaskan tantangan perakitan metagenomik (MA), peran yang dimainkan MA dalam penemuan revolusioner beberapa tahun terakhir, memperluas pengetahuan kita tentang dunia mikroba di planet kita.


Hasil

Subsampling

Dalam penelitian ini, data yang dirilis oleh Nicholls et al. 15 (pengurutan ultra-dalam dari dua komunitas tiruan yang berbeda menggunakan platform GridION dan PromethION) digunakan untuk mempelajari kesesuaian pengurutan nanopore untuk mengkarakterisasi komunitas mikroba kompleks rendah. Komunitas tiruan disusun oleh sepuluh mikroorganisme yang sama, tetapi dalam proporsi yang berbeda (Tabel 1). Dengan tujuan untuk mengurangi sumber daya komputasi yang diperlukan untuk penyaringan pertama dari assembler yang dipilih, set data GridION dan PromethION diambil sampelnya untuk mendapatkan output yang sebanding dengan studi genomik atau metagenomik terbaru berdasarkan MinION (sekitar 3 Gbp dan 6 Gbp) 9,34 ,35,36,37,38,39 . Secara umum, rata-rata panjang baca tetap sama dalam kumpulan data subsampel dibandingkan dengan data sekuensing asli 15 . Namun, kualitas baca lebih tinggi pada dataset subsampel. Fakta ini menunjukkan adanya bias terhadap kualitas yang lebih tinggi pada awal proses, karena subsampling dilakukan dengan memilih pembacaan teratas dari file asli (Tabel 2). Faktanya, pembacaan bawah yang diperoleh kemudian dalam proses pengurutan menampilkan kualitas yang sama dari keseluruhan dataset.

Perakitan metagenom

Dari alat yang dipilih, kami dapat memasang dan menjalankan dengan benar sembilan dari sepuluh assembler baca panjang, dan dua dari tiga assembler baca pendek (Tabel Tambahan S1). Secara total, 74 majelis dihasilkan, 40 untuk komunitas tiruan Genap dan 34 untuk komunitas Log. Enam rakitan tidak dapat diselesaikan karena miniasm dan Pomoxis gagal berjalan dengan kumpulan data Log 6 Gbp, sedangkan Unicycler gagal berjalan dengan kumpulan data Log 3 Gbp. Ukuran total setiap rakitan draf dan fraksi metagenom yang dipulihkan dari genom referensi dievaluasi untuk dataset Genap untuk mendapatkan pandangan pertama dari kinerja alat umum.

Secara keseluruhan, assembler yang telah lama membaca menghasilkan ukuran rakitan total yang lebih dekat dengan ukuran teoretis, dan juga memulihkan fraksi metagenom yang lebih besar, dengan beberapa pengecualian (Gbr. 1). Namun demikian, perbedaan besar terdeteksi untuk kedua metrik di antara assembler. Semua assembler masih jauh dari memulihkan totalitas metagenom, baik dalam set data 3 Gbp dan 6 Gbp (Gbr. 1A). Harus dicatat bahwa hasil metaQUAST dan minimap2 konsisten untuk assembler yang membaca panjang, tetapi tidak untuk assembler yang membaca pendek, di mana metrik minimap2 secara signifikan lebih tinggi (Gbr. 1B). MetaFlye (kedua versi) menghasilkan rakitan terbaik dalam hal ukuran metagenom total dan pemulihan metagenom kecuali untuk metrik minimap2, diikuti oleh Pomoxis, Canu dan Raven (sebelumnya dikenal sebagai Ra). Menariknya, jalur pipa perakitan berdasarkan algoritme miniasm (Pomoxis, Unycicler, dan miniasm itu sendiri) menghadirkan variasi besar dalam kinerjanya. Unicycler dan miniasm berkinerja relatif baik untuk dataset 3 Gbp, tetapi ketika menggunakan 6 Gb, perakitan akhir tidak meningkat secara signifikan dalam kasus miniasm, dan kinerja umum sangat berkurang untuk Unicycler. Ini berbeda dengan Pomoxis, yang menghasilkan rakitan terlengkap kedua dengan kedua ukuran set data. Meskipun didasarkan pada miniasm, perlu diperhatikan bahwa pipeline Unicycler dirancang untuk perakitan isolat tunggal, sehingga penurunan kinerja diharapkan untuk studi metagenomik. Akhirnya, Redbean (sebelumnya dikenal sebagai wtdbg2) dan Shasta menghasilkan kinerja perakitan yang buruk dibandingkan dengan alat baca panjang lainnya.

Evaluasi ukuran rakitan metagenom yang sesuai dengan setiap alat yang diuji untuk set data Genap subsampel. (A) Ukuran rakitan total rakitan draft sehubungan dengan ukuran total metagenom referensi (B) fraksi metagenom referensi yang dicakup oleh rakitan draf, dihitung dengan dua metode berbeda: metaQUAST (panel atas) dan minimap2 + BBTools (panel bawah).

MetaQUAST digunakan untuk mengevaluasi lebih lanjut tingkat kelengkapan setiap rancangan genom individu (Gbr. 2). Seperti yang diharapkan, genom ragi umumnya kurang pulih dari yang bakteri, karena kelimpahan yang lebih rendah (2%) dan ukuran yang lebih tinggi, menjelaskan fraksi metagenom rendah umumnya ditemukan oleh semua perakit (Gbr. 1). Faktanya, fraksi pemulihan rata-rata maksimum untuk genom bakteri adalah 99,92% (Gambar Tambahan S1). Minia dan Megahit tidak dapat memulihkan genom tunggal apa pun dengan kelengkapan tinggi (> 95% cakupan genom) dalam kumpulan data apa pun. Untuk kumpulan data 3 Gbp, metaFlye (kedua versi) dan Unicycler memulihkan delapan genom bakteri dengan tingkat kelengkapan tinggi (> 98,6%), sementara Pomoxis mencapai fraksi pemulihan yang lebih rendah untuk dua genom (

96,9 hingga 97,4%). Raven dan Canu menghasilkan persentase pemulihan yang berkurang, tetapi masih mengambil semua genom prokariotik dengan fraksi tertutup rata-rata lebih besar dari 85% dan 87%, masing-masing. Redbean dan Shasta mencapai fraksi pemulihan genom yang sangat rendah.

Fraksi genom yang dicakup oleh rakitan draf yang diperoleh dengan menggunakan setiap alat, dan untuk setiap mikroorganisme individu (set data Genap subsampel). Rakitan mini tidak ditampilkan, karena tidak mungkin untuk mengevaluasinya dengan metaQUAST.

Untuk dataset 6 Gbp, kinerja Unicycler menurun secara substansial seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1, sementara Canu, Pomoxis, Raven dan metaFlye mencapai hasil yang serupa atau lebih baik. Secara umum, metaFlye menunjukkan kinerja terbaik pada kedua ukuran dataset dalam hal pemulihan genom, diikuti oleh Pomoxis. Tren ini juga diamati ketika menganalisis proporsi genom ragi yang dipulihkan oleh masing-masing alat. Dalam konteks ini, penting untuk menyoroti bahwa kemampuan metaFlye untuk memulihkan genom eukariotik berkurang saat menggunakan metaFlye v2.7. Hal ini disebabkan oleh lebih rendahnya jumlah missassembly yang diambil oleh versi metaFlye ini, yang menunjukkan bahwa pengurangan fraksi pemulihan genom dikompensasikan dengan assemblies yang lebih andal (Tambahan Gambar. S2).

Hasil ini dikonfirmasi ketika menganalisis komunitas tiruan Log (Gambar Tambahan S3). Canu, metaFlye, Raven, dan Pomoxis dapat pulih Listeria monocytogenes dan Pseudomonas aeruginosa genom (89,1% dan 8,9% dari total DNA genom di komunitas Log mock, masing-masing) dengan tingkat kelengkapan lebih tinggi dari 99%. Perakit ini juga memulihkan sebagian besar dari Bacillus subtilis (0,89% dari total DNA genom dalam komunitas tiruan Log). Faktanya, Raven mampu merekonstruksi > 99% genomnya menggunakan set data 6 Gbp, sedangkan metaFlye pulih

98%. Dalam hal ini, kedua alat tersebut mengungguli Canu. Namun demikian, Raven tidak memulihkan sebagian besar dari Saccharomyces cerevisiae, sedangkan Canu dan metaFlye melakukannya (> 8%). Pomoxis bekerja dengan benar saat menggunakan kumpulan data 3 Gbp, tetapi gagal dijalankan dengan kedua file 6 Gbp. Alat lain berdasarkan algoritme miniasm juga gagal menjalankan kumpulan data 3 Gbp (Unicycler) dan/atau 6 Gbp (miniasm). Dalam semua kasus, kesalahan terkait dengan penggunaan memori dan aksesi (pelanggaran segmentasi), dan tidak dapat diselesaikan. Namun demikian, menggunakan komputer dengan lebih banyak RAM akan membantu mengatasi masalah ini dengan mudah. Shasta, RedBean, Minia, dan Megahit berkinerja buruk dibandingkan dengan alat lain (Gambar Tambahan S3). Perlu dicatat bahwa Shasta dan RedBean pada awalnya tidak dirancang untuk bekerja dengan data metagenomik, yang dapat mengakibatkan masalah untuk menangani cakupan yang tidak merata.

Mengenai waktu yang digunakan oleh setiap alat, Shasta adalah perakit tercepat (Gbr. 3A). Alat ini mampu merakit set data 6 Gbp hanya dalam 285 detik, kira-kira. RedBean dan miniasm adalah perangkat lunak tercepat kedua dan ketiga, diikuti oleh Raven (1,5–1,9 kali lebih cepat dari metaFlye v2.7). MetaFlye 1,4-1,7 kali lebih cepat dari Pomoxis, dan 3,8-5,5 kali lebih cepat dari Canu, yang terbukti menjadi alat paling lambat. Tren ini juga ditemukan di komunitas tiruan Log (Gambar Tambahan S4), di mana Canu menghabiskan waktu hingga 22 jam untuk merekonstruksi rancangan rakitan metagenom dari kumpulan data 6 Gbp. Dalam hal ini, Raven lebih cepat daripada metaFlye v2.7 untuk kumpulan data 3 Gbp, tetapi tidak untuk kumpulan data 6 Gbp.

Kinerja perakitan umum setiap alat untuk subsampel dataset Genap. (A) Waktu berjalan (B) N50 (C) jumlah contigs (D) L50.

Statistik metagenom umum (N50, L50, dan jumlah contigs) dievaluasi menggunakan QUAST (Gbr. 3 Tabel Tambahan S3). Harus ditekankan bahwa perbandingan berdasarkan metrik ini sulit untuk dianalisis karena variasi yang besar dalam kinerja umum di antara assembler yang berbeda. Misalnya, Shasta menghasilkan nilai N50 tertinggi dan L50 terendah untuk kumpulan data 6 Gbp, tetapi alat ini mampu mencakup kurang dari 35% metagenom. Faktanya, total ukuran perakitan untuk Shasta adalah sekitar 18–21 Mbp, dibandingkan dengan 49–53 Mbp yang dirakit oleh metaFlye.

Seperti yang diharapkan, assembler short-read tidak berkinerja baik dengan data nanopore, menghasilkan ribuan (Minia), atau bahkan ratusan ribu contigs (Megahit). Menariknya, assembler yang sudah lama membaca menghasilkan rancangan genom yang lebih terfragmentasi saat menggunakan set data 6 Gbp. Kecuali Shasta, assembler membaca panjang lainnya juga mengurangi N50 mereka dan meningkatkan L50 dan jumlah skor contigs saat menggunakan 6 Gbp. Goldstein dkk. 9 menunjukkan bahwa rakitan Canu meningkat dengan cakupan yang lebih tinggi saat merakit isolat bakteri. Fakta ini menunjukkan bahwa hilangnya kedekatan yang terdeteksi mungkin merupakan konsekuensi langsung dari tingkat pemulihan genom ragi yang lebih tinggi, yang mungkin lebih terfragmentasi. Memang, statistik rakitan rakitan rancangan Canu tetap hampir sama untuk spesies bakteri saat menggunakan 3 atau 6 Gbp (Tabel Tambahan S4). Akhirnya, metaFlye dan Raven menghasilkan perakitan yang lebih berdekatan dengan N50 yang lebih tinggi dan L50 yang lebih rendah dibandingkan dengan alat berkinerja terbaik lainnya (Canu dan Pomoxis), untuk kumpulan data 3 dan 6 Gbp (Gbr. 3 Tabel Tambahan S3). Hebatnya, metaFlye v2.7 menghasilkan hasil yang sedikit lebih baik daripada metaFlye v2.4 (Gbr. 3B-D), dan membutuhkan lebih sedikit waktu (Gbr. 3A).

Perangkat keras, protokol, dan perangkat lunak ONT terus berkembang, menghasilkan peningkatan besar dalam waktu singkat. Baru-baru ini, metodologi ekstraksi dan pemurnian DNA yang dioptimalkan telah memungkinkan untuk mencapai hasil rata-rata

15,9 Gbp per sel aliran 46 . Oleh karena itu, kami memutuskan untuk menjalankan assembler yang paling menjanjikan langsung pada data asli GridION (Bahkan komunitas tiruan 14 Gbp). RedBean dimasukkan karena efisiensi komputasinya, yang merupakan faktor kunci untuk analisis mikrobioma yang diurutkan secara mendalam. Hasil serupa dengan yang diperoleh untuk 3 dan 6 Gbp (Gbr. 4). Canu memulihkan proporsi genom bakteri tertinggi, diikuti oleh metaFlye. Raven, sekali lagi, menunjukkan masalah saat merekonstruksi keseluruhan Escherichia coli dan Salmonella enterica genom, masalah juga terdeteksi untuk RedBean dengan cara yang lebih penting. MetaFlye dan Raven mencapai rasio pemulihan yang lebih baik daripada Canu untuk genom ragi. Secara keseluruhan, genom metaFlye lebih lengkap tetapi kurang bersebelahan daripada rakitan rancangan Raven, yang menyajikan jumlah contig yang lebih rendah untuk semua spesies dengan pengecualian E. coli dan S. enterica (Gbr. 4B). Tren ini juga diamati untuk kumpulan data Log (Gambar Tambahan S4). Hebatnya, Raven mampu merakit dua genom bakteri hanya dalam satu contig (Lactobacillus fermentum dan P. aeruginosa), dan mengambil empat genom tambahan hanya dalam 2-3 contigs. Akhirnya, Pomoxis tidak dapat dijalankan pada kumpulan data ini karena kesalahan yang tidak dapat dipecahkan yang dijelaskan sebelumnya.

Bahkan evaluasi perakitan GridION (14 Gbp) untuk alat berperforma terbaik. (A) Fraksi genom yang dicakup oleh rakitan draft (B) jumlah contigs untuk setiap mikroorganisme.

Akurasi perakitan

Kesalahan pengurutan adalah kelemahan terbesar dari platform pengurutan generasi ketiga. Kesalahan ini dapat mencapai rakitan akhir, menghasilkan draf genom berkualitas lebih rendah. Untuk mengevaluasi bagaimana assembler yang berbeda menangani profil kesalahan spesifik dari platform ONT, kami menganalisis jumlah total SNP dan indel yang ada di setiap draf metagenome. Seperti dijelaskan dalam Metode, dua strategi yang berbeda dan saling melengkapi digunakan untuk mengukur jenis kesalahan ini: (1) minimap2 + bcftools, dan (2) MuMmer (Gbr. 5). Kedua strategi bergantung pada penyelarasan rakitan draf ke metagenom referensi, yang disusun oleh campuran semua genom lengkap dari setiap galur yang ada di komunitas tiruan.

Akurasi rakitan untuk rakitan draf (set data Genap subsampel). (A) Persentase kesamaan dihitung sebagai jumlah total kecocokan yang dinormalisasi oleh ukuran metagenom (B) persentase indel dihitung sebagai jumlah total indel yang dinormalisasi oleh ukuran metagenom. Dalam kedua kasus, dua strategi berbeda digunakan: penyelarasan (panel atas) dengan minimap dan evaluasi dengan bcftools + skrip internal 'indels_and_snps.py' (panel bawah) penyelarasan dengan MuMMer dan evaluasi dengan skrip 'count_SNPS_indels.pl' dari Goldstein et Al. 9 .

Hasil tidak sepenuhnya konsisten antara kedua metodologi, terutama untuk estimasi indel, tetapi masih menunjukkan tren yang sama. Semua assembler yang sudah lama membaca mengambil draf metagenom dengan kesamaan rata-rata lebih tinggi dari

98,9%, dengan pengecualian miniasm, yang menghasilkan akurasi perkiraan hanya 96%. Akurasi yang rendah ini dapat menjelaskan ketidakmampuan metaQUAST untuk mengevaluasi rakitan miniasm. Perlu dicatat bahwa jaringan pipa lain berdasarkan miniasm, Pomoxis dan Unicycler, menggabungkan beberapa putaran pemolesan melalui Racon 45 , yang secara substansial mengurangi jumlah SNP dan indel dalam perakitan draft akhir (lihat di bawah).

Canu menampilkan persentase kesamaan yang lebih tinggi untuk metodologi dan kumpulan data, diikuti oleh Unicycler untuk kumpulan data 3 Gbp, dan Shasta untuk kumpulan data 6 Gbp. Pomoxis, metaFlye, dan Raven menunjukkan kesamaan lebih dari 99,5%. Dalam kasus profil indel, Unicycler dan metaFlye v2.7 jelas mengungguli Canu. Raven dan Pomoxis juga mencapai rasio indel yang lebih baik daripada Canu, kecuali untuk kumpulan data 6 Gbp dan metrik bcftools. Hasil Redbean, miniasm, dan Shasta tidak konsisten antara dua metodologi yang diuji (Gbr. 5).

Prediksi kluster gen biosintetik

Prediksi gen sangat dipengaruhi oleh kedekatan genom, kelengkapan dan akurasi. BGC terutama dipengaruhi oleh faktor-faktor ini, karena mereka biasanya ditemukan di daerah berulang yang sering tidak dirakit dengan baik. AntiSMASH digunakan untuk menilai jumlah klaster yang ditemukan dalam rakitan draf yang diambil oleh masing-masing alat dibandingkan dengan metagenom referensi dengan tujuan mengevaluasi prediksi BGC pada rakitan metagenomik berbasis nanopore (Gbr. 6). Seperti yang diharapkan, tidak ada alat yang memulihkan seluruh profil BCG, karena metagenom tidak sepenuhnya direkonstruksi (Gbr. 1). Menggunakan seluruh dataset GridION (14 Gbp) tidak meningkatkan jumlah BCG yang dipulihkan (Tabel Tambahan S5). Secara keseluruhan, ketika mempertimbangkan jumlah total BGC yang diprediksi dan kesamaan profil yang diperoleh dibandingkan dengan profil referensi, Raven menampilkan kinerja terbaik untuk kedua kumpulan data 3 Gbp, sedangkan metaFlye v2.7 menampilkan kinerja terbaik untuk kumpulan data 6 Gbp. Pomoxis juga mencapai prediksi yang baik, mengungguli Canu. Semua profil yang diprediksi menyajikan pengayaan dalam peptida laso (peptida pendek yang disintesis secara ribosom), yang tidak ada dalam profil referensi. Untuk mempelajari lebih lanjut fenomena ini, peptida laso yang diprediksi oleh alat yang berbeda dicari menggunakan BLAST terhadap BGC yang diprediksi dalam metagenom referensi. Tidak ada hit yang ditemukan, menunjukkan bahwa hasil ini mungkin merupakan artefak prediksi yang terutama disebabkan oleh indels, yang mungkin memperkenalkan kesalahan frameshift, dan secara artifisial meningkatkan jumlah peptida pendek yang diprediksi (yaitu peptida laso). Faktanya, metaFlye v2.7, yang memiliki rasio indel yang jauh lebih rendah, mengambil lebih sedikit peptida laso daripada metaFlye 2.4 (Gbr. 5). Kami juga mengoreksi rakitan Pomoxis dengan Medaka, yang mengarah ke rasio indel yang lebih rendah (lihat bagian berikut). Peptida Lasso tidak terdeteksi dalam rakitan Pomoxis + Medaka, menyoroti pentingnya koreksi indel untuk prediksi fungsional (Gambar Tambahan S5).

Jumlah kluster gen biosintetik (BGC) yang diprediksi oleh antiSMASH untuk setiap rakitan draf dalam kumpulan data Even GridION. (A) BGC diprediksi menggunakan set data 3 Gbp (B) BGC diprediksi menggunakan set data 6 Gbp.

Evaluasi pemolesan

Pemolesan adalah proses mengoreksi rakitan untuk menghasilkan urutan konsensus yang lebih baik. Input untuk memoles rakitan berbasis nanopore dapat berupa pembacaan ONT mentah (yaitu Racon atau Medaka) 45 , sinyal listrik mentah (yaitu Nanopolish) (https://github.com/jts/nanopolish), atau bahkan pembacaan singkat berkualitas tinggi (yaitu Racon ) 45 . Alur kerja pemolesan canggih untuk pengurutan nanopore terdiri dari mengoreksi rakitan draf melalui beberapa putaran Racon (biasanya 2–4), diikuti oleh satu langkah Medaka.

Beberapa alat yang diuji secara otomatis memasukkan Racon (Raven, Pomoxis, dan Unicylcer) ke dalam pipeline mereka, sedangkan yang lain menyertakan algoritme berbeda untuk mengoreksi pembacaan sebelum (Canu) atau setelah (metaFlye dan ReadBean) proses perakitan. Jadi, kami ingin menilai bagaimana berbagai langkah pemolesan dapat memengaruhi SNP dan rasio indel dari berbagai assembler. Hasil sangat heterogen (Gbr. 7 Tabel Tambahan S6). Pomoxis dan Raven secara drastis meningkatkan akurasinya setelah beberapa putaran pemolesan dengan pembacaan ONT asli (Tabel Tambahan S6). Faktanya, akurasi tanpa langkah pemolesan mendekati 96%, seperti yang dilaporkan untuk miniasm (Gbr. 5). Persentase kesamaan yang lebih tinggi diamati setelah satu putaran Racon (1R) untuk Raven, dan empat putaran Racon + satu putaran Medaka (4R + m) untuk Pomoxis. Redbean dan metaFlye -yang dijalankan lagi tanpa menggunakan pemoles bawaannya- juga meningkatkan akurasinya masing-masing setelah 1R atau 4R + m. Canu menyajikan persentase SNP yang lebih rendah ketika tidak ada langkah pemolesan yang ditambahkan ke pipa (Tabel Tambahan S6). Namun demikian, semua alat secara drastis meningkatkan rasio indel mereka setelah 4R + m. Persentase peningkatan bervariasi antara 41% (Canu) dan 91% (Raven dan Pomoxis) (Gbr. 7A). Harus digarisbawahi bahwa jumlah SNP dan indel terendah dicapai oleh Canu, yang merupakan satu-satunya alat yang melakukan koreksi kesalahan sebelum merakit bacaan.

Evaluasi pemolesan. (A) Persentase peningkatan dalam seluruh metagenom, dengan mengambil referensi jumlah kesalahan sebelum pemolesan (B) persentase kesamaan tertinggi yang dicapai oleh masing-masing alat (C) rasio indel terbaik yang dicapai oleh masing-masing alat. Perhatikan bahwa jumlah putaran pemolesan yang berbeda mungkin diperlukan untuk mencapai kesamaan tertinggi dan rasio indel terendah tergantung pada pahat.

Profil kesalahan dievaluasi lagi untuk menilai lebih lanjut apakah rakitan draf pemolesan dengan bacaan pendek berkualitas tinggi menghasilkan rakitan yang lebih baik. Meskipun memberikan hasil yang heterogen, semua alat mencapai rasio indel yang lebih baik setelah empat putaran koreksi Racon dengan pembacaan Illumina (Tabel Tambahan S6). Dalam hal ini, semua assembler meningkatkan akurasi mereka (% kesamaan) setelah satu (Canu dan metaFlye) atau empat (Pomoxis, Raven dan RedBean) Racon putaran. Saat membandingkan skor tertinggi yang diperoleh dengan koreksi berbasis Illumina dengan skor tertinggi yang dicapai setelah pemolesan berbasis ONT (Gbr. 7), persentase kesamaan lebih tinggi untuk rakitan metaFlye dan Canu yang dikoreksi dengan pembacaan Illumina, dan lebih rendah untuk Pomoxis, Raven dan RedBean, di mana pemolesan ONT mengungguli Illumina. Tren serupa diamati untuk rasio indel. Kali ini, koreksi Illumina dengan jelas meningkatkan koreksi indel untuk metaFlye dan Canu. Faktanya, koreksi Canu + Illumina mendapatkan rasio indel terendah. Pomoxis, Raven, dan RedBean mencapai koreksi indel yang lebih baik dengan pembacaan ONT.


Pipa perakitan

Di atas, kami menggambarkan metaSPAdes sebagai saluran untuk perakitan metagenomik yang menggabungkan SPAdes. Sejumlah jalur pipa perangkat lunak lain tersedia yang menggabungkan pra-pemrosesan baca, perakit metagenomik, dan analisis pasca-perakitan. Mungkin, contoh paling komprehensif adalah MetAMOS [ 55], yang, pada saat penulisan, mendukung hampir 20 perakit genomik dan metagenomik, bersama dengan berbagai alat pra-pemrosesan, penyaringan, validasi, dan anotasi. Pengguna dapat membuat alur kerja yang berisi kombinasi alat yang sesuai dengan kumpulan data mereka.

InteMAP [ 56] mengintegrasikan output dari dua assembler dBG (ABySS, IDBA-UD) dan satu assembler OLC (Celera) dengan menggabungkan contig cakupan rendah dan tinggi secara terpisah dari pasangan assembler. Penulis EnsembleAssembler juga berpendapat bahwa menggabungkan output dari rakitan dBG dan OLC dapat menghasilkan hasil yang lebih baik [ 57]. MetaCRAM [25] difokuskan pada penyimpanan yang efisien melalui kompresi kumpulan data metagenomik. Secara taksonomi mengklasifikasikan bacaan dan kemudian merakit bacaan yang tidak diklasifikasikan menggunakan IDBA-UD. Baik bacaan yang disejajarkan dan rakitan bacaan yang tidak selaras kemudian dikompresi untuk penyimpanan.


Target Pemirsa

Lulusan, pascasarjana, staf bioinformatika, dan PI yang bekerja dengan atau akan memulai analisis gen penanda, metagenomik, dan data metatranskriptomik dari eksperimen yang berfokus pada mikrobioma.

Prasyarat: Keakraban dasar dengan lingkungan Linux dan analisis statistik diperlukan. Harus dapat menyelesaikan dan memahami tutorial Linux sederhana berikut sebelum menghadiri:

Anda juga akan memerlukan komputer laptop Anda sendiri. Persyaratan minimum: resolusi layar 1024x768, CPU 1,5GHz, RAM 2GB, ruang disk kosong 10GB, versi terbaru Windows, Mac OS X, atau Linux (Kebanyakan komputer yang dibeli dalam 3-4 tahun terakhir kemungkinan memenuhi persyaratan ini). Jika Anda tidak memiliki akses ke komputer Anda sendiri, Anda dapat meminjamnya dari CBW. Kirim email kepada kami untuk informasi lebih lanjut.


Metode

Di sini, kami menjelaskan MetAMOS [10], pipa perakitan modular open-source yang dibangun di atas AMOS dan dirancang khusus untuk data sekuensing generasi berikutnya metagenomik. MetAMOS adalah langkah pertama menuju jalur perakitan dan analisis yang sepenuhnya otomatis, mulai dari pembacaan yang dikawinkan (Illumina dan 454) hingga perancah dan ORF. Saat ini, MetAMOS memiliki dukungan untuk empat assembler (SOAPdenovo [11], Newbler, CABOG dan Minimus [12]), tiga metode anotasi (BLAST, PhymmBL dan MetaPhyler), dua alat prediksi gen metagenomic (MetaGeneMark dan Glimmer-MG) dan satu unitig scaffolder yang dirancang khusus untuk data metagenomik (Bambus 2). Kami juga menyediakan algoritme berbasis grafik baru untuk menyebarkan anotasi dengan cepat ke semua contigs dalam perakitan menggunakan, misalnya, hanya contigs terbesar atau contigs dengan klasifikasi kepercayaan tinggi. MetAMOS memiliki tiga keluaran utama: subdirektori yang berisi urutan FASTA dari motif contigs/scaffolds/varian milik tingkat taksonomi tertentu, kumpulan semua contigs yang tidak terklasifikasi/berpotensi baru yang terkandung dalam rakitan, dan laporan HTML dengan statistik rakitan terperinci dan bagan ringkasan .


Bahan dan metode

Validasi perakitan

MUMmer [77] versi 3.23 digunakan untuk menyelaraskan rakitan contigs/scaffolds ke genom referensi (--maxmatch -l 20). Ketika perancah tersedia, contig diekstraksi dengan membelah perancah pada tiga atau lebih Ns berturut-turut. Untuk analisis scaffold pada scaffolds sampel dorsum lidah HMP dibiarkan utuh. Hanya contigs/scaffolds lebih dari 150 bp yang digunakan untuk validasi (bacaan yang belum dirakit tidak dihitung terhadap total). Alignment kemudian difilter menggunakan 'delta-filter -i 97 -q' untuk hanya mempertahankan hits terbaik ke referensi untuk setiap contig/scaffold. Semua statistik dihitung pada set terakhir penyelarasan yang difilter menggunakan skrip validasi khusus. Sebuah contig dengan penyelarasan ke genom referensi tunggal di seluruh panjangnya (memungkinkan ketidakcocokan ± 15 bp di ujung penyelarasan) dianggap sebagai contig yang baik. Sebuah contig dengan keselarasan menutupi > 80% dari panjang contig tetapi < 100% dianggap sedikit salah perakitan dan masih dianggap valid. Sebuah contig dengan penyelarasan tunggal yang mencakup kurang dari < 80% dari panjang contig, beberapa penyelarasan ke genom referensi tunggal, atau beberapa penyelarasan ke beberapa genom referensi semuanya dianggap sebagai salah rakitan (dan dalam kasus penyelarasan ke beberapa genom referensi, chimeric). Untuk dataset dorsum lidah HMP, contigs diizinkan untuk memiliki banyak penyelarasan ke satu referensi dan untuk menyelaraskan pada identitas yang lebih rendah (-i 90) karena perbedaan yang diharapkan antara set genom referensi yang dipilih dan genom aktual dalam sampel. Tak satu pun dari contigs yang salah rakitan atau contigs chimeric yang digunakan untuk menghitung statistik cakupan referensi. Skrip validasi perakitan tersedia untuk diunduh di [78]. Untuk analisis perancah, kami hanya menghitung peristiwa chimera yang dapat dideteksi sebagai kesalahan.

Validasi anotasi

Anotasi kumpulan data tiruan dibuat menggunakan FCP. Setiap assembler dijalankan dalam MetAMOS seperti yang dijelaskan di bawah dan contig yang dirakit (bersama dengan urutan yang belum dirakit) dijelaskan menggunakan FCP. Untuk menetapkan kebenaran, urutan dipetakan menggunakan Bowtie ke referensi yang diketahui. Perintah 'bowtie -p 10 -f -l 25 -e 140 --best -k 1 -S' digunakan untuk memilih genom terbaik untuk setiap urutan. Urutan yang tidak dipetakan juga direkam. Hasil anotasi dibandingkan dengan kebenaran ini di setiap tingkat taksonomi menggunakan skrip khusus. Terakhir, langkah propagasi MetAMOS dijalankan menggunakan anotasi tingkat kelas dan hasilnya dibandingkan dengan hasil pra-propagasi.

Parameter MetAMOS default

Langkah Praproses mencakup satu program perangkat lunak eksternal, FastQC, selain skrip penyaringan khusus untuk pra-pemrosesan baca. Secara default, baca pra-pemrosesan dinonaktifkan. Jika diaktifkan (melalui parameter -t), semua pembacaan yang mengandung basa berkualitas rendah dan Ns akan dibuang secara agresif, yang dapat mengakibatkan 5 hingga 10% (atau lebih) pembacaan dibuang. If fastq files are available and FastQC is enabled (by default it is disabled), the following command is executed: fastqc -t < cpus > fastq_input_files. The assemble step currently supports eight assemblers. The default parameters/recipes for each assembler are available in the configuration files from the MetAMOS code repository and are listed below. The map reads step relies on the short read mapper bowtie to align the reads to the assembled contigs. The default bowtie command is: 'bowtie -l 25 -e 100 --best --strata -m 10 -k 1'. Alternatively, the user can select via the '-w' parameter to trim the reads to 25 bp and align with the following parameters: 'bowtie -v 1 -M 2'. Currently MetAMOS supports three metagenomic gene finders, MetaGeneMark, FragGeneScan, and Glimmer-MG. MetaGeneMark and FragGeneScan are run with default parameters. We rely on a utility script that runs Repeatoire to identify repetitive contigs and create multi-alignments of ORF families. Repeatoire parameters are, by default, set to: '--minreplen = 200 --z = 17'. By default, MetaPhyler is enabled to quickly estimate the abundance on the supplied metagenomic sample. The included version, MetaPhylerV1.13, relies on blastp. The blastp parameters used are: '-m 8 -b 10 -v 10'. No other parameters are required for running MetaPhyler. If annotate is enabled, FCP is used to annotate/classify contigs and predicted ORFs. The default parameters are used. In addition to FCP, we also support phmmer (-E 1.0e-10), PhyloSift ('all -threaded'), and PhymmBL (default program parameters). Bambus 2 is the metagenomic scaffolder included within MetAMOS and is also executed with default parameters (coverage cut-off is automatically calculated from the assembly graph).

Software packages and corresponding parameters used in our experiments

Program versions

All parameters used were default unless otherwise specified. The parameters below are the defaults within the MetAMOS pipeline for each tool. Modifications to default program parameters were the result of either a) recommendations from the program's author/user guide, b) published parameter settings on similar datasets, or c) empirical studies. SOAPdenovo, version 1.05 was run with the parameters '-D -d -R -M 3'. Velvet version 1.1.05 was run with 'k = 51'. Meta-IDBA version 0.19 with parameters '--mink 21 --maxk < user specified > --cover 1 --connect'. MetaVelvet version 1.1.01 with default parameters. Bowtie version 0.12.7 was run with '-l 25 -e 100 --best --strata -m 10 -k 1'. MetaGeneMark version 2.7d was run with default parameters. FragGeneScan version 1.16 was run with default parameters. FCP (nb-classify, epsilon-NB.py) version 1.0 was run with default parameters.

HMP mock experiment

For all experiments, the default MetAMOS parameters were used. For all assemblers, a k-mer of 51 was specified. For Bambus 2, a redundancy threshold of 10 was used.

HMP tongue dorsum experiment

For all experiments, the default MetAMOS parameters were used (except for specifying alternative assemblers with -a soap for SOAPdenovo and -a metaidba for Meta-IDBA). For all assemblers, a k-mer of 51 was specified. For Bambus 2, a redundancy threshold of 10 was used. The motif was aligned using web-based blastn against the nr database to identify top-scoring genes.

MetaHIT experiment/sexual dimorphism

We selected three males and three females randomly from the MetaHit project having the same age (59 years), the same country (Denmark), and the same enterotype (ET1) [7]. We also chose the samples to have approximately equal body mass index (26.19 for males versus 24.12 for females). The chosen samples were MH0041, MH0045, and MH0055 for males and MH0002, MH0024, and MH0082 for females. MetAMOS was run on all three samples of each sex using the longer paired libraries for each sample (ERR011181, ERR011189, ERR011209 for males and ERR011091, ERR011149, ERR011264 for females).

To test for concordance between pre- and post-assembly annotations, we selected the order level classifications and compared the percentage classified at each order in the pre- and post-assembly male and female samples independently. We used R (version 2.11.1) and the command cor.test(preAsm, postAsm) to estimate the concordance between pre- and post-assembly assignments. To test for significance of the difference between samples we used the Fisher exact test on the order, family, and genus compositions of the male and female samples with the R command fisher.test(x).

We ran two versions of MetaPhyler, one based on BLAST in addition to the new version based on MUMmer. The new MetaPhyler is significantly faster the new MetaPhyler ran in 12 CPU hours compared to 25 CPU hours for the post-assembly analysis (which used the original MetaPhyler).

For all experiments, the default MetAMOS parameters were used and a k-mer of 51 was specified. For Bambus 2, a redundancy threshold of 10 was used.

Datasets used in our experiments

HMP mock samples were part of the Human Microbiome Project Metagenomes Mock Pilot (BioProject ID: 48475) and available for download at [79].

HMP tongue dorsum sample was downloaded from the SRA [SRA:SRS077736].

MetaHIT human gut metagenome samples: *MH0041 [80] (run accession ERR011181) [81, 82] *MH0045 [83] (run accession ERR011189) [84, 85] *MH0055 [86] (run accession ERR011129) [87, 88]. MetaHIT human gut metagenome samples from three Danish females (aged 59 years): *MH0002 [89] (run accession ERR011091) [90, 91] *MH0024 [92] (run accession ERR011149) [93, 94] *MH0082 [95] (run accession ERR011264) [96, 97].


Informasi penulis

H Bjørn Nielsen, Mathieu Almeida, H Bjørn Nielsen, Mathieu Almeida, Julian Parkhill and Keith Turner: These authors contributed equally to this work.

Affiliations

Center for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark, Kongens Lyngby, Denmark

H Bjørn Nielsen, Agnieszka Sierakowska Juncker, Simon Rasmussen, Damian R Plichta, Laurent Gautier, Anders G Pedersen, Ida Bonde, Marcelo B Quintanilha dos Santos, Piotr Dworzynski, Ole Lund, David W Ussery, H Bjørn Nielsen, Agnieszka S Juncker, Simon Rasmussen, Damian R Plichta, Laurent Gautier, Anders G Pedersen, Ida Bonde, Marcelo B Quintanilha dos Santos, Piotr Dworzynski, Ole Lund, David W Ussery, Thomas Sicheritz-Ponten, Søren Brunak, Thomas Sicheritz-Ponten & Søren Brunak

Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Kongens Lyngby, Denmark

H Bjørn Nielsen, Agnieszka Sierakowska Juncker, Ida Bonde, Nikolaj Blom, H Bjørn Nielsen, Agnieszka S Juncker, Ida Bonde, Nikolaj Blom, Thomas Sicheritz-Ponten, Søren Brunak, Thomas Sicheritz-Ponten & Søren Brunak

INRA, Institut National de la Recherche Agronomique, UMR 14121 MICALIS, Jouy en Josas, France

Mathieu Almeida, Emmanuelle Le Chatelier, Jean-Michel Batto, Fouad Boumezbeur, Joël Doré, Sean Kennedy, Pierre Léonard, Florence Levenez, Bouziane Moumen, Nicolas Pons, Edi Prifti, Mathieu Almeida, Emmanuelle Le Chatelier, Jean-Michel Batto, Fouad Boumezbeur, Joël Doré, Sean Kennedy, Pierre Leonard, Florence Levenez, Bouziane Moumen, Nicolas Pons, Edi Prifti, Pierre Renault, S Dusko Ehrlich, Alexandre Jamet, Antonella Cultrone, Christine Delorme, Emmanuelle Maguin, Eric Guedon, Gaetana Vandemeulebrouck, Ghalia Khaci, Maarten van de Guchte, Nicolas Sanchez, Rozenn Dervyn, Séverine Layec, Yohanan Winogradski, Pierre Renault & S Dusko Ehrlich

INRA, Institut National de la Recherche Agronomique, US 1367 Metagenopolis, Jouy en Josas, France

Mathieu Almeida, Emmanuelle Le Chatelier, Jean-Michel Batto, Fouad Boumezbeur, Joël Doré, Sean Kennedy, Pierre Léonard, Florence Levenez, Bouziane Moumen, Nicolas Pons, Edi Prifti, Mathieu Almeida, Emmanuelle Le Chatelier, Jean-Michel Batto, Fouad Boumezbeur, Joël Doré, Sean Kennedy, Florence Levenez, Bouziane Moumen, Nicolas Pons, Edi Prifti, S Dusko Ehrlich, Benoit Quinquis, Florence Haimet, Hervé Blottière, Nathalie Galleron & S Dusko Ehrlich

Department of Computer Science, Center for Bioinformatics and Computational Biology, University of Maryland, USA

Mathieu Almeida & Mathieu Almeida

BGI Hong Kong Research Institute, Hong Kong, China

Junhua Li, Junjie Qin, Junhua Li & Junjie Qin

BGI-Shenzhen, Shenzhen, China

Junhua Li, Manimozhiyan Arumugam, Karsten Kristiansen, Junjie Qin, Junhua Li, Junjie Qin, Jun Wang & Jun Wang

School of Bioscience and Biotechnology, South China University of Technology, Guangzhou, China

European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany

Shinichi Sunagawa, Manimozhiyan Arumugam, Jens Roat Kultima, Julien Tap, Takuji Yamada, Shinichi Sunagawa, Manimozhiyan Arumugam, Jens Roat Kultima, Julien Tap, Takuji Yamada, Peer Bork & Peer Bork

Commissariat à l'Énergie Atomique et aux Énergies Alternatives, Institut de Génomique, Évry, France

Eric Pelletier, Denis Le Paslier, Eric Pelletier, Denis Le Paslier, François Artiguenave, Jean Weissenbach & Thomas Bruls

Centre National de la Recherche Scientifique, Évry, France

Eric Pelletier, Denis Le Paslier, Eric Pelletier & Denis Le Paslier

Université d'Évry Val d'Essonne, Évry, France

Eric Pelletier, Denis Le Paslier, Eric Pelletier & Denis Le Paslier

The Novo Nordisk Foundation Center for Basic Metabolic Research, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark

Trine Nielsen, Manimozhiyan Arumugam, Kristoffer S Burgdorf, Torben Hansen, Oluf Pedersen, Trine Nielsen, Kristoffer S Burgdorf, Torben Hansen, Oluf Pedersen, Jun Wang & Jun Wang

Digestive System Research Unit, University Hospital Vall d'Hebron, Ciberehd, Barcelona, Spain

Chaysavanh Manichanh, Natalia Borruel, Francesc Casellas, Francisco Guarner, Chaysavanh Manichanh, Natalia Borruel, Francesc Casellas, Francisco Guarner, Antonio Torrejon, Encarna Varela & Maria Antolin

Faculty of Health Sciences, University of Southern Denmark, Odense, Denmark

Torben Hansen & Torben Hansen

Department of Structural Biology, VIB, Brussels, Belgium

Falk Hildebrand, Falk Hildebrand & Falony Gwen

Department of Bioscience Engineering, Vrije Universiteit, Brussels, Belgium

Falk Hildebrand, Jeroen Raes, Falk Hildebrand & Jeroen Raes

Division for Epidemiology and Microbial Genomics, National Food Institute, Technical University of Denmark, Kongens Lyngby, Denmark

Department of Biology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark

Karsten Kristiansen, Karsten Kristiansen, Jun Wang & Jun Wang

Hagedorn Research Institute, Gentofte, Denmark

Oluf Pedersen & Oluf Pedersen

Institute of Biomedical Science, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark

Oluf Pedersen, Oluf Pedersen & Niels Grarup

Faculty of Health, Aarhus University, Aarhus, Denmark

Oluf Pedersen & Oluf Pedersen

Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute, KU Leuven, Belgium

VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium

Department of Biology, Section of Microbiology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark

Søren Sørensen & Søren Sørensen

Laboratory of Microbiology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands

Sebastian Tims, Sebastian Tims, Willem M de Vos, Jørgensen Torben, Michiel Kleerebezem & Zoetendal Erwin G

Department of Biological Information, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, Japan

Takuji Yamada & Takuji Yamada

Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, Germany

Princess Al Jawhara Center of Excellence in the Research of Hereditary Disorders, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia

King's College London, Centre for Host-Microbiome Interactions, Dental Institute Central Office, Guy's Hospital, United Kingdom

S Dusko Ehrlich & S Dusko Ehrlich

Institut Mérieux, Lyon, France

Alexandre Mérieux, Christian Brechot & Christine M'Rini

Danone Research, Palaiseau, France

Gérard Denariaz, Johan E T van Hylckama Vlieg, Muriel Derrien & Patrick Veiga

Gut Biology & Microbiology, Danone Research, Center for Specialized Nutrition, Wageningen, the Netherlands


Tonton videonya: The Worlds Top 5 Biggest Mining Dump Trucks (Februari 2023).