Informasi

Keamanan hayati Lentivector

Keamanan hayati Lentivector


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Lentivectors banyak digunakan dalam biologi molekuler, paling umum untuk mentransduksi secara stabil gen yang diinginkan. Sistem vektor ini memanfaatkan kemampuan virus untuk memperkenalkan genomnya sendiri ke dalam sel inang. Dengan demikian lentivectors ditransfeksi ke garis sel produsen (biasanya HEK) dan di sana virus diproduksi dengan sisipan yang diinginkan. Akhirnya virus ini akan dipanen dan garis sel yang diinginkan ditransduksi.

Untuk alasan keamanan hayati, sistem ini dirancang sedemikian rupa sehingga risiko yang ditimbulkan oleh "sistem virus" dapat dikurangi. Jadi virus yang dihasilkan oleh sistem ini tidak dapat bereplikasi, artinya sejauh yang saya pahami, virus yang terbentuk kemudian tidak dapat membentuk lebih banyak di inang kedua karena gen yang bertanggung jawab tidak direkrut. Namun, tampaknya plasmid yang digunakan dapat bergabung kembali dan menimbulkan kemungkinan untuk membuat virus yang mampu bereplikasi. Namun sejauh yang saya temukan dalam literatur ini tidak pernah terdeteksi dan berdiri sebagai kemungkinan teoretis.

Pertanyaan pertama saya, dalam angka sebenarnya, berapa probabilitas bahwa peristiwa tersebut akan terjadi (jumlah rekombinasi di lokasi tertentu). Jika hal ini terjadi, sistem lentivector akan berpotensi berbahaya, karena sistem ini sebagian besar berbasis pada HIV. Selain itu, vektor ini tidak menggunakan protein amplop HIV endogen melainkan VSV/G dari virus stomatitis vesikular, untuk meningkatkan tropisme dan stabilitas.

Selain itu, meskipun HIV diturunkan, sebagian besar gen HIV diambil dari lentivector, namun menurut saya yang paling penting ada di sana. Pertanyaan kedua, dengan mempertimbangkan semua ini, virus "ciptaan" teoretis ini pada akhirnya akan dapat menyebabkan AIDS atau efek buruk lainnya? perlu dicatat bahwa sekarang dapat menginfeksi hampir semua sel manusia karena protein VSV, lalu apakah benar untuk berpikir bahwa penyakitnya akan jauh lebih buruk, dan jauh lebih menular daripada HIV asli? perhatikan bahwa bahkan stabilitasnya meningkat.

Namun, saya juga dapat berpikir bahwa virus baru rekombinan ini mungkin memang dihancurkan oleh sistem kekebalan, meskipun tropisme meningkat, karena virus stomatitis vesikular tidak menyebabkan patologi pada manusia, dan mungkin protein ini berfungsi sebagai antigen dan dapat menginduksi respon imun yang cukup.

Terakhir, apakah virus rekombinan teoretis dapat dideteksi dengan tes HIV standar?

Untuk menyederhanakan banyak hal, saya mengacu pada lentivector generasi ketiga


Berapa banyak rekombinasi yang diperlukan untuk mencapai virus aktif?

FDA telah mengakui kemungkinan bahwa lentivectors dapat diubah menjadi lentivirus yang bereplikasi secara aktif jika mereka menjalani rekombinasi dengan HIV tipe liar pada pasien HIV-positif. Dalam hal ini, dua peristiwa rekombinasi diperlukan untuk mentransfer urutan lentivector ke dalam urutan HIV (mekanisme transfer identik dengan kasus lentivector generasi pertama).

Artikel dari VCU ini menjelaskan mekanisme lain yang melaluinya hal ini dapat terjadi di generasi pertama sistem lentivector, yang terdiri dari dua peristiwa rekombinasi antara lentivector dan plasmid pembantu. Perhatikan bahwa 3 gen lelucon, polo dan env terdapat pada plasmid yang sama, dan plasmid tersebut diapit oleh LTR. Lentivector generasi kedua, seperti sistem pLKO, tidak mengalami masalah ini dan membutuhkan HIV tipe liar untuk memproduksi lentivirus yang bereplikasi secara aktif.

Untuk mengurangi kemungkinan terjadinya hal ini, sistem lentivector generasi kedua dan ketiga membagi gen menjadi beberapa plasmid, yang kemudian membutuhkan lebih banyak peristiwa rekombinasi untuk menghasilkan replikasi virus yang kompeten. Selain itu, ekor poliA dari 3' LTR diganti untuk mengurangi kemungkinan terjadinya peristiwa rekombinasi.

Menurut artikel Addgene tentang keamanan hayati lentivector, plasmid transfer gen yang diinginkan (generasi ke-2 dan ke-3) memiliki penghapusan di wilayah 3' LTR yang mencegahnya menjadi aktif secara replikatif. Oleh karena itu, satu-satunya kemungkinan terjadinya rekombinasi adalah garis sel yang mengekspresikan virus mengalami replikasi dengan galur HIV tipe liar yang aktif. Contohnya adalah plasmid transfer pLKO ini, yang berisi LTR 3 'terpotong, mencegah urutan dari replikasi di luar E. coli, yang mereplikasinya tidak menggunakan LTR melainkan menggunakan plasmid asal replikasi.

Apakah virus aktif yang dihasilkan oleh rekombinasi lebih berbahaya di alam liar daripada HIV tipe liar?

Ini sulit untuk dijawab, karena rekombinasi hanya memungkinkan virus yang aktif terbentuk, tetapi tidak menjamin bahwa virus tersebut akan berbahaya. Virus berbahaya secara teoritis mungkin, tetapi membutuhkan rekombinasi yang jauh lebih banyak daripada minimal 2 untuk kompetensi replikasi dalam sistem lentivector generasi ke-2.

Sebagai contoh, sistem lentivector umumnya tidak mengkode protein virus vpr, vif, nef dan vpu. Protein ini diperlukan untuk meningkatkan infektivitas HIV di berbagai jenis jaringan (tetapi tidak pada sel yang dikultur seperti HEK293). Kurangnya protein ini dalam lentivector kompeten replikasi hipotetis akan secara signifikan menghambat penyebarannya di alam liar. Penggabungan protein ini masuk akal tetapi sangat tidak mungkin, karena lebih banyak peristiwa rekombinasi silang akan diperlukan.

Untuk menggunakan contoh Anda, env pengkodean protein untuk selubung protein VSV berada di dalam amplop plasmid. Karena lentivector kompeten replikasi yang dibentuk oleh 2 peristiwa rekombinasi akan menjadi pseudotipe yang hanya mengandung HIV env protein, ia perlu memperoleh lebih lanjut gen VSV untuk menggantikannya env protein, karena gen ini tidak ada di daerah yang sama. Tidak ada homologi antara dua untai DNA, yang secara signifikan akan menghambat kemungkinan gen VSV entah bagaimana dimasukkan ke dalam HIV aktif.

Penambahan berbagai protein chimeric dan daerah LTR pada lentivector generasi ke-3 hanya memperumit masalah.

Secara keseluruhan, saya tidak dapat menemukan sumber yang membandingkan infektivitas HIV transgenik teoretis ini versus tipe liar. Namun, meskipun secara teoritis mungkin bahwa lentivector kompeten replikasi transgenik dapat memiliki tropisme yang lebih baik daripada HIV dengan memperoleh gen VSV, kemungkinan terjadinya jauh lebih rendah daripada yang dihasilkan di tempat pertama.

Bisakah lentivector dideteksi dengan tes HIV?

Mengenai pertanyaan terakhir apakah lentivector dapat dideteksi dengan tes HIV standar, jawabannya adalah bahwa deteksi dimungkinkan jika orang yang terinfeksi lentivectors, telah memperoleh respons imun terhadap protein gag lentivector, dan beban lentivector adalah cukup tinggi.

Tes HIV spesifik untuk bagian yang berbeda dari virus, tetapi kebanyakan dari mereka menargetkan protein p24 virus, yang merupakan komponen dari tes HIV. muntah poliprotein.

Tes HIV berbasis PCR juga ada, tetapi tes ini akan bergantung pada primer spesifik yang dihasilkan dan apakah RT-PCR akan menghasilkan amplikon berdasarkan urutan spesifik plasmid.

Karena gen gag dikodekan untuk sebagian besar sistem lentivector, oleh karena itu sangat mungkin bahwa siapa pun yang terinfeksi lentivector akan mengekspresikan antibodi terhadap p24, dan oleh karena itu menghasilkan positif untuk ELISA serta tes Western blot dengan asumsi bahwa p24 dan jumlah antibodi cukup tinggi untuk mencapai titik potong.

Saya tidak dapat menemukan tingkat cutoff yang tersedia untuk umum untuk tingkat ELISA dan Western blot, tetapi jika (secara hipotesis) seseorang disuntik dengan banyak lentivectors, mereka kemungkinan akan dites positif HIV. Namun, karena lentivector tidak bereproduksi secara aktif, ia akan segera dibersihkan oleh sistem kekebalan.


Keterikatan yang berkepanjangan dari partikel vektor yang diturunkan dari human immunodeficiency virus ke sel target hematopoietik menyebabkan transduksi sekunder in vitro dan in vivo

Vektor lentivirus turunan human immunodeficiency virus tipe 1 yang membawa glikoprotein amplop vesikular stomatitis virus G (VSV-G) menunjukkan kisaran inang yang luas dan dapat secara stabil mentransduksi sel induk hematopoietik yang diam. Mengingat kekhawatiran tentang keamanan hayati dan potensi transmisi kuman, mereka telah digunakan terutama untuk strategi ex vivo, yang dianggap memastikan penghapusan partikel yang terikat permukaan berlebih dan mencegah penyebaran in vivo. Studi yang disajikan di sini malah mengungkapkan kepatuhan partikel yang berkepanjangan setelah paparan ex vivo, meskipun prosedur pencucian serial, dengan transduksi sel target sekunder berikutnya dalam kultur langsung dan transwell. Kami mengeksplorasi parameter kritis yang mempengaruhi retensi dan transfer partikel dan menunjukkan bahwa perlekatan pada permukaan sel secara selektif melindungi partikel virus dari inaktivasi yang dimediasi komplemen serum. Selain itu, penelitian dengan penerima murine nonmyeloablated menunjukkan bahwa transplantasi sel hematopoietik yang terpapar vektor dan dicuci menghasilkan penyebaran sistemik partikel fungsional VSV-G/lentivector. Kami mendemonstrasikan penandaan genetik dengan transfer partikel vektor yang tidak disengaja dan ekspresi produk transgen yang berkepanjangan dalam jaringan penerima. Temuan kami memiliki implikasi untuk keamanan hayati, desain vektor, dan penelitian biologi sel.

Angka

Ekspresi GFP dalam sel 293T…

Ekspresi GFP dalam sel 293T setelah kokultur dengan sel WBM murine yang terpapar lentivirus. 293T…

Pemindahan lentivector menular ke…

Pemindahan lentivector infeksius ke sel target sekunder tidak memerlukan kontak sel-sel…

Transfer partikel vektor dan sekunder…

Transfer partikel vektor dan transduksi sekunder tidak mewakili transduksi semu dan terjadi secara independen…

Partikel vektor menempel pada target…

Partikel vektor yang menempel pada sel target, tetapi tidak dalam suspensi, sebagian besar…

Ekspresi GFP di host CD45.2…

Ekspresi GFP pada inang CD45.2 genotipe subset leukosit darah tepi dalam perwakilan…

Ekspresi GFP dalam jaringan murine…

Ekspresi GFP dalam jaringan murine dari hewan 15 minggu setelah injeksi GFP…

Kegigihan urutan proviral di…

Kegigihan urutan proviral dalam jaringan inang. (A) Amplifikasi urutan GFP dengan…


Pengembangan Vektor Lentiviral dengan Ekspresi Epitel Pernafasan Terregulasi di vivo

Pengembangan vektor transfer gen dengan ekspresi spesifik paru yang diatur akan menjadi alat yang berguna untuk mempelajari biologi paru dan mengembangkan terapi gen. Dalam penelitian ini kami membangun serangkaian vektor lentiviral dengan elemen pengatur yang diprediksi menghasilkan ekspresi transgen spesifik paru: protein surfaktan C promotor (SPC) untuk ekspresi sel epitel tipe II alveolar (AECII), protein 10-kD sel Clara (CC10). ) untuk ekspresi sel Clara di saluran napas, dan promotor Jaagskiete sheep retrovirus (JSRV) untuk ekspresi di kedua jenis sel. Ekspresi transgen dari vektor SPC dan CC10 masing-masing terbatas pada garis sel AECII dan Clara, sementara ekspresi dari vektor JSRV diamati pada beberapa tipe sel pernapasan dan non-pernapasan. Setelah pengiriman supernatan lentivector intratrakeal ke tikus, ekspresi transgen diamati di AECII dari lentivector SPC, dan dalam sel Clara dari lentivector yang dipromosikan CC10. Ekspresi transgen tidak terdeteksi pada jaringan nonrespirasi setelah pengiriman intravena vektor lentiviral CC10 dan SPC ke penerima murine. Singkatnya, penggabungan elemen pengatur genom dari gen SPC dan CC10 menghasilkan ekspresi transgen spesifik pernapasan in vitro dan in vivo. Vektor-vektor ini akan memberikan alat yang berguna untuk mempelajari biologi paru-paru dan pengembangan terapi gen untuk gangguan paru-paru.

Vektor ini akan meningkatkan keamanan aplikasi terapi gen paru-paru. Mereka juga akan berguna bagi ilmuwan dasar, untuk mengarahkan ekspresi gen spesifik paru-paru dan/atau melacak keturunan sel punca yang ditransduksi.

Vektor berdasarkan parvovirus manusia nonpatogenik, adenoassociated virus (AAV), juga sedang dievaluasi untuk pengiriman gen di paru-paru (5). Vektor AAV rekombinan dapat berintegrasi ke dalam sel, tetapi lebih sering dipertahankan sebagai episom yang diencerkan atau hilang dengan pembelahan sel (5, 6). Selain itu, ukuran sisipan yang kecil membuat sulit untuk menghasilkan vektor rekombinan dengan unit transkripsi besar seperti promotor spesifik epitel yang mengekspresikan regulator transmembran fibrosis kistik, yang panjangnya bisa 8 kb atau lebih.

Sistem transfer gen nonviral menggunakan liposom atau DNA telanjang juga telah digunakan untuk mentransfer gen ke epitel pernapasan (7, 8). Keuntungan dari sistem ini adalah bahwa kaset transgenik dapat ditransfer tanpa urutan virus, dan gen besar atau banyak dapat ditransfer terlepas dari status proliferatif dan profil reseptor permukaan sel dari sel target. Namun, efisiensi keseluruhan transfer gen rendah, gen jarang berintegrasi, dan vektor hilang dalam sel yang berlipat ganda, dan dengan demikian pendekatan ini tidak berguna untuk mencapai terapi gen stabil jangka panjang.

Untuk terapi gen jangka panjang atau studi biologi, diperlukan vektor yang dapat berintegrasi secara efisien ke dalam genom sel target (9). Retrovirus tipe “C” seperti virus leukemia murine Moloney, atau lentivirus seperti HIV-1, berintegrasi secara stabil ke dalam genom sel target. Penghapusan urutan pengkodean untuk produk gen virus membuat replikasi vektor transfer gen tidak kompeten dan membuat 6-8 kb tersedia untuk penyisipan gen yang diinginkan (10). Vektor transfer gen lentiviral dapat mentransduksi dan berintegrasi ke dalam sel yang tidak membelah namun, mereka umumnya mentransduksi sel yang membelah lebih efisien (11-13).

Vektor transfer gen lentiviral, seperti vektor CCL yang dikembangkan oleh Zufferey dan rekan mengandung 10% dari genom HIV-1 tipe liar (14). Vektor lentiviral rekombinan pseudotyped dengan protein vesikular stomatitis G (VSV-G) dapat mentransduksi berbagai sel yang tidak membelah. Beberapa penelitian telah menunjukkan transfer gen lentiviral dari vektor berbasis HIV-1 atau FIV ke epitel pernapasan dalam kultur epitel yang diam dan terpolarisasi in vitro (15, 16) atau sel epitel hidung, saluran napas, bronkial, dan alveolar in vivo (16–20). Sel yang ditransduksi dapat dideteksi untuk jangka waktu yang lama in vivo, menunjukkan bahwa vektor-vektor ini dapat berintegrasi ke dalam sel yang berumur panjang, atau nenek moyang pernapasan, yang menyumbangkan keturunan untuk jangka waktu yang lama.

Persyaratan kedua untuk terapi gen adalah ekspresi transgen yang konsisten dan diatur oleh garis keturunan. Sementara ekspresi transgen konstitutif mungkin cocok untuk aplikasi terapi gen dalam defisiensi gen rumah tangga, seperti penyakit penyimpanan lisosom atau defisiensi enzim lainnya, itu tidak akan dapat diterima untuk gangguan lain yang membutuhkan regulasi ekspresi transgen. Hal ini sangat penting setelah perkembangan leukemia pada pasien X-SCID yang menerima sel hematopoietik yang ditransduksi secara retroviral dengan cDNA rantai umum, karena disregulasi proto-onkogen dalam genom dari penambah retroviral yang kuat dari vektor terintegrasi (21).

Untuk ekspresi transgen yang dibatasi garis keturunan dari vektor lentiviral, desain vektor yang tidak aktif sendiri di mana promotor dan penambah virus di wilayah U3 dari pengulangan terminal panjang (LTR) 3′ dihapus dari plasmid vektor dapat digunakan. Selama integrasi, wilayah U3 dari 3′LTR disalin ke 5′LTR, sehingga menghasilkan eliminasi promotor virus 5′ dalam provirus terintegrasi (14, 22). Transgen dapat diekspresikan dari elemen promotor/regulasi khusus garis keturunan internal atau diatur. Vektor lentiviral telah digunakan untuk ekspresi transgen yang diatur dalam berbagai garis keturunan seperti limfosit B (23), limfosit T (24, 25), atau eritrosit (26, 27) namun, mereka belum dijelaskan untuk jenis sel pernapasan.

Dalam studi ini kami menggambarkan pengembangan dan evaluasi dari serangkaian vektor lentiviral di mana transgen penanda protein fluoresen hijau (EGFP) yang ditingkatkan diekspresikan dari promotor dan elemen pengatur yang diprediksi memberikan ekspresi spesifik saluran napas dan/atau epitel alveolus. Promotor seluler yang dievaluasi dalam penelitian ini berasal dari gen surfaktan protein C (SPC) (28) atau protein sekretori 10-kD sel Clara (CC10) (29) untuk menyediakan ekspresi terbatas epitel alveolar tipe II (AECII) atau sel Clara, masing-masing. Promotor dari retrovirus domba Jaagskiete (JSRV), yang diprediksikan berekspresi dalam sel AECII dan Clara (30), juga dievaluasi. Profil garis keturunan ekspresi transgen dari lentivectors dengan masing-masing promotor ini dievaluasi dalam garis sel in vitro dan di paru-paru setelah in vivo pengiriman supernatan virus ke tikus. Penelitian ini menjelaskan perkembangan vektor lentivirus dengan ekspresi transgen spesifik epitel pernapasan, yang akan memfasilitasi pengembangan terapi gen paru dan studi perkembangan dan biologi paru.

Tulang punggung vektor lentiviral yang digunakan dalam penelitian ini adalah vektor penginaktifan-sendiri pCCL yang disediakan oleh Dr. Luigi Naldini (CellGenesys, San Francisco, CA) (14). Dalam tulang punggung ini, penambah virus dan kotak TATA di wilayah promotor U3 dari 3′LTR telah dihapus. Ini menghasilkan melumpuhkan promotor dalam provirus terintegrasi, karena wilayah U3 dari 3′LTR disalin ke 5′LTR selama integrasi.

Tulang punggung vektor dasar, CCL-X-EGFP, berisi situs multikloning (X) hulu dari gen reporter EGFP di mana promotor uji dapat dimasukkan. Tulang punggung vektor ini juga berfungsi sebagai kontrol negatif “tanpa promotor”. Promotor SPC manusia diselidiki untuk ekspresi spesifik AECII (28). Promotor CC10 tikus dievaluasi untuk ekspresi spesifik saluran napas dalam sel Clara (29). Promotor CC10 dan SPC berasal dari Dr. Jeffrey Whitsett (Pusat Medis Rumah Sakit Anak Cincinnati, Cincinnati, OH). Untuk ekspresi di kedua sel AECII dan Clara kami mengevaluasi promotor dari wilayah U3 JSRV dari Dr. Hung Fan (University of California, Irvine, CA) dievaluasi. Lentivector dengan promotor konstitutif dari promotor/peningkat LTR vektor MND retroviral (31) disediakan oleh Dr. Donald B. Kohn (Rumah Sakit Anak Los Angeles, Los Angeles, CA) dan digunakan sebagai vektor kontrol positif dalam penelitian ini.

Supernatan lentiviral pseudotipe VSV-G diproduksi oleh transfeksi rangkap tiga dari garis sel 293T ginjal embrionik manusia seperti yang dijelaskan sebelumnya (23). Singkatnya, 5 × 10 6 293T sel diunggulkan dalam poli-L-lisin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) -diperlakukan piring kultur jaringan 10 cm semalam.Hari berikutnya, sel ditransfeksi dengan 10 g plasmid vektor, 10 g plasmid kemasan 8,9 (10) (yang tidak mengekspresikan protein aksesori HIV-1), dan 2 g plasmid pMDG-VSV-G menggunakan transfeksi kalsium fosfat standar. Untuk preparat supernatan virus yang lebih besar, semua komponen kultur transfeksi diskalakan satu log untuk 500 cm 2 pelat kultur jaringan (Costar, Lowell, MA). Enam belas jam kemudian media telah dihapus, dan sel-sel dicuci dengan PBS dan kemudian terkena 10 mM natrium butirat (Sigma-Aldrich) selama 8 jam. Supernatan dikumpulkan pada 72 hingga 96 jam setelah transfeksi dan dipekatkan dengan sentrifugasi pada 25.000 rpm selama 90 menit dalam Beckman coulter: Optima L-90K Preparative Ultracentrifuge dalam swing bucket rotor (SW32Ti) (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Karena promotor dari semua vektor virus tidak akan berekspresi dalam satu jenis sel, titer mentah ditentukan setelah penambahan pengenceran serial supernatan virus yang dilengkapi dengan 8 g/ml polibrene (Sigma-Aldrich) ke tipe sel yang mengekspresikan setiap promotor. Vektor SPC dan JSRV dititrasi pada sel MLE-12 atau MLE-15 dan vektor CC10 pada H441. Titer mentah dihitung dengan:

Karena efisiensi transduksi tidak setara antara semua garis sel, setiap garis sel juga secara bersamaan ditransduksi dengan kontrol positif CCL-MND-EGFP, untuk menormalkan titer ke efisiensi transfer gen pada sel 293A (Invitrogen, Carlsbad, CA). Titer yang dinormalisasi digunakan untuk menghitung konsentrasi virus, dan untuk membuat pengenceran untuk setiap percobaan.

Untuk percobaan transduksi, 1 × 105 sel dilapisi di setiap sumur dari piring yang dirawat dengan kultur jaringan 6-sumur. Hari berikutnya, media diganti dengan supernatan lentiviral dan ditambah dengan 8 g/ml polybrene. Media supernatan vektor diganti keesokan paginya dengan media pertumbuhan segar. Sel-sel dilewatkan sesuai kebutuhan dan proporsi sel yang mengekspresikan EGFP ditentukan oleh flow cytometry 5 hingga 7 hari kemudian.

Untuk analisis flow cytometry dari ekspresi transgen EGFP, sel-sel ditripsinisasi, dicuci dalam PBS, dan disuspensikan kembali dalam larutan garam buffer Hanks (Invitrogen) bebas indikator. Sampel dianalisis pada FACs Calibur menggunakan perangkat lunak Cellquest (Becton Dickson, San Jose, CA).

Tikus betina C57B6J hamil waktunya dibeli dari Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), dan telanjang athymic berusia 6 hingga 8 minggu dibeli dari Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Semua tikus dipelihara di Rumah Sakit Anak Rumah Sakit Anak Los Angeles 'Saban Research Institute's Central Animal Facility selama masa penelitian. Semua penelitian telah disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee di Childrens Hospital Los Angeles.

Pada saat pembunuhan, tikus dibius dengan pemberian natrium pentobarbital (150 mg/kg) intraperitoneal. Rongga dada dan perut dibuka secara operasi, arteri ginjal dipotong, dan hewan itu diperfusi dengan setidaknya 10 ml PBS melalui ventrikel kanan jantung. Paru-paru dipompa dengan senyawa OCT Tissue-Tek (Fisher Scientific, Tustin, CA) melalui kateter intravena ukuran 22 yang dimasukkan ke dalam trakea. Paru-paru, trakea, jantung, timus, ginjal, usus, hati, limpa, dan otot rangka diambil untuk imunofluoresensi EGFP dan analisis DNA proviral. Untuk analisis imunofluoresensi, potongan jaringan disematkan dalam media OCT dan disimpan pada suhu -80 ° C sampai pemotongan dan analisis imunofluoresensi untuk ekspresi EGFP seperti yang dijelaskan di bawah ini. Aliquot jaringan juga dikumpulkan untuk analisis DNA proviral dengan pembekuan cepat dalam nitrogen cair dan penyimpanan pada -80 ° C sampai ekstraksi.

Untuk mengevaluasi profil garis keturunan ekspresi transgen dalam jaringan primer, tikus disuntik dengan supernatan lentiviral baik secara intravena atau intratrakeal. Pemberian intravena dilakukan seperti yang dijelaskan (32). Singkatnya, setiap hari ke 0 anak anjing C57B6J neonatus menerima 1 × 108 unit internasional (iu) yang diencerkan menjadi 50 l dengan saline bebas pengawet steril dan polibrene 8 g/ml yang dikirim melalui vena wajah. Anak-anak anjing ditimbang dari 1,3 hingga 1,8 g pada saat injeksi, menghasilkan dosis vektor 5,5 hingga 7,7 × 10 7 iu/g. Setelah disuntik, anak anjing dikembalikan ke sarangnya, dirawat, dan disapih mengikuti protokol standar.

Untuk pengiriman intratrakeal campuran lentivirus/keratinocyte growth factor (KGF), anestesi diinduksi dengan 5% isofluorane dan dipertahankan dengan 2,5% isofluorane pada tikus telanjang athymic berumur 6 sampai 8 minggu (Harlan, Indianapolis, IN). Leher diekstensikan dan dibersihkan dengan larutan klorheksidin. Sayatan kecil di garis tengah dibuat dengan pisau bedah steril untuk mengekspos trakea. Total volume 50 l yang mengandung 1 × 108 partikel vektor (disuspensikan dalam salin 0,9% dengan 5 mg/kg rekombinan manusia [rh] KGF) disuntikkan ke dalam trakea menggunakan jarum suntik insulin 0,5 cc dengan jarum 28-Ga (Becton -Dickson). Tikus kontrol menerima pengiriman intratrakeal 50 l saline yang dicampur dengan 5 mg/kg rhKGF. Setelah injeksi, luka diobati dengan 1 sampai 2 tetes bupivicane (sebagai anestesi lokal) dan ditutup dengan perekat jaringan. Mencit diberi antibiotik (Maxim-200 g/ml dalam air steril) selama 1 bulan dan ketoprofen subkutan pada hari operasi, dan sehari setelah operasi. Tikus dibunuh pada 1 hingga 6 minggu setelah injeksi untuk analisis ekspresi EGFP.

Paru-paru beku dipotong pada 5 m pada cryostat CM1900 (Leica, Bannockburn, IL) dan ditempatkan pada slide kaca Plus (Fisher Scientific, Tustin, CA). Bagian kering difiksasi dengan aseton 100% pra-dingin (−20°C) selama 10 menit pada suhu kamar. Bagian diwarnai untuk melokalisasi sel AECII dan Clara di dalam jaringan dan mengevaluasi garis keturunan mana yang mengekspresikan EGFP. Bagian diblokir dengan 5% serum keledai normal yang mengandung 1% albumin serum sapi, 0,1% triton X-100 dan 0,05% Tween 20 dalam PBS selama 2 jam pada suhu kamar sebelum menerapkan antibodi primer. Sampel yang akan diwarnai dengan antibodi yang ditujukan terhadap CD45 diblokir dengan buffer yang sama, tanpa penambahan Triton X-100.

Untuk mengidentifikasi sel AECII yang mengekspresikan EGFP, bagian paru-paru diberi label ganda dengan anti-GFP kambing (1:800 Abcam, Cambridge, MA) dan antibodi pro-SPC anti-manusia kelinci, yang bereaksi silang dengan pro-SPC tikus (1: 1,000 Chemicon, Temecula, CA) dengan pengenceran yang dibuat dalam buffer pemblokiran serum. Kontrol negatif termasuk bagian yang diperlakukan sama dengan sampel berlabel kecuali untuk diinkubasi dalam buffer pemblokiran tanpa antibodi primer. Bagian dicuci dalam 0,05% Tween 20 dalam PBS (PBST), dan sel imunoreaktif diidentifikasi setelah inkubasi 1 jam pada suhu kamar dengan keledai anti-kelinci-IgG CY3 dan keledai anti-kambing IgG fluorescein isothiocyanate (FITC) (semua antibodi sekunder dari Jackson ImmunoReseach Laboratories, West Grove, PA). Bagian dicuci lagi dengan PBST dan nukleus diwarnai dengan DAPI (Molecular Probe, Eugene, OR). Setelah pencucian terakhir dengan satu kali penggantian PBST, dan satu kali pencucian dalam PBS, bagian tersebut ditutup dengan Reagen Antifade Emas Prolong (Molecular Probe), dan dianalisis segera atau disimpan pada -20 °C.

Untuk mengkarakterisasi lebih lanjut garis keturunan sel-sel GFP-positif di bagian jaringan alveolar diwarnai dengan teknik yang sama yang dijelaskan di atas, tetapi diberi label tiga kali dengan: anti-GFP kambing (1:800), CD45 anti-tikus tikus (1:100 Caltag Laboratories, Carlsbad, CA), dan anti-pro-SPC kelinci (1:1.000). IgG FITC anti-kambing keledai, IgG CY3 anti-tikus keledai, dan IgG CY5 anti-kelinci anti-keledai digunakan sebagai antibodi sekunder.

Untuk identifikasi sel Clara positif EGFP di saluran udara, bagian paru-paru diinkubasi dengan antibodi anti-CC10 kambing untuk CC10 (1:1.500 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) dan anti-GFP ayam (1:2.000 Abcam) semalaman pada suhu 4°C. Sel-sel imunoreaktif diidentifikasi setelah diberi label dengan IgG anti-kambing keledai, antibodi terkonjugasi CY3, dan antibodi terkonjugasi anti-ayam FITC keledai selama 1 jam pada suhu kamar.

Kontrol negatif digunakan dengan setiap percobaan, dan termasuk tikus kontrol negatif yang diobati dengan PBS, serta bagian dari setiap kontrol dan hewan percobaan yang diinkubasi dengan buffer tanpa antibodi primer. Semua sampel divisualisasikan melalui mikroskop senyawa fluoresen (Leica DMRXA) dan gambar diambil dengan kamera digital (Spectra cube), dan diperoleh menggunakan perangkat lunak EasyFISH (Applied Spectral Imaging, Preston, UK).

DNA diekstraksi menggunakan kit Isolasi DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN) menggunakan protokol yang direkomendasikan pabrik. Analisis PCR standar untuk EGFP proviral dan sekuens DNA kontrol genomik -aktin dilakukan pada garis sel dan jaringan yang ditransduksi dari in vivo hewan yang diberi supernatan untuk mengkonfirmasi bahwa mereka mengandung urutan proviral seperti yang dijelaskan (33). Jumlah salinan vektor rata-rata ditentukan dalam sampel DNA yang tersedia dengan analisis reaksi rantai polimerase (PCR) waktu-nyata kuantitatif, dibandingkan dengan pengenceran logaritmik serial DNA genom dari klon Jurkat yang membawa salinan tunggal per sel seperti yang dijelaskan (33).

Serangkaian vektor lentiviral dibangun di mana transgen EGFP diekspresikan baik dari promotor SPC, CC10, atau JSRV internal. Ekspresi transgen dari vektor ini dibandingkan dengan vektor kontrol positif dengan promotor konstitutif dari wilayah U3 dari MND retrovirus LTR (31). Kontrol tanpa promotor berfungsi sebagai kontrol negatif untuk eksperimen garis sel. Diagram skema setiap vektor ditunjukkan pada Gambar 1 . Vektor dikemas ke dalam partikel lentiviral rekombinan dengan protein VSV-G sebagai amplop untuk mentransduksi berbagai jenis sel. Karena tidak ada garis sel tunggal yang akan mengekspresikan semua promotor yang dievaluasi dalam penelitian ini, titer dihitung setelah transduksi setiap vektor ke dalam garis sel yang diketahui mengekspresikannya seperti dijelaskan di atas.

Gambar 1. Diagram skema dari provirus terintegrasi. Vektor adalah vektor lentiviral generasi ketiga yang tidak aktif sendiri berdasarkan seri vektor CCL. panah mewakili promotor transkripsi.

Pada set percobaan pertama, ekspresi transgen dievaluasi dari masing-masing vektor uji dan kontrol dalam garis sel yang mewakili berbagai jenis sel. Aliquots dari setiap baris sel terkena partikel virus konsentrasi setara dari setiap vektor tes dan kontrol. Garis sel yang patuh ditransduksi dengan 3 × 10 4 iu/ml (multiplisitas infeksi [MOI]: 0,3) dan sel suspensi ditransduksi dengan 1 × 10 4 iu/ml (MOI: 0,1). Konsentrasi virus ini dipilih sebagai eksperimen oleh laboratorium kami, dan lainnya (23) telah menunjukkan bahwa kondisi ini meminimalkan proporsi sel dengan banyak salinan vektor, dan dengan demikian memfasilitasi analisis ekspresi pada sel yang membawa satu salinan provirus. Analisis aliran sampel sitometri untuk garis sel AECII (MLE-12) dan satu garis sel nonrespirasi (293A) ditunjukkan pada Gambar 2 . Karena tidak semua garis sel memiliki efisiensi transduksi keseluruhan yang sama, data disajikan sebagai proporsi relatif sel yang mengekspresikan EGFP dari vektor uji ke vektor kontrol MND konstitutif untuk garis sel spesifik tersebut. Misalnya, vektor uji yang diekspresikan dari proporsi sel yang sama dengan vektor yang dipromosikan MND kontrol positif dalam garis sel tertentu memiliki rasio ekspresi 1 ( Gambar 3 ).

Gambar 2. Analisis flow cytometry untuk ekspresi transgen EGFP di 293A (panel atas) dan MLE-12 (panel bawah) garis sel ditransduksi dengan panel vektor lentiviral. Sel ditransduksi sekali dengan supernatan lentiviral dan dievaluasi dengan flow cytometry 5 sampai 7 hari kemudian. Angka di wilayah 2 (R2) menunjukkan persentase sel positif untuk EGFP.

Ekspresi EGFP tertinggi dari promotor CC10 diamati pada garis sel Clara Mtcc1–2 dan H441. Tingkat ekspresi lebih tinggi daripada vektor kontrol positif CCL-MND-EGFP dengan ekspresi EGFP rata-rata 1,3 dan 1,5 untuk sel Mtcc1–2 dan H441, masing-masing, relatif terhadap ekspresi dari vektor MND, yang ditetapkan pada 1 (n = 4). Ekspresi transgen secara signifikan lebih rendah pada sel lain, sel non-Clara, garis sel epitel pernapasan, MLE-12 (0,09 P < 0,01), MLE-15 (0,2 P < 0,01), dan A549 (0,1 P < 0,01) menggunakan dua sisi T tes ( Gambar 3A ). Tingkat ekspresi EGFP dari promotor CC10 di semua lini sel nonrespirasi juga secara signifikan lebih rendah, dengan kisaran 0,001 hingga 0,14 (semua P < 0,001 dua sisi T tes). Data ini menunjukkan bahwa ekspresi transgen dari vektor CCL-CC10-EGFP diatur, dan spesifik garis keturunan untuk garis sel Clara.

Gambar 3. Ringkasan ekspresi transgen dalam panel garis sel dari (A) CCL-CC10-EGFP, (B) CCL-SPC-EGFP, dan (C) vektor CCL-JSRV-EGFP. Tingkat ekspresi disajikan sebagai dinormalisasi ke ekspresi dari vektor kontrol positif CCL-MND-EGFP ± kesalahan standar rata-rata. Tanda bintang menunjukkan perbedaan tingkat ekspresi yang signifikan secara statistik antara kelompok sel dengan P nilai < 0,05 (dua-ekor T tes) dengan spesifik T uji nilai statistik yang ditampilkan dalam teks.

Seperti yang diharapkan, persentase tertinggi sel yang mengekspresikan EGFP dari promotor SPC diamati pada garis sel AECII, yang mengekspresikan gen SPC endogen (Gambar 3B n = 4). Misalnya, tingkat ekspresi EGFP relatif dalam garis sel positif-SPC MLE-12 dan MLE-15 adalah 1,3 dan 0,9 relatif terhadap persentase sel yang diekspresikan dari promotor MND (ditetapkan pada 1,0). Persentase relatif sel yang mengekspresikan EGFP dalam garis non-AECII secara statistik lebih rendah daripada ekspresi dalam garis sel AECII. Secara khusus, garis sel Clara memiliki ekspresi relatif masing-masing 0,6 untuk H441 dan 0,03 untuk Mtcc1–2, yang secara signifikan lebih rendah daripada ekspresi rata-rata MLE-12 (P < 0,001 dua sisi T tes) dan MLE-15 (P < 0,001 dua sisi T tes).

Ekspresi EGFP relatif dari vektor CCL-SPC-EGFP di semua garis sel epitel nonrespirasi kurang dari 0,10 (Gambar 3B). Analisis statistik menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan antara ekspresi EGFP pada garis sel AECII MLE-12 dan MLE-15 dibandingkan dengan semua garis sel nonrespirasi (semua P < 0,002, dua sisi T tes). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa ekspresi EGFP proviral dari promotor SPC sangat spesifik untuk garis sel AECII positif-SPC.

Berbeda dengan ekspresi dari lentivector SPC dan CC10, ekspresi transgen tingkat sedang hingga tinggi diamati dari vektor CCL-JSRV-EGFP di semua garis sel pernapasan dan non-pernapasan yang diuji, kecuali 293A, yang memiliki ekspresi sangat rendah (Gambar 3C). n = 4). Tingkat ekspresi tertinggi diamati pada sel Jurkat (T-limfoid) dengan rasio ekspresi EGFP 1,1, dengan tingkat ekspresi sedang diamati di semua garis sel epitel pernapasan (kisaran: 0,4-0,8). Tingkat ekspresi sedang hingga rendah terdeteksi di garis sel otot, saraf, ginjal, dan asal hematopoietik (kisaran, 0,03-0,6). Tidak ada perbedaan yang signifikan antara ekspresi EGFP antara salah satu garis sel epitel pernapasan dan garis sel nonrespirasi (semua P nilai > 0,05 dua sisi T test), menunjukkan bahwa vektor CCL-JSRV-EGFP tidak menghasilkan ekspresi transgen spesifik epitel pernapasan.

Untuk mengkonfirmasi bahwa kurangnya ekspresi transgen dari promotor bukan karena kurangnya transduksi proviral dalam percobaan ini, semua sampel dievaluasi dengan analisis PCR untuk urutan EGFP proviral. Data dari analisis PCR yang representatif ditunjukkan pada Gambar 4, yang menunjukkan adanya rangkaian EGFP proviral di semua lini sel yang ditransduksi. Ini menegaskan bahwa kurangnya ekspresi EGFP yang diamati pada garis sel nonrespirasi dari promotor SPC dan CC10 bukan karena kurangnya transfer gen, melainkan karena perbedaan dalam regulasi ekspresi transgen dalam berbagai jenis sel.

Gambar 4. Analisis PCR untuk EGFP proviral (panel kanan) dan pengendalian internal B-aktin (panel kiri) sekuens gen pada DNA yang diekstraksi dari sel yang ditransduksi dengan panel vektor lentiviral. Sampel tiruan tidak terpapar supernatan lentiviral, dan tidak ada sampel promotor yang terpapar supernatan lentivirus kontrol yang tidak mengandung promotor untuk cDNA EGFP.

Untuk mengevaluasi ekspresi transgen dari lentivectors CC10 dan SPC di epitel pernapasan primer, supernatan lentiviral disuntikkan langsung ke dalam trakea tikus telanjang athymic penerima. Tikus telanjang digunakan dalam penelitian ini untuk memfasilitasi pembersihan daerah leher untuk operasi dan memvisualisasikan trakea untuk injeksi. Dalam studi pendahuluan, tikus diberikan supernatan lentiviral intratrakeal tanpa pengobatan KGF namun, tidak ada transduksi yang diamati (data tidak ditampilkan). Sementara vektor lentiviral dapat mentransduksi tipe sel yang tidak membelah, efisiensi transduksi yang lebih tinggi telah ditunjukkan pada beberapa tipe sel, dengan induksi siklus sel (11-13). Dalam semua percobaan pengiriman intratrakeal yang disajikan di sini, tikus diobati dengan KGF sebelum, dan pada saat pemberian virus untuk meningkatkan siklus sel Clara (34) dan AECII (35). Strategi ini telah terbukti meningkatkan siklus sel dan transfer gen retroviral ke paru-paru dalam penelitian lain (36, 37). Paru-paru dan saluran udara tikus penerima dipanen dan dievaluasi pada 6 minggu setelah pengiriman supernatan vektor untuk ekspresi EGFP dengan analisis imunofluoresensi.

Bagian jaringan dari penerima vektor lentiviral CCL-CC10-EGFP diimunisasi dengan antibodi anti-GFP. Sel-sel EGFP-imunoreaktif terdeteksi di saluran udara hewan yang diobati dengan CCL-CC10-EGFP, dengan beberapa sel saluran napas positif untuk imunofluoresensi EGFP per tampilan. Sel EGFP-positif tidak terdeteksi pada tikus kontrol negatif yang menerima PBS. Untuk mengidentifikasi garis keturunan sel EGFP-positif di saluran udara tikus percobaan, bagian jaringan diberi label dengan antibodi yang diarahkan terhadap protein CC10 (konjugat red-Cy3) dan EGFP (konjugat hijau-FITC) (Gambar 5). Analisis ini menunjukkan bahwa sel-sel yang diimunisasi untuk EGFP (hijau) di saluran udara juga diimunisasi dengan antibodi anti-CC10 (merah). Fotomikrograf dari analisis imunofluoresensi ganda yang representatif pada bagian saluran napas dari hewan kontrol CCL-CC10-EGFP dan PBS masing-masing ditunjukkan pada Gambar 5A dan 5B. NS panel kiri tampilkan gambar gabungan dengan EGFP (hijau), CC10 (merah), dan inti yang diwarnai DAPI (biru). NS panel tengah tampilkan DAPI dan EGFP (hijau) saluran, dan panel kanan hanya menampilkan saluran DAPI dan CC10.

Gambar 5. Analisis imunofluoresensi paru-paru setelah pengiriman intratrakeal supernatan lentiviral CCL-CC10-EGFP (A dan C) atau PBS (B dan D) pada tikus. A dan B adalah cryosections jaringan saluran napas yang diimunisasi untuk EGFP (hijau) dan CC10 (merah) dengan inti yang diwarnai DAPI (biru). C dan D menunjukkan cryosections jaringan alveolar yang diimunisasi untuk EGFP (hijau), pro-SP-C (Merah Jambu), dan inti yang diwarnai DAPI. Gambar ditampilkan dengan semua warna (Semua Saluran) digabungkan pada panel kiri, dan dengan masing-masing warna yang diimunisasi tunggal dengan DAPI ke Baik dari gambar gabungan. panah menunjukkan sel positif ganda. Perbesaran asli semua fotomikrograf: ×200.

Kami selanjutnya menentukan proporsi sel saluran napas yang positif untuk EGFP dengan menghitung jumlah total sel saluran napas dan sel saluran napas positif EGFP di bagian jaringan dari dua penerima pada 6 minggu setelah injeksi. Dalam satu penerima (IT1-8), 2,4% (10/422) sel saluran napas positif untuk EGFP, sedangkan pada penerima kedua (IT4-11) 3,6% (18/496 sel) sel saluran napas positif untuk EGFP ekspresi (Tabel 1).

TABEL 1. RINGKASAN PROPORSI SEL EGFP-POSITIF PADA JARINGAN ALIRAN DAN ALVEOLAR SETELAH PEMBERIAN SUPERNATAN LENTIVIRAL INTRAKHEAL

Definisi singkatan: CC10, EGFP protein 10-kD sel Clara, GFP protein fluoresen hijau yang disempurnakan, SPC protein fluoresen hijau, protein surfaktan C.

* Sel saluran napas eksklusif dihitung untuk analisis ini.

Semua sel di dalam regio alveolar dihitung untuk analisis ini, dan dengan demikian termasuk AECI, AECII, serta sel vaskular dan hematopoietik.

Pada penerima lentivirus CCL-CC10-EGFP, sel-sel alveolar yang diwarnai secara positif untuk EGFP juga terdeteksi. Untuk mengidentifikasi garis keturunan sel alveolar yang mengekspresikan EGFP pada penerima ini, cryosection dilabeli tiga kali dengan antibodi terhadap EGFP (terkonjugasi hijau-FITC), CC10 untuk sel Clara (terkonjugasi red-cy3), dan pro-SPC untuk AECII (merah muda-Cy5). terkonjugasi). Imunostaining sel alveolar untuk EGFP juga imunoreaktif untuk pro-SPC, tetapi negatif untuk ekspresi CC10, menunjukkan bahwa sel alveolar yang diekspresikan dari vektor CCL-CC10-EGFP adalah AECII (Gambar 5C). Ini menunjukkan bahwa promotor CC10 proviral aktif dalam sel pro-SPC-positif in vivo. Sel imunoreaktif untuk EGFP tidak terdeteksi dalam jaringan alveolar tikus kontrol yang diobati dengan PBS (Gambar 5D). Studi-studi ini menunjukkan bahwa vektor lentiviral yang membawa promotor CC10 mengarahkan ekspresi transgen ke AECII di jaringan alveolar dan sel Clara di jaringan saluran napas. in vivo.

Pada penerima supernatan vektor CCL-SPC-EGFP intratrakeal, sel-sel imunoreaktif untuk EGFP dan pro-SPC diamati di jaringan alveolar pada semua titik waktu yang dievaluasi. Morfologi, lokalisasi, dan pola pewarnaan belang-belang pro-SPC dari EGFP ganda dan sel-sel pro-SPC-positif ini konsisten dengan AECII. Gambar 6 menunjukkan fotomikrograf jaringan alveolar (Gambar 6A ×200), dan gambar pembesaran tinggi dari sel pro-SPC dan EGFP-positif ganda (Gambar 6B ×640), yang menunjukkan bahwa sel AECII mampu mengekspresikan EGFP dari promotor SPC lentiviral. Proporsi sel EGFP-positif bervariasi antara hewan, bagian jaringan, dan di dalam area setiap bagian jaringan, dengan sel-sel positif cenderung mengelompok di dalam suatu area. Gambar 6C menunjukkan area dengan beberapa sel AECII EGFP-positif berkerumun (×200), dan Gambar 6D menunjukkan fotomikrograf perbesaran tinggi dari area yang sama (×640). Untuk mengukur efisiensi transduksi rata-rata, kami menentukan proporsi sel alveolar pro-SPC-positif EGFP-positif di bagian dari tiga penerima pada 6 minggu setelah injeksi. Proporsi semua sel alveolar yang positif untuk EGFP dan pro-SPC berkisar antara 2,3% dan 4,6% (Tabel 1). Namun, karena jumlah total sel alveolar mencakup berbagai jenis sel alveolar yang tidak diharapkan diekspresikan dari promotor SPC, persentase ini kemungkinan kurang mewakili proporsi sebenarnya dari AECII yang ditransduksi yang mengekspresikan transgen EGFP.

Gambar 6. Analisis imunofluoresensi jaringan paru-paru untuk ekspresi transgen EGFP setelah pengiriman intratrakeal supernatan lentiviral CCL-SPC-EGFP ke tikus. Cryosections diimunisasi untuk EGFP (hijau) dan pro-SPC (merah) dan nuklei di-counterstain dengan DAPI (biru). Di dalam A, NS anak panah menunjukkan sel ganda positif untuk imunostaining pro-SPC dan EGFP (×200). B adalah perbesaran yang lebih tinggi (×640) dari area kotak dari A. C menunjukkan contoh daerah alveolar yang memiliki tingkat transduksi AECII dan ekspresi EGFP yang tinggi (×200). D menunjukkan perbesaran yang lebih tinggi dari area kotak di dalam C (×640). Semua gambar ditampilkan dengan semua warna digabungkan pada panel kiri (Semua Saluran), dan dengan setiap warna yang diimunisasi tunggal dengan DAPI ke Baik dari gambar gabungan.

Pada titik waktu awal pada beberapa hewan, imunoreaktivitas EGFP juga terdeteksi dalam sel alveolar negatif untuk pewarnaan pro-SPC, menunjukkan bahwa mereka bukan AECII. Sel pro-SPC-negatif EGFP-positif ini hanya diamati pada titik waktu awal (1 dan 2 minggu) dan tidak diamati pada titik waktu selanjutnya (6 minggu). Garis keturunan sel pro-SPC-negatif ini diidentifikasi sebagai hematopoietik (positif CD45) setelah pewarnaan untuk EGFP, pro-SPC, dan CD45 (data tidak ditampilkan). Sel hematopoietik EGFP-positif (positif CD45) tidak diamati pada titik waktu 6 minggu pada penerima mana pun. Sejak makrofag menelan debris, tidak jelas apakah makrofag alveolar ditransduksi dengan lentivirus dan mengekspresikan EGFP dari promotor SPC, atau menelan EGFP yang ada dalam preparasi virus dan/atau diproduksi oleh sel AECII yang ditransduksi. Mengingat kami in vitro data menunjukkan bahwa vektor CCL-SPC-EGFP tidak diekspresikan dalam garis sel hematopoietik ( Gambar 3 ), kurangnya ekspresi dalam sumsum tulang transduksi primer (data tidak ditampilkan), dan fakta bahwa EGFP tidak terdeteksi pada 6- titik waktu minggu, kemungkinan makrofag alveolar mungkin menelan puing-puing dalam persiapan virus. Namun, penelitian saat ini tidak dapat mengecualikan kemungkinan bahwa makrofag alveolar mengekspresikan transgen.

Dalam rangkaian percobaan berikutnya, pembatasan garis keturunan dari vektor lentiviral dievaluasi setelah pemberian intravena supernatan lentiviral melalui vena wajah tikus C57B6J neonatal Hari ke-0. Setiap tikus penerima neonatal disuntik dengan 1 × 108 partikel virus CCL-SPC-EGFP atau supernatan lentiviral CCL-CC10-EGFP. Jaringan dipanen dari tikus penerima hingga usia 14 bulan dan alikuot disimpan untuk ekstraksi DNA dan analisis PCR EGFP proviral, dan kriopreservasi dalam senyawa OCT untuk imunostaining dan analisis mikroskop fluoresensi untuk EGFP. Tikus C57B6J transgenik dan tipe liar GFP masing-masing digunakan sebagai kontrol positif dan negatif untuk pengujian ini.

Dalam tujuh penerima supernatan CCL-CC10-EGFP, urutan proviral terdeteksi di semua hati, dan sebagian besar limpa, jantung, dan ginjal dari penerima neonatus (Tabel 2). Selanjutnya, tingkat transduksi dievaluasi dengan analisis PCR kuantitatif real-time pada sampel yang tersedia. Jumlah salinan proviral dalam jaringan berkisar antara 0,060 hingga 0,175 salinan per sel rata-rata di hati (tertinggi). Jumlah salinan yang lebih rendah diamati di jantung (kisaran, 0,00025-0,09), limpa (kisaran, 0,027-0,030), dan ginjal (kisaran, 0,00002-0,00006). Tingkat transfer gen yang diamati dalam penelitian ini sesuai dengan tingkat transduksi yang diamati dalam penelitian lain tentang injeksi supernatan lentiviral ke neonatus (32). Semua jaringan hati, jantung, limpa, dan ginjal yang positif untuk sekuens proviral dalam kedua uji tersebut tunduk pada analisis mikroskopi imunofluoresensi EGFP. Dua bagian jaringan dengan jarak yang baik dievaluasi untuk setiap jaringan, dan ekspresi EGFP tidak terdeteksi di salah satu bagian yang dianalisis (data tidak ditampilkan). Mengingat jumlah salinan hingga 0,175 (sesuai dengan hingga 17,5% sel yang membawa genom proviral tunggal), data ini mendukung in vitro data garis sel menunjukkan bahwa ekspresi transgen tidak diamati di beberapa jaringan nonrespirasi dari vektor CCL-CC10-EGFP.

MEJA 2. RINGKASAN ANALISIS PCR EGFP PROVIRAL STANDAR PADA JARINGAN MENcit yang disuntik secara Intravena DENGAN SUPERNATAN LENTIVIRAL

Definisi singkatan: +, EGFP positif —, EGFP tidak terdeteksi CC10, NA protein 10-kD sel Clara, sampel tidak tersedia SPC, protein C surfaktan.

Dalam empat penerima vektor CCL-SPC-EGFP intravena, semua sampel DNA dari limpa dan hati, tiga dari empat jantung, dan satu dari empat sampel ginjal positif untuk rangkaian EGFP proviral (Tabel 2). Analisis PCR kuantitatif dilakukan pada sampel DNA yang tersedia. Rata-rata angka salinan proviral berkisar antara 0,003 dan 0,09 untuk jantung (tiga sampel), 0,01 dan 0,025 untuk limpa (tiga sampel), dan 0,03 untuk ginjal (satu sampel). Dua bagian jaringan dari semua jaringan positif-provirus dievaluasi untuk ekspresi EGFP. Semua bagian jaringan negatif untuk ekspresi EGFP dengan analisis imunofluoresensi (data tidak ditampilkan). Data ini menunjukkan variasi dalam tingkat transfer gen ke jaringan nonrespirasi menggunakan pendekatan intravena neonatus. Namun, kurangnya ekspresi transgen yang diamati pada jaringan nonrespirasi mendukung in vitro data, menunjukkan bahwa lentivector CCL-SPC-EGFP tidak diekspresikan dalam jaringan nonrespirasi. Secara kolektif, in vitro dan in vivo data yang disajikan di atas menunjukkan bahwa lentivectors ini menghasilkan ekspresi transgen spesifik pernapasan yang diatur.

Ekspresi transgen yang diatur garis keturunan akan diperlukan untuk terapi gen jangka panjang yang efektif untuk gangguan yang mempengaruhi paru-paru. Sebagian besar uji klinis terapi gen yang diarahkan ke epitel pernapasan hingga saat ini telah menggunakan promotor konstitutif seperti promotor dari cytomegalovirus (CMV) atau promotor dalam LTR retroviral. Namun, penelitian hewan jangka panjang telah menunjukkan bahwa, dari waktu ke waktu, ekspresi transgen dapat dibungkam dari promotor virus (38, 39), atau dapat mengacaukan gen seluler di dekat situs integrasi yang mengarah ke tumorigenesis (21). Dengan demikian, regulasi ekspresi spesifik garis keturunan akan bermanfaat bagi banyak aplikasi terapi gen untuk menghindari pembungkaman vektor atau toksisitas yang terkait dengan ekspresi transgen yang tidak diatur. Vektor spesifik garis keturunan juga akan menjadi alat yang berguna untuk studi biologi paru-paru, untuk melacak dan mengidentifikasi keturunan sel punca, memantau potensi diferensiasi sel punca, dan/atau mengirimkan transgen pada waktu tertentu atau ke garis keturunan tertentu.

Dalam penelitian ini kami mengevaluasi profil ekspresi garis keturunan vektor lentiviral dengan serangkaian elemen regulasi spesifik epitel pernapasan. Dalam percobaan garis sel, lentivector yang dipromosikan SPC menghasilkan ekspresi spesifik AECII sedangkan lentivector yang dipromosikan CC10 memiliki tingkat ekspresi tertinggi dalam garis sel Clara. Sebaliknya, lentivector yang dipromosikan JSRV menunjukkan ekspresi transgen tingkat tinggi di banyak tipe sel yang berbeda. Hasil ini berbeda dengan penelitian yang mengevaluasi promotor JSRV dalam konstruksi plasmid dan retroviral, di mana ekspresi diatur ke garis keturunan sel AECII dan Clara. Alasan perbedaan profil ekspresi dari promotor JSRV di antara vektor transfer gen yang berbeda tidak jelas. Namun, kami juga telah mengamati fenomena serupa dengan promotor CD11b, yang menghasilkan ekspresi yang diatur dari vektor plasmid, tikus transgenik (40, 41), dan retro-provirus terintegrasi (42), tetapi tidak diatur dan diekspresikan di sebagian besar jenis sel dari a lentiprovirus (43, dan C. Lutzko, data tidak dipublikasikan). Ada kemungkinan bahwa elemen yang tersisa di tulang punggung lentiviral dapat mempengaruhi struktur kromatin lokal untuk meningkatkan perekrutan mesin transkripsi (44). Kemungkinan lain adalah bahwa situs pengikatan faktor transkripsi yang tersisa di LTR minimal dapat bekerja sama dengan promotor JSRV untuk meningkatkan ekspresi transgen dari lentiprovirus terintegrasi dalam tipe sel di mana HIV tipe liar biasanya aktif. Untuk mendukung hipotesis ini, tingkat ekspresi tertinggi diamati pada Jurkat, garis sel T-limfoid di mana promotor HIV-1 tipe liar aktif. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengklarifikasi mekanisme disregulasi dengan promotor JSRV di tulang punggung lentiviral.

Karena profil ekspresi gen dari garis sel tidak persis mencerminkan sel primer normal, kami juga mengevaluasi ekspresi transgen dari lentivectors CC10 dan SPC dalam jaringan pernapasan dan non-pernapasan setelah pengiriman intratrakeal dan intravena ke penerima murine. Meskipun ada beberapa amplop yang menyediakan tingkat transfer gen yang lebih tinggi ke epitel hidung atau saluran napas seperti baculovirus GP64 (20, 45) atau amplop filoviral (16, 17, 46), kami memilih untuk menggunakan supernatan lentiviral semu VSV-G untuk NS in vivo studi karena akan memungkinkan analisis transduksi dan ekspresi dari berbagai jenis sel, karena tropisme selulernya yang luas. Oleh karena itu, penelitian ini akan memberikan data tentang pembatasan garis keturunan ekspresi transgen dari lentivector kami. Setelah pemberian lentivirus CCL-CC10-EGFP in vivo, ekspresi transgen secara eksklusif diamati di paru-paru, dan bukan di jantung, hati, limpa, atau otot. Anehnya, karakterisasi garis keturunan sel yang mengekspresikan transgen EGFP di paru-paru menunjukkan bahwa sel Clara dan AECII adalah EGFP positif. Sementara promotor CC10 biasanya digunakan untuk mengarahkan ekspresi transgen ke sel Clara, penelitian tikus transgenik lainnya juga mengamati ekspresi transgen dalam alveolus (29), meskipun penulis ini tidak dapat mengidentifikasi garis keturunan yang mengekspresikan transgen karena resolusi rendah dari metodologi yang tersedia pada saat itu. Dengan demikian, data kami menunjukkan bahwa penggabungan promotor CC10 ke dalam vektor lentiviral menghasilkan ekspresi spesifik pernapasan, yang mungkin berguna untuk studi biologi pernapasan, atau pengiriman gen terapeutik yang diatur ke saluran udara dan paru-paru.

Analisis profil ekspresi transgen dari vektor CCL-SPC-EGFP menunjukkan bahwa ekspresi dibatasi untuk AECII, karena EGFP tidak terdeteksi dalam garis sel nonrespirasi in vitro, atau limpa, jantung, atau hati setelah pemberian intravena. Sementara sel hematopoietik positif untuk protein EGFP diamati di alveoli tikus penerima pada titik waktu awal, mereka tidak terdeteksi pada 6 minggu, dan mungkin merupakan hasil dari fagositosis protein EGFP dalam preparasi virus.

Sedangkan metode intravena dan intratrakeal in vivo pengiriman yang digunakan dalam penelitian ini tidak menghasilkan transfer gen ke semua jaringan, mereka memberikan data tentang analisis ekspresi proviral dalam berbagai jenis jaringan primer, tanpa waktu dan biaya untuk menghasilkan tikus transgenik. Meskipun tikus yang digunakan untuk studi pengiriman supernatan intratrakeal kekurangan kekebalan, kemungkinan hasil ini akan serupa dengan galur tikus yang kompeten dengan kekebalan seperti C57B6J, karena ada beberapa penelitian yang menunjukkan ekspresi jangka panjang setelahnya. in vivo pengiriman lentivectors yang mengandung EGFP (47, 48) atau EYFP yang terkait erat (20).

Vektor lentiviral mudah dimodifikasi untuk mengekspresikan gen yang diinginkan dan siap diproduksi dengan titer tinggi yang cocok untuk in vivo administrasi. Sementara tingkat keseluruhan transfer gen ke saluran udara dan paru-paru rendah dalam penelitian ini, tingkat itu cukup untuk mengevaluasi dengan hati-hati garis keturunan yang mengekspresikan transgen EGFP. Beberapa penelitian baru-baru ini telah menjelaskan pengiriman yang efisien dari vektor lentiviral lainnya ke paru-paru hewan dengan mengubah amplop virus (16-18), atau meningkatkan viskositas supernatan dengan meresuspensi virus dalam 1% metilselulosa (49) atau LPC (19) untuk mengurangi tingkat pembersihan oleh saluran udara. Menggabungkan vektor yang diatur garis keturunan yang dijelaskan di sini, dengan metode pengiriman yang efisien untuk jenis sel yang diinginkan, akan memfasilitasi pengembangan terapi gen yang aman dan efisien untuk penyakit pernapasan, dengan menghasilkan ekspresi transgen yang diatur garis keturunan. Vektor ini juga akan menarik bagi ahli biologi pernapasan, karena mereka akan memungkinkan pengiriman gen yang diatur ke epitel alveolar dan saluran napas, yang dapat dengan mudah dimodifikasi untuk mengekspresikan gen yang diinginkan secara khusus di saluran napas dalam sel Clara atau alveolus di AECII . Selanjutnya, vektor-vektor ini juga dapat digunakan sebagai alat untuk menandai dan melacak keturunan sel punca yang telah berdiferensiasi menjadi garis keturunan pernapasan tertentu. in vitro atau in vivo. Singkatnya, vektor lentiviral dengan profil ekspresi spesifik yang diatur, alveolar dan saluran napas akan berguna untuk pengembangan terapi gen yang aman, dan studi biologi paru-paru.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drs. Donald B. Kohn, Gay Crooks, dan Paula Cannon untuk diskusi yang bijaksana dan meninjau naskah. Mereka berterima kasih kepada Dr. Jeffrey Whitsett untuk promotor SPC dan CC10 dan lini sel MLE-15, Dr. Hung Fan untuk promotor JSRV, Dr. Donald B. Kohn untuk promotor MND, dan Dr. Franco De Mayo untuk Mtcc1-2 sel.


Keamanan hayati Lentivector - Biologi

Transfer gen yang efisien ke limfosit T dan B diam untuk terapi gen atau tujuan imunoterapi memungkinkan pengobatan beberapa disfungsi genetik dari sistem hematopoietik, seperti imunodefisiensi, dan pengembangan strategi terapi baru untuk kanker dan penyakit yang didapat. Vektor lentiviral (LVs) dapat mentransduksi banyak jenis sel yang tidak berproliferasi, dengan pengecualian beberapa jenis sel diam tertentu seperti sel T dan B istirahat. Dalam sel T, penyelesaian reverse transcription (RT), impor nuklir, dan integrasi selanjutnya dari virus vesikular stomatitis virus G protein pseudotyped LV (VSVG-LV) genom tidak terjadi secara efisien kecuali jika diaktifkan melalui reseptor sel T (TCR) atau dengan sitokin bertahan hidup yang mendorong mereka untuk masuk ke G1b fase siklus sel. Transduksi lentiviral sel B adalah masalah lain karena bahkan stimulasi reseptor sel B yang menginduksi proliferasi tidak cukup untuk memungkinkan transduksi VSVG-LV yang efisien. Baru-baru ini, LV baru yang membawa glikoprotein virus campak (MV) di permukaannya mampu mengatasi pembatasan vektor di sel T dan B yang diam. Yang penting, sel T dan B memori naif serta memori secara efisien ditransduksi sementara tidak ada aktivasi yang jelas, entri siklus sel, atau sakelar fenotipik yang terdeteksi, yang membuka pintu ke banyak terapi gen dan aplikasi imunoterapi seperti yang dilaporkan di sini.


Transfeksi Virus

Untuk tipe sel yang tidak dapat menerima transfeksi yang dimediasi lipid, vektor virus sering digunakan. Transfeksi yang dimediasi virus, juga dikenal sebagai transduksi, menawarkan cara untuk mencapai jenis sel yang sulit ditransfeksi untuk ekspresi berlebih atau knockdown protein, dan ini adalah metode yang paling umum digunakan dalam penelitian klinis (Glover et al., 2005 Pfeifer dan Verma, 2001). Vektor adenoviral, oncoretroviral, dan lentiviral telah digunakan secara luas untuk pengiriman gen dalam kultur sel mamalia dan in vivo. Contoh terkenal lainnya untuk transfer gen virus termasuk baculovirus dan vektor berbasis virus vaccinia. Untuk informasi lebih lanjut tentang berbagai sistem pengiriman virus, lihat Vektor Viral.

Sementara virus adalah sistem yang lebih disukai untuk pengiriman gen dalam uji klinis karena efisiensi transfeksi in vivonya yang tinggi dan ekspresi gen yang berkelanjutan karena integrasinya ke dalam genom inang, virus memiliki sejumlah kelemahan termasuk imunogenisitas dan sitotoksisitasnya, secara teknis menantang dan prosedur produksi yang melelahkan. untuk vektor, biaya tinggi karena persyaratan keamanan hayati, kapasitas pengemasan rendah (

10 kb untuk sebagian besar vektor virus dibandingkan dengan

100 kb untuk vektor non-virus), dan variabilitas dalam infektivitas preparat vektor virus (Glover et al., 2005 Kim dan Eberwine, 2010 Vorburger dan Hunt, 2002).

Protokol transduksi tipikal melibatkan rekayasa virus rekombinan yang membawa transgen, amplifikasi partikel virus rekombinan dalam garis sel pengemasan, pemurnian dan titrasi partikel virus yang diperkuat, dan infeksi selanjutnya pada sel yang diinginkan. Sementara efisiensi transduksi yang dicapai dalam sel primer dan garis sel cukup tinggi (

90-100%), hanya sel yang membawa reseptor spesifik virus yang dapat terinfeksi oleh virus. Penting juga untuk dicatat bahwa garis sel pengemasan yang digunakan untuk amplifikasi virus perlu ditransfeksi dengan metode transfeksi non-virus.


Vektor lentiviral: dasar untuk translasi

Lebih dari dua dekade telah berlalu sejak HIV yang dimodifikasi secara genetik digunakan untuk pengiriman gen. Melalui perbaikan terus-menerus, HIV pembawa gen penanda awal ini telah berevolusi menjadi vektor lentiviral yang lebih aman dan lebih efektif. Vektor lentiviral menawarkan beberapa sifat menarik sebagai pembawa pembawa gen, termasuk: (i) pengiriman gen berkelanjutan melalui integrasi vektor yang stabil ke dalam genom inang (ii) kemampuan menginfeksi sel yang membelah dan tidak membelah (iii) tropisme jaringan luas, termasuk penting tipe sel target terapi gen dan sel (iv) tidak ada ekspresi protein virus setelah transduksi vektor (v) kemampuan untuk mengirimkan elemen genetik kompleks, seperti sekuens yang mengandung polikistronik atau intron (vi) profil situs integrasi yang berpotensi lebih aman dan ( vii) sistem yang relatif mudah untuk manipulasi dan produksi vektor. Dengan demikian, teknologi lentivector sekarang telah digunakan secara luas dalam biologi dasar dan studi translasi untuk ekspresi berlebih transgen yang stabil, pembungkaman gen yang persisten, imunisasi, in vivo pencitraan, menghasilkan hewan transgenik, induksi sel pluripoten, modifikasi sel induk dan pelacakan garis keturunan, atau pengeditan gen yang diarahkan ke lokasi. Selain itu, di era '-omics' throughput tinggi saat ini, ketersediaan komersial vektor lentiviral premade, yang direkayasa untuk mengekspresikan atau membungkam gen di seluruh genom, mempercepat ekspansi cepat teknologi vektor ini. Dalam tinjauan ini, kami menilai kemajuan dalam teknologi vektor lentiviral, termasuk lentivirologi dasar, desain vektor untuk meningkatkan efisiensi dan keamanan hayati, protokol untuk produksi vektor dan infeksi, pengiriman gen yang ditargetkan, aplikasi lentiviral tingkat lanjut dan masalah yang terkait dengan sistem vektor.


Keamanan hayati Lentivector - Biologi

Sebuah tinjauan dan panduan vektor lentiviral dan retroviral untuk pengiriman asam nukleat

Dalam beberapa tahun terakhir, vektor retroviral dan lentiviral telah menjadi alat yang semakin penting untuk pengiriman asam nukleat ke banyak jenis sel dalam berbagai sistem eksperimental. Selain menjadi penting dalam pengaturan laboratorium untuk digunakan baik dalam kultur jaringan dan model hewan, mereka juga telah diterapkan dalam uji klinis untuk mengobati penyakit genetik. Zynteglo dari Bluebird Bio adalah pengobatan terapi gen untuk beta-thalassemia yang bergantung pada transfusi, di mana sel induk hematopoietik autologus ditransduksi ex vivo dengan gen beta-globin melalui vektor lentiviral pseudotyped dengan vesikular stomatitis virus glikoprotein G. Menggunakan sistem lentiviral atau retroviral memungkinkan integrasi yang stabil dan diwariskan dari urutan asam nukleat spesifik ke dalam genom sel target. Memanfaatkan fitur vektor lentiviral dan retroviral ini memungkinkan ekspresi permanen secara teoritis dari konstruksi gen, seperti urutan pengkodean siRNA atau protein, dalam populasi sel, atau pada tingkat sel tunggal [6].

Anggota famili Retroviridae, yang mencakup -retrovirus dan lentivirus, dicirikan oleh kemampuannya untuk mentranskripsi ulang genom RNA mereka ke dalam salinan cDNA, yang kemudian secara stabil diintegrasikan ke dalam genom sel inang. Retrovirus sering digambarkan sebagai sederhana (kadang-kadang disebut onkogenik atau -retrovirus misalnya, virus leukemia murine [MLV]) atau kompleks (misalnya, lentivirus). Perbedaan utama antara subtipe ini adalah adanya sejumlah gen aksesori dan pengatur dalam retrovirus yang kompleks, tetapi tidak sederhana (dibahas lebih lanjut di bawah) [4, 7]. Partikel virus dari kedua kelompok (Gambar 1) mengandung dua salinan RNA untai positif dengan viral reverse transcriptase (RT) terkait yang terletak di dalam inti internal. Juga terletak di dalam kompartemen ini adalah protein struktural dan enzimatik, termasuk nukleokapsid (NC), kapsid (CA), integrase (IN), dan protease (PR). Inti bagian dalam dikelilingi oleh lapisan protein luar yang terdiri dari protein matriks (MA), yang pada gilirannya dicakup oleh amplop glikoprotein (ENV), sel inang yang berasal dari membran sel inang [4, 7]. Intasome, suatu tetramer integrase (IN) yang dirakit pada ujung DNA virus, menangkap nukleosom inang dan memungkinkan rekombinasi DNA virus pada titik-titik tertentu [8].

Retrovirus sederhana dan kompleks keduanya mengandung dua salinan RNA untai tunggal linier, tidak tersegmentasi, dengan panjang 7-12 kb yang mengkodekan gen gag, pol, dan env. Gag mengkodekan poliprotein yang diterjemahkan dari mRNA yang tidak disambung yang kemudian dipecah oleh protease virus (PR) menjadi protein MA, CA, dan NC. Gen Env juga mengkode prekursor poliprotein yang dipecah oleh protease seluler menjadi glikoprotein gp120 amplop permukaan (SU) dan glikoprotein gp41 transmembran (TM). Sementara gp120 berinteraksi dengan reseptor seluler dan koreseptor, gp41 menambatkan kompleks gp120/gp41 di membran virus dan mengkatalisis fusi membran dengan sel inang selama masuk. Pol diekspresikan sebagai poliprotein Gag-Pol sebagai hasil dari pergeseran bingkai ribosom selama translasi mRNA Gag, dan mengkodekan protein enzimatik RT, PR, dan IN. Ketiga protein ini terkait dengan genom virus di dalam virion. Protein RT memiliki tiga aktivitas berbeda: (a) aktivitas DNA polimerase yang bergantung pada RNA, yang bertanggung jawab untuk mentranskripsikan dua genom RNA menjadi satu cDNA (b) aktivitas RNase H dan (c) aktivitas DNA polimerase yang bergantung pada DNA. PR memotong poliprotein gag dan Gag-Pol, menghasilkan pematangan virion dan produksi virion yang sepenuhnya menular. IN bertanggung jawab untuk integrasi cDNA virus ke dalam genom sel inang. Setelah terintegrasi, genom virus bersebelahan dengan kromosom sel inang dan disebut sebagai provirus [1, 4, 7, 9].

Fitur utama genom retroviral kompleks yang membedakannya dari retrovirus sederhana adalah adanya satu set gen aksesori yang produknya terlibat dalam regulasi transkripsi, transpor RNA, ekspresi gen, dan perakitan. Ini termasuk protein Rev dan Tat serta protein aksesori Vpu, Vif, Vpr, dan Nef. Rev adalah protein pengikat RNA yang mempromosikan ekspresi gen fase akhir. Ini juga penting untuk pengangkutan mRNA yang tidak disambung atau disambung tunggal, yang mengkode protein struktural virus, dari nukleus ke sitoplasma. Tat adalah protein pengikat RNA yang meningkatkan transkripsi. Protein Nef menghambat aktivasi sel T. Vpu meningkatkan pelepasan virus dari permukaan sel ke sitoplasma selama masuk [7]. Protein Vif diperlukan untuk replikasi lentivirus karena kemampuannya untuk menurunkan regulasi respons antivirus inang [7, 10].

Genom provirus terintegrasi (Gambar 2) memiliki 5' dan 3' long terminal repeats (LTR) yang masing-masing terdiri dari tiga wilayah: (a) wilayah U3, yang berfungsi sebagai promotor dan mengandung elemen penambah transkripsi dan kotak TATA (b ) wilayah R, tempat transkripsi dimulai dan (c) wilayah U5, yang terlibat dalam transkripsi balik dan membawa situs pengikatan primer tRNA. Elemen urutan penting lainnya dari provirus adalah sinyal pengemasan (ψ, psi) dan saluran polipurin (ppt), yang berfungsi sebagai tempat inisiasi sintesis DNA untai positif selama transkripsi terbalik [4, 7, 9].

Terlepas dari perbedaan genom, siklus replikasi retrovirus sederhana dan kompleks sangat mirip (Gambar 3). Infeksi dimulai ketika amplop glikoprotein gp120 mengikat reseptor seluler, menghasilkan perubahan konformasi ENV yang mengekspos subunit TM, menghasilkan fusi amplop virion dan membran seluler dan selanjutnya melepaskan inti ke dalam sitoplasma [4]. Tropisme virus ditentukan oleh pengenalan reseptor seluler spesifik oleh glikoprotein amplop virus gp120 [9]. Misalnya, HIV dan SIV mengenali CD4 pada limfosit T pembantu dan makrofag diikuti oleh interaksi dengan koreseptor, paling sering CXCR4 atau CCR5 [1, 9]. Saat masih dalam inti virus, genom RNA ditranskripsi balik oleh RT menjadi DNA untai ganda [1, 2, 11].

Perlu dicatat bahwa ini adalah titik di mana siklus replikasi virus lentivirus berbeda dari retrovirus sederhana. dsDNA virus dari retrovirus sederhana tidak mampu melewati kompleks pori nukleus dan membutuhkan pemecahan membran nukleus selama mitosis untuk integrasi cDNA terjadi [4, 7]. Selama infeksi lentivirus, di sisi lain, kompleks praintegrasi diangkut ke dalam nukleus, dan oleh karena itu lentivirus mampu berintegrasi baik dalam sel yang membelah maupun yang tidak membelah [4, 12]. Ini adalah fitur penting untuk dipertimbangkan ketika memilih vektor yang sesuai untuk aplikasi tertentu, karena vektor retroviral tidak akan secara efisien mengintegrasikan transgen dalam sel yang tidak membelah.

Integrasi dimediasi oleh aktivitas enzimatik IN. Prosesnya dimulai dengan penghilangan beberapa nukleotida dari ujung 3’ kedua untai cDNA. IN juga memotong DNA seluler, dan cDNA virus diikat ke overhang ini. Kesenjangan untai tunggal diisi oleh mesin perbaikan DNA seluler [1]. DNA virus terintegrasi disebut sebagai "provirus" dan direplikasi dan diwariskan bersama dengan kromosom inang. Untuk waktu yang lama dianggap bahwa integrasi tidak terjadi dalam urutan tertentu [9]. Namun, indikasi awal bahwa integrasi dapat terjadi secara non-acak ditemukan selama uji coba terapi gen untuk X-SCID di mana vektor berbasis MLV terapeutik terintegrasi secara selektif di dekat proto-onkogen dalam banyak mata pelajaran. Hal ini tampaknya menjadi faktor yang berkontribusi terhadap perkembangan leukemia pada beberapa pasien penerima, dan meningkatkan kekhawatiran tentang efek samping mutagenik dari pemasangan retroviral. Sejak pengurutan seluruh genom, penelitian terbaru menunjukkan bahwa sebenarnya ada pola integrasi spesifik virus yang mungkin bergantung pada struktur kromatin daripada urutan DNA. Sebagai contoh, baru-baru ini ditunjukkan bahwa integrasi HIV-1 cDNA terhambat ketika kromatin target dipadatkan [13]. Virus sarkoma unggas (ASV), di sisi lain, sebenarnya telah diamati untuk berintegrasi lebih efisien setelah kondensasi kromatin target. Juga, untuk HIV-1 dan -2, vektor berbasis HIV-1, vektor berbasis simian immunodeficiency virus (SIV), dan feline immunodeficiency virus (FIV), sekitar 70% peristiwa integrasi terjadi dalam gen [13]. Vektor lentiviral tampaknya menunjukkan preferensi untuk integrasi di situs yang jauh dari situs awal transkripsi [11, 14]. Sebaliknya, sekitar 20% peristiwa integrasi selama infeksi MLV (-retrovirus) terjadi di dekat ujung 5' unit transkripsi, dengan beberapa preferensi untuk pulau CpG dan kedekatan dengan situs hipersensitif DNase I. Menariknya, HIV-1, SIV, MLV dan ASLV tampaknya memiliki preferensi dasar simetris di sekitar lokasi integrasi [13, 15]. Lebih lanjut memperumit pemahaman kita tentang selektivitas situs integrasi proviral adalah kontribusi kompleks dari faktor sel inang, yang bervariasi tergantung pada retrovirus yang bersangkutan dan jenis sel yang terinfeksi [13]. Bias dalam integrasi situs dapat memiliki implikasi yang menarik untuk tingkat genotoksisitas dari berbagai vektor lentiviral atau -retroviral. Khususnya, vektor lentiviral tampaknya memiliki potensi onkogenik yang rendah jika dibandingkan dengan vektor retroviral [11, 14].

CDNA virus terintegrasi ditranskripsi oleh mesin transkripsi seluler [4] menggunakan promotor/peningkat virus di LTR 5’ [16]. Transkrip diangkut dari nukleus dan diterjemahkan mirip dengan mRNA seluler [16]. Transkrip awal mengkodekan Rev, Nef, dan Tat, dengan Tat dan Nef masing-masing mengandung intron yang dihilangkan dalam mRNA matang [9]. Tat berikatan dengan situs Transactivation Response Element (TAR) yang terletak di 5' LTR yang merangsang transkripsi transkrip yang lebih panjang [14]. Rev mengikat intron dari mRNA virus yang baru ditranskripsi. Akumulasi Tat dan Rev menghasilkan pergeseran ke transkripsi akhir, di mana mRNA yang mencakup satu atau kedua intron diterjemahkan. Transkrip yang lebih panjang ini mengkodekan protein struktural [9].

Di sitoplasma, dua RNA genomik virus berasosiasi dengan enzim replikasi dan protein inti berkumpul di sekitarnya, membentuk kapsid virus. Saat bermigrasi menuju permukaan sel, poliprotein Gag dan Gag-Pol dipecah oleh protease virus, menghasilkan partikel infeksius yang matang [9, 14]. Partikel matang kemudian bertunas dari membran sel, sehingga memperoleh selubungnya [7].

Baru-baru ini, beberapa laboratorium telah menghasilkan lentivirus yang tidak berintegrasi dengan mekanisme retrovirus tradisional, atau sebaliknya tidak berintegrasi sama sekali. Yang terakhir, yang disebut vektor lentiviral yang cacat integrasi, mengandung IN bermutasi yang tidak memiliki aktivitas enzimatik. Vektor lentiviral ini menghasilkan lingkaran DNA episomal untai ganda dalam inti sel inang. Vektor lentiviral yang cacat integrasi dikembangkan sebagian karena kekhawatiran seputar integrasi acak dan onkogenesis penyisipan (dijelaskan di atas) [15]. Ada juga hibrida vektor-transposon lentiviral yang menghasilkan transgen yang terintegrasi secara stabil melalui transposisi. Akhirnya, ada vektor lentiviral yang menyisipkan gen melalui rekombinasi homolog. Ini memiliki keuntungan mengurangi kemungkinan mutagenesis penyisipan dan memungkinkan pola ekspresi alami dari urutan 'penggantian' dipertahankan [15].

Langkah besar lainnya dalam teknologi vektor lentiviral dan retroviral adalah penggunaannya pada hewan dan manusia. Sel primer dapat dimodifikasi secara genetik menggunakan vektor lentiviral atau retroviral (misalnya, pengenalan sel kanker atau hepatosit yang ditransduksi GFP) dan kemudian dimasukkan ke dalam tikus. Sel-sel kemudian dapat dilacak menggunakan berbagai teknik pencitraan [14]. Vektor lentiviral juga dapat menggantikan injeksi DNA plasmid ke dalam oosit yang telah dibuahi sebagai cara untuk menghasilkan hewan transgenik karena efisiensi transfer gen mereka, ketahanan ekspresi transgen, dan peningkatan tingkat kelangsungan hidup di banyak spesies hewan yang berbeda [14, 17, 18]. Vektor lentiviral juga menjanjikan dalam aplikasi medis. Namun kekhawatiran keamanan dan genotoksisitas merupakan rintangan utama untuk penggunaan terapeutik vektor virus secara luas. Ada juga tantangan manufaktur, seperti memastikan kemurnian dan hasil tinggi yang diperlukan untuk vektor lentiviral tingkat klinis [19]. Ada beberapa kematian akibat protokol terapi gen yang menggunakan vektor adenoviral, vektor -retroviral, atau vektor virus terkait adeno. Seperti disebutkan di atas, meskipun percobaan berhasil menggunakan vektor retroviral untuk mengoreksi X-SCID, banyak pasien akhirnya meninggal karena leukemia yang disebabkan oleh mutagenesis penyisipan transgen [19]. Kemajuan terus dibuat dalam membuat vektor-vektor ini lebih aman dan lebih berguna untuk uji klinis. Misalnya, keberhasilan koreksi penyakit sel sabit pada model hewan baru-baru ini dicapai dengan mentransduksi sel punca hematopoietik dengan vektor lentiviral [20]. Menariknya, penelitian yang menjanjikan juga baru-baru ini menunjukkan bahwa vektor turunan HIV untuk terapi gen mungkin berguna dalam memerangi infeksi HIV itu sendiri [21, 22].

Pengembangan metode pengiriman asam nukleat baru telah membuka jalan baru untuk aplikasi terapeutik, seperti penggantian gen. Secara khusus, metode baru menggunakan vektor lentiviral G1XCGD untuk ekspresi gp91phoxtransgene dalam sel myeloid telah berhasil diuji dalam model tikus [23]. Sel CD34+ yang ditransduksi dengan vektor lentiviral telah dicangkokkan ke dalam tikus dan menginduksi tingkat aktivitas NADPH yang penting secara terapeutik dalam sel myeloid.

Juga, pasien dengan cystic fibrosis (CF) mungkin cukup mendapat manfaat dari pendekatan terapeutik berdasarkan vektor lentiviral, yang berintegrasi ke dalam genom dan menghasilkan ekspresi gen yang stabil. Sebuah studi yang dilakukan pada babi CF, model CF hewan percobaan, telah mencapai peningkatan fungsi protein regulator konduktansi transmembran (CFTR) CF menggunakan vektor lentiviral berbasis virus immunodeficiency kucing [24]. Dengan demikian, pemulihan gangguan saluran anion dicapai dengan CFTR yang disampaikan oleh lentivirus. Selain itu, vektor lentiviral berbasis situs entri ribosom internal, yang mengekspresikan faktor angiogenik dan kardioprotektif dan stimulator kontraktil SERCA2a, telah menunjukkan peningkatan yang signifikan dari fungsi jantung ketika diberikan pada tikus dengan infark miokard yang diinduksi secara eksperimental [25].

Beberapa uji klinis telah menunjukkan kemanjuran awal untuk pendekatan berbasis lentivirus terapeutik. Secara khusus, peningkatan yang signifikan dari gejala penyakit Parkinson baru-baru ini dilaporkan oleh percobaan ProSavin, vektor lentiviral yang memberikan dopamin [26].ProSavin telah terbukti dapat ditoleransi dengan baik pada pasien dengan penyakit Parkinson.

Perhatian harus diberikan saat menangani lentivirus dan vektor berbasis -retrovirus karena umumnya berasal dari patogen manusia. Kekhawatiran utama ketika bekerja dengan vektor-vektor ini adalah (a) generasi lentivirus yang kompeten-replikasi, mencemari (b) potensi onkogenesis dan (c) potensi toksisitas transgen. Sistem lentiviral generasi kedua dan ketiga, yang membentuk sebagian besar sistem lentiviral yang tersedia secara komersial, memiliki banyak fitur keamanan yang mengurangi risiko ini [27]. Dalam sistem ini, pengemasan dan protein enzimatik diekspresikan dari vektor terpisah, mengurangi homologi antara konstruksi pengemasan dan dengan demikian mengurangi kemungkinan rekombinasi homolog. Selain itu, banyak vektor transfer lentiviral yang tidak aktif sendiri karena penghapusan di 3'LTR [28].

  • Mengenakan alat pelindung diri yang sesuai (yaitu jas lab dan sarung tangan beberapa perusahaan menyarankan sarung tangan ganda)
  • Bekerja di tudung aliran laminar Kelas II
  • Dekontaminasi semua permukaan kerja (terutama setelah tumpahan, percikan, atau produksi aerosol)
  • Penerapan BL2 atau penahanan BL2 yang ditingkatkan

Informasi lebih lanjut tentang penanganan lentivirus dan retrovirus, dan deskripsi kriteria tingkat keamanan hayati laboratorium, disediakan oleh NIH dan Kantor Kesehatan dan Keselamatan Pusat Pengendalian Penyakit: [29, 30].

Sistem pengiriman gen lentiviral dan retroviral mengeksploitasi aspek replikasi retrovirus untuk memberikan integrasi yang stabil dari urutan asam nukleat yang diinginkan. Sedangkan transfeksi asam nukleat hanya menghasilkan ekspresi transgen sementara, aktivitas integrase virus dalam sistem berbasis retroviral dan lentiviral memungkinkan integrasi stabil transgen yang kemudian diwariskan dan terus diekspresikan melalui pembelahan sel berulang. Fitur utama dari vektor lentiviral dan retroviral adalah bahwa mereka menghasilkan partikel yang tidak dapat direplikasi, atau tidak dapat diaktifkan sendiri. Hal ini memungkinkan pengiriman urutan yang diinginkan, tanpa replikasi virus lanjutan di sel target. Lebih penting lagi, karena beberapa di antaranya dikembangkan dari virus manusia, virus ini menghilangkan bahaya yang terkait dengan penggunaan patogen hidup. Produksi virus cacat replikasi dicapai melalui trans-komplementasi (Gambar 4) di mana sel-sel pengemasan ditransfeksi bersama dengan tiga plasmid terpisah (Gambar 5) (lihat di bawah) yang bersama-sama mengekspresikan semua protein virus yang diperlukan untuk menghasilkan partikel infeksius, seperti serta urutan asam nukleat yang menarik yang akan dikemas di dalamnya untuk pengiriman. Sementara banyak sistem vektor lentiviral didasarkan pada transduksi dua plasmid pembantu (generasi kedua) dengan plasmid transfer, beberapa sistem yang lebih baru (generasi ketiga) memiliki konstruksi pengemasan dan amplop pada tiga plasmid yang digabungkan dengan plasmid transfer. Pemindahan khas dan dua plasmid pembantu yang digunakan dalam produksi retroviral atau lentiviral yang cacat replikasi adalah:

Vektor ini digunakan untuk mentransfer gen yang diinginkan ke dalam sel target. Ada penghapusan wilayah U3 dan sekuens aktif transkripsi lainnya dari 3' LTR, yang mengakibatkannya menjadi LTR yang tidak aktif sendiri (yang dianggap lebih aman daripada memiliki LTR utuh/aktif yang dapat mengaktifkan gen yang berdekatan dengan penyisipan ). The 5 'LTR mendorong ekspresi RNA genomik yang dikemas, dan transgen didorong dari promotor dalam vektor [14].

Gag dan Pol: Protein virus ini diperlukan untuk pematangan virion. Tat dan Rev meningkatkan aktivitas transkripsi dan ekspor nuklir RNA genomik. Gen aksesori telah dihapus untuk meningkatkan keamanan dengan mengurangi kemungkinan rekombinasi (lihat Bagian Keamanan di bawah) [14]. Tat telah dihapus dalam sistem lentiviral generasi baru dan Rev telah ditempatkan pada vektor terpisah untuk meningkatkan keamanan.

Vektor virus dapat dibuat pseudotype dengan protein mantel dari patogen lain untuk mengubah tropisme mereka. Yang paling umum digunakan adalah glikoprotein amplop fusogenik G dari virus stomatitis vesikular (VSV-G) [31], misalnya, plasmid AddGene pCMV-VSV-G (8454) [32], bersama dengan kemasan AddGene psPAX2 plasmid (12260 ) [33-36]. Berbicara tentang virus stomatitis vesikular, ada kalanya sistem pseudotipe virus stomatitis vesikular lebih disukai daripada sistem lentiviral, misalnya, untuk memeriksa masuknya virus corona ke dalam sel inang [37]. Protein amplop umum lainnya berasal dari virus rabies, MLV, Ebola, baculovirus, virus campak, dan filovirus. Sementara pseudotyping baculovirus GP64, dan Hepatitis E1 dan E2 meningkatkan transduksi hati, pseudotyping amplop filovirus meningkatkan transduksi sel epitel atau endotel saluran napas. Menariknya, pseudotyping juga dapat mempengaruhi perdagangan lentivirus dengan glikoprotein virus rabies yang menyebabkan transportasi aksonal retrograde [15].

Catatan: Karena perbedaan isoform antara gen -retroviral dan lentiviral gag, pol, dan env, plasmid pengemasan tidak dapat dipertukarkan dengan plasmid transfer [38].

Secara prosedural, perbedaan utama antara vektor lentiviral dan retroviral adalah bahwa dengan vektor lentiviral, biasanya vektor pengemasan, amplop, dan transfer ditransfeksi bersama ke dalam garis sel pengemasan, sedangkan dengan vektor retroviral hanya vektor transfer yang ditransfusikan ke dalam garis sel yang sudah stabil. membawa dua vektor lainnya. Untuk retrovirus, vektor transfer ditransfusikan ke dalam sel Phoenix, garis sel berdasarkan Ginjal Embrio Manusia 293T yang membawa dua konstruksi pembantu (env dan gag-pol) sebagai episom. Sel-sel ini hanya perlu ditransfeksi dengan vektor transfer untuk menghasilkan retrovirus (Gambar 4, kanan). Sel Phoenix perlu diseleksi dua kali setiap tiga bulan dengan Hygromycin B dan toksin Difteri selama satu minggu untuk memastikan keberadaan kedua konstruk pembantu di semua sel. Phoenix-Eco dan Phoenix-Ampho tersedia melalui ATCC [39, 40], dan Invitrogen. Amplop lentiviral yang umum digunakan yang mengekspresikan plasmid termasuk Addgene pMD2.G (12259), misalnya [36, 41].

Biasanya, sel Human Embryonic Kidney 293T atau 293FT berfungsi sebagai jalur pengemasan untuk lentivirus. Phoenix-ECO juga telah digunakan [42]. Sel 293FT dirancang untuk menghasilkan lentivirus dengan titer tinggi. Pembuatan garis sel pengemasan untuk vektor lentiviral telah terbukti lebih sulit karena toksisitas protease (dikodekan oleh gen pol) dan VSV-G sulit diatasi [15]. Beberapa sistem produksi retrovirus lentivirus telah dikembangkan dan tersedia secara komersial (tercantum di bawah di bagian reagen).

Saat memilih plasmid transfer, penting untuk memperhatikan promotor yang menggerakkan gen yang diinginkan. Promotor RNA Pol II (seperti CMV) mendorong ekspresi RNA pengkode protein. Promotor RNA Pol III (seperti H1 atau U6), mendorong ekspresi transkrip yang lebih pendek, seperti shRNA.

  • Langkah pertama dalam produksi vektor lentiviral adalah ko-transfeksi sel pengemasan dengan transfer, amplop, dan plasmid gag-pol (atau transfeksi tunggal plasmid transfer dalam kasus produksi vektor retroviral).
    Catatan: Sel pengemasan tidak boleh dibiarkan mencapai pertemuan karena hal ini mengurangi efisiensi transfeksinya. Misalnya, transfeksi terjadi pada pertemuan 70% [43].
    Kualitas DNA plasmid juga dapat mempengaruhi efisiensi transfeksi. Penggunaan kit komersial, seperti Kit Plasmid bebas Endotoksin QIAGEN, dapat membantu jika kualitas plasmid menjadi masalah.
  • Sel turunan HEK 293T sangat dapat ditransfeksi baik dengan transfeksi yang dimediasi kalsium fosfat atau berbasis lipid (lihat bagian Reagen di bawah). Tergantung pada protokol transfeksi yang digunakan, sel mungkin perlu dicuci, diikuti dengan penambahan media baru dalam 12 hingga 18 jam. Sekitar 24 jam pasca-transfeksi, media harus dikeluarkan dan diganti dengan media yang akan dioleskan ke sel target. Sel-sel kemasan sekarang diizinkan untuk memproduksi virus selama 48-72 jam ke depan. Karena lentivirus lebih stabil pada suhu 32 °C daripada 37 °C, sel pengemasan dapat diinkubasi pada suhu ini sampai virus dikumpulkan.
  • Konsentrasi tertinggi virus biasanya dihasilkan antara 48-72 jam. Untuk mengumpulkan virus, keluarkan supernatan dari sel kemasan dan masukkan ke dalam tabung 15 mL. Untuk menghilangkan debris seluler, supernatan dapat disentrifugasi pada 1500 rpm selama 5 menit atau dapat disaring melalui filter 0,45 um dan dipekatkan melalui, misalnya, konsentrator Clontech Retro-X [44].
    Catatan: Virus yang telah dimurnikan dapat disimpan pada suhu -80 °C hingga diperlukan. Namun, titer turun sekitar 50% dengan setiap siklus beku-cair.
  • Media dapat ditambahkan kembali ke sel pengemasan dan panen dapat diulang hingga 96 jam pasca-transfeksi jika lebih banyak virus diinginkan.
    Catatan: Jika diinginkan, titer virus dapat ditentukan dengan berbagai metode, seperti yang akan dibahas nanti.
  • Media yang mengandung virus sekarang dapat ditambahkan ke sel target subkonfluen. Pembelahan sel secara aktif akan mengambil virus lebih efisien dalam kasus vektor retroviral, sel harus membelah atau konstruk tidak akan mencapai nukleus. Bergantung pada eksperimen Anda, Anda dapat memilih multiplicity of infection (MOI) spesifik atau Anda dapat menguji berbagai volume virus yang dimurnikan untuk menentukan mana yang memberi Anda hasil yang sesuai.
  • Transduksi lentiviral dan Retroviral dapat ditingkatkan dengan penambahan polybrene [36, 45] (Santa Cruz sc-134220 MilliporeSigma TR-1003-G [46] MilliporeSigma 107689 [47] ) atau protamine sulfat [41, 48]. Juga dikenal sebagai heksadimetrin bromida, polimer kationik ini digunakan untuk meningkatkan efisiensi transduksi retrovirus. Diperkirakan bertindak dengan menetralkan tolakan bermuatan sel virus [49] dan meningkatkan adsorpsi reseptor-independen virus [50]. Untuk sel suspensi (dibandingkan dengan sel patuh), spinokulasi dapat memfasilitasi proses transduksi [44, 47], meskipun dapat menurunkan kelangsungan hidup, misalnya, sel T sensitif [51]. Jung HY dkk mentransduksi organoid epitel mammae primer tikus yang baru diisolasi dan sel/organoid Caco2 dengan shRNA lentivirus dan retrovirus yang diekspresikan gen secara berlebihan dengan menggunakan protamine sulfat [48].
  • Dimasukkannya inhibitor Rho kinase Y-27632 dapat meningkatkan kelangsungan hidup sel dan organoid yang berasal dari sel induk selama transduksi virus [44, 52].
  • Ganti media keesokan harinya
    Catatan: Media dapat diganti dalam waktu 4 jam jika toksisitas partikel lentiviral menjadi perhatian.
    Catatan: Transkripsi terbalik dan integrasi konstruksi berlangsung dalam 24-36 jam.
  • Proses transduksi dapat diulang jika diperlukan. Ketika media yang mengandung virus dikeluarkan dari sel pengemasan, media baru diganti. Ini dapat dikumpulkan 24 jam kemudian dan digunakan untuk mengulangi langkah transduksi.
  • Beberapa vektor transfer juga mengandung penanda seperti reporter fluorescent atau penanda pemilihan obat.
  • Penyortiran FACS dapat digunakan untuk memperkaya sel yang mengekspresikan reporter fluoresen (seperti GFP).
  • Jika mengandung penanda yang dapat dipilih obat, ikuti protokol untuk obat tertentu. Misalnya, pemilihan puromisin biasanya dilakukan pada 1-10 ug/mL, tergantung pada sensitivitas sel target.

Karena produksi dan penerapan vektor lentiviral dan retroviral mengandung banyak langkah, ada beberapa titik di mana efisiensi produksi atau transduksi dapat terhambat. Di sini kita akan membahas beberapa masalah yang paling umum:

Penyebab potensial dari hal ini adalah bahwa sel-sel kemasan telah dipertahankan pada pertemuan, yang menghasilkan penurunan jangka pendek dalam produksi virus. Pertimbangkan untuk mencairkan sejumlah sel baru. Sebagai alternatif, dalam kasus retrovirus, sel-sel phoenix mungkin perlu diseleksi dua kali dengan higromisin B dan toksin difteri untuk memastikan bahwa semua sel mengekspresikan kedua konstruksi pengemasan.

Rasio transfer dan plasmid pembantu mungkin perlu dioptimalkan untuk sistem khusus Anda. Sebagian besar perusahaan akan merekomendasikan rasio untuk memulai, tetapi ini mungkin perlu disesuaikan.

Sementara vektor lentiviral dan retroviral dapat menampung sisipan yang relatif besar dibandingkan dengan sistem vektor virus lainnya, masih ada batas pengemasan. Partikel virus dapat menampung 8-10 kb antara dua LTR. Konstruksi transgen lebih lama dari ini akan sangat menurunkan efisiensi pengemasan, yang akan menghasilkan titer virus yang lebih rendah.

Cara lain yang mungkin untuk mengatasi titer rendah adalah dengan memusatkan virus. Setelah pemurnian untuk menghilangkan puing-puing sel, supernatan dapat dibuat pelet dengan ultrasentrifugasi. Virus pelet kemudian dapat disuspensikan kembali dalam volume media atau buffer yang diinginkan. Banyak perusahaan menyediakan produk dan reagen untuk konsentrasi virus (lihat Reagen di bawah).

Jika hasil sel yang ditransduksi rendah meskipun titer virusnya tinggi, kemungkinan volume total media transduksi pada sel target terlalu tinggi [53]. Langkah transduksi dapat dilakukan dalam volume media yang hanya menutupi sel ini meningkatkan paparan sel terhadap virus, dan memaksimalkan kemungkinan interaksi virus-sel. Perawatan harus dilakukan untuk tidak mengeringkan area piringan, misalnya dengan menggoyang piring secara berkala selama transduksi. Volume dapat dinaikkan lagi setelah 4-6 jam untuk mencegah sel mengering dalam semalam.

Mungkin juga virus dikumpulkan terlalu dini. Puncak produksi virus adalah antara 48-72 jam pasca-transfeksi.

Beberapa jenis sel, seperti fibroblas primer atau sel saraf, secara inheren sulit untuk ditransduksi. Ini bisa menjadi masalah yang sulit untuk dipecahkan, dan mungkin memerlukan optimasi protokol transduksi atau transduksi dengan titer yang meningkat. Pseudotyping dari virus transduksi untuk menargetkan reseptor yang lebih melimpah pada jenis sel tertentu adalah pendekatan lain yang perlu dipertimbangkan.

Media sel kemasan mungkin tidak kompatibel dengan pertumbuhan sel target. Encerkan virus dalam media yang kompatibel dengan sel target atau konsentrasikan seperti dijelaskan di atas dan suspensikan kembali dalam media yang kompatibel dengan sel target.

  • Seberapa sulit sisipan yang Anda coba tiru?
  • Apakah sel target Anda sulit untuk ditransduksi?
  • Apakah Anda membutuhkan titer virus yang tinggi?
  • Jenis sisipan apa yang akan Anda ekspresikan?

Banyak reagen dan transfer plasmid telah dioptimalkan untuk kondisi tertentu (produksi titer virus tinggi) atau dirancang dengan fitur tertentu (seperti promotor spesifik, ganda, atau dapat diinduksi). Vektor ekspresi lentiviral yang umum digunakan adalah Takara Bio / Clonetech pLVX-Puro dengan promotor CMV konstitutif [54].

Ada beberapa variasi pada sel kemasan berbasis HEK-293 yang dijelaskan di atas yang tersedia dari sumber komersial:

Perusahaan Nama Fitur Referensi
Clontech / Takara BioLenti-X 293TProduksi virus 6X lebih banyak dari 293FT dan virus 30X lebih banyak dari 293 sel [32, 55]
GenecopoeiaLenti-Pac 293TaMenghasilkan titer tinggi
Biolab Sel293LTV293-berasal
Keterikatan kuat pada pelat
Tingkat pertumbuhan lebih cepat
Menghasilkan titer tinggi
SBI293TNSangat dapat ditransfeksi
Menghasilkan titer tinggi
Biolab SelKemasan Retroviral Platinum293T diturunkan
Menghasilkan titer tinggi Stabilitas lebih lama tanpa pemilihan obat
Tiga versi: ecotropic (Plat-E) [56], amphotropic (Plat-A), dan pantropic (Plat-GP)
[56, 57]
Biolab Sel293RTV Ekspresi Retroviral dan Garis sel Pengemasan
Pertumbuhan sel lebih cepat
Titer retrovirus lebih tinggi
Keterikatan yang lebih kuat pada pelat

Reagen transfeksi dapat diperoleh secara komersial atau diformulasikan di laboratorium. Selain reagen transfeksi yang paling umum: kalsium fosfat [44, 58], lipofektamin [59], fugene [33], dll. Ada juga banyak kit yang diformulasikan secara komersial yang berisi transfer dan plasmid pembantu dan menunjukkan hasil virus yang lebih tinggi dan rasio plasmid yang dioptimalkan. Parameter untuk transfeksi kalsium fosfat telah dioptimalkan [60, 61], dan inkubasi berkepanjangan dengan kalsium fosfat mungkin beracun.

Bagian berikut membahas beberapa reagen transfeksi umum. Kit reagen transfeksi khusus juga ada, misalnya, Reagen Transfeksi mESC Clontech/Takara Bio Xfect untuk transfeksi sel induk embrionik tikus [62], Jetprime [63] atau jetPEI [64] dari Polyplus atau TransIT-LT1 [65] atau TransIT X2 [ 41] reagen transfeksi dari Mirus .

Lipofectamine adalah lipid kationik dengan gugus kepala bermuatan positif dan 1-2 rantai hidrokarbon. Kelompok kepala berinteraksi dengan tulang punggung fosfat dari asam nukleat. Muatan permukaan positif liposom memungkinkan fusi kompleks liposom/asam nukleat dengan sel bermuatan negatif. Sebagai contoh, Vodnala SK dkk mentransfeksi sel pengemasan Platinum-E ecotropic (PlatE) dari Cell Biolabs dan plasmid pCL-Eco menggunakan Lipofectamine di OptiMEM dari Invitrogen [57]. Reagen PLUS dari Thermo Fisher dapat meningkatkan efisiensi reagen transfeksi, seperti Lipofectamine [59].

Perusahaan Produk Fitur
Biolab SelViraSafe™ Lentivirus Expression Sistem lengkapBerbasis HIV-1 Lebih aman karena berkurangnya tumpang tindih dengan gen HIV asli Pantropic System (VSV-G pseudotyped) Atau Ectopic (hanya menginfeksi sel tikus atau tikus tidak stabil saat dibekukan, tidak akan bertahan dengan ultrasentrifugasi) sistem
GenekopiaKit Pengemasan Lenti-Pac™ LentiviralSistem Pengemasan Ekspresi HIV dan FIV
Campuran plasmid kemasan lentiviral yang dioptimalkan
Termasuk reagen transfeksi EndoFectin™
Reagen TiterBoost™ meningkatkan titer 5-10 kali lipat
SBIpPACKH1 Kemasan campuran plasmidBerbasis HIV dan FIV
Keamanan yang Dimaksimalkan Campuran 3 plasmid pembantu yang dioptimalkan: pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV dan pVSV-G. pPACKH1-GAG
Menginfeksi sel mamalia dan non-mamalia
InvitrogenCampuran Kemasan Lentiviral ViraPower™Sistem lentiviral berbasis HIV-1
Campuran yang dioptimalkan dari 3 plasmid pengemasan/pembantu (pLP1, pLP2, dan pLP/VSVG)
Kit Ekspresi Lentiviral ViraPower™pLenti vektor transfer berbasis
Campuran yang dioptimalkan dari 3 plasmid pengemasan/pembantu (pLP1, pLP2, dan pLP/VSVG)
293FT sel kemasan
Sistem Ekspresi Lentiviral NativePure™Untuk ekspresi fusi terbiotinilasi N- dan C-terminal dengan protein yang Anda minati
MiliporeSigmaCampuran Kemasan Lentiviral [66] Titer tinggi bila digunakan dengan plasmid shRNA MISI
Rasio plasmid yang sudah dioptimalkan (mungkin langkah yang lebih sedikit untuk benar-benar memproduksi virus) pseudotyping VSV-G
Biolab SelSistem Lengkap Ekspresi Retroviral PlatinumEkspresi retroviral dan sistem pengemasan
Titer tinggi
Menghasilkan virus ekotropik, amfotropik, atau pantropik (memerlukan garis sel spesifik - ekotropik (Plat-E), amfotropik (Plat-A), dan pantropik (Plat-GP))

Fugene adalah reagen transfeksi nonliposomal yang mengklaim memiliki efisiensi transfeksi tinggi dengan toksisitas rendah. Ini kompatibel dengan serum dan tidak memerlukan penggantian media setelah digunakan. Ini adalah campuran eksklusif lipid bermuatan positif dan komponen lain yang berinteraksi dengan DNA bermuatan negatif dan memungkinkan untuk masuk ke dalam sel. Aplikasi terbaru termasuk [33, 67].

Catatan: Saat menggabungkan Fugen dan plasmid, disarankan agar tabung polistirena digunakan dan Fugen ditambahkan terakhir untuk menghindari interaksi dengan tabung.

Roche menggambarkan ini sebagai "reagen multi-komponen yang membentuk kompleks dengan DNA, kemudian mengangkut kompleks ke dalam sel hewan atau serangga." Hal ini memungkinkan untuk transfeksi DNA ke berbagai sel dengan toksisitas minimal. Ini telah dikutip dalam literatur [34].

Plasmid transfer berasal dari berbagai tulang punggung. Vektor tipikal mengandung beberapa, atau semua, fitur berikut yang membuat vektor lebih aman, meningkatkan titer virus, atau meningkatkan ekspresi sisipan.

Nama Fungsi
5'LTRpengulangan terminal panjang 5'
SIN/LTR3 'pengulangan terminal panjang yang tidak aktif sendiri
oriasal replikasi
Resistensi ampisilin atau kanamisinGen resistensi ampisilin atau kanamisin untuk seleksi bakteri
Psi (ψ)Sinyal pengemasan RNA
RREElemen tanggapan rev
cPPTSaluran polipurin sentral
hpgkPromotor eukariotik fosfogliserat kinase manusia
Elemen WPREElemen Pengaturan Pasca Transkripsi Hepatitis Woodchuck
Sinyal poliadenilasi SV40Memungkinkan penghentian transkripsi yang efisien dan pemrosesan transkrip rekombinan
puroRGen resistensi puromisin untuk seleksi mamalia
pUC AsalMemungkinkan replikasi salinan tinggi dan pemeliharaan plasmid dalam sel E.Coli
SV40 AsalMenyediakan perbanyakan plasmid yang stabil dalam sel pengemasan
F1 Oriasal replikasi

MilliporeSigma menawarkan banyak tulang punggung untuk plasmid shRNA MISI mereka. Mereka memiliki berbagai pilihan penanda fluoresen atau obat, dan sistem yang dapat diinduksi. vektor shRNA menggunakan promotor U6. Mereka menawarkan kontrol positif dan negatif untuk semua tulang punggung. Ini dikembangkan bekerja sama dengan ilmuwan konsorsium RNA, dan vektor dasar pLKO.1-puro dikembangkan di Broad Institute [68]. Semua ini adalah vektor lentiviral. Berbagai set dan kontrol plasmid shRNA MISI telah diterbitkan di >1.500 artikel jurnal.

Menggunakan Backbone-Promotor Penanda yang dapat dipilih
ekspresi shRNApLKO.1-CMV PLKO.1-UbCeGFP, tGFP, TagCFP, TagYFP, TagRFP, TagFP635, TurboGFP, dan TagFP635 Puromycin, neomycin
Dapat diinduksipLKO-puro-IPTG-1xLacOPuromisin
pLKO-puro-IPTG-3xLacOPuromisin
Transfeksi shRNA sementara atau Stabil dan produksi lentivirusTRC2-pLKOPuromisin

SBI menawarkan vektor lentiviral yang berbasis HIV dan FIV dan memiliki banyak promotor, tergantung pada jenis sel yang ditransduksi: CMV (Cytomegalovirus) untuk HeLa dan banyak jenis sel lainnya dan untuk transduksi HEK293 dan HT1080 MSCV (Murine Stem Cell Virus), untuk hematopoietik dan transduksi sel induk UbC (Ubiquitin C), untuk mentransduksi sebagian besar jenis sel PGK (Phosphoglycerate Kinase), untuk mentransduksi sebagian besar jenis sel dan EF1 (Elongation Factor 1α), untuk mentransduksi sebagian besar jenis sel [69] Selain vektor transfer tercantum di bawah ini, mereka menawarkan tulang punggung promotor yang dapat diinduksi dan ganda. Penanda yang dapat dipilih yang tersedia termasuk GFP, RFP, Puromycin, Hygromycin, Neomycin dan Zeocin.

Ringkasan dari Backbone-Promoter dan spidol mereka dijelaskan di bawah ini.

Menggunakan Backbone-Promotor
Tulang punggung/promotor untuk cDNApCDF1-MCS2-EF1
pCDH-CMV-MCS2
pCDH-CMV-MCS-EF1
pCDH-MCS-T2A
pCDH-CMV-MCS
pCDH-EF1-MCS
pCDH-UbC-MCS
pCDH-MSCV-MCS
pPS-EF1-GFP-RFP
pPS-PGK-GFP-RFP
pPS-MSCV-GFP-RFP
Tulang punggung/promotor untuk shRNApSIH1-H1
pSIF-HI
pGreenPuro
pFIV-H1
Tulang punggung/promotor untuk microDNApCDH-CMV-MCS-EF1
pMIF-cGFP-Zeo

Invitrogen menawarkan Sistem Ekspresi Lentiviral ViraPower™. Plasmid transfer adalah vektor berbasis pLP atau pLenti dan disertai dengan tiga plasmid pengemasan/pembantu (pLP1, pLP2, dan pLP/VSVG) [70]. Mereka memiliki sistem lentiviral yang dioptimalkan untuk ekspresi gen di bawah kendali promotor CMV, UbC, CMV/TO, RSV, atau EF-1α. Mereka menyertakan beberapa vektor lentiviral untuk pembuatan protein bertanda epitop Lumio atau V5. Satu perbedaan dari sistem Invitrogen adalah bahwa mereka menyediakan beberapa pilihan untuk kloning termasuk Gateway (DEST™), TOPO®, dan sistem berbasis rekombinasi (pLenti6/UbC/V5-DEST™). Berbagai plasmid berbasis pLenti telah dipublikasikan di >2.000 artikel jurnal.

Menggunakan Vektor Tulang Punggung-promotor Promotor Metode Kloning Pilihan Agen Penginduksi
Ekspresi Gen Target atau Pembuatan Tagged proteinpLPRSV, CMVtidak adaGFPtidak ada
pLenti7.3⁄V5-DEST™CMV, GFPgerbang
pLenti7.3⁄V5-TOPO®CMVTOPO® atau TOPO®-TABlastidin
pLenti6.3⁄V5-DEST™CMVgerbangBlastidin
pLenti6.3⁄V5-TOPO®CMVTOPO®-TABlastidin
pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™EF-1α, CMV, Tidak Ada (Tanpa Promosi)gerbangBlastidin
pLenti6.2/C,N-Lumio™/V5-DESTCMVgerbangBlastidin
pLenti6.2⁄V5-DEST™CMVgerbangBlastidin
pLenti6⁄V5atau pDESTCMV, UbCGerbang Arah TOPO® atau GerbangZeosin
pLenti4⁄V5-DEST™CMVgerbangtidak ada
Sistem yang Dapat DiinduksipLenti6.3⁄ TO⁄ V5-DESTCMV/TOgerbangBlastidinDoksisiklin dan Tetrasiklin
pLenti6/TRCMVgerbangBlastidinDoksisiklin dan Tetrasiklin

Produksi Retrovirus

Cell Biolabs menawarkan berbagai vektor ekspresi retroviral [71] di berbagai plasmid latar belakang yang diturunkan dari virus leukemia murine (MLV). Mereka menawarkan lini sel pengemasan retroviral (293RTV) dan kit untuk pemurnian dan konsentrasi virus: Kit Konsentrasi dan Pemurnian ViraBind™ atau Kit Konsentrasi dan Pemurnian ViraBind™ PLUS. Vektor pMXs, pMYs, dan pMCs mereka telah terbukti efektif dalam menginduksi sel induk berpotensi majemuk. Mereka menawarkan beberapa penanda yang dapat dipilih: Hygromycin, Neomycin, Puromycin, Zeomycin, dan GFP. Berbagai vektor tulang punggung telah dipublikasikan di >500 artikel jurnal. Misalnya, Yasuda S et al memperkenalkan RAD23B dan variannya ke sel RAD23B-KO dengan vektor pMX-Puro (Biolab Sel) [72].

Menggunakan Tulang punggung-promotor Penanda yang Dapat Dipilih
vektor ekspresipBABE
pMCs-CAG
pMXs-CMV
pMXs-EF1
pMXs-EF1α
pMXs-IRES
pMXs-SRα
pMXs-U6
pMYs-IRES
pWZL
higromisin
neomisin
Puromisin
Zeomisin
GFP

Produksi Lentivirus

Cell Biolabs, Inc. menawarkan vektor ekspresi lentiviral berdasarkan tulang punggung pSMPUW-IRES dan pSMPUW-U6 di mana gen yang diinginkan dapat langsung dikloning. Mereka termasuk penanda yang dapat dipilih berikut: Blasticidin, Hygromycin, Neomycin, Puromycin, dan GFP. Vektor transfer ini membawa gen resistensi kanamisin, WPRE, Multiple Cloning Site (MCS), cPPT, 3' LTR, dan 5' CMV/LTR [73]. Vektor ekspresi ini telah dirujuk dalam 6 artikel jurnal.

Menggunakan Tulang punggung-promotor Penanda yang dapat dipilih
Vektor EkspresipSMPUW-IRES
pSMPUW-U6
Blastidin
higromisin
neomisin
Puromisin
GFP

Addgene adalah repositori nirlaba untuk plasmid dan menawarkan berbagai vektor transfer lentiviral dan retroviral. Beberapa vektor retroviral yang umum digunakan tercantum dalam tabel 9. Lainnya dari Addgene termasuk pBMN-PIB [56].

Menggunakan Tulang punggung/seleksi Pemilihan Obat
Vektor retroviral untuk ekspresi shRNApMKO.1 dan pMKO.1Puromisin, neomisin, Zeosin, GFP
Ekspresi retroviralpBABEHigromisin, puromisin, Zeosin, GFP
Ekspresi gen retroviral mamalia dengan penanda yang dapat dipilih GFPMSCV-IRES-GFPGFP

Vektor lentiviral populer yang tersedia melalui Addgene termasuk dalam tabel 10. Plasmid kemasan lentiviral PAX2 (12260) dan pMD2.G (12259) dari Addgene sangat umum digunakan [41, 74]. Duncan A dkk, misalnya, memperoleh p-Lenti-7xTcf-FFluc-SV40-mCherry dari Addgene (24307) [75].

MenggunakanTulang punggungReferensi
Ekspresi Lentiviral pWPXL, pLenti-puro 39481 [76]
Ekspresi shRNA lentiviralpLKO.1
Ekspresi shRNA lentiviral yang dapat diinduksi tetTet-pLKO 21915 [47]
ekspresi cDNAFUGW
Ekspresi shRNA bersyarat di bawah kontrol Cre-LoxpSico
ekspresi cDNApLJM1-EGFP

SBI System Biosciences menawarkan alternatif sentrifugasi kecepatan rendah untuk konsentrasi retrovirus dengan Retro-Concentrin™ mereka yang mengendapkan virus diikuti dengan sentrifugasi kecepatan rendah. Prosesnya memakan waktu setidaknya 12 jam. Satu keuntungan, bagaimanapun, adalah bahwa pelet yang dihasilkan stabil untuk penyimpanan pada -80 °C [77].

SBI System Biosciences juga menawarkan solusi pengendapan virus Peg-it™ [33]. Solusi ini diformulasikan dengan polietilen glikol dan telah dioptimalkan untuk pengendapan partikel lentiviral. Ketika dicampur dengan media yang dikumpulkan dari sel-sel kemasan, itu menyebabkan partikel virus mengendap. Campuran kemudian dapat disentrifugasi untuk membentuk partikel. Ini meningkatkan konsentrasi 10 sampai 100 kali lipat.

Cell Biolabs, Inc. menyediakan konsentrasi lentivirus dan kit pemurnian yang berbasis kolom, dialisis, atau filter. Kit berbasis kolom memungkinkan konsentrasi hingga 500 kali lipat dengan kemurnian lebih tinggi dari ultrasentrifugasi dalam 3-5 jam. Ini dapat memproses volume yang lebih besar daripada metode berbasis filter. Kit berbasis dialisis memungkinkan konsentrasi hingga 10 9 TU/mL, dengan kemurnian lebih tinggi, dalam waktu sekitar 12-24 jam. Kit berbasis filter memulihkan lebih dari 90% virus dengan kualitas tinggi dalam waktu kurang dari dua jam.

GeneCopoeia menawarkan Solusi Konsentrasi Lenti-Pac™ Lentivirus yang, melalui penggunaan reagen miliknya, memungkinkan peningkatan konsentrasi virus 10-100 kali lipat dalam waktu kurang dari 3 jam tanpa ultrasentrifugasi.

Perusahaan lain juga menyediakan produk serupa. Konsentrator Lenti-X dari Clontech (631231) adalah pilihan populer untuk mengkonsentrasikan lentivirus [59, 78].

Cell Biolabs, Inc. menyediakan kit kuantisasi/titering lentivirus. Ini mengukur kandungan asam nukleat virus dari lentivirus yang dimurnikan atau supernatan yang tidak dimurnikan dalam 45-60 menit. Virus ditangkap oleh manik-manik dan kemudian didenaturasi, dan absorbansi dibaca dan dibandingkan dengan kurva standar (Standar RNA Lentivirus disediakan dengan kit) untuk menentukan kandungan asam nukleat.

Mereka juga menyediakan kit lain (QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit) yang mengukur protein matriks p24 terkait virus dengan ELISA pada pelat berlapis antibodi anti-p24. Standar antigen p24 disediakan untuk kuantifikasi. Fanning S et al menggunakan kit ini untuk menentukan titer vektor ekspresi pLV-hSyn-hSNC dan pLV-hSyn-mGFP [79].

GeneCopoeia menawarkan kit titer berbasis qRT-PCR (Lenti-Pac™ HIV dan FIV qRT-PCR Lentivirus Titration Kits). Mereka menyediakan kontrol standar, reagen ekstraksi RNA, dan reagen qRT-PCR. Genom RNA lentiviral dikuantifikasi dengan qPCR menggunakan teknologi hijau SYBR.

Cell Biolabs, Inc. menawarkan kit (ViraDectin™ Lentivirus Transduction Kit dan ViraDctin™ Retrovirus Transduction kit) yang terdiri dari koktail eksklusif yang membentuk superkompleks dengan partikel lentivirus, menghasilkan peningkatan efisiensi transduksi 2 hingga 6 kali lipat jika dibandingkan dengan polibre.

SBI System Biosciences menawarkan TransDux™, yang merupakan reagen infeksi dengan toksisitas minimal yang memberikan peningkatan efisiensi transduksi secara substansial dibandingkan polibre.

Mereka juga menawarkan kit LentiMag™ yang berisi formulasi nanopartikel magnetik yang dikembangkan untuk transduksi sel mamalia dengan vektor retrovirus atau lentivirus. Dengan menjalankan magnet di bawah sel yang ditransduksi, virus terkait nanopartikel magnetik menjadi terkonsentrasi ke sel dengan sangat cepat, meningkatkan efisiensi transduksi.

Banyak perusahaan yang tercantum di atas dan lainnya juga menawarkan partikel transduksi virus siap pakai yang memiliki titer dan kemurnian tinggi (AddGene, MilliporeSigma SBI System Biosciences, dan lainnya). Sebagai contoh, De Cecco M dkk menggunakan pLKO-RB1-shRNA63 dan pLKO-RB1-shRNA19 dari T. Waldman melalui AddGene ( 25641 dan 25640) [80]. Duncan A dkk memperoleh pGF-CREB-mCMV-EF1α-Puro CREB reporter dan vektor kontrol dalam tulang punggung lentivirus dari System Biosciences (TR202va-p) [75]. SE Sillivan dkk memperoleh pra-miR-135b-5p dan kontrol dalam vektor lentiviral CD513 dari System Biosciences [64].

Dana-Farber Cancer Institute dan The Broad Institute menyediakan CCSB-Broad Lentiviral Expression Library untuk lebih dari 15.000 ORF manusia dalam sistem lentiviral siap ekspresi dengan tag C-terminal V5. Ebright RY dkk terinfeksi terisolasi sel tumor beredar dengan beberapa konstruksi dari perpustakaan [59].

Terlepas dari kemajuan tertentu dalam aplikasi pendekatan berbasis lentivirus saat ini, peningkatan teknik transfer gen tetap menjadi tujuan utama untuk pengembangan protokol terapeutik yang lebih efisien. Beberapa penelitian telah melaporkan metode yang berbeda untuk meningkatkan efisiensi transduksi dalam sel punca hematopoietik (HSC). Sebuah studi baru-baru ini telah menunjukkan bahwa UM171, sebuah aktivator HSC secara signifikan mempotensiasi transduksi sel CD34+ berbasis lentivirus [81]. Juga, menurut Hauber et al, LentiBOOST, poloxamer penyegel membran, juga meningkatkan efisiensi transduksi lentiviral dalam sel CD34+ manusia yang diperoleh dari darah perifer [82] dan sel T murine [51].

Juga, platform baru untuk ekspresi gen jangka pendek menggunakan Integration-deficient lentiviruses (IdLVs), yang mengekspresikan gen hanya secara sementara dalam sel yang membelah, baru-baru ini diperkenalkan [83]. Para penulis telah mengamati peningkatan aktivitas fungsional HSC ketika IdLVs telah digunakan untuk pengiriman HOXB4 dan Angptl3. Teknik ini membantu menghindari efek samping yang ditemukan dengan ekspresi konstitutif.


Penilaian Fungsional Varian Pengkodean dan Regulasi Dari DKK1 Tempat

NS DKK1 gen mengkodekan inhibitor ekstraseluler dari jalur Wnt dengan posisi penting dalam pertumbuhan jaringan tulang, homeostasis tulang, dan elemen vital tulang yang sama sekali berbeda. biologi. Beberapa BMD genom-wide affiliation research (GWAS) terus-menerus menemukan afiliasi dengan SNP di dalam DKK1 daerah genom. Untuk penyebab ini, sangat penting menilai kinerja pengkodean dan varian peraturan dalam gen.

Di sini, kami sekarang telah mempelajari kinerja varian regulasi diduga, yang sebelumnya ditemukan terkait dengan BMD dalam berbagai penelitian oleh orang lain dan kami sendiri, dan juga enam varian missense saat ini dalam genpenduduk ral. Dengan menggunakan uji reporter luciferase spesifik jalur-Wnt, kami sekarang telah memutuskan bahwa varian p.Ala41Thr, p.Tyr74Phe, p.Arg120Leu, dan p.Ser157Ile menunjukkan penurunan kemampuan penghambatan DKK1 berbeda dengan WT. Hasil akhir ini sesuai dengan fenotipe massa tulang tinggi (HBM) dari dua wanita dari kohort kami yang membawa mutasi p.Tyr74Phe atau p.Arg120Leu.

Di sisi lain, melalui eksperimen sekuensing pengambilan- (4C-) konformasi kromosom sirkular, kami sekarang telah mendeteksi bahwa area yang mengandung 24 varian BMD-GWA, diposisikan 350-kb hilir dari DKK1, berinteraksi masing-masing dengan DKK1 dan LNCARD (Regulator pengaktif LncRNA dari DKK1, AKA LINC0148) pada sel osteoblastik. Sebagai kesimpulan, kami sekarang telah membuktikan bahwa beberapa varian pengkodean yang tidak umum adalah mutasi hilangnya sebagian fungsi yang akan menghasilkan fenotipe HBM, sedangkan SNP yang tersebar luas terkait dengan BMD di GWAS termasuk dalam area regulasi jarak jauh yang diduga, melalui a tetapi mekanisme yang tidak diketahui melibatkan LNCARD. © 2020 Penulis. JBMR Plus dicetak oleh Wiley Periodicals LLC atas nama American Society for Bone and Mineral Research.

/>Sel neuroendokrin paru: fisiologi, homeostasis jaringan dan penyakit

Sistem Biosains

System Biosciences menawarkan berbagai layanan khusus untuk mendukung penelitian Anda, memungkinkan Anda menghabiskan lebih sedikit waktu membuat alat, dan lebih banyak waktu membuat penemuan. Manfaatkan keahlian kami dengan teknologi berikut: • Kloning vektor lentiviral dan pengemasan titer tinggi • Isolasi eksosom dan pengurutan NGS • Garis sel kustom yang direkayasa CRISPR/Cas9 • Pembuatan garis sel yang stabil (sistem ekspresi berlebih, knockdown, dan inducible) • Minicircle kustom • Pembuatan profil qPCR MicroRNA untuk seluruh genom atau panel pilihan Anda Semua layanan diselesaikan di tempat di fasilitas canggih SBI di Palo Alto, California oleh ilmuwan tingkat Ph.D dengan pengalaman bertahun-tahun dalam memberikan layanan berkualitas kepada para peneliti . Pilih SBI untuk kebutuhan layanan kustom Anda – Memanfaatkan inovasi untuk mendorong penemuan sejak 2003

Sertifikasi & Kualifikasi

Layanan Kami (32)

Isolasi dan Karakterisasi Eksosom

Analisis Biomarker

Kloning Molekul

Sintesis dan Subkloning Gen Khusus (Syn2CloneTM)

Lelah melompat melalui lingkaran kloning untuk mendapatkan konstruksi Anda? Hemat waktu dan tenaga Anda dan mintalah tim ahli SBI membangun konstruksi khusus yang Anda butuhkan melalui layanan Syn2Clone kami. Ini adalah layanan turnkey sepenuhnya di mana Anda memberikan urutan klon dan kami mengurus sisanya. Anda mendapatkan sisipan QC sepenuhnya yang dikloning ke dalam koleksi vektor terkemuka di industri SBI yang dikirimkan hanya dalam waktu 2 minggu dan dengan harga yang tidak lebih dari vektor kosong.

SBI menawarkan berbagai pilihan untuk shRNA tunggal atau ganda, cDNA & microRNA amp, serta kloning konstruksi Reporter Transkripsi. Pilih dari berbagai promotor, gen reporter, dan sistem pengiriman termasuk vektor Lentivector, Minicircle, dan PiggyBac.

Detail Layanan
• Waktu penyelesaian untuk proyek Syn2Clone adalah 2-6 minggu tergantung pada ukuran/kompleksitas insert
• Semua konstruksi diverifikasi urutan dengan peta plasmid beranotasi
• Pilih dari vektor Lentivector, Minicircle, atau PiggyBac premium SBI
• Pilihan kustomisasi vektor untuk memberikan apa yang Anda butuhkan

Produksi Lentivirus

SBI adalah Pemimpin Industri dalam Manufaktur Lentivirus
SBI menawarkan layanan Pengemasan Lentiviral Ekspres untuk menghasilkan partikel virus titer tinggi berkualitas tinggi menggunakan konstruksi lentivector Anda hanya dalam 10 hari. Hemat waktu dan upaya Anda untuk menyiapkan virus Anda sendiri, dan terima partikel lentiviral yang siap ditransduksi dari SBI - Pakar Lentiviral.* (lihat contoh data infektivitas).
Semua layanan produksi virus kustom harus dilengkapi dengan informasi tentang plasmid yang harus dikemas.

Kuantisasi Titer Lentivirus
Titer Lentivirus dapat diukur dengan berbagai cara. Pengukuran protein permukaan virus oleh ELISA melebih-lebihkan tingkat titer karena mendeteksi partikel virus aktif dan mati. SBI mengukur titer virus dengan mentransduksi sel target pada beberapa multiplisitas infeksi (MOI) dengan analisis qPCR berikutnya untuk menentukan jumlah pasti integrasi lentiviral per genom sel target. Titer terhitung ini adalah metode paling akurat untuk mengukur partikel virus aktif dan dilaporkan sebagai Infectious Units (IFU) per mL.

Jaminan Layanan Pengemasan Virus Berkualitas Kami

  • Produksi virus di fasilitas BSL-2 yang canggih dengan kontrol kualitas yang kuat sesuai dengan kriteria NIH Biosafety Level 2
  • Produksi percontohan skala kecil tersedia untuk menguji infektivitas dalam lini sel pilihan Anda
  • Sangat konsisten dan andal menggunakan vektor dan layanan kloning SBI
  • Titer virus pada atau di atas level titer yang diinginkan, menggunakan vektor SBI
  • Satu paket virus tambahan berjalan disertakan jika titer yang diinginkan tidak tercapai
  • Fleksibilitas skala produksi virus untuk memenuhi kebutuhan penelitian Anda
  • Titer Virus yang akurat seperti yang ditentukan oleh qPCR untuk mengukur unit infeksi per ml ( ifus/ml)
  • Bantuan teknis ahli yang diberikan oleh staf ilmiah berpengalaman SBI dalam waktu 24 jam

Urutan RNA

Temukan biomarker pasien baru yang ada dalam eksosom
Eksosom adalah vesikel membran 60 - 150 nm yang disekresikan oleh sebagian besar jenis sel in vivo dan in vitro. Mereka ditemukan dalam darah, urin, cairan ketuban, cairan asites ganas dan mengandung subset yang berbeda dari microRNA, mRNA, lncRNA dan ncRNA lainnya. Identitas dan kelimpahan RNA ini telah terbukti menjadi pendekatan yang berharga untuk menemukan tanda tangan urutan untuk diagnosis dan prognosis penyakit. SBI mengumumkan layanan pengurutan RNA eksosom generasi berikutnya untuk mempercepat penemuan biomarker Anda. Layanan Exo-NGS SBI menyediakan solusi awal hingga akhir lengkap dari biofluida apa pun hingga data RNA-Seq yang dianalisis dan disejajarkan. Kami mengisolasi eksosom, memurnikan eksoRNA, dan membangun perpustakaan Illumina NGS. Pustaka ini kemudian diurutkan menggunakan ujung berpasangan 2x 75bp Illumina NGS berjalan untuk memberikan kepercayaan yang lebih besar dari identitas urutan RNA.

Konstruksi Vektor CRISPR/Cas9

Pengeditan Genom menggunakan RNA panduan
Penemuan kompleks CRISPR/Cas9 baru-baru ini telah memberi para peneliti alat yang sangat berharga untuk menargetkan dan memodifikasi urutan genom apa pun dengan tingkat kemanjuran dan spesifisitas yang tinggi. Sistem, yang terdiri dari RNA-guided nuclease (Cas9) dan guide RNA (gRNA) yang melengkapi urutan target, memungkinkan pembelahan spesifik urutan lokus target di seluruh genom. SBI menyediakan desain gRNA khusus dan kloning ke vektor SmartNuclease apa pun dengan waktu penyelesaian 2 minggu. Hubungi kami hari ini untuk memulai.

Vektor SDM Kustom
Harga sesuai permintaan
Manfaatkan sepenuhnya sifat kuat dari platform rekayasa genom CRISPR/Cas9 dan TALEN dengan menggunakan vektor HR yang cocok. Mayoritas peristiwa pengeditan genom hanya memengaruhi persentase dari total populasi sel yang ditransfeksi, diperkirakan 1-80% untuk modifikasi mono atau bi-alel tergantung pada platform, jenis sel, dan target DNA yang diinginkan. Karena variasi aktivitas yang luas, melakukan uji fenotipik hilir di latar belakang sel tipe liar itu menantang, terutama jika fenotipe yang dimaksud halus atau sulit untuk dibedakan. Oleh karena itu, alat dalam bentuk donor atau vektor penargetan yang mengandung 1) penanda seleksi fluoresen atau antibiotik dan 2) fragmen gen yang menarik untuk knock-in, knock-out, atau mengoreksi urutan tipe liar akan sangat berguna untuk memperoleh populasi homogen sel yang genomnya telah berhasil ditargetkan. SBI telah menghasilkan serangkaian vektor penargetan rekombinasi homolog yang cocok untuk tujuan rekayasa baik pengkodean protein dan gen non-pengkode termasuk microRNA dan lokus genom LncRNA.


Vektor lentiviral: dasar untuk translasi

Lebih dari dua dekade telah berlalu sejak HIV yang dimodifikasi secara genetik digunakan untuk pengiriman gen. Melalui perbaikan terus-menerus, HIV pembawa gen penanda awal ini telah berevolusi menjadi vektor lentiviral yang lebih aman dan lebih efektif. Vektor lentiviral menawarkan beberapa sifat menarik sebagai pembawa pembawa gen, termasuk: (i) pengiriman gen berkelanjutan melalui integrasi vektor yang stabil ke dalam genom inang (ii) kemampuan menginfeksi sel yang membelah dan tidak membelah (iii) tropisme jaringan luas, termasuk penting tipe sel target terapi gen dan sel (iv) tidak ada ekspresi protein virus setelah transduksi vektor (v) kemampuan untuk mengirimkan elemen genetik kompleks, seperti sekuens yang mengandung polikistronik atau intron (vi) profil situs integrasi yang berpotensi lebih aman dan ( vii) sistem yang relatif mudah untuk manipulasi dan produksi vektor. Dengan demikian, teknologi lentivector sekarang telah digunakan secara luas dalam biologi dasar dan studi translasi untuk ekspresi berlebih transgen yang stabil, pembungkaman gen persisten, imunisasi, pencitraan in vivo, menghasilkan hewan transgenik, induksi sel pluripoten, modifikasi sel induk dan pelacakan garis keturunan, atau gen yang diarahkan ke lokasi. mengedit. Selain itu, di era throughput tinggi saat ini, ketersediaan komersial vektor lentiviral yang dibuat sebelumnya, yang direkayasa untuk mengekspresikan atau membungkam gen di seluruh genom, mempercepat ekspansi cepat teknologi vektor ini. Dalam tinjauan ini, kami menilai kemajuan dalam teknologi vektor lentiviral, termasuk lentivirologi dasar, desain vektor untuk meningkatkan efisiensi dan keamanan hayati, protokol untuk produksi vektor dan infeksi, pengiriman gen yang ditargetkan, aplikasi lentiviral tingkat lanjut dan masalah yang terkait dengan sistem vektor.

Jurnal

Jurnal Biokimia &ndash Portland Press

Diterbitkan: 1 Mei 2012

Kata kunci: penargetan sel, saluran polipurin pusat (cPPT), terapi gen, HIV-1, Lentivirus, self-inactivating (SIN)


Tonton videonya: Lentiviral vector stable cell line generation (November 2022).