Informasi

Bagaimana antigen terhadap autoantibodi yang terbentuk, diidentifikasi?

Bagaimana antigen terhadap autoantibodi yang terbentuk, diidentifikasi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Katakanlah kami mencurigai beberapa gangguan autoimun baru pada pasien, dan kami mengumpulkan darah untuk serologi.

Bagaimana antibodi diri dibedakan dari yang normal dalam sampel yang dikumpulkan? Setelah mereka diidentifikasi, bagaimana antigen yang diarahkannya diketahui?

Apakah ada tes untuk ini? Atau apakah itu diidentifikasi oleh struktur wilayah variabel? Dapatkah IHC sederhana dilakukan pada semua jaringan tubuh menggunakan antibodi terisolasi yang dimurnikan untuk melokalisasi protein?

Maksud saya, apa akar kecurigaan suatu antigen? Seperti, apa yang menyebabkan ANCA (antibodi sitoplasmik anti-neutrofil) dicurigai pada lupus eritematosis sistemik (SLE)?


Semua hal di atas, pada dasarnya. Jika itu adalah antigen protein, Anda dapat melakukan imunopresipitasi dengan auto-antibodi dan menggunakan salah satu (atau lebih) dari beberapa metode (Western blot, berbagai metode pengurutan, dll.) untuk mengidentifikasi pasangan pengikat. DNA dan RNA dapat diidentifikasi dengan mudah dengan cara biokimia. Anda juga dapat menggunakan ELISA atau metode serupa seperti electrochemiluminescence yang memungkinkan tingkat multiplexing yang lebih besar.

Pengurutan daerah variabel autoantibodi dapat memberikan beberapa informasi tentang struktur antigen, tetapi tidak cukup untuk benar-benar mengidentifikasi pasangan pengikat. Juga, satu fakta penting yang perlu diingat adalah bahwa respons antibodi pada banyak penyakit autoimun adalah poliklonal (seperti respons sel T yang sering terjadi), artinya mungkin ada lusinan hingga ratusan daerah penentu komplementaritas (CDR) yang berbeda untuk diurutkan, proses yang sangat melelahkan yang mungkin tidak menghasilkan banyak informasi.

Imunohistokimia (IHC) dapat berguna untuk melihat jenis sel mana yang diikat oleh antibodi, tetapi tidak memberikan resolusi yang bagus pada tingkat subselular, dan tidak memberi tahu Anda apa pun tentang target sebenarnya. Selain itu, karena jumlah pemrosesan kimia yang dilalui oleh jaringan tertanam parafin tetap formalin (FFPE), antigen antibodi mungkin tidak terpapar dengan benar agar antibodi dapat mengikat.

Dari apa yang saya temukan, orang-orang mencurigai adanya hubungan antara ANCA dan lupus karena kesamaan dalam presentasi klinis kedua penyakit. Ini adalah makalah dari tahun 1996 yang membicarakannya, masih banyak yang lain.


15.1: Antibodi diproduksi sebagai respons terhadap antigen

  • Disumbangkan oleh Clare M. O&rsquoConnor
  • Associate Professor Emeritus (Biologi) di Boston College

Antibodi adalah protein yang diproduksi oleh vertebrata dengan sistem imun adaptif yang mampu merespon antigen asing. Antigen didefinisikan sebagai zat yang merangsang produksi antibodi. Antigen umumnya mampu merangsang produksi beberapa jenis antibodi, yang masing-masing mengenali wilayah kecil yang berbeda pada permukaan antigen yang dikenal sebagai epitop. Antibodi adalah protein berbentuk Y yang diproduksi oleh limfosit yang mengikat epitop dengan afinitas tinggi.

Antibodi mengikat antigen.

Sebuah antigen dengan tiga epitop yang berbeda pada permukaannya diikat oleh tiga molekul antibodi yang berbeda, yang masing-masing mengikat satu epitop dengan afinitas tinggi.

Ketersediaan sel hibridoma yang mensekresi antibodi dalam jumlah besar dengan spesifisitas tunggal telah sangat memudahkan studi struktural pada antibodi. Para peneliti dapat memanen molekul antibodi yang disekresikan oleh sel hibridoma yang dikultur dan menyiapkan kristal untuk difraksi sinar-X. Berdasarkan sejumlah besar studi kristalografi, kita sekarang memahami arsitektur dasar antibodi, lebih dikenal sebagai imunoglobin. Struktur kristal menunjukkan bahwa imunoglobin (Igs) terdiri dari tiga domain yang mudah terlihat dalam struktur kristal (di bawah). Kedua Fab daerah (fragmen pengikat antigen) yang membentuk lengan &ldquoY&rdquo adalah daerah hipervariabel yang terlibat dalam pengikatan antigen. FC wilayah (fragmen yang dapat dikristalkan) yang membentuk dasar &ldquoY&rdquo dikenali oleh sel efektor non-imun, seperti sel mast dan makrofag, yang memproses kompleks antigen-antibodi. Setiap kelas Ig memiliki rantai berat yang khas, yang memberi nama pada kelas tersebut. Kami menggunakan antibodi dari kelas IgG imunoglobin, yang memiliki rantai berat gamma. (IgG juga dikenal sebagai gamma globulin.) Molekul IgA memiliki rantai alfa, molekul IgM memiliki rantai mu, dll.

Struktur kristal antibodi IgG.

Angka ini berasal dari Protein Data Bankentry 1IGT (Harris dkk., 1997).


Pengantar

Antibodi alami terbentuk secara spontan tanpa imunisasi spesifik, dalam kondisi bebas kuman. Mereka adalah garis pertahanan pertama organisme yang baru lahir [1-10], meskipun definisi ini tidak mencakup antibodi anti-Gal dan/atau antibodi alami anti-Gal [11]. Mereka ditemukan sekitar setengah abad yang lalu [7, 10]. Pada awal tahun 1908, hadiah Nobel diberikan kepada Paul Ehrlich untuk, antara lain, hipotesis bahwa organisme dari orang yang sehat menciptakan antibodi yang merupakan bagian dari ȁmemanggil antibodi” [12]. Istilah 𠇊ntibodi alami” pertama kali diperkenalkan oleh Boyden pada tahun 1963 [13]. Di Polandia, pada 1980-an protein ini dideskripsikan [10] sebagai elemen penting dari kekebalan, meskipun itu adalah gagasan kontroversial, misalnya, dalam konteks antigen buatan. Antibodi alami adalah garis pertahanan pertama melawan infeksi sebelum pembentukan pusat germinal di mana antibodi adaptif terbentuk [8, 12, 14]. Mereka terjadi di banyak vertebrata, mis. amfibi, reptil, ikan, burung, dan mamalia, termasuk manusia [8, 15, 16]. Pada manusia, mereka terutama terdiri dari imunoglobulin M, imunoglobulin A dengan isotipe IgA1 dan IgA2, dan IgG, terutama IgG3, tetapi juga IgG1, IgG2 dan IgG4 [1, 7, 8, 15-17]. Antibodi alami disintesis oleh subpopulasi limfosit B, terutama limfosit B1 dan sel B zona marginal [1, 7-9, 12, 14-21]. Saat menjelaskan antibodi anti-Gal dan/atau antibodi alami anti-Gal, beberapa penulis [22-24] menunjukkan bahwa antibodi dibentuk oleh sekitar 1% limfosit B yang bersirkulasi, dan ini adalah IgG, IgM, IgA dan IgE, yang merupakan sekitar 1% dari semua imunoglobulin yang ada dalam darah.

Berbeda dengan antibodi adaptif, antibodi alami (terutama IgM) diproduksi sebelum terpapar antigen atau patogen asing [25]. Tidak seperti antibodi alami, antibodi adaptif spesifik untuk antigen tertentu dan diproduksi oleh sel B2, yang memerlukan pengikatan antigen ke reseptor sel B (BCR) limfosit B2 dan tambahan “help” limfosit T [ 25]. Pada tikus dan manusia, isotop antibodi alami terutama membuat dan mengubah limfosit B1 [8]. Jumlah mereka menurun seiring bertambahnya usia, yang menyebabkan penurunan potensi imunologi mereka [8, 14, 16, 21, 26, 27]. Terlepas dari fakta ini, diamati bahwa ada orang sehat yang tidak mengalami perubahan konsentrasi IgM alami, bahkan ketika mereka berusia di atas 25 tahun [28-30], tetapi jumlah IgG alami dalam tubuh mereka meningkat [ 31]. Antibodi alami juga berbeda dari antibodi adaptif dalam fungsinya [8], tetapi mirip dengan antibodi adaptif, mereka juga multi-spesifik (polireaktif) dan mereka mengidentifikasi autoantigen dan determinan antigenik baru, termasuk yang terbentuk selama apoptosis atau proses oksidasi [1 , 14]. Autoreaktivitas antibodi alami terutama didasarkan pada kemampuannya untuk mengikat dengan partikel seperti lipoprotein densitas rendah teroksidasi (oxLDL), yang terjadi selama aterosklerosis, protein amiloid dan tau, yang terjadi pada penyakit neurodegeneratif, dan antigen NGcGM3 (N-glikol [NGc] granulosit makrofag [GM3]), yang menyertai neoplasma ganas [1, 6, 8, 12, 14, 32-40]. Salah satu fungsi terpenting dari antibodi alami, termasuk antibodi anti-Gal dan/atau antibodi alami anti-Gal, adalah perlindungan terhadap patogen virus, bakteri, jamur dan protozoa [11]. Antibodi alami juga mengenali fosforilkolin – konstituen dari membran banyak sel [14], termasuk bakteri seperti Streptococcus pneumoniae. Diasumsikan bahwa mereka memastikan homeostasis spesifik untuk organisme [1, 8, 9, 11, 12, 14, 32, 37, 38, 41]. Keadaan spesifik dari organisme yang dikondisikan oleh antibodi alami ini juga terkait dengan percepatan penghapusan sel mati dan sekarat serta 'kremain' lainnya, termasuk faktor-faktor yang berpotensi menyebabkan peradangan dan elemen toksik yang secara langsung bertanggung jawab atas kerusakan sel dan jaringan [8, 14 ]. Antibodi alami juga terkait dengan mikrobioma manusia karena ada hubungan penting antara antibodi alami dan flora komensal organisme, yang sangat mempengaruhi berbagai antibodi alami [7, 12, 16, 18, 42-46]. Telah ditunjukkan bahwa sudah pada tahap awal kehidupan, keseimbangan dinamis yang konstan terbentuk antara sistem kekebalan inang dan antigen mikrobioma, sebuah fakta yang memiliki pengaruh pada perkembangan sistem kekebalan yang tepat [12, 18, 45, 46]. Keadaan ini dikondisikan oleh partisipasi reseptor autopolireaktif dari imunitas humoral dan yang diperantarai sel dengan afinitas rendah terhadap antibodi dan bakteri komensal ini. Situasi ini berarti bahwa meskipun antibodi mampu mengenali autoantigen dan mikroorganisme komensal, mereka tidak menghancurkannya [18]. Diamati bahwa antibodi alami yang disintesis oleh limfosit B1 dan limfosit zona marginal juga dikondisikan oleh pengaruh limfosit T, termasuk limfosit γδT (berlimpah di saluran pencernaan), yang bersama-sama dengan banyak sitokin yang diproduksi mempengaruhi sintesis antibodi alami. antibodi [1, 14]. Diamati bahwa pada tikus yang tidak diimunisasi limfosit γδT secara efektif mempengaruhi tidak hanya jumlah IgA dan IgG alami, tetapi juga spesifik dan repertoar protein ini [1, 47]. Analisis menunjukkan bahwa limfosit γδT mengatur aktivitas fungsional antibodi alami dengan mempengaruhi, antara lain, tingkat IL-4, dan diamati bahwa IL-18 meningkatkan produksi SIgM [1, 48]. Diasumsikan bahwa tingkat dan aktivitas antibodi alami manusia dan tikus dipengaruhi oleh perubahan yang terjadi pada limfosit γδT, terutama terbentuk karena pengaruh flora usus [1], dan fakta bahwa mereka menyediakan sitokin. Mereka mendukung dan memodulasi perkembangan limfosit B dan mempengaruhi pembentukan antibodi alami bahkan sebelum imunisasi organisme [1]. Telah dibuktikan bahwa antibodi alami yang bekerja bersama-sama dengan komplemen berfungsi sebagai ajuvan endogenik dalam produksi limfosit CD8 +, mis. setelah vaksinasi terhadap leishmaniasis [48]. Oleh karena itu, disarankan [48] bahwa kompleks imunologi yang dibuat dari antibodi alami dapat menjadi alasan peningkatan jumlah limfosit CD8 + dan bahwa mereka mungkin merangsang sel-sel ini untuk mensekresi IL-4 [48].

Asal usul dan peran antibodi alami

Limfosit B1, baru-baru ini diisolasi sebagai subpopulasi baru limfosit B [8, 14, 21], dihasilkan dalam gelombang selama ontogenesis, terutama pada periode janin dan pasca-janin. Mereka tidak diciptakan pada tahap kehidupan selanjutnya [14, 21, 49]. Limfosit B1 berkembang di luar janin dari kantung kuning telur dan splanchnopleura para-aorta, pada periode janin dari sumsum tulang dan hati, dan pada minggu-minggu pertama setelah lahir dari sumsum tulang [21, 49]. Awalnya, fungsi limfosit B1 ditetapkan berdasarkan penelitian yang dilakukan pada tikus, dan profil reseptornya (CD20 + CD27 + CD43 + CD70 −) ditentukan berdasarkan analisis darah tali pusat dan darah perifer. darah orang dewasa [8, 12, 14, 50-52]. Pada tikus, limfosit B1 terletak terutama di rongga peritoneum, rongga pleura, limpa, sumsum tulang dan dalam jumlah kecil di kelenjar getah bening dan darah [19, 53, 54]. Limfosit ini berbeda dari limfosit B2 konvensional dalam ukuran. Mereka dicirikan oleh peningkatan kemampuan bertahan hidup ex vivo dan resistensi terhadap apoptosis tergantung pada reseptor Fas [14, 50, 51]. Limfosit B1 dicirikan oleh ekspresi unik protein dan transkripsi gen. Mereka juga memiliki sifat pensinyalan yang berbeda, termasuk reaksi terhadap phorbol ester [14]. Mereka dicirikan oleh konsentrasi Ca 2+ intraseluler yang lebih tinggi, dan perkembangannya tidak tergantung pada pengaruh faktor pengaktif sel B BAFF/BLys dan IL-7 [14]. Namun, limfosit B1, mirip dengan limfosit B2, dicirikan oleh fungsi dasar limfosit B, yaitu sintesis antibodi yang diperlukan untuk perlindungan organisme terhadap patogen [8, 9, 12, 14, 55]. Diasumsikan bahwa sumber utama antibodi alami, baik pada tikus dan manusia, adalah limfosit B1 dan limfosit B dari zona marginal (MZ), tetapi juga subpopulasi limfosit B lainnya [1, 7-9, 12, 14-21 ]. Diasumsikan bahwa, karena heterogenitasnya, limfosit B1 dan MZ mempengaruhi terjadinya perbedaan antara antibodi alami yang disintesis [14]. Diasumsikan bahwa 80-90% dari IgM serum istirahat dan 50% IgA serum istirahat (isotipe utama dari imunoglobulin sel B-1 yang diaktifkan) diproduksi oleh sel B-1 [12, 14, 16]. Pada tikus, juga telah ditunjukkan bahwa antibodi alami berbeda dari antibodi adaptif dalam beberapa hal, termasuk fungsinya [14]. Antibodi alami bersifat polireaktif, autoreaktif, dan mereka mengekspresikan afinitas anti-mikroba yang relatif sederhana [8, 14, 56, 57]. Polireaktivitas memastikan heterologi yang berbeda untuk antibodi tunggal, meskipun ini juga dikondisikan oleh antigen permukaan yang tersusun luas. Akibatnya, aviditas mereka meningkat [14]. Cara khusus perubahan konformasi mereka di wilayah Fc membuat mereka sangat efisien [14]. Diasumsikan bahwa antibodi alami yang paling banyak dipelajari pada manusia dan tikus adalah IgM. Mereka dikodekan oleh germline dan diproduksi oleh limfosit B1a (CD5 +), terutama dari limpa, tetapi juga oleh limfosit B1 dari peritoneum dan sumsum tulang [1, 3, 14, 21, 58, 59]. Antibodi alami penting dalam pencegahan penyakit, termasuk penyakit autoimun [14], yang juga diamati dalam kaitannya dengan antibodi anti-Gal dan/atau antibodi alami anti-Gal pada penyakit Crohn’s dan purpura Henoch-Schönlein [22 ]. Juga ditentukan bahwa antibodi alami dapat digunakan dalam pengobatan orang tua [8, 14, 50]. Dalam contoh lain, mereka digunakan dalam kasus penyakit degeneratif yang terkait dengan akumulasi partikel beracun dan dalam pengobatan infeksi bakteri [8, 14, 60]. Lahir dkk. dan Ugorski menyarankan bahwa keberadaan antibodi alami telah diprogram dalam ontogenesis sedemikian rupa sehingga memungkinkan mamalia untuk berkembang secara normal dengan memastikan semua fungsi yang diperlukan dan perlindungan terhadap patogen umum pada saat tidak ada antibodi adaptif [1, 10] . Keadaan seperti itu mempengaruhi homeostasis jaringan dan keseimbangan imunologi yang penting dalam kasus penyakit menular dan perlindungan antikanker [1, 7, 8, 12, 14, 32, 37-39]. Terbentuk selama infeksi, keadaan dipengaruhi oleh fakta bahwa, yang penting, komponen utama antibodi alami mengenali fosforilkolin (PC), yang merupakan konstituen utama membran sel bakteri Gram-positif dan Gram-negatif, serta protozoa. dan jamur [7, 14, 48]. Saat ini disarankan bahwa antibodi alami juga mengenali PC membran sel apoptosis dan lipid teroksidasi [5, 7, 14, 61-65]. Pengenalan antigen tersebut oleh antibodi alami, terutama sel-sel apoptosis, dikondisikan oleh elemen lain mereka – phosphatidylcholines (PtC) – yang merupakan konstituen kunci dari penuaan (apoptosis) membran eritrosit yang ada pada orang tua [14, 66]. Pengenalan spesifik sel apoptosis oleh antibodi alami ini juga dapat menyebabkan aktivasi berlebihan dari sistem kekebalan dan peradangan kronis [7]. Di sisi lain, partisipasi antibodi alami dalam menghilangkan sel-sel apoptosis menyebabkan penurunan peradangan [7, 67]. Antibodi alami juga mengenali lipoprotein densitas rendah, melindungi organisme terhadap aterosklerosis karena oxLDL menyebabkan pembentukan plak aterosklerotik, peradangan dan sebagai konsekuensi penyakit kardiovaskular. Selanjutnya, antibodi alami mengikat dengan bentuk utama teroksidasi dari lipoprotein – apolipoprotein B100 [8, 14, 38]. Antibodi ini juga berpartisipasi dalam pencegahan tumor [8, 68]. Dengan mengikat antigen tumor NGcGM3 – yang ada, mis. selama kanker paru-paru – mereka dapat menyebabkan penghapusan sel kanker. Pengikatan dengan antigen tumor berlangsung melalui mekanisme yang bergantung pada komplemen dan/atau mekanisme seperti onkosis yang bergantung pada komplemen [8, 33, 48, 68, 69]. Partisipasi antibodi alami juga diamati dalam reaksi dengan antigen tumor Thomsen-Friedenreich [1, 32, 70], gangliosida neuron pada sindrom Guillain-Barré [1, 71] dan amiloid yang ada pada penyakit Alzheimer [1, 8, 26, 39, 72]. Disarankan bahwa, karena susunan fungsi ini, antibodi alami mungkin juga berfungsi sebagai biomarker dalam studi klinis keadaan ini [12, 14, 63]. Dapat diterima bahwa peningkatan frekuensi banyak penyakit, termasuk penyakit yang umum pada orang tua, dikaitkan dengan penurunan jumlah antibodi [8, 14, 26, 48]. Oleh karena itu, semakin sering, untuk mengobati keadaan ini, dianjurkan untuk menggunakan imunoglobulin intravena (IVIG) yang dibangun terutama dari IgG, termasuk IgG alami, dan sejumlah kecil antibodi alami poliklonal – IgM dan IgA [1 , 7, 12, 35, 39, 41, 73-78]. Telah dibuktikan bahwa terapi menggunakan IVIG sangat efektif pada pasien dengan penyakit autoimun dan sindrom respon inflamasi sistemik (SIRS) [79]. Saat ini, karena fitur antibodi alami, terutama IgM, ada upaya untuk menggunakan antibodi ini bersama dengan IgA di IVIG, yang seharusnya meningkatkan kemampuan anti-inflamasi preparasi [79].

Karakteristik dan peran antibodi alami IgM

Imunoglobulin kelas M adalah antibodi alami yang paling banyak dipelajari. Mereka umumnya terjadi pada orang sehat dan terwakili dengan baik dalam sirkulasi setelah lahir [12, 48, 80]. Antibodi dari kelas ini adalah salah satu imunoglobulin utama dalam organisme, dan mereka yang paling awal terbentuk dari semua antibodi selama ontogenesis [55]. Baik pada manusia maupun hewan, mereka memanifestasikan sejumlah besar SIgM (300-800 μg/ml untuk tikus dan 400-2300 μg/ml untuk manusia) [81]. Sebagian besar IgM alami dibentuk oleh limfosit B1, tetapi juga oleh limfosit B dari zona marginal limpa [3, 7, 12, 14, 16, 21, 58, 59, 80, 82, 83]. Antibodi ini mungkin mencapai sekitar 80% dari semua IgM yang beredar dalam organisme [12, 16, 21] dan terlepas dari fungsi imunologisnya [14, 48, 55] mereka juga memiliki pengaruh pada perkembangan limfosit B [1]. Pada tikus dan manusia, IgM terutama dikodekan dalam germline, dan mereka dibentuk oleh limfosit B1a (CD5 + ) [1, 21]. Namun, ada banyak data yang menunjukkan bahwa, selain limfosit B1a (CD5 + ), limfosit B1b (CD5 - ) juga bertanggung jawab untuk sintesis IgM [21]. Produksi IgM alami juga dapat ditingkatkan melalui aktivasi LPS/TLR atau dengan aktivasi reseptor sel B oleh patogen [16, 48]. Juga diamati [55] bahwa IgM alami mengalami ekspresi dalam sel epitel yang dirangsang oleh agonis TLR9, dan karena fakta ini diasumsikan bahwa sel-sel ini juga merupakan sumber penting IgM alami. Sama halnya dengan IgM adaptif, antibodi alami dari kelas M adalah molekul pentamerik. Namun, pada pasien yang menderita penyakit autoimun [84] dan penyakit hati kronis, IgM alami dapat terjadi terutama dalam bentuk monomer [85]. IgM alami memiliki reseptor Fc spesifik untuk IgM (FCMR), yang merupakan protein transmembran dengan massa partikel sekitar 41 kDa. Namun, setelah proses O-glikosilasi di domain ekstraseluler, massa protein mungkin meningkat hingga 60 kDa [81]. Reseptor juga mengalami ekspresi di banyak sel sistem kekebalan, termasuk limfosit B CD19 +, limfosit T CD4 + /CD8 + dan sel NK CD56 + /CD3 [86]. Lebih menonjol, ia mengalami overekspresi dalam kasus leukemia limfositik kronis dan karena itu dapat berfungsi sebagai penanda spesifik untuk penyakit ini [86]. IgM alami polivalen dengan 10 situs pengikatan antigen mengenali banyak struktur, termasuk protein, karbohidrat, fosfolipid, dan asam nukleat. Mereka berpartisipasi dalam identifikasi sel apoptosis berkat perubahan yang dikenakan membran sel. Salah satu perubahan tersebut adalah oksidasi, yang memungkinkan pengenalan kelompok lipid utama fosforilkolin [5, 12, 48, 64, 82, 87]. Peran yang dimainkan IgM alami dalam proses fagositosis sel apoptosis mengarah pada konfirmasi efek anti-inflamasinya. Fitur ini telah dikonfirmasi pada tikus dengan defisit antibodi kelas M alami. Dalam hal ini, sifat anti-inflamasi potensial IgM dalam kaitannya dengan membran sel apoptosis telah ditunjukkan [2, 12, 87]. Harus ditambahkan bahwa pembersihan sel-sel apoptosis tidak hanya dikaitkan dengan pembuangan badan seluler, tetapi juga dengan perlindungan terhadap faktor-faktor yang berpotensi berbahaya, yaitu protein kotak kelompok mobilitas tinggi 1 (HMGB – 1) dan panas. protein kejutan (HSP) [12] – elemen yang membentuk faktor bahaya – DAMP (pola molekul terkait kerusakan) [88]. In vitro penelitian menunjukkan bahwa sifat anti-apoptosis IgM alami dalam kaitannya dengan penentu PC menghambat ekspresi sitokin melalui reseptor seperti tol (TLR) dan aktivasi protein kinase yang diaktifkan mitogen, yang merupakan elemen imunitas sel bawaan. [2, 12]. IgM alami juga dapat menginduksi jalur sinyal anti-inflamasi spesifik, yang bergantung pada induksi imunosupresif fosfatase mitogen diaktifkan protein kinase fosfatase 1 (juga dikenal sebagai MKP-1 atau DUSP-1) dalam sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang [5 , 12, 64]. Saat ini, diasumsikan bahwa penghapusan badan apoptosis dari organisme dikaitkan dengan fungsi SIgM, yang fungsinya bergantung pada banyak elemen sistem kekebalan, termasuk reseptor IgM Fcα/μR dan komplemen. komponen C1q [7, 58, 80, 89]. Selain itu, proses ini juga terkait dengan IgM alami, karena antibodi ini bergabung dengan komponen komplemen C1q, yang mengarah ke situasi di mana tubuh apoptosis diarahkan ke makrofag [7, 58, 80, 89], yang menghancurkannya dalam proses eferositosis [90-92]. Oleh karena itu, berkat polireaktivitas tersebut, mereka memperkuat efektivitas melawan infeksi dengan menggunakan fagositosis dan proses lainnya [3, 5, 64, 80, 93]. Aktivasi kaskade komplemen, oleh lektin yang mengikat mannose atau oleh konstituen komplemen C1q, juga dapat terjadi ketika target IgM alami adalah epitop PC dari sel apoptosis [2, 3, 5, 9, 12, 48, 64]. Telah ditunjukkan bahwa serum bayi baru lahir dicirikan oleh reaktivitas IgM alami yang tinggi terhadap banyak antigen diri, ssDNA virus dan partikel LDL [6, 12, 35, 36, 94], antigen bakteri umum, fosfolipid dan beberapa protein membran sel. [1, 9, 21, 94]. Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa penyakit autoimun dapat diblokir oleh autoantibodi alami dari isotipe IgM yang menutupi antigen yang berasal dari limfosit T autoimun patogen [6]. Pada tikus yang kehilangan kemampuan untuk membuat SIgM, diamati bahwa hewan cenderung mengembangkan autoantibodi IgG “patogenik” dan autoimunitas mirip lupus [12, 95, 96]. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa IgM alami melindungi organisme terhadap penyakit autoimun [12], dan karakteristik pelindung IgM ini juga berlaku untuk penyakit sistem kardiovaskular. [12, 15, 21]. IgM alami dapat berpartisipasi dalam penghambatan umpan balik diferensiasi sel B1 [97]. Fungsi IgM ini diamati pada tikus dengan defisiensi IgM yang disekresikan dan tikus dengan FcμR yang tidak mencukupi [97-99]. Diamati bahwa jumlah limfosit B1 dalam MZ limpa meningkat secara signifikan pada tikus dengan IgM yang tidak mencukupi, sedangkan konsentrasi IgM meningkat pada hewan dengan defisiensi FcμR. Fenomena ini mungkin menunjukkan bahwa tingkat IgM alami mempertahankan homeostasis sel B melalui pengikatan FcμR [97-99]. Partisipasi IgM dalam perlindungan terhadap aterosklerosis dikonfirmasi oleh penelitian pada tikus. Dalam hal ini, IgM alami mungkin menghilangkan lipoprotein densitas rendah yang teroksidasi dan lipid “patogenik” [12, 34, 38, 40]. Selanjutnya, IgM alami menghambat perkembangan perubahan aterosklerotik pada kasus hiperkolesterolemia pada tikus yang menderita defisiensi apolipoprotein E (ApoE) [12, 100]. Peran protektif mereka juga terdaftar pada pasien yang mengalami hemolisis dan mereka yang memiliki sindrom koroner akut. Diamati bahwa ketika tingkat IgM alami pada pasien ini rendah, angka kematian meningkat [12, 63, 101]. Karena fakta ini, diasumsikan bahwa konsentrasi tinggi antibodi ini menurunkan risiko penyakit kardiovaskular, seperti infark miokard (serangan jantung) dan stroke [5, 12, 37, 64]. Diasumsikan bahwa IgM alami dapat berfungsi sebagai penanda dalam studi yang memungkinkan seseorang untuk menentukan terjadinya penyakit ini, terutama gangguan yang terkait dengan aterosklerosis [12]. Pada tikus, ditentukan bahwa IgM alami juga merupakan elemen dasar yang membentuk penghalang pelindung terhadap mikroorganisme karena pengurangan IgM menyebabkan infeksi pada hewan ini [7, 12]. Telah ditunjukkan bahwa antibodi kelas IgM juga dapat bereaksi silang dengan epitop yang terkait dengan bakteri patogen Porphyromonas gingivalis, yang bertanggung jawab untuk peradangan di rongga mulut [12, 102]. Antibodi ini juga melindungi organisme manusia terhadap infeksi dengan Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae dan virus influenza [1]. Peningkatan level mereka juga diamati selama infeksi yang disebabkan oleh Pneumonia mikoplasma dan virus Epstein-Barr [103-105]. Antibodi alami ini juga mendukung kekebalan pejamu terhadap infeksi dengan Pneumocystis jamur [106]. Diamati bahwa mereka juga memiliki pengaruh pada pengenalan antigen jenis jamur ini melalui sel dendritik, meningkatkan migrasi mereka ke kelenjar limfatik dan menyebabkan diferensiasi intens sel Th2 dan Th17 selama infeksi patogen ini [106]. Dengan demikian, dapat diasumsikan bahwa IgM alami bertanggung jawab untuk banyak proses fisiologis, termasuk homeostasis jaringan, modulasi respon imunologi dan pembersihan apoptosis sel [12, 14, 21, 48]. Kemungkinan antibodi ini merupakan faktor penting yang memungkinkan untuk bertahan dalam kondisi peradangan kronis [12], tetapi, pada saat yang sama, mereka memperkuat keadaan inflamasi dengan meningkatkan sekresi, mis. kristal asam urat, yang memperkuat peradangan dengan merekrut neutrofil [101]. Seperti disebutkan di atas, IgM alami melindungi manusia dari penyakit autoimun [12], mungkin termasuk lupus eritematosus sistemik. Mereka juga bertanggung jawab untuk pencegahan penyakit kardiovaskular, termasuk aterosklerosis [5, 7, 12, 21, 37], dan penyakit usia tua [14].

Karakteristik dan peran antibodi alami kelas IgG dan IgA

Dalam hal antibodi alami, selain IgM yang dikenal luas, ada juga IgA dan IgG alami [8, 12, 17, 45, 46]. IgG alami dibagi lagi menjadi subkelas IgG1, IgG2, IgG4 dan tingkat tertinggi IgG3 [1, 7, 8, 16, 17]. Antibodi IgG adalah satu-satunya isotipe yang dapat melintasi penghalang plasenta untuk memastikan kekebalan janin [7, 9, 19]. IgG dibuat oleh berbagai subpopulasi limfosit B, dan diperkirakan [1, 7-9, 12, 14-21] bahwa limfosit B1 dan limfosit B limpa MZ terutama bertanggung jawab atas ekspresi IgG2 [7, 8, 12 , 16]. Baik IgGs dan IgMs alami mengikat dengan antigen filogenetik yang sama dan pada tikus sekitar 15-20% dari IgGs ditemukan polireaktif, mirip dengan IgAs [16]. Berbeda dengan IgM, IgG alami tidak aktif setelah lahir. Pada tikus, telah ditunjukkan bahwa limfosit B memulai produksi IgG setelah terpapar bakteri usus atau antigen asing [7, 8, 12, 16, 42, 73]. Dilaporkan bahwa pada manusia dibutuhkan waktu selama dua tahun sebelum konsentrasi IgG alami dalam serum menjadi cukup tinggi untuk terlihat [107]. Juga disarankan bahwa limfosit T autoreaktif dapat mengaktifkan limfosit B untuk menghasilkan IgG alami pada orang dewasa [16]. Diamati bahwa tingkat IgG anti-dsDNA polireaktif meningkat setelah berbagai infeksi dan bahwa IgG anti-dsDNA yang sama bereaksi silang dengan antigen mikroorganisme, termasuk bakteri [16, 43, 108]. Peran potensial IgG alami dalam mengendalikan peradangan telah dibuktikan, berdasarkan kompleks yang terbentuk dalam kondisi hemolitik, antara antibodi IgG dan hemoglobin [7]. Itu telah ditunjukkan in vitro [7] bahwa IgG alami yang dimurnikan yang berasal dari serum orang sehat mengenali bakteri Gram-positif dan Gram-negatif melalui reseptor pengenalan pola (PRR), seperti ficolin atau mannose-binding lectin (MBL). Diketahui bahwa, dengan mengikat residu polisakarida pada mikroorganisme, lektin tipe-C menyebabkan pembentukan kompleks yang mencakup IgG dan lektin alami, memperkuat proses fagositosis bakteri melalui FcγR1, mis. monosit [17]. Mekanisme yang dimediasi interaksi PRR: PRR ini menginduksi respon imunologi yang lebih kuat [7]. Dalam hal ini, interaksi antara IgG dan ficolin terjadi, memperkuat fagositosis tersebut [7, 17, 109]. Menariknya, kompleks karakteristik IgG-ficolin terjadi pada manusia dan tikus, yang membuktikan pentingnya mendasar IgG dalam perlindungan imunologi organisme [7, 76]. Baik IgG alami dan IgG adaptif bereaksi dengan PRR melalui wilayah C dari rantai H, yang menunjukkan bahwa Fc penting dalam transmisi informasi pertahanan inang, terlepas dari asal dan spesifisitas IgG [7]. IgG alami juga secara khusus bekerja sama dengan lektin dalam perjuangan melawan infeksi yang disebabkan oleh Pseudomonas aeruginosa dan Stafilokokus aureus [7, 17]. IgG anti-PC manusia terutama mewakili subkelas IgG2, sedangkan anti-MDA (malondialdehid) mewakili subkelas IgG1 atau IgG3, yang terakhir memiliki potensi lebih tinggi untuk memasukkan kaskade komplemen dan terlibat dalam aktivasi reseptor imunoglobulin Fc [5, 7, 12, 64]. It was observed that anti-MDA IgGs do not show high expression apart from in patients with inflammatory diseases [5, 12, 64], and that anti-PC IgGs are present even in healthy people [12]. Therefore, it is assumed that these natural IgGs participate in both the regulation of inflammatory states and in the protection of the organism against pathogens, fulfilling the role of innate immunity [7].

On the other hand, natural IgAs are a group of immunoglobulins consisting of two subclasses, IgA1 and IgA2, which are present in mucosal surfaces [8, 12, 14]. In their case, it has been demonstrated [7] that a percentage of natural IgAs are formed by B1 lymphocytes at the newborn stage [7, 12, 44-46] and that, together with natural IgMs, they recognise autoantigens and bind with homologous molecules produced by different microbes [12]. It was observed that natural IgAs along with natural IgMs are important factors responsible for a variety of microbes which settle in the human intestine – the microbiome [12, 45, 46]. It has been shown that the isotypes of IgA inhibit inflammation by participating in it via a reaction with the Fc type 1 receptor (FcαR1/CD89), but the manner in which they take part in this process is a matter of debate [7]. The regulating role of natural IgAs has also been demonstrated in patients who suffered from a selective deficiency of IgAs, when the concentration of both IgA1 and IgA2 was significantly decreased or totally absent but, at the same time, the concentration of IgMs and IgGs remained normal [78]. In such a case, apart from a higher frequency of occurrence of infections in the respiratory tract and digestive tract, the patient was more susceptible to autoimmune disorders, allergy-related illnesses, haematological diseases, arthritis, chronic liver inflammation, ulcerative colitis and Crohn’s disease.


Advantages and Disadvantages of Using Polyclonal Antibodies

  • Production is quicker
  • It is inexpensive
  • Tolerant of minor changes of antigen. Polyclonal antibodies are less sensitive to antigen changes than monoclonal antibodies.
  • Have a choice of producing antibodies in different animals.
  • Chances of getting a better response to the antigen are increased, and can be tried with various animal sources as the secondary antibody produced recognizes different epitopes on the same antigen.
  • Moderately easy to purify while using the high-affinity chromatography methods.

Kekurangan

  • An amplified chance for cross-reaction and false positives.
  • Non-specific interaction with the considerable antigen heterogeneity within the antibody pool.
  • The life span of the host animal is limited.
  • Multiple epitopes make it essential to check the immunogen sequence for any cross-reactivity.
  • Multiple animals have to be immunized against the same antigen.
  • Antibody response depends on the host animal.
  • Sometimes requires multiple control samples to arrive at meaningful conclusions.

Applications of Polyclonal Antibodies

Polyclonal antibodies are a mixture of heterogeneous products produced by different B cell clones. They can recognize and bind to many different epitopes of a single antigen. Polyclonal antibodies are produced by injecting an immunogen into an animal.

After being injected with a specific antigen to elicit a primary immune response, the animal is given a secondary even tertiary immunization to produce higher titers of antibodies against the particular antigen. After immunization, polyclonal antibodies can be obtained straight from the serum or purified to get a free solution from other serum proteins.

The ability of antibodies to selectively bind a specific epitope present on a chemical, carbohydrate, protein or nucleic acid has been thoroughly exploited through the years, as evidenced by the broad spectrum of research and clinical applications in which they are utilized. Applications include simple qualitative and quantitative analyses to ascertain the following:

  • Whether an epitope is present within a solution, cell, tissue, or organism, and if so, where
  • Methods to facilitate purification of an antigen, antigen-associated molecules, or cells expressing an antigen and
  • Techniques that use antibodies bind to mediate and modulate physiological effects for research, diagnostic, or therapeutic purposes.

The applications listed in Table 1 are by no means exhaustive. Still, they illustrate that the versatility of an antibody-x2y is frequently limited only by the user’s imagination and determination.

TujuanApplications relative to antigen
SolubilizedIntact tissues/cellsorganisme
Analysis (qualitative or quantitative)Immunoblot (noda barat)FACS b analysisImmunoimaging (SPECT b and PET b)
Imunopresipitasi
Proteomics/antibody microarraySandwich ELISAImmunofluorescence
Proteomics/antibody microarrayImunohistokimia
kristalografi sinar-X
Purification and/or enrichmentImmunoaffinity purificationFACS and MACS
Mediation and/or modulationCatalysis-abzymesNeutralize activityNeutralize activity
Activate signalingDeplete cell types to alter phenotype
Proteomics/intrabodiesImunoterapi

A particular rundown of applications in which polyclonal antibodies(PAbs), monoclonal antibodies (MAbs), their pieces and forms, either play a fundamental part or have had a massive effect in the essential exploration process. With the exception of imaging, immunotherapy, immunohistochemistry, and x-ray crystallography, regardless of whether to utilize PAb or MAb, relies upon the setting wherein the application is being utilized and the staff’s specialized capacities using them.

ELISA, protein connected immunosorbent examine ELISPOT, compound connected immunospot test FACS, fluorescence-enacted cell checking MACS, attractive actuated cell arranging PET, positron discharge tomography SPECT, single-photon outflow automated tomography.

To know more about the comprehensive range of polyclonal and monoclonal antibodies, contact Helvetica Health Care today!!


Autoantibodies

Circulating antibodies elicited by the patient’s own immune system after exposure to cancer proteins are emerging as promising biomarkers for the early detection of cancer. An advantage of autoantibodies as biomarkers is their production in large quantities despite the presence of a relatively small amount of corresponding antigen. Autoantibodies are also expected to have persistent concentrations and long half-lives due to limited proteolysis and clearance. The immune system constantly monitors the body for the invasion of microorganisms and foreign molecules. A tightly regulated network of antibodies, T-lymphocytes, antigen-presenting cells, cytokines, and microenvironment signals secures the development of an appropriately targeted immune response to combat infections. Foreign extracellular and surface antigens are recognized by B-lymphocytes, which respond by secreting antibodies. To mount a sustained antibody response, B cells require an additional signal from T helper cells, which present the relevant antigen as peptide fragments 15–25 amino acids in length that are in complex with major histocompatibility complex (MHC) class II. Antigens can also stimulate CD8+ T lymphocytes. These cells are activated by intracellular and membrane proteins that are processed by the endogenous processing pathway and presented as peptides 8–10 amino acids in complex with MHC class I. The 2 systems are highly coordinated, and in most cases, high affinity immunoglobulin G (IgG) antibody responses require recognition of the antigen by both B and T lymphocytes. During the initial development of the immune system, more than half of the newly generated B cell receptors are estimated to be capable of binding autoantigens. Most autoreactive B cells are eliminated during B cell maturation, however, preventing mature B cells from reacting with self-molecules. This selection provides the basis for the development of self-tolerance, the ability of the immune system to recognize and ignore the body’s own cells and tissues. Sometimes this mechanism fails and the immune system reacts with one’s own antigens as a consequence of over-expression, mutations, changes in protein half-lives, misfolding, aberrant degradation of self-proteins, or altered post-translational modifications (eg, glycosylation and phosphorylation) of the protein. Autoantibodies have long been recognized in autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus, myasthenia gravis, and rheumatoid arthritis. In some of the diseases, autoantibodies play a central role in its pathogenesis (eg, myasthenia gravis), whereas their role in others is less clear. Nevertheless, the existence and detection of autoantibodies is an important element in establishing an accurate diagnosis. In rheumatoid arthritis, for example, the test for an anti-IgG antibody, also known as the rheumatoid factor, is useful and has a sensitivity of approximately 80%.


Immunoglobulins-Antigen-Antibody reactions and Selected Tests

The combining site of an antibody is located in the Fab portion of the molecule and is constructed from the hypervariable regions of the heavy and light chains. X-Ray crystallography studies of antigen-antibody interactions show that the antigenic determinant nestles in a cleft formed by the combining site of the antibody as illustrated in Figure 1. Thus, our concept of antigen-antibody reactions is one of a key (i.e. the antigen) which fits into a lock (i.e. the antibody).

Non-covalent Bonds

The bonds that hold the antigen to the antibody combining site are all non-covalent in nature. These include hydrogen bonds, electrostatic bonds, Van der Waals forces and hydrophobic bonds. Multiple bonding between the antigen and the antibody ensures that the antigen will be bound tightly to the antibody.

Since antigen-antibody reactions occur via non-covalent bonds, they are by their nature reversible.

Antibody affinity is the strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single combining site on the antibody. It is the sum of the attractive and repulsive forces operating between the antigenic determinant and the combining site of the antibody as illustrated in Figure 2.

Affinity is the equilibrium constant that describes the antigen-antibody reaction as illustrated in Figure 3.

Avidity is a measure of the overall strength of binding of an antigen with many antigenic determinants and multivalent antibodies. Avidity is influenced by both the valence of the antibody and the valence of the antigen. Avidity is more than the sum of the individual affinities. This is illustrated in Figure 4.

To repeat, affinity refers to the strength of binding between a single antigenic determinant and an individual antibody combining site whereas avidity refers to the overall strength of binding between multivalent antigens and antibodies.

SPECIFICITY AND CROSS REACTIVITY

Specificity refers to the ability of an individual antibody combining site to react with only one antigenic determinant or the ability of a population of antibody molecules to react with only one antigen. In general, there is a high degree of specificity in antigen-antibody reactions. Antibodies can distinguish differences in:

The primary structure of an antigen

Isomeric forms of an antigen

Secondary and tertiary structure of an antigen

Cross reactivity refers to the ability of an individual antibody combining site to react with more than one antigenic determinant or the ability of a population of antibody molecules to react with more than one antigen.

Factors affecting measurement of antigen-antibody reactions

The only way that one knows that an antigen-antibody reaction has occurred is to have some means of directly or indirectly detecting the complexes formed between the antigen and antibody. The ease with which one can detect antigen-antibody reactions will depend on a number of factors.

Afinitas
The higher the affinity of the antibody for the antigen, the more stable will be the interaction. Thus, the ease with which one can detect the interaction is enhanced.

Avidity
Reactions between multivalent antigens and multivalent antibodies are more stable and thus easier to detect.

Physical form of the antigen
The physical form of the antigen influences how one detects its reaction with an antibody. If the antigen is a particulate, one generally looks for agglutination of the antigen by the antibody. If the antigen is soluble one generally looks for the precipitation of the antigen after the production of large insoluble antigen-antibody complexes.


Agglutination Tests

Agglutination/Hemagglutination
When the antigen is particulate, the reaction of an antibody with the antigen can be detected by agglutination (clumping) of the antigen. The general term agglutinin is used to describe antibodies that agglutinate particulate antigens. When the antigen is an erythrocyte the term hemagglutination is used. All antibodies can theoretically agglutinate particulate antigens but IgM, due to its high valence, is particularly good agglutinin and one sometimes infers that an antibody may be of the IgM class if it is a good agglutinating antibody.

Qualitative agglutination test
Agglutination tests can be used in a qualitative manner to assay for the presence of an antigen or an antibody. The antibody is mixed with the particulate antigen and a positive test is indicated by the agglutination of the particulate antigen. (Gambar 7).

For example, a patient’s red blood cells can be mixed with antibody to a blood group antigen to determine a person’s blood type. In a second example, a patient’s serum is mixed with red blood cells of a known blood type to assay for the presence of antibodies to that blood type in the patient’s serum.
Quantitative agglutination test
Agglutination tests can also be used to measure the level of antibodies to particulate antigens. In this test, serial dilutions are made of a sample to be tested for antibody and then a fixed number of red blood cells or bacteria or other such particulate antigen is added. Then the maximum dilution that gives agglutination is determined. The maximum dilution that gives visible agglutination is called the titer. The results are reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination. Figure 8 illustrates a quantitative hemagglutination test.

Prozone effect – Occasionally, it is observed that when the concentration of antibody is high (i.e. lower dilutions), there is no agglutination and then, as the sample is diluted, agglutination occurs (See Patient 6 in Figure 8). The lack of agglutination at high concentrations of antibodies is called the prozone effect. Lack of agglutination in the prozone is due to antibody excess resulting in very small complexes that do not clump to form visible agglutination.

Applications of agglutination tests

Saya. Determination of blood types or antibodies to blood group antigens.

ii. To assess bacterial infections

misalnya A rise in titer of an antibody to a particular bacterium indicates an infection with that bacterial type. N.B. a fourfold rise in titer is generally taken as a significant rise in antibody titer.

Practical considerations
Although the test is easy to perform, it is only semi-quantitative.

Direct Coomb’s Test
When antibodies bind to erythrocytes, they do not always result in agglutination. This can result from the antigen/antibody ratio being in antigen excess or antibody excess or in some cases electrical charges on the red blood cells preventing the effective cross linking of the cells. These antibodies that bind to but do not cause agglutination of red blood cells are sometimes referred to as incomplete antibodies. In no way is this meant to indicate that the antibodies are different in their structure, although this was once thought to be the case. Rather, it is a functional definition only. In order to detect the presence of non-agglutinating antibodies on red blood cells, one simply adds a second antibody directed against the immunoglobulin (antibody) coating the red cells. This anti-immunoglobulin can now cross link the red blood cells and result in agglutination. This test is illustrated in Figure 10 and is known as the Direct Coomb’s test.

Aplikasi
These include detection of anti-rhesus factor (Rh) antibodies. Antibodies to the Rh factor generally do not agglutinate red blood cells. Thus, red cells from Rh+ children born to Rh- mothers, who have anti-Rh antibodies, may be coated with these antibodies. To check for this, a direct Coombs test is performed. To see if the mother has anti-Rh antibodies in her serum an Indirect Coombs test is performed.
Hemagglutination Inhibition
The agglutination test can be modified to be used for the measurement of soluble antigens. This test is called hemagglutination inhibition. It is called hemagglutination inhibition because one measures the ability of soluble antigen to inhibit the agglutination of antigen-coated red blood cells by antibodies. In this test, a fixed amount of antibodies to the antigen in question is mixed with a fixed amount of red blood cells coated with the antigen (see passive hemagglutination above). Also included in the mixture are different amounts of the sample to be analyzed for the presence of the antigen. If the sample contains the antigen, the soluble antigen will compete with the antigen coated on the red blood cells for binding to the antibodies, thereby inhibiting the agglutination of the red blood cells. as illustrated in Figure 12.

By serially diluting the sample, you can quantitate the amount of antigen in your unknown sample by its titer. This test is generally used to quantitate soluble antigens and is subject to the same practical considerations as the agglutination test.


Precipitation tests

Radial Immunodiffusion (Mancini)
In radial immunodiffusion antibody is incorporated into the agar gel as it is poured and different dilutions of the antigen are placed in holes punched into the agar. As the antigen diffuses into the gel, it reacts with the antibody and when the equivalence point is reached a ring of precipitation is formed as illustrated in Figure 13.


The diameter of the ring is proportional to the log of the concentration of antigen since the amount of antibody is constant. Thus, by running different concentrations of a standard antigen one can generate a standard cure from which one can quantitate the amount of an antigen in an unknown sample. Thus, this is a quantitative test. If more than one ring appears in the test, more than one antigen/antibody reaction has occurred. This could be due to a mixture of antigens or antibodies. This test is commonly used in the clinical laboratory for the determination of immunoglobulin levels in patient samples.
Immunoelectrophoresis
In immunoelectrophoresis, a complex mixture of antigens is placed in a well punched out of an agar gel and the antigens are electrophoresed so that the antigen are separated according to their charge. After electrophoresis, a trough is cut in the gel and antibodies are added. As the antibodies diffuse into the agar, precipitin lines are produced in the equivalence zone when an antigen/antibody reaction occurs as illustrated in Figure 14.


This tests is used for the qualitative analysis of complex mixtures of antigens, although a crude measure of quantity (thickness of the line) can be obtained. This test is commonly used for the analysis of components in a patient’ serum. Serum is placed in the well and antibody to whole serum in the trough. By comparisons to normal serum, one can determine whether there are deficiencies on one or more serum components or whether there is an overabundance of some serum component (thickness of the line). This test can also be used to evaluate purity of isolated serum proteins.
Countercurrent electrophoresis
In this test the antigen and antibody are placed in wells punched out of an agar gel and the antigen and antibody are electrophoresed into each other where they form a precipitation line as illustrated in Figure 15. This test only works if conditions can be found where the antigen and antibody have opposite charges. This test is primarily qualitative, although from the thickness of the band you can get some measure of quantity. Its major advantage is its speed.


Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Radioimmunoassays (RIA) are assays that are based on the measurement of radioactivity associated with immune complexes. In any particular test, the label may be on either the antigen or the antibody. Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) are those that are based on the measurement of an enzymatic reaction associated with immune complexes. In any particular assay, the enzyme may be linked to either the antigen or the antibody.

Competitive RIA/ELISA for Ag Detection
The method and principle of RIA and ELISA for the measurement of antigen is shown in Figure 16. By using known amounts of a standard unlabeled antigen, one can generate a standard curve relating radioactivity (cpm) (Enzyme) bound versus amount of antigen. From this standard curve, one can determine the amount of an antigen in an unknown sample.

The key to the assay is the separation of the immune complexes from the remainder of the components. This has been accomplished in many different ways and serves as the basis for the names given to the assay:

Precipitation with ammonium sulphate
Ammonium sulphate (33 – 50% final concentration) will precipitate immunoglobulins but not many antigens. Thus, this can be used to separate the immune complexes from free antigen. This has been called the Farr Technique

Anti-immunoglobulin antibody
The addition of a second antibody directed against the first antibody can result in the precipitation of the immune complexes and thus the separation of the complexes from free antigen.

Immobilization of the Antibody
The antibody can be immobilized onto the surface of a plastic bead or coated onto the surface of a plastic plate and thus the immune complexes can easily be separated from the other components by simply washing the beads or plate (Figure 17). This is the most common method used today and is referred to as Solid phase RIA or ELISA. In the clinical laboratory, competitive RIA and ELISA are commonly used to quantitate serum proteins, hormones, drugs metabolites.

Non-competitive RIA/ELISA for Ag or Ab
Non-competitive RIA and ELISAs are also used for the measurement of antigens and antibodies. In Figure 18, the bead is coated with the antigen and is used for the detection of antibody in the unknown sample. The amount of labeled second antibody bound is related to the amount of antibody in the unknown sample. This assay is commonly employed for the measurement of antibodies of the IgE class directed against particular allergens by using a known allergen as antigen and anti-IgE antibodies as the labeled reagent. It is called the RAST test (radioallergosorbent test). In Figure 19, the bead is coated with antibody and is used to measure an unknown antigen. The amount of labeled second antibody that binds is proportional to the amount of antigen that bound to the first antibody.

Tests for Cell Associated Antigens

Immunofluorescence
Immunofluorescence is a technique whereby an antibody labeled with a fluorescent molecule (fluorescein or rhodamine or one of many other fluorescent dyes) is used to detect the presence of an antigen in or on a cell or tissue by the fluorescence emitted by the bound antibody.

Direct Immunofluorescence
In direct immunofluorescence, the antibody specific to the antigen is directly tagged with the fluorochrome (Figure 20).

Indirect Immunofluorescence
In indirect immunofluorescence, the antibody specific for the antigen is unlabeled and a second anti-immunoglobulin antibody directed toward the first antibody is tagged with the fluorochrome (Figure 21). Indirect fluorescence is more sensitive than direct immunofluorescence since there is amplification of the signal.

Aliran Sitometri
Flow cytometry is commonly used in the clinical laboratory to identify and enumerate cells bearing a particular antigen. Cells in suspension are labeled with a fluorescent tag by either direct or indirect immunofluorescence. The cells are then analyzed on the flow cytometer.


Figure 22 illustrates the principle of flow cytometry. In a flow cytometer, the cells exit a flow cell and are illuminated with a laser beam. The amount of laser light that is scattered off the cells as they passes through the laser can be measured, which gives information concerning the size of the cells. In addition, the laser can excite the fluorochrome on the cells and the fluorescent light emitted by the cells can be measured by one or more detectors.

The type of data that is obtained from the flow cytometer is shown in Figure 23. In a one parameter histogram, increasing amount of fluorescence (e.g. green fluorescence) is plotted on the x axis and the number of cells exhibiting that amount of fluorescence is plotted on the y axis. The fraction of cells that are fluorescent can be determined by integrating the area under the curve. In a two parameter histogram, the x axis is one parameter (e.g. red fluorescence) and the y axis is the second parameter (e.g. green fluorescence). The number of cells is indicated by the contour and the intensity of the color.

rx-24.jpg (17140 bytes) Figure 24
PowerPoint animation of figure 24 of this figure

Antigen/antibody complexes can also be measured by their ability to fix complement because an antigen/antibody complex will “consume” complement if it is present, whereas free antigens or antibodies do not. Tests for antigen/antibody complexes that rely on the consumption of complement are termed complement fixation tests and are used to quantitate antigen/antibody reactions. This test will only work with complement fixing antibodies (IgG and IgM are best).
The principle of the complement fixation test is illustrated in Figure 24. Antigen is mixed with the test serum to be assayed for antibody and antigen/antibody complexes are allowed to form. A control tube in which no antigen is added is also prepared. If no antigen/antibody complexes are present in the tube, none of the complement will be fixed. However, if antigen/antibody complexes are present, they will fix complement and thereby reduce the amount of complement in the tube. After allowing complement fixation by any antigen/antibody complexes, a standard amount of red blood cells, which have been pre-coated with anti-erythrocyte antibodies is added. The amount of antibody-coated red blood cells is predetermined to be just enough to completely use up all the complement initially added, if it were still there. If all the complement was still present (i.e. no antigen/antibody complexes formed between the antigen and antibody in question), all the red cells will be lysed. If antigen/antibody complexes are formed between the antigen and antibody in question, some of the complement will be consumed and, thus, when the antibody-coated red cells are added not all of them will lyse. By simply measuring the amount of red cell lysis by measuring the release of hemoglobin into the medium, one can indirectly quantitate antigen/antibody complexes in the tube. Complement fixation tests are most commonly used to assay for antibody in a test sample but they can be modified to measure antigen.


Dendritic Cells

Dendritic cells reside in the skin, lymph nodes, and tissues throughout the body. Most dendritic cells are antigen-presenting cells. That is, they ingest, process, and present antigens, enabling helper T cells to recognize the antigen. Dendritic cells present antigen fragments to T cells in the lymph nodes.

Another type of dendritic cell, the follicular dendritic cell, is present in lymph nodes and presents unprocessed (intact) antigen that has been linked with antibody (antibody-antigen complex) to B cells. Follicular dendritic cells help B cells respond to an antigen.

After T and B cells are presented with the antigen, they become activated.


REAP: A platform to identify autoantibodies that target the human exoproteome

Autoantibodies that recognize extracellular proteins (the “exoproteome”) exert potent biological effects but have proven challenging to detect with existing screening technologies. Here, we developed Rapid Extracellular Antigen Profiling (REAP) as a technique for comprehensive, high-throughput discovery of exoproteome-targeting autoantibodies. With REAP, patient samples are applied to a genetically-barcoded library containing 2,688 human extracellular proteins displayed on the surface of yeast. Antibody-coated cells are isolated by magnetic selection and deep sequencing of their barcodes is used to identify the displayed antigens. To benchmark the performance of REAP, we screened 77 patients with autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy (APECED). REAP sensitively and specifically detected known autoantibody reactivities in APECED in addition to numerous previously unidentified reactivities. We further screened 106 patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and identified novel autoantibody reactivities against a diverse set of antigens including growth factors, extracellular matrix components, cytokines, and immunomodulatory proteins. Several of these responses were associated with disease severity and specific clinical manifestations of SLE and exerted potent functional effects on cell signaling ex vivo. These findings demonstrate the utility of REAP to atlas the expansive landscape of exoproteome-targeting autoantibodies and their impacts on patient health outcomes.


Poin Kunci

Natural antibodies or autoantibodies, particularly IgM, that react with self-molecules occur in normal individuals and display a moderate affinity but high avidity for self-antigens

High-affinity, somatically mutated, class-switched IgG autoantibodies reflect a pathologic process in which homeostatic pathways related to cell clearance, antigen-receptor signaling or cell effector functions are disturbed

The mechanisms involved in immune-complex-mediated tissue injury include engagement of FcγRs and activation of complement, as well as internalization and activation of Toll-like receptors

Autoantibodies might be detectable long before disease onset and serve as biomarkers enabling diagnosis and targeting of therapeutic intervention

In organ-specific autoimmune diseases, autoantibodies directly injure target organs in systemic autoimmune diseases, they can also bind to different self-molecules and cause disease through the formation of immune complexes

Research is needed to clarify why certain antigens are targeted in different autoimmune diseases and how some antibodies activate, whereas others inhibit, immune responses


Regulatory Cells

The adaptive immune system is carefully regulated by several different cell populations. Helper T cells that promote immune responses are described earlier. Other T cells are called regulatory T cells (Treg cells). These secrete a mixture of cytokines that inhibit conventional immune responses. They serve to turn off an immune response once it has completed its task and the invading microorganism is eliminated. Treg cells also play a central role in preventing the development of autoimmunity.

For More Information

Also see pet health content regarding adaptive immunity in dogs, cats, and horses.


Tonton videonya: Coronavirus: how to self-swab (November 2022).