Informasi

14.4: Mengapa Penting- Ekspresi Gen - Biologi

14.4: Mengapa Penting- Ekspresi Gen - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mengapa menjelaskan regulasi ekspresi gen?

Kanker adalah salah satu dari sepuluh penyebab kematian di Amerika Serikat. Mutasi juga dapat mengubah laju pertumbuhan atau perkembangan sel melalui siklus sel.

Dengan demikian, kanker dapat digambarkan sebagai penyakit ekspresi gen yang berubah. Perubahan pada setiap tingkat ekspresi gen eukariotik dapat dideteksi dalam beberapa bentuk kanker di beberapa titik waktu. Untuk memahami bagaimana perubahan ekspresi gen dapat menyebabkan kanker, sangat penting untuk memahami bagaimana setiap tahap regulasi gen bekerja dalam sel normal. Dengan memahami mekanisme kontrol dalam sel normal yang tidak sakit, akan lebih mudah bagi para ilmuwan untuk memahami apa yang salah dalam keadaan penyakit termasuk yang kompleks seperti kanker.


Strategi rekayasa metabolisme sistem untuk produksi asam amino

Rekayasa metabolisme sistem adalah area multidisiplin yang mengintegrasikan biologi sistem, biologi sintetik, dan rekayasa evolusi. Ini adalah pendekatan yang efisien untuk perbaikan strain dan optimasi proses, dan telah berhasil diterapkan dalam produksi mikroba dari berbagai bahan kimia termasuk asam amino. Dalam ulasan ini, strategi rekayasa metabolisme sistem termasuk pendekatan yang berfokus pada jalur, pendekatan berbasis biologi sistem, pendekatan evolusioner dan aplikasinya dalam dua mikroorganisme penghasil asam amino utama: Corynebacterium glutamicum dan Escherichia coli, diringkas.


Latar belakang

Hormon tanaman dianggap sebagai penentu utama pertumbuhan dan perkembangan tanaman secara keseluruhan. Beberapa hormon tanaman seperti auksin, sitokinin (CK), giberelin (GA) dan brassinosteroid (BR) telah terbukti memiliki fungsi utama dalam mengatur berbagai proses perkembangan seperti, perkembangan biji dan buah, arsitektur pucuk dan akar [1]. Dengan kemajuan dalam genetika maju dan mundur, sekarang ada pemahaman yang baik tentang bagaimana hormon-hormon ini dirasakan dan pemain kunci diidentifikasi dalam jalur pensinyalan mereka. Untuk tujuan ini, hormon tanaman dan jaringan transduksi sinyalnya telah dipelajari secara luas dan digunakan untuk meningkatkan pertanian berkelanjutan seperti pemanjangan batang, waktu pembungaan dan proses seperti efisiensi penggunaan nitrogen [2]. Menariknya, efek pada regulasi pertumbuhan ini dikendalikan oleh jalur sinyal yang berinteraksi di antara hormon tanaman. Interaksi ini bersifat antagonistik, sinergis atau terjadi secara paralel [3]. Misalnya, proses seperti perkecambahan biji, pertumbuhan pucuk dan akar dan pengisian butir diatur oleh hubungan antagonis antara asam absisat (ABA) dan etilen (ET) pada jagung [4]. Selain itu, auksin dan sitokinin menunjukkan antagonisme selama pembentukan meristem apikal akar tetapi bertindak secara sinergis selama pembentukan meristem apikal pucuk [5].

Melatonin (MT) adalah molekul indolic yang ada di mana-mana di semua organisme hidup. Melatonin pada tanaman dikaitkan dengan pertumbuhan dan perkembangan, seperti organogenesis daun dan akar, penuaan dan pembungaan [6,7,8,9]. Selain itu, melatonin juga mengurangi berbagai tekanan abiotik dan biotik pada tanaman seperti dingin, kekeringan, panas dan infeksi oleh jamur patogen. Diplocarpon mali, bakteri biotrofik dan hemibiotrofik Xanthomonas oryzae dan Pseudomonas syringae DC3000, masing-masing [10,11,12,13,14,15]. Sampai saat ini, melatonin dianggap sebagai metabolit sekunder pengatur pertumbuhan pada tanaman tetapi studi terbaru menunjukkan bahwa melatonin juga berpotensi menjadi hormon tanaman [16]. Agar dianggap sebagai hormon tanaman potensial, ada karakteristik mendasar tertentu yang perlu ditunjukkan oleh calon molekul. Ini termasuk pengetahuan tentang jalur biosintetik, reseptor dan efek fisiologis. Studi tentang jalur biosintetik melatonin pada tanaman telah membuat kemajuan yang cukup besar. Ini menunjukkan triptofan (Trp) sebagai prekursor diikuti oleh empat reaksi berurutan dengan enzim Triptofan dekarboksilase (TDC), Triptofan-5-hidroksilase (T5H), Serotonin-n-acetyltransferase (SNAT) dan Acetyl serotonin methyltransferase (ASMT) [17, 18]. Ini telah diusulkan menjadi rute biosintetik standar pada tanaman seperti: Arabidopsis thaliana dan Nasi (Zea mays) di bawah kondisi pertumbuhan normal, bagaimanapun, jalur alternatif juga telah diusulkan untuk ada di bawah kondisi seperti penuaan di mana enzim kunci SNAT dan ASMT beralih untuk menghasilkan melatonin. Ini juga telah diusulkan untuk menjadi rute biosintetik yang paling umum di Arabidopsis thaliana dan Nasi (Zea mays) dibandingkan dengan rute klasik [19]. Baru-baru ini, reaksi biosintetik terbalik yang melibatkan enzim n-acetylserotonin deacetylase (ASDAC) telah diidentifikasi dalam Arabidopsis thaliana dan nasi yang mengandung melatonin intermediate n-asetilserotonin dengan cepat diubah menjadi serotonin. Reaksi ini membatasi sintesis melatonin sehingga mempertahankan kadar melatonin yang optimal untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang seimbang [20]. Seperti hormon tanaman lainnya, melatonin memberikan beberapa efek fisiologis pada tanaman seperti pengaturan pembukaan/penutupan stomata, fotosintesis, tropisme, perubahan metabolisme karbohidrat dan nitrogen dan efek seluler seperti mengubah kandungan kalsium intraseluler (Ca 2+ ) dan permeabilitas membran. 21,22,23,24]. Baru-baru ini, reseptor melatonin pertama CAND2/PMTR1, reseptor berpasangan G-protein telah diidentifikasi di Arabidopsis thaliana yang ditunjukkan untuk mengatur penutupan stomata yang dimediasi oleh melatonin [25]. Ini sudah lama dicari karena kurangnya reseptor melatonin pada tanaman menghambat pemahaman penuh tentang pensinyalan yang dimediasi melatonin. Tanpa reseptor yang teridentifikasi, juga merupakan tantangan untuk melihat melatonin sebagai hormon tanaman yang potensial.

Studi terbaru telah menyelidiki crosstalk melatonin dengan hormon tanaman terkenal seperti asam salisilat (SA), asam absisat (ABA), dan etilen [26]. Yang menarik adalah perbandingan antara melatonin dan hormon yang dipelajari secara luas, auksin, karena prekursor biosintetik umum mereka, triptofan, yang mengarah pada kesamaan struktural seperti memiliki inti indole. Kesamaan ini telah mengarah pada hipotesis bahwa melatonin juga dapat berbagi aktivitas seperti auksin, dalam hal mengatur pertumbuhan dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Namun, pemahaman saat ini tentang hubungan antara melatonin dan auksin masih belum jelas. Studi sebelumnya menggunakan konstruksi promotor-reporter, ekspresi gen, dan respons fisiologis keduanya mendukung dan bertentangan dengan mode aksi yang serupa atau jalur pensinyalan yang tumpang tindih antara auksin dan melatonin. Untuk mendukung fungsi serupa, telah dilaporkan bahwa melatonin merangsang pertumbuhan tanaman pada konsentrasi rendah (10 4 M,10 7 M, 0,01 M) mirip dengan auksin dengan meningkatkan pertumbuhan akar, pembentukan akar lateral dan adventif di berbagai tanaman spesies [6, 27, 28]. Demikian pula, pada akar Brassica juncea, pengobatan melatonin (0,1 M) meningkatkan konsentrasi asam indole-asetat (IAA) dan meningkatkan pertumbuhan akar [13, 29]. Dalam, tanaman tomat transgenik mengekspresikan gen jalur biosintesis melatonin ovine secara berlebihan, Serotonin-N-asetiltransferase (SNAT), menyebabkan penurunan kadar IAA dan hilangnya dominasi apikal [15, 30]. Demikian pula, melatonin menurunkan kelimpahan transkrip YUCCA (YUC) (YUC1, YUC2, YUC5, YUC6 dan TAR2) gen biosintetik auksin pada pengobatan 600 M di akar Arabidopsis [31]. Garis penanda yang responsif terhadap auksin seperti Langsung Ulangi 5, DR5, telah digunakan untuk menyelidiki respon dan distribusi auksin di banyak spesies tanaman seperti Arabidopsis dan kedelai [32]. DR5 adalah promotor sintetis yang mengandung elemen responsif auksin (AuxREs) dan digunakan secara luas sebagai penanda tidak langsung distribusi, pensinyalan, dan respons auksin endogen [33, 34]. Wang dan rekan menunjukkan bahwa pengobatan melatonin eksogen pada konsentrasi penghambatan (600 M) ke akar Arabidopsis ditingkatkan GFP dan GUS ekspresi dari DR5 garis [31]. Selain itu, analisis sekuensing RNA dari akar yang diberi melatonin 10 dan 20 M dari bibit padi berumur 2 minggu menunjukkan bahwa gen pensinyalan auksin meningkat secara signifikan dalam kelimpahan [35]. Bertentangan dengan studi di atas, Kim et al. (2016) melaporkan ketidakmampuan melatonin (10 7 M–10 4 M) untuk merangsang respons tanaman pada jagung dalam bioassay klasik yang secara khusus digunakan untuk menunjukkan respons auksin yaitu pemanjangan koleoptil, penghambatan akar pada bibit muda dan induksi gen biosintesis etilen, sintase 1-aminosiklopropana-1-karboksilat (ACC) [36]. Studi ekspresi gen pada tanaman Arabidopsis yang diobati dengan melatonin 100 pM dan 1 mM mengungkapkan bahwa biosintetik auksin dan gen terkait tidak berubah dalam kelimpahan transkrip kecuali untuk satu gen responsif auksin IAA-amino sintase, yang meningkat dalam kelimpahan pada pengobatan melatonin [37]. Telah terbukti bahwa pengobatan melatonin (5, 100, 450 dan 500 M) tidak dapat menginduksi ekspresi garis penanda yang responsif terhadap auksin. DR5:GUS di dalam Arabidopsis bibit [38, 39]. Data dari studi ini menunjukkan temuan kontras antara dan di dalam spesies tanaman. Faktor pengganggu yang umum terutama untuk analisis transkriptomik, adalah kurangnya perbandingan langsung antara perawatan melatonin dan auksin di bawah rangkaian kondisi eksperimental yang identik.

Interaksi melatonin dan mitokondria telah dipelajari secara ekstensif pada mamalia tetapi baru-baru ini mulai diselidiki pada tanaman [40, 41]. Mitokondria adalah pembangkit tenaga sel dan memainkan peran kunci dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman dengan menyediakan metabolit yang diperlukan, kofaktor enzim dan energi (ATP). Studi terbaru menunjukkan bahwa mitokondria memainkan peran integral dalam pensinyalan seluler. Pensinyalan mitokondria, atau pensinyalan retrograde mitokondria dihasilkan ketika fungsi mitokondria terganggu oleh rangsangan dan ini mengarah pada transmisi sinyal untuk mengubah ekspresi gen nuklir [42]. Hal ini menunjukkan bahwa mitokondria tidak hanya penting untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman tetapi juga untuk mendorong respons terhadap cekaman biotik dan abiotik. Dengan demikian tidak mengherankan bahwa ada interaksi antara mitokondria dan jalur pensinyalan hormon karena hormon sangat terkait dengan proses pertumbuhan dan pertahanan stres [43]. Gen nuklir yang mengkode protein mitokondria telah terbukti responsif terhadap berbagai perawatan hormon berdasarkan studi meta-analisis. Pengatur utama fungsi mitokondria yang diidentifikasi adalah hormon tanaman auksin, sitokinin (CK), asam jasmonat (JA), dan asam salisilat (SA) [43]. Pendekatan bertarget yang lebih langsung telah menunjukkan interaksi antara hormon-hormon ini dan pensinyalan mitokondria. Misalnya, pensinyalan sel penjaga yang diinduksi ABA sebagai respons terhadap cekaman kekeringan diatur secara negatif oleh pembawa piruvat mitokondria yang disebut sebagai Regulator Negatif Pensinyalan ABA Sel Penjaga 1, (NRGA1) di dalam Arabidopsis thaliana [44]. Perawatan asam salisilat (SA) telah terbukti melepaskan dan menghambat transpor elektron mitokondria dalam Nicotiana tabacum [45]. Auksin dan respirasi mitokondria telah lama dihipotesiskan memiliki hubungan [46]. Selain itu, beberapa penelitian telah menunjukkan hubungan antara respon auksin dan fungsi mitokondria [47, 48]. Mutan gen penyandi protein yang terlibat dalam sintesis membran mitokondria bagian dalam seperti Filamentation Temperature Sensitive H4 (FTSH4) dan PROHIBITIN3 terbukti menghambat respon auksin [49, 50]. Selain itu, auksin terdegradasi secara oksidatif di ftsh4 mutan melalui hidrogen peroksida (H2HAI2)-mediasi yang disarankan menjadi strategi untuk memprioritaskan proses seperti pertahanan stres atas proses terkait pertumbuhan [51]. Antimisin A adalah stimulus kimia stres mitokondria yang bekerja dengan memblokir kompleks III dari rantai pernapasan mitokondria. Pengobatan dengan antimisin A juga menyebabkan penurunan kadar auksin (IAA) dan penurunan regulasi reseptor dan pengangkut auksin seperti pengangkut penghabisan auksin PIN1/3/4/7 di Arabidopsis thaliana [52, 53]. Selain itu, homeostasis auksin rusak pada mutan gen IAA-alanine Resistant 4 (IAR4) yang mengkodekan subunit alfa mitokondria piruvat dehidrogenase E1 menunjukkan peran integralnya dalam mempertahankan homeostasis auksin [54].

Alternatif oksidase (AOX) adalah oksidase terminal yang merupakan bagian dari rantai transpor elektron mitokondria tanaman dan bertindak untuk memisahkan respirasi dengan melewati kompleks pemompa proton III dan IV, sehingga mengurangi ledakan berlebihan spesies oksigen reaktif (ROS). Aktivitas ini sangat dominan di bawah kondisi lingkungan yang penuh tekanan seperti kekeringan, suhu rendah dan infeksi bakteri oleh pseudomonas jarum suntik di mana penelitian telah menunjukkan peningkatan yang luar biasa dalam transkrip AOX dan/atau protein [55]. Ini menunjukkan bahwa beragam jalur dapat memicu AOX dan karenanya dianggap sebagai penanda untuk pensinyalan retrograde mitokondria. Sementara berbagai hormon tanaman dapat memicu/menginduksi AOX seperti SA dan ET [45, 56] lainnya seperti auksin bersifat antagonis terhadap induksi AOX [52]. Aplikasi Auksin (4,5 M NAA) terbukti menghambat induksi promotor-reporter yang dimediasi Antimisin A Oksidase1a alternatif (AOX1a::LUC) di Arabidopsis [52]. Hubungan antagonis auksin dan pensinyalan retrograde mitokondria memainkan peran sentral dalam menyeimbangkan respons pertumbuhan dan stres. Mitokondria bersama dengan kloroplas telah dihipotesiskan sebagai tempat asli sintesis melatonin. Hal ini berkaitan dengan teori endosimbiosis dimana organel tersebut dianggap sebagai keturunan bakteri endosimbiosis yang menghasilkan melatonin [57]. Baru-baru ini, sintesis melatonin di mitokondria, serta kloroplas telah dilaporkan dalam daun apel Malus zumi dan Arabidopsis. Selain itu, gen biosintetik melatonin apel Serotonin N-asetiltransferase SNAT dan Acetylserotonin O-methyltransferase ASMT ditemukan terlokalisasi pada mitokondria dan kloroplas, masing-masing pada apel dan Arabidopsis [41, 58]. Namun, ada kurangnya pemahaman tentang bagaimana fungsi melatonin dengan pensinyalan retrograde mitokondria dan hubungannya dengan auksin. Dengan demikian, oksidase alternatif merupakan penanda yang ideal untuk menguji interaksi antara auksin dan melatonin.

Dalam penelitian ini, efek melatonin dibandingkan langsung dengan perawatan auksin. Dua garis Arabidopsis transgenik berbeda yang membawa konstruksi promotor-reporter yang dapat diinduksi yang responsif terhadap auksin digunakan untuk membandingkan respons tanaman terhadap melatonin versus auksin. Pengulangan langsung 5 (protein fluoresen hijau) DR5::GFP sebagai penanda respon auksin dan Oksidase1a alternatif (luciferase) AOX1a::LUC sebagai penanda untuk pensinyalan retrograde mitokondria digunakan [52, 59]. Selanjutnya, crosstalk molekuler potensial antara melatonin dan auksin diselidiki menggunakan analisis transkriptom global daun roset Arabidopsis dari bibit yang akarnya diperlakukan dengan melatonin atau auksin.


Pengantar

Pada bakteri, regulasi gen secara tradisional dianggap sebagai mekanisme adaptif atau homeostatik yang memungkinkan sel untuk merespons perubahan kondisi metabolisme atau tekanan lingkungan (misalnya, Wall dkk, 2004 Seshasayee dkk, 2009). Alasan yang mendasari adalah bahwa protein 'harus' dibuat hanya bila diperlukan untuk menghemat sumber daya seluler atau karena aktivitas protein merugikan dalam kondisi lain. Contoh klasik adalah induksi di Escherichia coli dari lac operon sebagai respons terhadap laktosa: lac operon diperlukan untuk pertumbuhan pada laktosa, dan lac operon sangat lemah diekspresikan tanpa adanya laktosa. jika lac operon secara artifisial diinduksi tanpa adanya laktosa dengan menambahkan analog laktosa yang tidak dapat dimetabolisme ke media, kemudian ekspresi lac operon mengurangi tingkat pertumbuhan. Pengurangan laju pertumbuhan ini mencerminkan biaya produksi protein yang tidak berguna daripada protein yang berguna ( Stoebel dkk, 2008 ) dan juga aktivitas yang merugikan dari LacY permease dalam beberapa kondisi (Eames dan Kortemme, 2012). Pengurangan relatif dalam E. coliLaju pertumbuhan karena memproduksi protein yang tidak berguna tampaknya bervariasi di seluruh kondisi pertumbuhan, tetapi di bawah kondisi biaya rendah, biayanya kira-kira sebagian kecil dari total protein yang tidak berguna (Shachrai dkk, 2010 ).

Meskipun banyak contoh spesifik regulasi gen tampak adaptif dalam kondisi laboratorium, tidak jelas apakah regulasi mayoritas gen adaptif. Studi luas genom pada bakteri dan ragi telah menemukan sedikit korelasi antara perubahan ekspresi dan pentingnya gen untuk kebugaran (Birrell dkk, 2002 Giaever dkk, 2002 Smith dkk, 2006 Deutschbauer dkk, 2011 ). Dengan kata lain, sebagian besar gen tidak diturunkan regulasinya saat tidak dibutuhkan untuk pertumbuhan, dan sebaliknya, sebagian besar gen yang diregulasi tampaknya tidak penting untuk kebugaran. Hal ini mengejutkan karena di bawah model cost-benefit dari ekspresi optimal (Dekel dan Alon, 2005), tingkat ekspresi optimal dari sebuah gen akan jauh lebih rendah jika ada sedikit atau tidak ada manfaat (atau keuntungan kebugaran) daripada jika ada banyak keuntungan. keuntungan. Jadi, ada teka-teki mengapa regulasi adaptif tampaknya tidak lebih tersebar luas pada bakteri.

Ada beberapa usulan mengapa gen mungkin diekspresikan ketika mereka tidak diperlukan untuk kebugaran atau mengapa mereka mungkin tidak diinduksi ketika dibutuhkan. Lebih tepatnya, teori-teori ini mencoba menjelaskan mengapa bakteri dengan regulasi yang tampaknya non-adaptif belum dikalahkan oleh bakteri lain dengan regulasi yang lebih optimal. Pertama, beberapa gen mungkin diekspresikan dalam 'mode siaga' karena mereka akan membantu bakteri bertahan hidup jika kondisi berubah (Fischer dan Sauer, 2005). Kontrol siaga dapat dianggap sebagai cara untuk mengurangi penundaan yang melekat pada kontrol adaptif. Jika suatu gen berada di bawah kendali adaptif dan tidak diekspresikan sama sekali ketika tidak dibutuhkan, maka setelah kondisi berubah dan menjadi dibutuhkan, ada penundaan sampai cukup protein diproduksi untuk beradaptasi dengan kondisi baru ini. Selama penundaan ini, sel mungkin berhenti tumbuh atau bahkan mati. Dengan demikian, ketidakpastian tentang waktu dekat menyiratkan beberapa kemungkinan manfaat dari mengekspresikan gen yang saat ini tidak diperlukan. Jika ada peluang yang signifikan untuk memperoleh manfaat di masa depan, maka rata-rata manfaat di masa depan akan melebihi biaya (tertentu) untuk mengekspresikan protein yang tidak dibutuhkan, sehingga tingkat ekspresi optimal akan berada di atas nol meskipun gen saat ini tidak memberikan manfaat. Sebaliknya, jika gen saat ini dibutuhkan tetapi kondisi mungkin berubah dalam waktu dekat, ini mengurangi manfaat yang diharapkan dari ekspresi tinggi, dan karenanya mengurangi tingkat ekspresi optimal. Dengan kata lain, kontrol siaga yang optimal harus meredam rentang ekspresi dinamis tanpa mengubah polanya. (Untuk contoh rinci, lihat Gambar Tambahan 1). Dengan demikian, kontrol siaga yang optimal tidak dapat menjelaskan mengapa ada begitu sedikit korelasi antara ekspresi relatif (yaitu, ketika gen diregulasi) dan kebugaran mutan (yaitu, ketika dibutuhkan untuk pertumbuhan optimal).

Teori kedua dan terkait adalah bahwa protein yang hanya dibutuhkan dalam jumlah kecil mungkin diekspresikan secara konstitutif karena biaya kontrol adaptif, seperti biaya pembuatan faktor transkripsi, mungkin melebihi manfaat membuat lebih sedikit protein ketika tidak diperlukan. (Wessely dkk, 2011 ). Biaya regulasi tampaknya kecil-misalnya, represor LacI hadir hanya 20-50 eksemplar per sel ( Milo dkk, 2010 )—jadi teori ini seharusnya hanya berlaku untuk gen yang diekspresikan dengan lemah yang memiliki biaya rendah untuk ekspresi yang tidak perlu.

Teori ketiga yang terkait dengan perubahan kondisi adalah bahwa mikroorganisme mungkin menggunakan satu sinyal lingkungan untuk 'mengantisipasi' yang lain (Tagkopoulos dkk, 2008 Mitchell dkk, 2009). Di sini, perubahan lingkungan (agak) dapat diprediksi, daripada sepenuhnya acak. Misalnya, untuk bakteri usus seperti E. coli, kenaikan suhu mungkin menunjukkan bahwa itu telah tertelan dan akan segera mencapai lingkungan anaerobik (Tagkopoulos dkk, 2008 ), sehingga gen untuk respirasi anaerob dapat diinduksi meskipun tidak segera berguna. Tidak jelas apakah kontrol ekspresi antisipatif tersebar luas pada bakteri.

Keempat, gen yang ditransfer secara horizontal, yang umum pada bakteri, mungkin kekurangan regulasi karena waktu yang tidak cukup untuk mengembangkan regulasi yang sesuai pada inang mereka saat ini (Lercher dan Pal, 2008). Namun, hanya gen yang paling baru ditransfer tampaknya kurang regulasi (Lercher dan Pal, 2008). Juga, regulasi dapat berkembang dengan cepat (Stone and Wray, 2001 Berg dkk, 2004 ), regulasi dapat dilestarikan di seluruh peristiwa transfer ( Price dkk, 2008 ), dan banyak gen yang ditransfer secara horizontal berada di bawah kendali kompleks oleh beberapa faktor transkripsi ( Price dkk, 2008 ). Dengan demikian, kami ragu bahwa transfer gen horizontal dapat menjelaskan mengapa ada sedikit korelasi antara ekspresi relatif (yaitu, regulasi) dan seluruh genom kebugaran mutan.

Kelima, regulasi beberapa gen mungkin suboptimal atau maladaptif karena pola ekspresi gen tersebut tidak dalam seleksi yang kuat. Lebih tepatnya, jika regulasi yang diubah meningkatkan pertumbuhan relatif kurang dari 1/ne per generasi, dimana ne adalah ukuran efektif populasi bakteri dan pengaruhnya terhadap pertumbuhan dirata-ratakan di seluruh lingkungan alami, maka regulasi yang diubah ini tidak mungkin mengambil alih populasi. Evolusi netral selektif juga dapat menjelaskan beberapa kompleksitas regulasi gen (Lynch, 2007). Namun, kedua situs peraturan (Mccue dkk, 2002 Rajewsky dkk, 2002 ) dan koekspresi gen ( Price dkk, 2007 ) biasanya dilestarikan antara bakteri yang terkait erat, yang menyiratkan bahwa regulasi sebagian besar gen berada di bawah beberapa seleksi. Selanjutnya, di E. coli, lebih dari setengah dari semua gen hadir di atas 0,1 mRNA per sel dalam satu kondisi, yang sesuai dengan 30-60 protein per sel ( Lu dkk, 2007 ) atau lebih dari 1 dari 100.000 molekul protein di dalam sel ( Milo dkk, 2010 ). Karena biaya kebugaran ekspresi gen yang tidak perlu mungkin setidaknya sama besar dengan proporsi protein totalnya, ini menyiratkan bahwa biaya kebugaran ekspresi yang tidak perlu dari gen tipikal setidaknya 10 5 per generasi. Ini hampir sama dengan perkiraan biaya kesesuaian mutasi dalam penggunaan kodon yang sedang diseleksi (Bulmer, 1991). Dengan demikian, ekspresi protein tipikal yang tidak perlu harus diseleksi.

Akhirnya, kami mengusulkan bahwa regulasi non-adaptif tersebar luas pada bakteri, setidaknya dalam pengaturan laboratorium, karena dua faktor utama. Pertama, genom bakteri mengkodekan jauh lebih banyak operon daripada regulator. Pada bakteri tipikal, hanya 4,2% protein yang diprediksi menjadi faktor transkripsi ( Charoensawan dkk, 2010 ). Dengan sedikit regulator, sebagian besar gen mungkin diatur oleh faktor-faktor yang tidak berhubungan langsung dengan fungsinya. Kami menyebutnya mode regulasi kontrol tidak langsung. Sebagai contoh, gen bakteri sering diatur oleh faktor transkripsi 'global' yang mengatur gen yang beragam dan terkadang tidak berhubungan secara fungsional (Martinez-Antonio dan Collado-Vides, 2003). Kedua, sistem regulasi bakteri telah berkembang dalam kondisi yang sangat berbeda dari yang diuji di laboratorium. Jika kegunaan aktivitas gen berkorelasi dengan sinyal yang tidak terkait secara fungsional, maka regulasi oleh sinyal itu akan dipilih di alam liar, tetapi korelasi ini mungkin tidak akan dipertahankan dalam kondisi buatan. Jadi kami tidak mengharapkan kontrol tidak langsung yang berkembang di alam liar menjadi adaptif di bawah kondisi buatan. Sebaliknya, jika ada hubungan regulasi langsung antara sinyal lingkungan dan respons fisiologis, seperti lac operon, maka sistem regulasi dapat bekerja dengan baik di luar kondisi yang berkembang di bawahnya.

Untuk menguji berbagai teori regulasi gen bakteri ini, kami mengumpulkan data kebugaran mutan luas genom dan data ekspresi gen dari bakteri pereduksi logam. Shewanella oneidensis MR-1 di 15 kondisi pencocokan. Kami juga memeriksa ringkasan besar data kebugaran dan ekspresi (tak tertandingi) untuk bakteri ini. Kami menemukan bahwa 24% gen merusak kebugaran di beberapa kondisi laboratorium, yang menunjukkan bahwa regulasi banyak gen bersifat maladaptif di laboratorium. Kami mengkonfirmasi bahwa korelasi antara ekspresi relatif dan kebugaran mutan lemah, seperti dalam penelitian kami sebelumnya dengan hanya empat kondisi ( Deutschbauer dkk, 2011 ). Kami mengesampingkan beberapa penjelasan teknis untuk korelasi yang lemah, seperti efek fase pertumbuhan pada ekspresi, variasi halus dalam kondisi eksperimental, atau redundansi genetik karena paralog, dan kami menemukan sedikit bukti kontrol antisipatif. Sebagai bukti kontrol tidak langsung, kami menunjukkan bahwa banyak gen diekspresikan secara konstitutif alih-alih dikendalikan oleh faktor transkripsi, atau diatur oleh laju pertumbuhan. Lebih lanjut, untuk banyak gen, regulasi ini tampaknya suboptimal dan tidak dapat dijelaskan dengan kontrol siaga. Kami juga menunjukkan bahwa gen dengan fungsi yang terkait erat dapat memiliki pola ekspresi yang agak berbeda, yang menunjukkan bahwa beberapa di antaranya tidak berada di bawah kendali langsung.

Untuk menguji keumuman temuan kami, kami memeriksa ekspresi dan kesesuaian mutan gen biosintetik pada empat bakteri yang berbeda—S. oneidensis MR-1, E. coli K-12, bakteri penghasil etanol Zymomonas mobilis ZM4, dan bakteri pereduksi sulfat Desulfovibrio alaskensis G20. Di dalam E. coli, gen biosintetik yang diperlukan untuk kebugaran di media minimal tetapi tidak di media kaya hampir semuanya diturunkan regulasinya di media minimal, tetapi di tiga bakteri lainnya, hal ini sering tidak terjadi. Kami juga membandingkan data kebugaran dan ekspresi untuk Z. mobilis ZM4 di 18 kondisi yang cocok, dan menemukan sedikit korelasi antara ekspresi relatif dan kebugaran mutan di Z. mobilis ZM4. Kami menyimpulkan bahwa regulasi suboptimal tersebar luas pada bakteri, setidaknya dalam kondisi laboratorium.


LOKALISASI OSKAR mRNA DI AWAL DROSOPHILA EMBRIO

Selama Drosophila oogenesis, lokalisasi mRNA menyajikan langkah kunci awal untuk pembentukan sumbu tubuh dan pola embrio. Beberapa mRNA yang berasal dari ibu, termasuk bikoid, gurken dan osk, diangkut dari sel perawat ke oosit dan dilokalisasi ke posisi yang berbeda di dalam oosit. Setelah pembuahan, produk protein yang diterjemahkan secara lokal memberikan informasi posisi dan membentuk jaringan regulasi transkripsi yang dikontrol ketat untuk segmentasi embrio [61]. Lokalisasi mRNP yang mengandung bikoid atau osk telah dipelajari dengan sangat rinci [11, 62] dan melibatkan protein motorik yang bergantung pada mikrotubulus seperti kinesin dan dynein [11]. Terutama dalam hal osk, proses lokalisasinya dapat disusun menjadi beberapa fase, termasuk ekspor mRNA dari nukleus, transportasi yang bergantung pada dynein osk dari sel perawat ke dalam oosit, dan perdagangan yang bergantung pada kinesin ke kutub posterior oosit. Sejumlah protein pengikat RNA telah dijelaskan yang bertindak secara trans untuk memfasilitasi transportasi dari sel perawat ke dalam dan di dalam oosit [11]. Beberapa dari mereka juga berfungsi sebagai penekan translasi selama proses transportasi.

Sepanjang hidupnya dari sintesis dalam inti sel perawat hingga degradasi di kutub posterior oosit, osk transkrip dikaitkan dengan koleksi dinamis protein. Faktor-faktor ini mengatur sintesis, pemrosesan, ekspor, kontrol translasi, lokalisasi, dan degradasi osk mRNA. Faktor trans-acting yang lebih relevan secara fungsional diketahui karena osk RNA daripada transkrip lokal lainnya.

Selama penyambungan pada eukariota multiseluler, kompleks multisubunit besar yang disebut kompleks sambungan ekson (EJC) diendapkan di hulu sambungan ekson-ekson. Sedangkan kompleks ini umumnya berfungsi sebagai ciri untuk pembusukan mRNA yang dimediasi-omong kosong dengan kodon stop prematur [63], perakitannya di hulu persimpangan ekson-ekson pertama sangat penting untuk osk lokalisasi mRNA [64]. Persyaratan ini sangat cocok dengan data genetik yang menunjukkan bahwa osk mRNA reporter yang berasal dari cDNA tidak kompeten dalam pelokalan tanpa adanya endogen osk mRNA. Selain komponen EJC, beberapa protein pengikat RNA lain yang kehilangan fungsinya mengakibatkan cacat pada osk lokalisasi, antar-jemput antara nukleus dan sitoplasma. Ini termasuk protein dari keluarga RNP nuklir heterolog (hnRNP) seperti Hrp48 dan Squid/Hrp40. Sedangkan HRp48 langsung mengikat ke osk 5’- dan 3’-UTR [65, 66], Hrp40 hanya berinteraksi dengan osk 3’-UTR di mana ia juga mengikat Hrp48 [67]. Karena banyak protein hnRNP mengikat RNA secara ko-transkripsi [68], Hrp40 dan Hrp48 kemungkinan juga berkumpul dengan osk dalam nukleus. Tidak seperti hnRNP lain yang mengikat ke osk, protein pengikat saluran polipirimidin (PTB)/hnRNP I tidak perlu mengikat mRNA targetnya di dalam nukleus. Kesimpulan ini diambil berdasarkan pengamatan bahwa varian sitoplasma eksklusif PTB dapat berasosiasi dengan osk dan secara fungsional menggantikan PTB endogen [69]. Berbeda dengan Drosophila protein, asosiasi nuklir dari Xenopus laevis Homolog PTB dengan targetnya Vg1 mRNA telah diusulkan menjadi langkah penting selama lokalisasi [70]. Drosophila PTB mengikat ke beberapa situs dalam osk 3’-UTR dan menengahi pembentukan kompleks besar yang mengandung banyak osk molekul [69]. Perakitan ini mungkin melayani setidaknya dua fungsi, mengemas beberapa molekul mRNA ke dalam mRNP untuk transportasi yang efisien dan represi osk terjemahan dengan menutupi mRNA dari mesin terjemahan.

Menariknya, formasi besar osk Partikel protein RNA juga melibatkan penekan translasi kedua, Bruno [71]. Bruno mengandung tiga RNA-Recognition Motifs (RRM), mengikat ke beberapa situs di dalam osk 3’-UTR (Elemen respons Bruno, BRE) dan tampaknya menekan terjemahan melalui dua mekanisme berbeda. Di satu sisi, Bruno merekrut Cup, penghambat inisiasi translasi cap-dependent yang mengganggu interaksi faktor inisiasi translasi eIF4E dan eIF4G [72]. Di samping itu, in vitro pengamatan menunjukkan bahwa dengan mengikat situs serumpunnya di dalam osk mRNA protein menggabungkan transkrip ke besar 50 - 80S translasi membungkam partikel [73]. Kemasan mRNA ini membuatnya tidak dapat diakses oleh aparatus translasi. Mirip dengan Bruno, Hrp48 mengikat BRE [66]. Pencitraan kehidupan osk Partikel RNP baru-baru ini mengungkapkan bahwa Hrp48 juga diperlukan untuk pembentukan partikel besar osk partikel [74]. Bukti tambahan untuk fungsi BRE dalam multimerisasi osk mRNA berasal dari pengamatan bahwa elemen BRE dapat bertindak dalam trans dan membangun kontrol translasi pada co-expressed osk mRNA mutan yang kekurangan BRE [75]. Temuan ini konsisten dengan gagasan bahwa osk Partikel RNP mengandung banyak osk Molekul RNA dengan protein pengikat RNA yang sesuai. Selain multimerisasi yang digerakkan oleh protein, data baru juga menunjukkan bahwa interaksi RNA-RNA antara individu osk molekul dapat berkontribusi pada pembentukan partikel besar ini. Sebuah wilayah batang-loop di dalam osk 3’-UTR yang tidak mencakup situs pengikatan yang diketahui untuk protein yang disebutkan di atas cukup untuk mendorong homodimerisasi dua osk pesan [76]. Together these data suggest that protein- as well as RNA-mediated formation of large particles is crucial, both for translational repression and transport of osk mRNA.

The large osk particles described above contain additional RNA binding proteins like Exuperantia (Exu) and Staufen (Stau). Exu lacks canonical RNA binding motifs but associates with osk mRNA and with many proteins involved in translational repression of osk [77]. Exu is required for proper osk mRNA localization and found in RNPs that display dynamic movements consistent with active transport. Staufen contains several double-stranded RNA binding domains (dsRBDs) and is involved in RNA localization in a number of organisms [78]. On one hand, genetic data provide evidence that it is involved in anchoring at the end of transport. On the other hand, Stau is a component of the large osk mRNPs already early on during microtubule-dependent transport [79]. Although in mammalian cells, at least a subfraction of both Staufen homologs, Stau1 and Stau2, shuttle between nucleus and cytoplasm [80], it has been demonstrated that XStau, the Xenopus homolog that participates in localization of Vg1 mRNA in oocytes, assembles with the RNA in the cytoplasm after nuclear export [70]. Demikian pula, Drosophila Stau associates with the mature osk particle in the cytoplasm, presumably after the transport of osk particles from the nurse cell to the oocyte [74]. In the oocyte, osk-containing mRNPs are localized to the posterior pole via active transport by microtubule-dependent motor proteins [74, 81]. The transport is at least in part mediated by the plus end directed motor kinesin-1. Interestingly, tracking of osk mRNPs in living oocytes has revealed that this transport corresponds to a random walk [81] and might actually reflect directed, motor-dependent movement along a weakly polarized microtubule network [82]. Transport is followed by anchoring or local entrapment at the oocyte’s posterior pole. This entrapment depends on components of the actomyosin system [83] but also on RNA binding proteins like Staufen.

In summary, the detailed analysis of osk mRNA localization has revealed that also in multicellular organisms multiple RNA-binding proteins participate in the localization of an mRNA and that nuclear events are important to guide cytoplasmic localization of transcripts. Some of the described proteins like Stau, Hrp48, or EJC components such as Barentz might have a more direct role in mRNA transport by e.g. recruiting different motor proteins (dynein or kinesin I) at various stages of localization. The involved RNA-binding proteins can have diverse but also overlapping functions during localization, ranging from translational control to particle formation and anchoring at the target site.


Diskusi

Expression microarrays are used to analyze molecular profiles of cancer in order to better understand the biological background of the disease. Another aim is to find new molecular markers, therapeutic targets, and/or new classification approaches that will enable better treatment of patients. Our study was intended to achieve both goals. We searched for gene expression patterns that may characterize histological types of ovarian cancer and are related to its histological grade, FIGO stage, response to chemotherapy, and survival times.

From the broad spectrum of features that we analyzed in our study, only histological type of the tumor was a factor, which showed a very strong impact on the gene expression pattern. Interestingly, there was one exception: six undifferentiated tumors that were available for this analysis, showed practically no difference in gene expression pattern from serous cancers. If confirmed in other studies, this may be an indication for evaluating these two groups together in microarray analyses.

On the contrary, the differences between serous/undifferentiated, endometrioid, and clear cell cancers were statistically highly significant. Moreover, the gene expression signature selected in respect to tumor histology allowed for a very precise sample classification, with the sensitivity and specificity not achieved in any other comparisons. Also unsupervised analysis, performed using the singular value decomposition (SVD) showed that histological type of the tumor is a major source of variability in the gene expression pattern in ovarian cancer (not shown). This large difference in gene expression pattern may be not surprising when we take into account that histological differences are clearly manifested at the morphological level and are easily distinguishable by light microscopy. On the other hand, these results, indicating deep molecular divergence, may support the current knowledge that ovarian cancer has a heterogeneous histological origin (e.g., fallopian, endometrioid, or endocervical) (28�).

The histology of ovarian cancer was already analyzed in many previous microarray studies (33�), however, it has not been regarded as a confounding factor in gene expression analysis in respect to other features. Conversely, different factors have been analyzed across various histological types. This may be one of the reasons for discrepancies and low reproducibility of the findings. Thus, a practical conclusion may be drawn that when searching for the genes related to other features of ovarian cancer, the analyses should be carried out on histologically homogenous groups of samples. Alternatively, the influence of the histological type on gene expression may be controlled by multivariate approach.

Except for evaluation of histological type, no other comparison gave such a huge number of statistically significant genes. This was the reason why we decided to use less stringent criteria for gene selection (uncorrected P-value π.001 and FDR 㰐%). Analyzing gene expression patterns in tumor samples of different grades, we focused mostly on the difference between grade 3 and 4, as the usage of the latter grade was abandoned in ovarian cancer diagnostics. A study performed by members of our group showed that the recognition of grade 4 might be important from the clinical viewpoint, since patients with grade 4 ovarian cancer had worse response to taxanes than to DNA-damaging agents (23). Thus, we expected that we would find differences between grade 3 and 4 also at the molecular level. However, samples classification was poor and in pairwise comparison we found only one gene with significantly changed expression (FDR 㰐%). It was surprising, as in ANOVA we found 152 probe sets (FDR 㰐%) differentiating between three grades (G2, G3, and G4), and this difference was also significant in the global test. In our opinion, this discrepancy may suggest that although tumor grade is generally associated with significant changes in gene expression pattern, the subjectively defined grades 3 and 4 may not reflect these differences. An additional factor influencing the results of this analysis may be the small and unequal size of the groups evaluated.

The problem also occurred when analyzing gene expression profiles in relation to FIGO stages and residual tumor size. These features were significant in the ANOVA and global tests, but the number of genes with different expression found in pairwise comparisons was low and the quality of classification was poor. The difference between FIGO II and FIGO III/IV was statistically significant, however, this result may be an artifact related to uneven samples distribution in the groups being compared.

As far as the residual tumor size is concerned, poor classification of tumor samples may be due to the fact that debulking status did not solely depend on the biological tumor profile, but also on the changing attitude to optimal debulking over several years during which our material was collected. Other factors influencing the results might be technical issues, such as skills of surgeons and the equipment available. Our samples came from mid 1990s (patients treated with platinum𠄼yclophosphamide, PC), and from early 2000s (patients treated with taxane–platinum, TP). The group treated with PC had been generally less radically operated than the group treated with TP (23). Thus, this may be the major reason why it was hard to obtain reliable results in gene expression analysis in respect to this parameter. In addition, the arbitrarily outlined classes (R0𠄲) may not reflect intrinsic biological differences.

The most important, from the clinical point of view, is the search for molecular markers suitable for prediction of tumor response to the therapy. In the presented analysis, we were not able to find a gene signature that would allow for good classification of samples sensitive and resistant to chemotherapy. It seems that chemosensitivity/resistance, in contrast to, e.g., histological type, is a feature that may depend on subtle molecular changes, possibly in many alternative pathways. Such differences may be hard to detect by the methods applied. It has been shown recently, by comparing the data from Cancer Cell Line Encyclopedia and Cancer Genome Project, that discrepancies in drug sensitivity testing are common even when performed on cell lines (41). Another reason for the failure of this analysis may be again the fact that we analyzed two cohorts of patients treated with different CHT regimens. Probably, different molecular pathways were engaged in tumor response to the two regimens and this could affect the results of our analyses. It was not advisable, however, to divide patients into two groups according to the CHT regimen, because this would result in biased results due to small classes of samples.

We also searched for genes that may be related to patients’ prognosis, i.e., DFS and OS. Only 4 out of 15 genes, selected in microarray analysis as associated with OS, were positively validated by qRT-PCR, and none were validated for DFS. Our further attempts to validate these four genes in the independent set of samples were unsuccessful. There may be several reasons for this result. First, all genes selected in respect to survival time were of low statistical significance in the microarray analysis. Second, contrarily to the initial group, the independent set of patients used for validation was uniformly treated with TP regimen only. Therefore, it might show results different from those obtained in the initial, mixed group. Indeed, we observed that the initial group of patients had different OS statistics than the test group (Table 6).

Table 6. Characteristics of the two groups of patients according to OS statistics (days).

In general, the results of qRT-PCR validation were surprising. Several genes that were selected as related to one feature appeared to correlate with another factor(s). In our opinion, this observation confirms that many clinical and biological features of the tumor are difficult to define and that arbitrarily assigned groups of samples used in gene expression analyses not always reflect biologically significant differences.

Our attempts to validate selected genes were rather unsuccessful. It should be noted, however, that we performed an external validation on the independent group of tumor samples, while many other studies that claim finding potential biomarkers, were confined just to the internal, technical validation [reviewed, e.g., in Ref. (2, 42)].

One of the most interesting genes selected in our study is CLASP1 (cytoplasmic linker associated protein 1). It was associated with both OS and DFS in the microarray analysis, although validation results were mixed. In the initial group of samples, it was validated in respect to OS and showed significant association with response to chemotherapy and with the presence of hereditary BRCA1 mutation. Surprisingly, when we tried to validate CLASP1 in the independent set of samples it was statistically insignificant in respect to OS, but it proved to be associated again with DFS. CLASP1 is thought to play a role in the regulation of microtubule dynamics in interphase and during cell division (43, 44). Thus, the protein may be important in tumor cell response to taxanes. Possibly, it may also be somehow engaged in differential response to CHT in patients with hereditary, BRCA1 mutation-linked ovarian cancer. Regardless of the inconsistent results of validation, we think that CLASP1 may be worth further investigation as a potential prognostic and predictive marker.


Why narcoleptics get fat

People with narcolepsy are not only excessively sleepy, but they are also prone to gaining weight. In fact, narcoleptic patients will often pack on pounds even as they eat considerably less than your average person.

Now researchers reporting in the October issue of Metabolisme Sel, a Cell Press publication, appear to have an answer as to why. It seems a deficiency of the neuropeptide hormone orexin, an ingredient that encourages hunger and wakefulness, may leave them with a lack of energy-burning brown fat.

The findings may lead to orexin-based weight loss therapies for those with narcolepsy and for the rest of us, too, according to the researchers.

Orexins are rather unique in that they allow one to eat more and lose more at the same time, explained Devanjan Sikder of the Sanford-Burnham Research Institute. "It is a couch potato's dream."

Fat comes in one of two types: white or brown. White fat stores calories while brown fat burns them, generating heat in the process. There had been hints that orexins might influence body temperature, but it wasn't clear exactly how.

The new evidence in mice shows that orexins are critical for the formation of mature brown fat from its precursors. With too little orexin, animals' brown fat activity drops along with their energy expenditure. Likewise, mice injected with orexin show a substantial loss of fat.

The findings bolster the emerging concept that those with less active brown fat may be destined from birth, or even before, to be fatter. "They are somehow predisposed," Sikder said.

There are already ways of stimulating brown fat's production, but it isn't easy to do. For instance, more brown fat is produced when you spend a lot of time in the cold. The new findings suggest that orexin therapies might be useful for increasing brown fat and literally melting extra calories away.

"One caveat is that orexin might increase arousal," the researchers wrote, "although this is expected only under sleep deprived conditions."

Sikder says it will now also be worthwhile to examine orexin-deficient people with narcolepsy to find out whether their brown fat activity is indeed compromised.


Latar belakang

Transcript quantification has been a key component of RNA-seq analysis pipelines, and the most popular approaches (such as RSEM [1], kallisto [2], and Salmon [3]) estimate the abundance of individual transcripts by inference over a generative model from transcripts to observed reads. To generate a read in the model, a transcript is first sampled proportional to its relative abundance multiplied by length, then a fragment is sampled as a subsequence of the transcript according to bias correction models. The quantification algorithm thus takes the reference transcriptome and the set of reads as input and outputs a most probable set of relative abundances under the model. We focus on a generalization of the problem, called graph quantification, that allows for better handling of uncertainty in the reference transcriptome.

The concept of graph quantification was first proposed by Bernard et al. [4], which introduced a method called FlipFlop. Instead of a set of linear transcripts, a splice graph is given and every transcript compatible with the splice graph (a path from transcript start to termination in the splice graph) is assumed to be able to express reads. The goal is to infer the abundance of edges of the splice graph (or its extensions) under flow balance constraints. Transcript abundances are obtained by flow decomposition under this setup. FlipFlop infers network flow on its extension of splice graphs, called fragment graphs, and uses the model to further assemble transcripts. However, the proposed fragment graph model only retains its theoretical guarantee when the lengths of single-end reads or paired-end fragments are fixed. In this work, we propose an alternative approach to graph quantification that correctly addresses the variable-length reads and corrects for sequencing biases. Our method is based on flow inference on a different extension of the splice graph.

Modeling RNA-seq reads directly by network flow on splice graphs (or variants) is advantageous when the set of transcript sequences is uncertain or incomplete. It is unlikely that the set of reference transcripts is correct and complete for all genes in all tissues, and therefore, many transcriptome assembly methods have been developed for reconstructing a set of expressed transcripts from RNA-seq data [5,6,7,8], including FlipFlop [4]. Recent long-read sequencing confirms the expression of unannotated transcripts [9], but it also shows that the individual exons and splice junctions are relatively accurate. With incomplete reference transcripts but correct splice graphs, it is more appropriate to model RNA-seq reads directly by splice graph network flows compared to modeling using the abundances of an incomplete set of transcripts.

The network flow of graph quantification may be incorporated into other transcriptome assembly methods in addition to FlipFlop. StringTie [6] iteratively finds the heaviest path of a flow network constructed from splice graphs. A theoretical work by Shao et al. [10] studies the minimum path decomposition of splice graphs when the edge abundances satisfy flow balance constraints. Better network flow estimation on splice graphs inspires improvement of transcriptome assembly methods.

The splice graph flow itself is biologically meaningful as it indicates the relative usage of splice junctions. Estimates of these quantities can be used to study alternative splicing patterns under the incomplete reference assumption. PSG [11] pioneered this line of work but with a different abundance representation. It models splice junction usage by fixed-order Markov transition probabilities from one exon (or fixed number of predecessor exons) to its successor exon in the splice graph. It develops a statistical model to detect the difference in transition probability between two groups of samples. However, a fixed-order Markov chain has limitations: a small order cannot capture long-range phasing relationships, and a large order requires inferring a number of transition probabilities that are likely to lack sufficient read support. Markov models set the abundance of a transcript to the product of transition probabilities of its splice junctions, which implicitly places a strong constraint on the resulting transcriptome. Many other previous studies of splice junction usage depend on a list of reference transcripts and compute the widely used metric Percentage Spliced In (PSI) [12,13,14]. Under an incomplete reference assumption, the estimated network flow is a potential candidate to compute PSI and study alternative splicing usage.

A key challenge of graph quantification, especially for paired-end reads, is to incorporate the co-existence relationship among exons in transcripts. When a read spans multiple exons, the exons must co-exist in the transcript that generates this read. Such a co-existence relationship is called phasing, and the corresponding read is said to contain phasing information. For these reads, the flows of the spanned splice edges may be different from each other, and in this case, the probability of the read cannot be uniquely inferred from the original splice graph flow. FlipFlop solves this problem by expanding the splice graph into a fragment graph, assuming all reads are fixed-length. In a fragment graph, every vertex represents a phasing path, two vertices are connected if the phasing paths represented by the vertices differ by one exon, and every transcript on the splice graph maps to a path on the fragment graph. The mapped path in the fragment graph contains every possible phasing path from a read in the transcript, in ascending order of genomic location. However, it is not possible to construct this expansion of splice graphs when the reads or fragments are of variable lengths. There is no longer a clear total order over all phasing paths possible from a given transcript, and it is unclear how to order the phasing paths in a fragment graph. We detail the FlipFlop model in Additional file 1: Section 1.1.

To incorporate the phasing information from variable-length reads or fragments, we develop a dynamic unrolling technique over the splice graph with an Aho-Corasick automaton. The resulting graph is called a prefix graph. We prove that optimizing a network flow on the prefix graph is equivalent to optimizing abundances of reference transcripts using the state-of-the-art transcript expression quantification formulation when all full paths of splice graphs are provided as reference transcripts, assuming modeled biases of generating a fragment are determined by the fragment sequence itself regardless of which transcript it is from. In other words, quantification on prefix graphs generates exact quantification for the whole set of full splice graph paths. The proof is done by reparameterizing the sequencing read generation model from transcript abundances to edge abundances in the prefix graph. We also propose a specialized EM algorithm to efficiently infer a prefix graph flow that solves the graph quantification problem.

As a case study, we apply our method to paired-end RNA-seq data of bipolar disease samples and estimate flows for neurogenesis-related genes, which are known to have complex alternative splicing patterns and unannotated isoforms. We use this case study to demonstrate the applicability of our method to handle variable-length fragments. Additionally, the network flow leads to different PSI compared to the one computed with reference transcripts, suggesting reference completeness should be considered in alternative splicing analysis.


Abbott R, Albach D, Ansell S, Arntzen JW, Baird SJE, Bierne N, Boughman J, Brelsford A, Buerkle CA, Buggs R, Butlin RK, Dieckmann U, Eroukhmanoff F, Grill A, Cahan SH, Hermansen JS, Hewitt G, Hudson AG, Jiggins C, Jones J, Keller B, Marczewski T, Mallet J, Martinez-Rodriguez P, Möst M, Mullen S, Nichols R, Nolte AW, Parisod C, Pfennig K, Rice AM, Ritchie MG, Seifert B, Smadja CM, Stelkens R, Szymura JM, Väinölä R, Wolf JBW, Zinner D (2013) Hybridization and speciation. J Evol Biol 26(2):229–246

Ainouche ML, Jenczewski E (2010) Focus on polyploidy. New Phytol 186(1):1–4

Barkman TJ, McNeal JR, Lim SH, Coat G, Croom HB, Young ND, dePamphilis CW (2007) Mitochondrial DNA suggests at least 11 origins of parasitism in angiosperms and reveals genomic chimerism in parasitic plants. BMC Evol Biol 7:248

Bass C, Zimmer CT, Riveron JM, Wilding CS, Wondji CS, Kaussmann M, Field LM, Williamson MS, Nauen R (2013) Gene amplification and microsatellite polymorphism underlie a recent insect host shift. Proc Natl Acad Sci USA 110(48):19460–19465

Bates BR, Templeton A, Achter PJ, Harris TM, Condit CM (2003) What does “a gene for heart disease” mean? A focus group study of public understandings of genetic risk factors. Am J Med Genet Part A 119(2):156–161

Baxendale S, Abdulla S, Elgar G, Buck D, Berks M, Micklem G, Durbin R, Bates G, Brenner S, Beck S (1995) Comparative sequence analysis of the human and pufferfish Huntington’s disease genes. Nature Genet 10(1):67–76

Benzer S (1957) The elementary units of heredity. In: McElroy WD, Glass B (eds) The chemical basis of heredity. Johns Hopkins University Press, Baltimore, pp 70–93

Bergstrom CT, Rosvall M (2011) The transmission sense of information. Biol Philos 26(2):159–176

Bodmer W, Bonilla C (2008) Common and rare variants in multifactorial susceptibility to common diseases. Nature Genet 40(6):695–701

Bromham L (2000) Conservation and mutability in molecular evolution. Trends Ecol Evol 15:355

Bromham L (2008) Reading the story in DNA: a beginner’s guide to molecular evolution. Pers Universitas Oxford, Oxford

Brunetti CR, Selegue JE, Monteiro A, French V, Brakefield PM, Carroll SB (2001) The generation and diversification of butterfly eyespot color patterns. Curr Biol 11:1578–1585

Cardon LR, Abecasis GR (2003) Using haplotype blocks to map human complex trait loci. Trend Genet 19(3):135–140

Carroll RC (2000) Towards a new evolutionary synthesis. Trends Ecol Evol 15:27–32

Crick FHC (1970) Central dogma of molecular biology. Nature 227:561–563

Cussens J, Bartlett M, Jones EM, Sheehan NA (2013) Maximum likelihood pedigree reconstruction using integer linear programming. Genet Epidemiol 37(1):69–83

Darwin C (1859) The origin of species by means of natural selection: or the preservation of favoured races in the struggle for life. John Murray, London

Demir E, Dickson BJ (2005) Fruitless splicing specifies male courtship behavior in Drosophila. Cell 121(5):785–794

Doolittle WF (2013) Is junk DNA bunk? a critique of ENCODE. Proc Natl Acad Sci USA 110(14):5294–5300

Eddy SR (2013) The ENCODE project: missteps overshadowing a success. Curr Biol 23(7):R259–R261

Friedman JE (2011) Anticipation in hereditary disease: the history of a biomedical concept. Hum Genet 130(6):705–714

Godfrey-Smith P (2000) On the theoretical role of “genetic coding”. Philos Sci 67:26–44

Goldschmidt RB (1946) Position effect and the theory of the corpuscular gene. Cell Mol Life Sci 2(7):250–256

Graur D, Zheng Y, Price N, Azevedo RBR, Zufall RA, Elhaik E (2013) On the immortality of television sets: “Function” in the human genome according to the evolution-free gospel of ENCODE. Genome Biol Evol 5(3):578–590

Grossniklaus U, Kelly WG, Ferguson-Smith AC, Pembrey M, Lindquist S (2013) Transgenerational epigenetic inheritance: how important is it? Nature Rev Genet 14(3):228–235

Holmes FL (2006) Reconceiving the gene: Seymour Benzer’s adventures in phage genetics. Yale University Press, New Haven

Jasperson KW, Tuohy TM, Neklason DW, Burt RW (2010) Hereditary and familial colon cancer. Gastroenterology 138(6):2044–2058

Johannsen W (1911) The genotype conception of heredity. Am Nat 45(531):129–159

Kunte K, Zhang W, Tenger-Trolander A, Palmer D, Martin A, Reed R, Mullen S, Kronforst M (2014) Doublesex is a mimicry supergene. Nature 507(7491):229–232

Lemos B, Landry CR, Fontanillas P, Renn SCP, Kulathinal R, Brown KM, Hartl DL (2008) Evolution of genomic expression. In: Pagel MD, Pomiankowski A (eds) Evolutionary genomics and proteomics. Sinauer Associates, Sunderland

Lynch M (2007) The origins of genome architecture. Sinauer Associates, Sunderland

Mallet J (2008) Mayr’s view of Darwin: was Darwin wrong about speciation. Biol J Linn Soc 95:3–16

Mallet J (2010) Why was Darwin’s view of species rejected by twentieth century biologists? Biol Philos 25(4):497–527

Maynard Smith J (1958) The theory of evolution. Penguin, London

McClintock B (1983) The significance of responses of the genome to challenge. In: Federoff N, Botstein D (eds) Nobel prize lecture: reprinted in the dynamic genome: Barbara McClintock’s ideas in the century of genetics. 1992. Cold Spring Laboratory Press, New York

Nekrutenko A, Wadhawan S, Goetting-Minesky P, Makova KD (2005) Oscillating evolution of a mammalian locus with overlapping reading frames: an XLas/ALEX relay. PLoS Genet 1(2):e18

Nickrent D, Blarer A, Qiu Y-L, Vidal-Russell R, Anderson F (2004) Phylogenetic inference in Rafflesiales: the influence of rate heterogeneity and horizontal gene transfer. BMC Evol Biol 4:1471–2148

Parkinson CN, Osborn RC (1957) Parkinson’s law, and other studies in administration. Houghton Mifflin, Boston

Pickrell JK, Pai AA, Gilad Y, Pritchard JK (2010) Noisy splicing drives mRNA isoform diversity in human cells. PLoS Genet 6(12):e1001236

Pigliucci M (2007) Do we need an extended evolutionary synthesis? Evolution 62:2743–2749

Ridley R, Frith C, Crow T, Conneally P (1988) Anticipation in Huntington’s disease is inherited through the male line but may originate in the female. J Med Genet 25(9):589–595

Servedio MR, Doorn G, Kopp M, Frame AM, Nosil P (2011) Magic traits in speciation: “magic” but not rare? Trends Ecol Evol 26(8):389–397

Shea N (2011) What’s transmitted? inherited information. Biol Philos 26(2):183–189

Sorek R, Shamir R, Ast G (2004) How prevalent is functional alternative splicing in the human genome? Trends Genet 20(2):68–71

Sterelny K, Kitcher P (1988) The return of the gene. J Philos 85:339–361

Thompson M, Jiggins C (2014) Supergenes and their role in evolution. Heredity 113:1–8

Tricker PJ, López CMR, Gibbings G, Hadley P, Wilkinson MJ (2013) Transgenerational, dynamic methylation of stomata genes in response to low relative humidity. Int J Mol Sci 14(4):6674–6689

Wadhawan S, Dickins B, Nekrutenko A (2008) Wheels within wheels: clues to the evolution of the Gnas and Gnal loci. Mol Biol Evol 25(12):2745–2757

Walsh S, Liu F, Ballantyne KN, van Oven M, Lao O, Kayser M (2011) IrisPlex: a sensitive DNA tool for accurate prediction of blue and brown eye colour in the absence of ancestry information. Forensic Sci Int Genet 5(3):170–180

Weinstein LS, Liu J, Sakamoto A, Xie T, Chen M (2004) Minireview: GNAS: normal and abnormal functions. Endocrinology 145(12):5459–5464

Weismann A (1882) Studies in the theory of descent. AMS Press, New York

Wexler NS, Lorimer J, Porter J, Gomez F, Moskowitz C, Shackell E, Marder K, Penchaszadeh G, Roberts SA, Gayan J, Brocklebank D, Cherny SS, Cardon LR, Gray J, Dlouhy SR, Wiktorski S, Hodes ME, Conneally PM, Penney JB, Gusella J, Cha JH, Irizarry M, Rosas D, Hersch S, Hollingsworth Z, MacDonald M, Young AB, Andresen JM, Housman DE, De Young MM, Bonilla E, Stillings T, Negrette A, Snodgrass SR, Martinez-Jaurrieta MD, Ramos-Arroyo MA, Bickham J, Ramos JS, Marshall F, Shoulson I, Rey GJ, Feigin A, Arnheim N, Acevedo-Cruz A, Acosta L, Alvir J, Fischbeck K, Thompson LM, Young A, Dure L, O’Brien CJ, Paulsen J, Brickman A, Krch D, Peery S, Hogarth P, Higgins DS Jr, Landwehrmeyer B (2004) Venezuelan kindreds reveal that genetic and environmental factors modulate Huntington’s disease age of onset. Proc Natl Acad Sci USA 101(10):3498–3503

Wilson Sayres MA, Makova KD (2011) Genome analyses substantiate male mutation bias in many species. Bioessays 33(12):938–945

Xu S, Hu Z (2010) Mapping quantitative trait loci using distorted markers. Int Journal Plant Genomics 2009

Yandell M, Ence D (2012) A beginner’s guide to eukaryotic genome annotation. Nature Rev Genet 13(5):329–342


Can we test the hypothesis that mitochondrial health = immune health and enhanced resistance to the virus?

In terms of testing and/or looking for evidence that mitochondria could help explain some of the pathophysiology of this virus, there are several potential ways to look for this relationship, ranging from laboratory based to population studies.

Direct evidence that SARs-CoV-2 modulates mitochondrial function

This work could be carried out in vitro with cultured cells and/or isolated mitochondria prepared from control and infected individuals. In particular, using imaging to look for co-localisation in “virus factories”.

Lifestyle and mitochondrial function

It could be predicted that those populations exhibiting the lowest levels of optimal health and the highest levels of the metabolic syndrome and “diabesity”, will show the highest susceptibility. For example, it might be revealing to map the case fatality rate to the latest trends in obesity/ diabetes after the necessary confounders are taken into account [284]. In support of this, the emerging data from New York in relation to SARS-CoV-2 infection is that obesity is strongly correlated with critical illness [9]. In contrast, would those populations showing the highest fitness levels and functioning be more resistant? For instance, would measured VO2 max show an inverse relationship with morbidity?

Inherited mitochondrial dysfunction

Individuals with known mitochondrial dysfunction are well known to show abnormal susceptibility to infections [25]. Is there a link between mitochondrial haplotype and resistance? There is certainly evidence for different mtDNA haplotypes amongst different populations [285]. Although there is an emerging disparity in morbidity between Black people and other minorities in the USA, it is thought it may be more to do with socio-economic imbalances and higher rates of lifestyle induced co-morbidities [286].

Markers of mitochondrial health in the blood

Blood-derived mitochondrial markers of reduced function may correlate with disease severity before, during and after infection.

Epigenetic age and mitochondrial function

Data now show it is possible to determine someone’s epigenetic age and compare it with their chronological age. There is a close correlation with this ratio and co-existing morbidity [287]. Thus, would blood-derived epigenetic markers of metabolic age correlate with disease severity before, during and after infection?


Tonton videonya: Ekspresi Gen (Februari 2023).