Informasi

Akankah ekspresi GroEL dan GroES dalam eritrosit menjadi terapi yang berpotensi efektif untuk penyakit sel sabit?

Akankah ekspresi GroEL dan GroES dalam eritrosit menjadi terapi yang berpotensi efektif untuk penyakit sel sabit?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Akankah ekspresi GroEL dan GroES dalam eritrosit menjadi strategi terapi yang berpotensi efektif untuk penyakit sel sabit? Mengapa atau mengapa tidak?


  1. GroEL dan GroES adalah kompleks chaperonin multiprotein: Tidak mudah diekspresikan secara ektopik
  2. Eritrosit tidak memiliki nukleus: Anda tidak dapat mengekspresikan apa pun secara stabil dalam eritrosit dewasa.
  3. Jika tujuan Anda adalah melakukan ekspresi gen yang stabil (yang akan membutuhkan integrasi genom), cara yang lebih baik adalah melakukan terapi gen: kultur sel induk hematopoetik, Koreksi mutasi dengan rekombinasi homolog. Masukkan kembali sel ke dalam sumsum tulang.

Hidrofobisitas: pola molekuler terkait kerusakan kuno yang memulai respons imun bawaan

Saat ini diperkirakan bahwa respons imun diprakarsai oleh pola molekuler terkait patogen atau oleh sinyal bahaya/alarm yang diturunkan dari jaringan. Di sini, kami mengusulkan bahwa kedua kelompok molekul ini mungkin tidak saling eksklusif. Banyak dari mereka mungkin menjadi bagian dari sistem peringatan evolusioner kuno di mana bagian hidrofobik dari molekul biologis bertindak, ketika terpapar, sebagai pola molekul terkait kerusakan universal untuk memulai perbaikan, remodeling, dan kekebalan.


Penerapan Rekayasa Genetika dalam Pengembangan Bioterapi

Kemajuan dalam rekayasa genetika telah sangat mempengaruhi industri bioterapi dan membentuk banyak metode dan strategi yang digunakan saat ini baik untuk bioproduksi maupun desain terapeutik. Peningkatan hasil produksi dan kualitas telah dicapai dengan memanipulasi ekspresi gen yang terlibat dalam kelangsungan hidup sel, metabolisme, sekresi, dan glikosilasi, antara lain, dan terobosan baru-baru ini dalam uji klinis terapi gen menunjukkan harapan besar untuk masa depan. Di sini kami meninjau alat pengeditan genom saat ini yang digunakan di lapangan dan memeriksa bidang penelitian utama untuk bioproduksi inang mikroba dan mamalia serta kemajuan dalam terapi berbasis gen dan sel.

Metode

Kami merangkum metode pengeditan gen yang digunakan untuk bioproduksi berbasis prokariota dan eukariota dan memberikan survei singkat tentang pendekatan klinis untuk terapi gen.

Hasil

Sementara kemajuan awal dalam rekayasa genetika telah menciptakan sel inang prokariotik yang ideal untuk bioproduksi, munculnya nuklease yang dapat diprogram telah sangat memperluas kegunaan inang eukariotik untuk produksi glikoprotein, memungkinkan kontrol yang lebih tepat atas pabrik sel ini. Alat yang sama ini juga telah menciptakan peluang baru untuk penciptaan terapi berbasis terapi gen dengan beberapa uji klinis yang sekarang sedang berlangsung.

Kesimpulan

Rekayasa genetika telah mengubah lanskap bioterapi dan menciptakan jalan baru untuk bioproduksi dan desain terapeutik.


Abstrak—Bagaimana sel merespons stres adalah masalah utama dalam biologi kardiovaskular. Berbagai tekanan fisiologis (misalnya, panas, hemodinamik, protein mutan, dan cedera oksidatif) menghasilkan banyak perubahan dalam sel yang pada akhirnya mempengaruhi struktur dan fungsi protein. Sel-sel dari filum yang berbeda memulai serangkaian peristiwa yang melibatkan protein esensial, molekul pendamping, dalam keputusan untuk memperbaiki atau mendegradasi protein yang rusak sebagai strategi pertahanan untuk memastikan kelangsungan hidup. Bukti akumulatif menunjukkan bahwa pendamping molekuler seperti heat shock family of stress protein (HSPs) secara aktif berpartisipasi dalam serangkaian proses seluler, termasuk sitoprotektif. Fleksibilitas keluarga HSP di mana-mana lebih ditingkatkan oleh jaringan regulasi yang dapat diinduksi stres, baik pada tingkat transkripsi dan pascatranskripsi. Dalam tinjauan ini, kami membahas regulasi dan fungsi pendamping HSP dan signifikansi klinisnya dalam kondisi seperti hipertrofi jantung, cedera dinding pembuluh darah, operasi jantung, prakondisi iskemik, penuaan, dan, mungkin, mutasi pada gen yang mengkode protein kontraktil dan saluran ion. .

Stres fisiologis mulai dari iskemia miokard hingga mutasi genetik menghasilkan keadaan penyakit di mana kerusakan protein dan struktur protein yang salah lipatan merupakan penyebab umum. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Bagaimana respon sel? Beberapa jalur endogen terlibat dalam memulihkan homeostasis seluler, tetapi satu mekanisme yang ditandai dengan baik yang melibatkan pelipatan protein adalah keluarga kejutan panas dari protein stres, atau HSP. 10 11 Pemahaman tentang mekanisme yang mendasari fungsi HSP disediakan oleh 2 bukti utama: (1) pelipatan yang benar dari banyak protein dalam sel membutuhkan mesin pelipat protein, molekul pendamping, 12 13 dan (2) perbaikan pendamping HSP didenaturasi protein atau mempromosikan degradasi mereka setelah kejutan panas. 14 15

Studi genetik memberikan bukti yang meyakinkan dalam filum yang berbeda bahwa ekspresi berlebih dari protein stres adalah cara sitoprotektif yang kuat, bahkan di jantung yang utuh. 10 16 17 18 Demikian pula, studi biokimia telah menunjukkan bahwa pendamping Hsc70 meningkatkan lipatan produktif mutasi F508 umum CFTR. Ini menunjukkan peran fisiologis pendamping HSP dalam penyakit manusia. 19 20 Mekanisme divergen yang menghasilkan protein seluler abnormal atau salah lipatan menyatu menjadi jalur umum, yang mengarah ke peningkatan kadar protein stres sitoprotektif, yang menurunkan atau menetralisir efek merusak dari stres akut atau kronis.

Dalam ulasan ini, kami merangkum pengetahuan saat ini tentang regulasi dan fungsi pendamping individu (misalnya, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27, dan B-crystallin) dalam sistem kardiovaskular. Selain peran mapan mereka dalam kelangsungan hidup sel (nekrosis dan apoptosis), kami akan menekankan bukti yang muncul mengenai fungsi pendamping dalam adaptasi fisiologis selama hipertrofi jantung, prakondisi iskemik, cedera dinding pembuluh darah, stres oksidatif, dan penuaan. Meskipun saat ini kami hanya dapat berspekulasi tentang peran mereka dalam penyakit jantung tertentu, kami akan membahas banyak peluang potensial untuk menetapkan apakah pendamping HSP memberikan efek atau memainkan peran fisiologis langsung dalam riwayat penyakit akibat mutasi alat kontraktil jantung ( misalnya, kardiomiopati hipertrofik) dan saluran ion (misalnya, sindrom long-QT) pada manusia.

Definisi dan Nomenklatur

Apa itu Protein “Heat Shock” Stres?

Istilah protein "kejutan panas" adalah keliru tetapi tetap sebagai warisan penemuan kebetulan Ritossa 21 bahwa sengatan panas menghasilkan embusan kromosom sel kelenjar ludah di Drosophila. Stres panas (≈5° di atas suhu pertumbuhan normal) meningkatkan sintesis cepat dari keluarga protein multigen, awalnya disebut protein kejut panas, 22 yang merupakan hasil dari respons yang sering disebut sebagai respons sengatan panas. 10 21 Stres panas subletal sebelumnya secara sementara meningkatkan kemampuan sel untuk menahan tantangan panas berikutnya yang mematikan. Fenomena ini, atau thermotolerance, memainkan peran kunci dalam meluncurkan banyak penelitian baik dalam model eksperimental in vitro dan in vivo di mana hubungan serupa ditemukan antara respons sengatan panas dan perlindungan terhadap hipoksia atau iskemia yang disimulasikan. Memang, beragam tekanan, termasuk logam berat, analog asam amino, peradangan, dan stres oksidatif/iskemik, menginduksi ekspresi gen HSP. Akibatnya, istilah "protein stres" atau "keluarga kejut panas dari protein stres" lebih disukai, meskipun banyak dari protein ini memiliki fungsi penting selama kondisi tanpa tekanan. 13

Protein stres termasuk dalam keluarga multigen dengan ukuran molekul berkisar dari 10 hingga 150 kDa dan ditemukan di semua kompartemen seluler utama. Konvensinya adalah memberi nama protein stres dengan berbagai ukuran molekul sebagai berikut: Hsp27, Hsp70, dan Hsp90 sedangkan gen protein kejut panas ditetapkan sebagai berikut: hsp27, hsp70, dan hsp90. 23 Perbedaan antara yang diekspresikan secara konstitutif (misalnya, Hsc70 dan Hsp90β) atau anggota serumpun dari keluarga HSP dan isoform yang dapat diinduksi (Hsp70 dan Hsp90α, masing-masing) adalah sewenang-wenang, karena mengumpulkan bukti, dalam sistem in vivo yang relevan secara fisiologis, sekarang menunjukkan bahwa hubungan tersebut bergantung pada ekspresi terbatas sel dan jaringan.

Konsekuensi Seluler dari Panas dan Stres Iskemik Mirip

Seperti iskemia/reperfusi eksperimental, heat shock adalah stres yang mengganggu banyak proses metabolisme dan struktur seluler dan berujung pada kematian sel ketika ambang batas kritis terlampaui. 10 24 25 Stres panas dan iskemia menyebabkan kerusakan yang luas pada sitoskeleton, termasuk runtuhnya jaringan filamen menengah seperti benang menjadi agregat perinuklear yang besar, reorganisasi jaringan sitoplasma, relokalisasi serat yang mengandung aktin di sekitar nukleus, dan gangguan mikrotubulus dan spindel mitosis. 26 27 Pembengkakan mitokondria, hilangnya mitokondria, dan pelepasan fosforilasi oksidatif adalah fitur yang sama dari heat shock dan cedera iskemik reversibel awal. 28 29 30

Secara khas, sintesis protein umum dihambat setelah tantangan panas yang ekstrim sebagai akibat dari fosforilasi faktor inisiasi seperti eIF2α, yang mengganggu perakitan ribosom dan menonaktifkan protein pengikat tutup. 31 32 33 Sebaliknya, gen HSP diekspresikan secara efisien setelah tantangan panas, sebagian, sebagai akibat dari tidak adanya intron dalam beberapa gen yang dapat diinduksi (misalnya, hsp70). Selain itu, perubahan penyambungan mRNA dan stabilisasi mRNA yang diinduksi panas adalah mekanisme adaptif yang digunakan untuk menerjemahkan protein stres secara efisien, yang dapat mencapai 15% hingga 25% dari total protein intraseluler dalam beberapa menit setelah stres fisiologis dalam kondisi ini. 10 34 Secara kebetulan, beberapa pendamping sitosol mentranslokasi ke dalam nukleus, 35 di mana inhibisi perakitan kromatin DNA yang diinduksi panas memperlihatkan konformasi sensitif nuklease, fitur patognomonik dari apoptosis yang diinduksi oleh panas dan iskemia. 36 Perubahan yang kurang dramatis terlihat pada protein membran integral, lapisan ganda lipid, dan morfologi permukaan seluler. Penghentian rangsangan berbahaya diikuti oleh degradasi mRNA Hsp yang cepat dan efisien. 37 38 39

Seperti disebutkan sebelumnya, tekanan panas subletal sebelumnya atau "pengkondisian hipertermik" sangat melemahkan semua perubahan seluler yang diinduksi panas ke tantangan panas parah berikutnya. Selain itu, perlakuan awal dengan panas menghasilkan “toleransi silang” terhadap berbagai jenis stres fisiologis. Misalnya, perlindungan jantung iskemik yang utuh setelah perlakuan awal panas dapat berlangsung selama berjam-jam hingga berhari-hari. 40 41 Wawasan yang diperoleh dari peran fisiologis ekspresi Hsp selama respons sengatan panas telah berkontribusi pada pemikiran terkini tentang fungsi pendamping dalam keadaan patologis yang cenderung menghasilkan pelipatan protein yang abnormal.

Perhatian terutama difokuskan pada induksi pendamping HSP dan mekanisme perbaikan potensial yang terlibat dalam mengurangi cedera iskemia/reperfusi. Gambar 1 secara skematis merangkum banyak dari konsep-konsep ini dan mengilustrasikan beberapa mekanisme yang diketahui dengan baik yang terlibat dalam cedera miokard iskemik, termasuk stres/kerusakan oksidatif, kelebihan kalsium dan protease teraktivasi, pelepasan enzim proteolitik dan lisosom, perubahan sitoskeleton, dan aktivasi komplemen.

Berbagai Tekanan Fisiologis Menginduksi Ekspresi Gen HSP Melalui Mekanisme Umum

Induksi cepat ekspresi protein stres dicapai melalui mekanisme aktivasi transkripsi dan terjemahan preferensial. 10 42 HSF (HSF1 hingga HSF4) mengatur sintesis HSP yang dapat diinduksi selama perkembangan, pertumbuhan, dan adaptasi. 42 43 44 Sedangkan gen salinan tunggal esensial mengkode HSF dalam Saccharomyces cerevisiae dan Drosophila, 45 46 beberapa HSF telah diidentifikasi pada anak ayam, tanaman, tikus, dan manusia. 47 48 49 50 51 Dua HSF (HSF1 dan HSF2, mengkode protein 75 dan 72 kDa, masing-masing) telah diidentifikasi pada tikus. 49 Baik HSF1 maupun HSF2 tidak dapat diinduksi panas, tetapi HSF1 mengalami hiperfosforilasi dalam a rascara yang bergantung pada anggota subfamili MAPK (ERK1, JNK/SAPK, dan protein kinase p38) selama stres fisiologis. 52 53 Selama kondisi tanpa tekanan, baik aktivitas pengikatan DNA maupun aktivitas transkripsi vertebrata HSF1 berada di bawah kontrol negatif yang ketat (ditinjau dalam Referensi 44 44 ). Namun, masih kontroversial apakah represi oleh pendamping Hsp70, sekuestrasi fosforilasi konstitutif pada residu serin, atau regulator penghambat yang tidak diketahui adalah mekanisme utama yang mendasari aktivasi yang dapat diinduksi stres dan penonaktifan cepat HSF1. 43 54 55 56

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa sebagai respons terhadap panas dan iskemia simulasi, mekanisme untuk aktivasi HSF1 serupa, jika tidak identik, dalam sel miogenik 57 dan bahwa penipisan ATP intraseluler memainkan peran penting dalam memicu pengikatan HSF1-DNA. aktivitas. 58 Dalam kondisi penyakit, penginduksi aktivasi HSF1, seperti LDL teroksidasi dan intermediet nitrogen reaktif, diperkirakan meningkatkan kerusakan protein, yang memicu upregulasi ekspresi gen HSP. 59 60 61 Namun, aktivasi transkripsi dari jalur HSF1 tidak memerlukan sintesis protein baru, karena transaktivator yang sudah ada sebelumnya (HSF1) tidak aktif dalam keadaan tidak tertekan. 43 56 57 Stres fisiologis, seperti panas dan iskemia, menginduksi monomer HSF1 untuk dioligomerisasi sebagai homotrimer, yang kemudian mengikat motif spesifik urutan hulu, elemen kejutan panas, dalam promotor semua gen HSP yang diinduksi stres 62 63 (Gambar 1I melalui 1K). Kami baru-baru ini membuat model knockout gen Hsf1 dan menunjukkan dalam studi in vitro persyaratan penting dari jalur pengaturan ini dalam pertahanan seluler dan termotoleransi. 36 Selain itu, ekspresi protein stres telah terlibat dalam mempromosikan kelangsungan hidup sel tumor 64 dan perlindungan jantung iskemik. 16 17 18

Stres Protein Berlebihan Meningkatkan Kecepatan Pemulihan Fisiologis Jantung Iskemik

Literatur substansial menjelaskan induksi Hsp70 oleh iskemia, 57 65 66 peran potensial Hsp70 dalam prakondisi iskemik, 40 67 dan korelasi terbalik antara ekspresi Hsp70 yang diinduksi oleh prakondisi iskemik atau termal dan ukuran infark pada model hewan. 41 68 69 70 Selain itu, ekspresi paksa Hsp70 menyampaikan efek sitoprotektif dalam sel yang dikultur, termasuk miosit jantung yang mengalami iskemia simulasi. 71 72 Secara khusus, ekspresi berlebih dari protein kejut panas 70-kDa utama (Hsp70) pada tikus transgenik meningkatkan fungsi miokard, 16 17 18 mempertahankan pemulihan fungsional metabolik, 18 dan mengurangi ukuran infark 73 setelah iskemia/reperfusi. Selain Hsp70, Hsp27 dan B-crystallin dapat melindungi kardiomiosit primer terhadap kerusakan iskemik. 74 Meskipun mekanisme yang tepat tidak cukup dipahami, protein stres dianggap memediasi cardioprotection melalui fungsi biologis mereka sebagai pendamping molekuler.

Protein Stres Dapat Berfungsi sebagai Molecular Chaperones

Pendamping molekuler, seperti Hsp70 dan B-crystallin, adalah protein yang memfasilitasi pelipatan, perakitan, dan pembongkaran protein lain tetapi bukan merupakan bagian dari produk jadi. 75 Karena banyak protein memerlukan pendamping untuk melipat, protein ini merupakan komponen penting dalam tahap akhir dari dogma sentral biologi molekuler: DNA↔RNA→polipeptida→protein terlipat. 11 75 Pendamping in vitro berfungsi untuk mencegah agregasi protein lain di bawah kondisi stres dan untuk mempromosikan pemulihan aktivitas enzimatik substrat protein terdenaturasi atau enzim (misalnya, sitrat sintase, -galaktosidase, atau luciferase) pada penghapusan stres. 11 13 76

Gambar 2 menunjukkan secara skematis siklus reaksi pendamping Hsc70 dalam kaitannya dengan cochaperone dan substrat molekuler yang baru-baru ini diidentifikasi dalam sel. Misalnya, pendamping Hsp40 memainkan fungsi katalitik utama dalam memuat substrat target ke siklus pengikatan/pelepasan Hsc70. 77 Meskipun mekanisme fungsi-fungsi ini masih muncul, fungsi utama dari molekul pendamping adalah untuk (1) mengikat sementara dan menunda pelipatan rantai polipeptida yang baru lahir sampai sintesis selesai, (2) mempertahankan rantai polipeptida dalam konformasi yang sesuai yang cocok untuk translokasi melintasi membran organel, (3) mencegah agregasi dari interaksi intramolekul atau antarmolekul, (4) secara aktif membongkar vesikel berlapis klatrin, (5) menahan kompleks aporeseptor steroid dalam keadaan kompeten ligan (Hsp90 dan cochaperone), dan (6) membantu dalam mendegradasi racun metabolit dengan mempromosikan ubiquination dan lisis proteasome 78 (Gambar 1L sampai 1P).

Kasus Molecular Chaperones pada Penyakit Jantung

Minat klinis yang luas ke dalam fungsi biologis pendamping molekuler meluas ke berbagai patologi manusia dari kondisi degeneratif seperti penyakit Alzheimer, prion, amiloidosis, pembentukan katarak, penyakit sel sabit, cystic fibrosis, dan berbagai penyakit jantung termasuk iskemia miokard. Peristiwa awal yang membangun kembali aliran tepat waktu dari miokardium iskemik baik melalui trombolitik, angioplasti langsung, atau lisis bekuan spontan sangat penting untuk meningkatkan penyelamatan miokard dan mengurangi morbiditas dan mortalitas. 79 80 Meskipun demikian, iskemia berulang baik dari pecahnya plak yang tidak stabil atau gagal jantung kongestif dapat mempersulit perjalanan klinis infark miokard akut. Pada infark miokard akut tanpa komplikasi, pemulihan fisiologis pada tingkat sel dimulai dalam beberapa menit tetapi dapat berlangsung selama berminggu-minggu hingga berbulan-bulan sebelum perbaikan miokard selesai. Dengan demikian, mekanisme perlindungan endogen memiliki relevansi klinis dalam mengurangi efek penyakit jantung iskemik.

Aktivitas Biokimia Jalur Regulasi HSP dan Pendamping Selama Iskemia Miokard

Dalam pekerjaan sebelumnya yang dilakukan untuk menentukan stimulus terdekat untuk aktivasi HSF, kami mengamati bahwa asidosis intraseluler yang parah (pH 6,7) tidak cukup untuk menginduksi pengikatan DNA HSF1 dalam sel-sel miogenik yang dikultur yang terpapar pada iskemia yang disimulasikan, jika simpanan ATP dipertahankan. 58 Sebaliknya, deplesi ATP yang parah (65%) merangsang pengikatan DNA HSF1, bahkan jika pH dipertahankan dalam kisaran normal. 58 Pada jantung iskemik utuh, iskemia 15 menit, yang menghasilkan cedera reversibel, dikaitkan dengan penurunan serupa (65%) simpanan ATP berenergi tinggi, sedangkan cedera mematikan ditemukan dengan iskemia berkepanjangan (>40 menit) dan >90% deplesi dari kolam berenergi tinggi. 81 KM untuk aktivitas ATPase yang lemah dari Hsc70 sapi adalah 1 hingga 2 mol/L, 3 kali lipat di bawah konsentrasi milimolar dari kumpulan nukleotida adenin intraseluler.75 Oleh karena itu, aktivasi ATP-dependen dari jalur regulasi HSF1 dan sifat biokimia molekul pendamping tidak mungkin terpengaruh selama periode iskemia transien atau cedera iskemik miokard reversibel.

Bukti prinsip yang menunjukkan efek kardioprotektif Hsp70 pada hewan transgenik yang mengalami iskemia/reperfusi menunjukkan bahwa metode farmakologis atau genetik untuk meningkatkan ekspresi protein stres di miokardium pasien yang berisiko kejadian iskemik akut dapat membatasi cedera iskemik. 82 Namun, pengetahuan dasar tambahan diperlukan mengenai (1) hubungannya dengan jalur endogen lain yang terlibat dalam perlindungan miokard dari stres/kerusakan oksidatif, (2) spesifisitas fungsional di antara anggota pendamping dari keluarga multigen HSP, dan (3) kontribusi ini jalur selama iskemia akut dan keadaan fisiologis lain yang memicu respons kejutan panas, sebelum aplikasi klinis.

Protein Stres dan Jalur Antioksidan untuk Kardioproteksi

Sejak tahun 1970-an, hipotesis bahwa pemulung radikal bebas dapat memperbaiki kerusakan oksidatif selama iskemia/reperfusi telah dikejar oleh dokter dan peneliti. 83 Dalam sistem model mulai dari transgenik Drosophila untuk tikus, overekspresi katalase, superoksida dismutase, atau glutathione peroksidase cenderung protektif terhadap stres oksidatif. 84 85 86 Stres oksidatif, dari iskemia/reperfusi, juga memainkan peran sentral dalam cedera organ vital seperti otak, ginjal, dan jantung. ROS dianggap berkontribusi terhadap disfungsi ventrikel, atau aritmia, atau kerusakan sel progresif atau kematian setelah cedera iskemik (Gambar 1). 87 88 89 90

Hasil yang tidak sesuai telah dilaporkan dari upaya untuk memberikan antioksidan selama dan setelah iskemia/reperfusi miokard. 91 92 Antioksidan eksogen, yang terbatas pada ruang interstisial, mungkin memiliki kemampuan terbatas untuk melindungi protein intraseluler terhadap ROS. Misalnya, radikal bebas hidroksil (·OH), yang diyakini sebagai agen utama kerusakan oksidatif, sangat reaktif dengan substrat tipikal sehingga waktu paruhnya pada 37°C adalah 7×10 10 detik. 93 Dengan demikian, sulit untuk membayangkan bahwa pemberian antioksidan eksogen, pada konsentrasi yang layak secara fisiologis, dapat secara efektif mencegah kerusakan makromolekul yang diinduksi OH. Strategi yang berpotensi lebih efektif mungkin secara fisiologis meminimalkan produksi ·OH. Memang, ekspresi berlebihan dari anggota keluarga HSP dapat memberikan satu jalan seperti itu. Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa selama perlindungan terhadap iskemia miokard, peningkatan regulasi kadar protein stres berkorelasi dengan peningkatan aktivitas enzim katalase, menunjukkan potensi interaksi aditif atau sinergis dari jalur endogen ini terhadap stres oksidatif. 40 94 95 Pertanyaan penting yang belum terjawab adalah apakah fungsi protein stres, sebagai pendamping molekuler, melengkapi fungsi unik enzim antioksidan dalam melindungi terhadap stres/kerusakan oksidatif.

Pendamping Molekuler dari Kompartemen Sitosol/Nuklir

Tabel menunjukkan kelas utama HSP, kompartemen intraseluler, fungsi diduga mereka, dan potensi signifikansi dalam biologi kardiovaskular.

Pendamping Hsp70

Anggota keluarga Hsp70 adalah kelompok yang paling banyak dipelajari dan berlimpah dalam sel eukariotik. 96 Dalam sitosol, Hsp70 berikatan dengan polipeptida yang baru lahir sebelum dilepaskan dari ribosom. 97 Semua anggota kelas pendamping Hsp70 memiliki dua domain berbeda: domain ATPase terminal-N yang sangat terkonservasi dan domain terminal-C yang lebih divergen, yang mengikat peptida hidrofobik pendek dari substrat target (Gambar 2A). Fungsi pendamping Hsp70 membutuhkan domain N-terminal ATPase, yang menarik, secara struktural mirip dengan aktin otot rangka kelinci meskipun sedikit kesamaan urutan. 100

Hubungan struktur/fungsional Hsp70 ini kemungkinan memberikan aktivitas pendamping in vivo dalam perlindungan jantung. Dalam hal ini, hampir tidak ada yang diketahui tentang pendamping Hsc70 konstitutif, yang berbagi homologi urutan >80% dengan Hsp70. Dapat dibayangkan, peningkatan regulasi sederhana dari Hsc70 konstitutif dapat meningkatkan manfaat kardioprotektif yang substansial. Namun, peningkatan regulasi HSP di luar ambang batas kritis mungkin memiliki konsekuensi seluler yang merusak. 101 Fungsi yang berbeda antara anggota Hsp70 dilaporkan baru-baru ini ada di wilayah di luar domain pengikatan peptida, menunjukkan tingkat kerumitan tambahan untuk fungsi pendamping in vivo. 102

Pendamping Hsp90

Gambar 2 menunjukkan bahwa pendamping Hsp90 adalah komponen dari siklus reaksi yang melibatkan kompleks pendamping Hsc70 dan protein yang baru disintesis. Selain itu, anggota keluarga Hsp90, Hsp90α dan Hsp90β, yang merupakan 1% hingga 2% dari total protein sitoplasma terlarut, memiliki karakteristik hubungan fungsional in vivo terbaik dengan protein target, reseptor hormon steroid. 103 Hsp90 dengan mitra pendamping, Hsp70 dan Hsp56, secara langsung mengikat, menstabilkan, dan mempertahankan kompleks aporeceptor dalam konformasi yang tidak aktif. Pengikatan ligan (misalnya, estrogen) ke kompleks aporeceptor memicu hidrolisis ATP oleh Hsp90, yang berdisosiasi dari reseptor "aktif" yang sekarang dapat mengikat motif pengenalan urutan-spesifik dan menginduksi transkripsi gen target. 104 Selain itu, peningkatan kadar ekspresi Hsp90 mengacaukan reseptor estrogen/kompleks elemen responsif estrogen dan menurunkan regulasi ekspresi gen target responsif estrogen, yang menunjukkan loop umpan balik regulasi. 105

Fungsi pendamping Hsp90 dimediasi oleh jalur transduksi sinyal yang melibatkan berbagai protein kinase dari kedua jenis tirosin dan serin-treonin, kasein kinase II, eIF-2α yang diatur heme, dan berbagai protein seluler lainnya, seperti calmodulin, aktin, dan tubulin (diulas dalam Referensi 106 106 ). Akhirnya, pendamping Hsp90 dari Saccharomyces cerevisiae sangat penting untuk bertahan hidup di bawah semua kondisi, mendukung peran fisiologis penting mereka pada eukariota rendah. 107

Pendamping Sitosol dengan Minat Khusus dalam Biologi Jantung dan Pembuluh Darah

Berbeda dengan rekan-rekan Hsp70 dan Hsp90 di mana-mana, anggota spesifik dari HSP MW kecil (HO-1 atau Hsp32, Hsp27, B-crystallin, dan pendamping Hsp20) menunjukkan ekspresi terbatas jaringan, menunjukkan potensi sifat khusus dalam sistem kardiovaskular.

H2O yang dapat diinduksi (Hsp32)

H2O adalah enzim pembatas laju dalam degradasi heme menjadi biliverdin (antioksidan kuat), besi molekuler, dan karbon monoksida. Tiga gen salinan tunggal terkait mengkodekan isoform H O: HO-1, HO-2, dan HO-3. 108 109 110 HO-1 adalah protein stres 32-kDa bonafide (Hsp32) yang diinduksi oleh beragam tekanan fisiologis, termasuk hipoksia, iskemia/reperfusi, hemin, hidrogen peroksida, dan beberapa logam berat (selenium, arsenit, kobalt, kadmium , dan ion stannous). 108 109 110 Inducible Hsp32 (HO-1), isoform yang paling banyak diekspresikan, terdapat dalam sel miokard. 111

Hsp32, seperti bentuk NO sintase yang dapat diinduksi memediasi penghambatan trombosit yang bergantung pada guanylyl cyclase dan vasodilatasi VSMC. 112 113 114 Namun, gaya hemodinamik yang relevan secara fisiologis (tegangan geser dan regangan siklik) menginduksi ekspresi mRNA HO-1 tetapi tidak menginduksi ekspresi NO sintase, menunjukkan kekhususan jalur respons stres ini terhadap sinyal fisiologis. 115 Baik NO yang dilepaskan secara endogen atau yang diberikan secara eksogen menginduksi peningkatan ekspresi gen Hsp32 (HO-1) 3 hingga 6 kali lipat dan produksi CO di VSMCs 116 sama halnya, inhibitor timah protoporfirin-IX mencegah agregasi trombosit melalui induksi gen HO-1 ekspresi dan produksi CO2 di VSMCs aorta. 115 Pada VSMC tikus, pengobatan angiotensin II menurunkan ekspresi mRNA Hsp32 (HO-1) dengan cara yang bergantung pada kalsium. 117 Namun, hipertensi yang diinduksi angiotensin II meningkatkan ekspresi mRNA Hsp32 (HO-1) di aorta tikus, menunjukkan pengaruh utama faktor hemodinamik in vivo. 118

Beberapa jalur regulasi terlibat dalam induksi ekspresi gen Hsp32, terutama jalur HSF1 dan jalur faktor-1 transkripsi yang diinduksi hipoksia. 119 120 121 122 Meskipun bukti langsung dari fungsi pendamping Hsp32 kurang, ekspresi berlebihnya dalam beberapa jenis sel melindungi terhadap stres/kerusakan oksidatif. 123 124 125 Dengan demikian, penelitian untuk menentukan jalur regulasi yang tepat yang dirangsang oleh logam berat, hipoksia, dan stres oksidatif dapat memberikan wawasan baru tentang peran biologis Hsp32 (HO-1) dalam memodulasi stres/kerusakan oksidatif selama iskemia/reperfusi, tonus vaskular (misalnya, hipertensi), dan penghambatan agregasi trombosit dan/atau proliferasi VSMC setelah angioplasti balon.

Hsp25/27 pendamping

Setelah penemuannya sebagai penghambat polimerisasi aktin, 126 pendamping Hsp 25/27 (Hsp25 pada tikus dan Hsp27 pada manusia) telah terbukti memainkan peran utama dalam dinamika filamen aktin dalam beragam jenis sel. Rangsangan fisiologis (stres oksidatif, sitokin, dan faktor pertumbuhan) secara dramatis meningkatkan fosforilasi Hsp27 manusia pada residu Ser15, Ser78, dan Ser83, yang penting untuk toleransi yang didapat. 127 128 129 Fosforilasi Hsp25/27 dikatalisis oleh MAPKs (p38-MAPKs, JNKs, atau SAPKs) dan ERKs. 130 Pada jantung dewasa yang perfusi, p38-MAPK dan JNK/SAPK diaktifkan setelah iskemia/reperfusi. 131 Menanggapi pengobatan ROS, aktivasi p38-MAPK meningkatkan aktivitas MAPKAP kinase 2, yang memfosforilasi Hsp27. 132

Dalam sel endotel manusia, penghambatan aktivasi p38-MAPK yang diinduksi faktor pertumbuhan endotel vaskular menghapus fosforilasi Hsp27, polimerisasi aktin, dan migrasi sel, menunjukkan kemungkinan hubungan antara Hsp27 dan angiogenesis. 133 Bersama-sama, bukti yang tersedia menempatkan p38-MAPK sebagai aktivator hulu fosforilasi Hsp25/27 yang diinduksi stres, dan jalur ini mendasari efek p38-MAPK pada reorganisasi aktin berfilamen, akumulasi serat stres, dan perekrutan vinculin di lokasi adhesi fokal. 134 Selanjutnya akan menjadi penting untuk menentukan apakah Hsp25/27 memberikan tindakan vasoprotektif dalam menanggapi kekuatan hemodinamik atau cedera dinding pembuluh darah. Namun, analisis langsung kemungkinan akan membutuhkan model knockout gen Hsp27.

B-Crystallin Chaperone (Hsp22)

Sedangkan Hsp27 terdeteksi dalam sel endotel, VSMC, dan kardiomiosit, pendamping B-kristalin diekspresikan hanya dalam kardiomiosit. 135 Baik Hsp27 dan B-crystallin secara struktural terkait HSPs bonafid dengan aktivitas pendamping in vitro tetapi, tidak seperti Hsp70, bukan protein pengikat ATP. 136 137 138 139 Meningkatnya minat terhadap regulasi dan fungsi protein B-crystallin (Hsp22), protein struktural utama lensa okular, terkait dengan ekspresi terbatas jaringannya dalam garis keturunan miogenik lurik dengan kapasitas oksidatif tinggi, seperti jantung dan serat otot rangka tipe I. 140 Dalam jaringan nonlenticular, ekspresi postnatal B-crystallin meningkat dan mencapai tingkat tertinggi di jantung orang dewasa (≈1% sampai 3% dari total protein terlarut), diikuti oleh otot rangka dan ginjal. 140 Studi imunohistokimia sebelumnya telah melokalisasi ekspresi B-kristalin tertinggi dalam serat konduksi jantung jantung dewasa. 141 Apakah perubahan ekspresi B-kristalin dapat menyebabkan kelainan sistem konduksi saat ini tidak diketahui tetapi menimbulkan kemungkinan yang menarik.

Meskipun ekspresi B-crystallin telah dilokalisasi ke pita Z dari sitoskeleton, dalam pola yang mirip dengan desmin dan aktin, 142 penelitian terbaru menunjukkan bahwa interaksi ini jauh lebih sementara dan dinamis sehubungan dengan target intraseluler, tergantung pada kondisi fisiologis. Pada miosit jantung yang tidak distimulasi, studi biokimia menunjukkan bahwa B-crystallin sangat larut dan tetap dalam fraksi sitosolik Panas atau iskemia memicu translokasi cepat B-crystallin ke dalam fraksi sitoskeletal/nuklear yang tidak larut, agregasi, dan interaksi spesifik pada pita Z (Referensi 142 142 dan IJ Benjamin, data tidak dipublikasikan, 1998). Signifikansi fisiologis untuk kecenderungan B-crystallin dan Hsp25/27 untuk membentuk kompleks hetero-oligomer besar (500 hingga 800 kDa) baik in vivo maupun in vitro setelah tekanan fisiologis tetap menjadi misteri. 143 144 Meskipun pendamping B-crystallin memberikan sitoproteksi untuk kardiomiosit, 74 mekanisme regulasi modifikasi pascatranslasi seperti fosforilasi, glikasi, dan deasetilasi pada fungsi B-kristalin menunggu analisis langsung dalam sistem kardiovaskular.

Protein Stres dan Pengembangan dan Diferensiasi Otot Lurik

Peningkatan ekspresi pendamping HSP MW kecil telah dijelaskan selama periode yang terkait dengan peningkatan sintesis protein, degradasi protein, dan reorganisasi seluler, seperti diferensiasi miogenik dan embriogenesis. 145 Ekspresi B-crystallin yang dibatasi jaringan selama miogenesis otot rangka mungkin memerlukan keluarga MyoD dari faktor transkripsi helix-loop-helix dasar, yang mengikat penambah E-box penting yang terkandung dalam promotor B-crystallin. 146 147 Kami baru-baru ini melaporkan bahwa ekspresi B-crystallin, tetapi tidak Hsp27, secara langsung terkait dengan peningkatan metabolisme oksidatif di otot rangka setelah stimulasi saraf kronis. 148 Namun, peran fisiologis upregulasi ekspresi Hsp27, yang mendahului diferensiasi awal sel induk embrionik murine, masih harus ditetapkan dalam garis keturunan miogenik. 149

Lebih sedikit yang diketahui tentang mekanisme pengaturan yang terlibat dalam ekspresi terbatas B-kristalin dalam miosit jantung. B-Crystallin banyak diekspresikan dalam perkembangan jantung awal yang dimulai pada hari embrio 8.5, menunjukkan peran baik sebagai protein struktural atau sebagai pendamping molekuler dalam stabilisasi myofiber. 150 Karena faktor Myod-like tidak ada di jantung, studi pengikatan in vitro ekstrak jantung telah melibatkan aktivitas transkripsi dari faktor stimulasi hulu pada elemen E-box dan faktor respons serum pada kotak CArG terbalik di jantung. Promotor B-kristalin. 151 Sejauh ini, survei perkembangan in vivo mengungkapkan bahwa ekspresi B-kristalin tidak terpengaruh pada otot rangka myf5 tikus nol atau jantung tikus nol d-HAND pada hari embrio 9.0 (I.J. Benjamin, data tidak dipublikasikan, 1998). 152 153

Pendamping Sitosol/Nuklir Lainnya

Beberapa HSP lain yang ada di kompartemen sitosol/nuklear berpotensi menarik dalam biologi kardiovaskular. Misalnya, protein 20-kDa sitosol, p20, banyak diekspresikan di jantung, rangka, dan otot polos dan dimurnikan bersama dengan pendamping B-kristalin dan Hsp27. 154 155 Meskipun ekspresi p20 tidak diinduksi oleh panas atau stres kimia, ia mengandung homolog C-terminal " domain-crystallin domain" yang dimiliki bersama oleh semua anggota HSP MW kecil. 138 Dalam VSMCs, p20 adalah substrat untuk protein kinase cAMP dan cGMP, menunjukkan peran pengaturan untuk fungsi yang didalilkan dalam pemeliharaan fisiologis tonus vaskular dan adaptasi terhadap cedera dinding pembuluh darah. 156

Anggota keempat dari HSP kecil (selain Hsp27, B-crystallin, dan p20), asosiasi protein pengikat protein kinase myotonic dan meningkatkan aktivitas protein kinase distrofi dan mencegah denaturasi yang diinduksi panas secara in vitro. 157 Myotonic distrofi protein kinase, tidak seperti Hsp27 atau B-crystallin, diregulasi di otot rangka pasien dengan distrofi miotonik, menunjukkan bahwa protein baru ini mungkin terlibat dalam patogenesis penyakit ini. 157

Anggota keluarga Hsp110 menunjukkan fungsi pendamping dan sitoprotektif, meskipun rincian tentang ekspresi relatif mereka dalam sel miokard dan distribusi regional dalam sistem kardiovaskular menunggu karakterisasi lebih lanjut. 158 Anggota keluarga Hsp110 tambahan termasuk Hsp105, Apg-1, dan Osp94. 159 160 161 Ada minat yang kuat dalam mengidentifikasi homolog mamalia dari ragi Hsp104, yang, alih-alih mencegah agregasi protein, tampaknya melarutkan kembali agregat protein yang tidak larut. 162

Sistem Pendamping Mitokondria Hsp70

Semua organisme memiliki mekanisme yang bergantung pada ATP untuk pelipatan dan perakitan protein di dalam organel. 11 13 Translokasi protein melintasi membran mitokondria membutuhkan pendamping mitokondria Hsp70 dalam matriks, di mana pelipatan ke keadaan asli selesai 13 (lihat Gambar 1).

Sistem Pendamping Mitokondria

Selain pendamping seperti Hsp70, pendamping mitokondria Hsp60 dan Hsp10 merupakan sistem terpisah yang menyediakan lingkungan yang diasingkan untuk melipat subset protein in vivo. 163 Cincin beranggota 7 ini disusun sebagai struktur silinder di mana pelipatan protein yang bergantung pada ATP terjadi di rongga pusatnya. 164 Bukti dari studi in vitro menunjukkan bahwa Hsp70 chaperones dan sistem chaperonin berfungsi secara kooperatif dalam pelipatan dan perakitan protein pada eukariota (ditinjau dalam Referensi 13 13 ).

Sistem Chaperonin Sitosolik

TRiC chaperonin dianggap setara fungsional chaperonin Hsp60/Hsp10 dalam sitosol eukariotik. Kompleks TRIC, yang terdiri dari cincin ganda beranggota 8 atau 9 dari subunit 55 hingga 65 kDa, diperlukan untuk melipat aktin dan tubulin in vivo. 165 Chaperonin TRIC membutuhkan komponen tambahan, seperti Hsp40, yang merangsang Hsc70 ATPase, untuk pelipatan protein dalam sitosol 77166 (lihat Gambar 2). Bukti yang tersedia menunjukkan bahwa chaperonin TRIC berfungsi pada tahap akhir pelipatan selama translasi sejumlah domain polipeptida yang terbatas. 13

Implikasi

Pendamping mitokondria dan pendamping hanya sedikit diinduksi oleh stres fisiologis pada kardiomiosit dan jantung. 167 Namun, lokasi mitokondria Hsp70 pendamping dan pendamping di situs utama produksi ROS dapat berfungsi untuk melengkapi mekanisme pertahanan baik enzimatik dan nonenzimatik untuk mengurangi cedera oksidatif dan meningkatkan tingkat pemulihan fisiologis setelah cedera iskemik. 168 169 Apakah overekspresi baik mitokondria Hsp75 pendamping atau pendamping dapat memberikan perlindungan setara atau unggul terhadap cedera iskemik saat ini tidak diketahui. Pertanyaan penting lainnya menyangkut apakah fungsi yang tumpang tindih dari pendamping Hsp70 dan sistem pendamping Hsp60 atau TRIC/Hsp40 dikoordinasikan untuk pelipatan protein de novo dan sitoproteksi potensial selama patogenesis penyakit jantung.

Pendamping Molekuler di ER

Protein yang Diatur Glukosa

Analisis pendamping ER mungkin kepentingan klinis tertentu, karena fungsi ER untuk mendegradasi atau memperbaiki protein yang rusak setelah iskemia miokard atau setelah protein mutan (misalnya, CFTR atau tiroglobulin) gagal melipat dengan benar. 11 170 171 Anoksia, kelaparan glukosa, dan ionofor kalsium menginduksi anggota kelas protein stres yang diatur glukosa mengikat Ca 2+, Grp170, Grp94, dan Grp78/BiP. 11 172 Perubahan variabel dalam ekspresi protein Grp78 telah dilaporkan setelah iskemia.173 174 Meskipun "bersalah karena asosiasi" dengan pendamping sitosolik adalah peran yang diduga dari fungsi pendamping Grp dalam pengawasan protein dan kontrol kualitas, lebih banyak studi tentang ekspresi mereka diperlukan dalam keadaan patofisiologis yang terkait dengan ekspresi, glikosilasi pascatranslasi, dan sekresi protein abnormal melalui jalur ER-Golgi.

Hsp47 pendamping

Glikoprotein Hsp47 pengikat kolagen 47-kDa adalah anggota dari superfamili serpin (inhibitor protease serin) dan sangat diinduksi oleh stres panas atau keadaan patofisiologis (misalnya, fibrosis hati) yang terkait dengan peningkatan sintesis kolagen. 175 Hsp47 berada di ER dan berisi sinyal retensi C-terminal Arg-Asp-Glu-Leu ER. 176 Hsp47 mengikat secara sementara ke kolagen tipe I hingga IV dan dengan kuat ke substrat kolagen yang terdenaturasi sehingga perannya dalam pemrosesan dan transportasi prokolagen tampaknya sudah mapan. 177 Studi masa depan sekarang harus membahas kemungkinan relevansi biologis dan klinis dari ekspresi Hsp47 pada permulaan dan perkembangan keadaan patofisiologis, seperti infark miokard, kardiomiopati idiopatik dan hipertrofi, dan hipertensi, di mana fibrosis miokard menonjol. 178

Tantangan Saat Ini dan Arah Masa Depan

Pemulihan fisiologis jantung iskemik dimulai dalam beberapa menit, tetapi tingkat perbaikan iskemik seluler, yang dapat berlangsung selama berhari-hari hingga berminggu-minggu, sangat penting untuk mengurangi morbiditas dan mortalitas kardiovaskular berikutnya. Gagasan bahwa protein stres dapat mempercepat pemulihan fisiologis cedera miokard reversibel didasarkan pada bukti eksperimental yang menunjukkan bahwa beberapa "sinyal" proksimat dapat mengaktifkan respons sengatan panas dan, dengan demikian, membangkitkan mekanisme perlindungan endogen Hsps. Kejadian klinis utama seperti angina tidak stabil, oklusi berulang setelah terapi trombolitik, dan eksaserbasi akut angina kronis merupakan penginduksi fisiologis potensial protein stres sitoprotektif. Langkah logis berikutnya adalah mempertimbangkan kemungkinan bahwa anggota terkait dari keluarga protein stres multigen memberikan manfaat fungsional yang serupa atau tambahan. Karena iskemia dan gangguan fisiologis lainnya mengganggu hubungan struktur-fungsi normal protein intraseluler, penelitian selanjutnya harus menetapkan apakah pendamping molekuler, baik sendiri atau dalam kombinasi, mengurangi kerusakan iskemik dengan mempercepat pemulihan fisiologis sel miokard dalam organisme utuh.

Model Eksperimental untuk Penelitian Protein Stres

Model transgenik dari ekspresi berlebih Hsp70 (keuntungan fungsi) dan hsf1-tikus yang kekurangan (kehilangan fungsi), dan karakterisasi selanjutnya, mulai menjelaskan peran fisiologis mereka in vivo. 16 17 18 36 Salah satu arah yang menarik dari upaya tersebut dapat mengarah pada pendekatan terpadu ke dalam peran fisiologis seluruh sistem atau jaringan regulasi dalam model hewan yang dimodifikasi secara genetik dari penyakit manusia. Namun, kekayaan pengetahuan yang ada tentang studi fisiologis pada hewan yang lebih besar dari tikus tidak boleh diabaikan. Studi untuk menentukan peran ekspresi HSP dalam pemingsanan miokard menggunakan hewan sadar dapat membenarkan pengembangan model tikus dan kelinci transgenik. Keterbatasan potensial dari strategi tersebut mencakup biaya yang jauh lebih besar dari periode kehamilan yang lebih lama, waktu yang lebih lama untuk mencapai kematangan seksual, dan ukuran serasah yang lebih kecil dari spesies yang lebih besar tersebut. Namun, peneliti dengan keahlian dalam biologi molekuler dan fisiologi molekuler yang melakukan proyek kolaboratif meningkatkan peluang keberhasilan, sambil menghindari duplikasi upaya.

Apakah Ekspresi Gen HSP yang Diinduksi Stres Mempengaruhi Ukuran Infark, Aritmogenesis, dan Remodeling Miokard Setelah Infark Miokard Akut?

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa perlakuan awal (24 jam) dengan stres panas melemahkan pelepasan radikal bebas di jantung tikus yang terisolasi95 dan mengurangi jumlah aritmia, ciri fungsional utama dari cedera iskemia/reperfusi (ditinjau dalam Referensi 92 92 ). Bersama-sama, studi ini mengkorelasikan interaksi potensial antara jalur pelindung ini tetapi tidak memadai untuk membangun hubungan sebab dan akibat. Pengembangan model tikus knockout gen HSF1 memberikan pendekatan eksperimental yang kuat untuk menentukan apakah defisiensi sintesis HSP yang diinduksi stres, selama gangguan fisiologis seperti iskemia miokard, memengaruhi hasil cedera pascainfark dan mekanisme perbaikan pada organisme utuh. Hasil studi tersebut dapat membantu membangun kausalitas, menjelaskan mekanisme potensial dimana sintesis HSP berhubungan dengan iskemia miokard, dan mengevaluasi partisipasi protein stres selama prakondisi iskemik awal dan akhir. Karakterisasi tepat waktu dari beberapa model knockout, yang saat ini sedang dikembangkan di laboratorium di seluruh dunia, harus terus mendorong kolaborasi yang bermanfaat di antara para peneliti. 179 Kemajuan lebih lanjut harus mempercepat aliran pengetahuan baru ke bidang terkait seperti fibrosis reaktif dan reparatif pascaiskemik, 180 inflamasi pascareperfusi, 181 dan pemingsanan miokard. 89 182

Ekspresi Protein Stres dan Mekanisme Prakondisi Iskemik

Prakondisi iskemik adalah manuver eksperimental paling kuat yang melindungi jantung secara berulang terhadap tantangan iskemik berikutnya. 183 Namun, ada kontroversi tentang peran yang tepat dari protein stres dalam fenomena yang ditandai dengan baik ini. 184 Beberapa mekanisme yang melibatkan protein kinase C, reseptor adenosin, dan hubungannya dengan jalur transduksi sinyal telah terlibat dalam prakondisi iskemik. 185 Bukti yang cukup menunjukkan kurangnya korelasi antara ekspresi yang diinduksi stres (misalnya, Hsp70) dan pengkondisian awal, yang berumur pendek dan berlangsung antara 1 dan 3 jam, tergantung pada model dan spesiesnya. 186

Apakah Keluarga Pendamping Protein Stres Tidak Mungkin Memiliki Relevansi Fisiologis dalam Prakondisi Dini?

Menurut pendapat kami, penelitian di bidang ini telah mengabaikan atau memberikan perhatian yang tidak memadai terhadap potensi pentingnya Hsps MW kecil, seperti B-crystallin dan Hsp27. Para pendamping ini tampaknya menjadi kandidat untuk "garis pertahanan pertama" melawan stres yang tidak mematikan. Apakah oligomerisasi MW Hsps kecil berkontribusi pada stabilitas mekanik atau peran sitoskeleton dalam perlindungan iskemik miosit jantung saat ini tidak diketahui. 187 188 Kedua model knockout gen B-crystallin dan Hsp27, yang saat ini dalam pengembangan, dapat secara langsung menjawab hipotesis ini.

Demikian pula, penelitian diperlukan untuk mengatasi korelasi antara pengkondisian terlambat dan ekspresi protein stres. Dua puluh empat jam setelah stres iskemik awal, beberapa penelitian telah melaporkan peningkatan sintesis Hsp60 dan Hsp70 pada kelinci, 41 Hsp70 pada babi, 182 dan mangan-SOD pada anjing 189 190 dan toleransi iskemik tertunda atau pengkondisian terlambat. Oleh karena itu, pertanyaan mendasar adalah apakah ada hubungan langsung antara ekspresi protein stres dan pengkondisian akhir. 191 192 193 Penilaian yang lebih rinci tentang peran spesifik Hsp individu dalam perlindungan jantung juga diperlukan. Upaya untuk menentukan mekanisme saluran kalium sensitif ATP kardioprotektif dengan menggunakan inhibitor telah menemukan kurangnya korelasi dengan ekspresi protein stres Hsp70. 194 Namun, pendekatan menggunakan inhibitor spesifik tidak memadai untuk menetapkan spesifisitas, untuk tingkat kepastian apa pun, di luar protein yang sedang diselidiki. 195

Pendamping Molekuler dan Jalur Kematian Sel

Protein stres adalah kandidat ideal untuk memainkan peran pengaturan kunci dalam kelangsungan hidup sel dan jalur kematian yang melibatkan kerusakan DNA dan sintesis, perbaikan, dan degradasi protein. Manuver yang meningkatkan ekspresi Hsp70 setelah kejutan panas, paparan natrium butirat, dan ekspresi berlebih konstitutif atau teregulasi menghambat apoptosis pada berbagai jenis sel. 196 197 198 Proto-onkogen c-myc mempotensiasi apoptosis yang diinduksi kejutan panas 199 200 sebaliknya, ekspresi berlebih Bcl-2 menambah kelangsungan hidup seluler yang diinduksi termotoleransi. 201 Ekspresi spesifik jaringan Hsp70-2 mencegah apoptosis pada sel mitosis tertentu melalui mekanisme yang melibatkan kontrol siklus sel. 202 Fungsi pendamping Hsp70 dalam mengatur apoptosis mungkin pada tingkat transduksi sinyal, seperti yang telah terlibat dalam jalur kinase teraktivasi stres. 203

Studi terbaru di laboratorium kami menggunakan hsf1-sel kultur yang kekurangan telah menetapkan peran Hsps yang diinduksi stres untuk membuat sel termotoleran terhadap apoptosis yang diinduksi panas. 36 Penelitian ini menyediakan model genetik untuk menguji hubungan saling ketergantungan potensial antara Hsps yang diinduksi stres dan mekanisme yang terlibat dalam kelangsungan hidup sel dan/atau jalur kematian sel. Stres panas subletal melindungi mitokondria terhadap stres oksidatif dan mencegah kematian sel melalui apoptosis. 204 Mengingat lokasinya yang strategis di semua organel utama, tergoda untuk berspekulasi bahwa beberapa Hsps dapat memerangi stres/kerusakan oksidatif dengan melipat kembali represor yang rusak dari jalur kematian sel atau mencegah degradasinya. Atau, menekan pelepasan aktivator bunuh diri seperti sitokrom C dapat terjadi melalui interaksi dengan pendamping mitokondria dan pendamping (Gambar 1).

Selain itu, hasil dari beberapa penelitian terbaru telah melibatkan MW Hsp25/27 kecil dalam jalur kelangsungan hidup sel yang melibatkan diferensiasi sel dan stres/kerusakan oksidatif. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa ekspresi berlebih dari Hsp25/27, seperti protein antiapoptosis Bcl-2, meningkatkan kadar glutathione antioksidan dan resistensi terhadap apoptosis yang dimediasi Fas/APO-1, meskipun apakah ini terjadi secara langsung masih belum jelas. 205 Penarikan sel induk embrionik tikus dari siklus sel menginduksi upregulasi mRNA Hsp25/27, yang disertai dengan penurunan fosforilasi dan peningkatan oligomerisasi protein Hsp25/27. 149 Pengurangan antisense Hsp25/27 membalikkan perubahan ini melalui perpanjangan siklus sel, pengurangan kadar glutathione, dan percepatan menuju apoptosis. Bersama-sama, temuan provokatif ini menunjukkan bahwa selama proliferasi dan diferensiasi sel miokard, pendamping Hsp25/27, dan lainnya, dapat mengurangi stres/kerusakan oksidatif dan mencegah apoptosis melalui mekanisme baru yang bergantung pada redoks. 206

Apakah Ekspresi Gen HSP yang Diinduksi Stres Mempengaruhi Sejarah Alami Penyakit Kardiovaskular Kronis, Termasuk Penuaan?

Sejumlah penelitian telah mengkorelasikan induksi ekspresi Hsp dan kelebihan tekanan oleh pita aorta, hipertensi akut, paparan agen vasoaktif atau hipertrofi ventrikel kiri, dan ekspresi faktor pertumbuhan pada beberapa jenis sel. 207 208 209 Penurunan ekspresi gen HSP dan aktivitas pengikatan DNA HSF1 dilaporkan terjadi selama proses penuaan di miokardium hewan pengerat. 210 Ada semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa stres/kerusakan oksidatif mungkin menjadi faktor penyebab utama dalam proses penuaan. 211 Tingkat stres oksidatif dan kerentanan jaringan terhadap stres oksidatif yang diinduksi secara eksperimental tampaknya meningkat selama proses penuaan. Apakah peningkatan jumlah kerusakan oksidatif molekuler, yang diamati selama proses penuaan, secara kausal terkait dengan penurunan aktivitas HSF1 dan, implikasinya, ekspresi gen Hsp saat ini tidak diketahui. Ketersediaan model KO transgenik dan gen akan memungkinkan penelitian di masa depan untuk menetapkan peran ekspresi gen syok panas yang diinduksi stres selama penuaan normal atau adaptasi fisiologis terhadap faktor risiko jantung terkait penyakit.

Molecular Chaperones pada Penyakit Jantung yang Disebabkan oleh Ekspresi Protein Mutan

Peningkatan kadar protein yang salah lipatan atau terdenaturasi, serta injeksi mikro protein abnormal, merupakan penginduksi kuat ekspresi gen HSP. 14 59 Studi terbaru menunjukkan bahwa pendamping Hsc70 berinteraksi secara tidak langsung dengan CFTR yang menyimpan mutasi lipat F508 yang umum mendukung gagasan umum tentang peran biologis mereka dalam penyakit manusia. 20

Dari perspektif biologi pendamping, penyakit jantung yang timbul dari mutasi pada gen yang mengkode komponen aparatus kontraktil atau protein saluran ion pada dasarnya adalah masalah protein abnormal. Beberapa mutasi protein sarkomer telah terlibat dalam patogenesis kardiomiopati hipertrofik familial, termasuk rantai berat dan ringan miosin, subunit troponin I dan T, protein pengikat miosin C, dan tropomiosin (Referensi 6 6 dan ditinjau dalam Referensi 7 7 ). Sementara pendamping Hsp27 berperan dalam polimerisasi aktin dan pendamping TRiC terlibat dalam pelipatan aktin dan tubulin, peran fisiologis sistem pendamping dan pendamping dalam pelipatan dan perakitan struktur sarkomer, dalam kondisi normal atau dalam penyakit, tetap menjadi misteri. Dapat dibayangkan, pendamping dapat mempengaruhi baik perbaikan atau degradasi protein sarkomer mutan, yang, pada akhirnya, mempengaruhi hubungan struktur-fungsi dan fenotipe penyakit. 212 Analisis in vitro pertama-tama diperlukan untuk menentukan apakah fungsi pendamping dapat mempengaruhi pelipatan protein produktif yang disebabkan oleh mutasi yang relevan, yang dapat divalidasi dalam model hewan yang sesuai. 18 213

Pendamping Molekuler dalam Biologi Vaskular

Ada banyak peluang untuk membedah fungsi pendamping selama sintesis dan sekresi peptida dan protein aktif biologis, proliferasi seluler, pensinyalan intraseluler, dan penataan ulang sitoskeletal. Hasil studi tersebut dapat mengidentifikasi target protein HSP spesifik dan spesifisitas di antara berbagai jenis sel dalam mempromosikan efek perlindungan vaskular estrogen. 214 215 Peran penting Hsp90 dan cochaperones dalam biologi reseptor steroid menunjukkan bahwa pendamping HSP memainkan peran klinis yang signifikan dalam efek terapi penggantian hormon pada wanita pascamenopause. 216 217 Studi epidemiologis telah menemukan bahwa manfaat perlindungan terhadap penyakit jantung koroner pada wanita pramenopause dihapuskan pada tahun-tahun pascamenopause. 218 219 220 Potensi tindakan protektif estrogen telah dikaitkan dengan sifat antioksidan dan vasoprotektifnya, menurunkan lipid darah dan lipoprotein, dan efek langsung pada dinding pembuluh darah. 221 Penting untuk menentukan apakah ekspresi Hsp yang diinduksi stres pada tikus yang dimodifikasi secara genetik berperan dalam respons vaskular terhadap cedera pada hewan jantan dan betina. 215

Pendamping Molekuler dan Penyakit Imunologis

Berbeda dengan peran sitoprotektif mereka yang mapan, protein stres tertentu telah terlibat dalam patogenesis penyakit kardiovaskular. Misalnya, peningkatan kadar serum antibodi terhadap homolog bakteri Hsp60 mamalia telah ditunjukkan pada pasien dengan kardiomiopati dan diabetes, pada individu tanpa gejala dengan stenosis karotis, dan pada lesi aterosklerotik pada kelinci dan manusia (diulas dalam Referensi 22222). Satu hipotesis adalah bahwa penyakit autoimun hasil dari reaktivitas silang peptida imunogenik, yang berasal dari pendamping bakteri dan mitokondria dan Hsp60 (chaperonin) dan dikenali oleh limfosit T /δ yang diaktifkan. 223 224 Respon imun humoral dan penanda seropositif terhadap famili Hsp70 (terutama ER Grp78 dan Hsc70) dari parasit protozoa Trypanosoma cruzi telah terlibat dalam patogenesis penyakit Chagas, 224A penyebab paling umum gagal jantung kongestif di Amerika Latin (lihat Tabel). Meskipun studi korelatif ini memiliki keterbatasan yang melekat, penelitian masa depan untuk menetapkan kausalitas dapat membuka jalan untuk mengembangkan vaksin atau terapi baru lainnya untuk pengobatan dan pencegahan.

Aplikasi Terapi Potensial dari Molecular Chaperones

Strategi yang dapat meningkatkan tingkat pemulihan fisiologis setelah pemingsanan pascainfark dan disfungsi ventrikel tetap menjadi tujuan penting dalam pengelolaan pasien dengan infark miokard akut. Karena manuver menggunakan baik jaringan atau hipertermia seluruh tubuh yang rumit dan tidak praktis pada manusia sadar, strategi farmakologis yang meningkatkan ekspresi protein stres untuk perlindungan isotermal memiliki potensi manfaat terhadap kerusakan iskemik pada jantung, ginjal, dan otak. Inhibitor proteasome, yang secara sementara meningkatkan tingkat protein yang tidak dilipat di dalam sel, adalah salah satu pendekatan potensial. 225 Pendekatan alternatif mungkin melibatkan pengembangan molekul kecil dan peptida 226 226A yang meniru aksi in vivo pendamping dengan manfaat terapeutik.

Perspektif

Peran protein stres dalam cardioprotection telah diakui sebagai salah satu arah masa depan yang paling penting dari penelitian penyakit jantung iskemik. 227 Karena jumlah individu yang terkena sangat besar, intervensi terapeutik yang berkontribusi pada perubahan kecil dalam morbiditas dan mortalitas pasca-infark miokard, misalnya, dapat memiliki efek dramatis pada hasil klinis secara keseluruhan. Peluang untuk mengatasi peran fisiologis pendamping sitoprotektif pada penyakit jantung perlu diperluas untuk memasukkan kemungkinan peran mereka selama kondisi kronis (aterosklerosis, hipertensi, diabetes, kelainan genetik, dan penyakit jantung katup) yang berkumpul melalui jalur umum, mengakibatkan gagal jantung dan kematian mendadak. Aliansi strategis di antara tim peneliti dapat menempa arah baru dan mempercepat kemajuan di bidang yang menjanjikan ini, yang, pada akhirnya, dapat berhasil mengeksploitasi jalur endogen untuk meningkatkan kesehatan fisiologis dan mengurangi gesekan fisiologis yang terkait dengan penyakit kardiovaskular.

Singkatan dan Akronim yang Dipilih

CFTR=regulator konduktansi transmembran fibrosis kistik
ER=retikulum endoplasma
ERK=kinase responsif ekstraseluler
grp=protein terkait glukosa
HO=heme oksigenase
Hsc=serumpun sengatan panas
HSF=faktor transkripsi kejutan panas
HSP=keluarga kejut panas dari protein stres
Hsp=protein kejut panas
JNK=c-Jun N-terminal kinase
MAPK=protein kinase yang diaktifkan oleh mitogen
MAPKAP=Protein kinase yang diaktifkan MAPK
MW=berat molekul
ROS=spesies oksigen reaktif
SAPK=protein kinase yang diaktifkan oleh stres
TRIC=Kompleks cincin TCP-1
VSMC=sel otot polos pembuluh darah

Gambar 1. Ringkasan sinyal patofisiologis utama yang mengaktifkan sintesis HSP (kiri garis solid vertikal) dan fungsi potensial HSP (kanan garis solid vertikal). Cedera seluler dimanifestasikan oleh peningkatan generasi ROS, ketersediaan besi redoks-aktif, peroksidasi lipid membran, dan kerusakan protein, antara lain. 92 Sumber ekstraseluler ROS (A) dapat berupa sel endotel, VSMC, dan bahkan miosit di jaringan sekitar mitokondria, transpor elektron molekul oksigen (B) dapat menjadi sumber intraseluler utama untuk pembentukan ROS.Kalsium bebas intraseluler (C), yang meningkat 10 kali lipat dalam 10 menit reperfusi, 228 229 telah terlibat dalam aktivasi protease (D), yang, pada gilirannya, dianggap berkontribusi pada cedera miokard intraseluler. 230 231 232 Kerusakan sitoskeleton (E) adalah kejadian awal cedera iskemik, yang menyebabkan disfungsi ventrikel atau "kejutan miokard" ketika cedera reversibel. 87 Cedera miokard juga dapat terjadi dari perekrutan leukosit polimorfonuklear (PMNs) melalui berbagai mekanisme ke dalam wilayah iskemik dan dengan pelepasan radikal bebas yang diturunkan oksigen (A), enzim lisosom sitotoksik (F), protease ekstraseluler (G), dan komplemen. aktivasi (H) (ditinjau dalam Referensi 233). Sinyal fisiologis yang beragam diperkirakan mengaktifkan HSF1 (I) yang dapat diinduksi stres, yang mengikat elemen kejutan panas spesifik urutan (HSE) (J), yang terkandung dalam promotor semua HSP (K). Meskipun mekanisme yang tepat dari perlindungan iskemik yang dimediasi Hsp70 kurang dipahami, ini secara luas dikaitkan dengan sifat biologis "pendamping molekuler," yang diusulkan untuk membantu dalam perakitan atau perbaikan protein yang baru disintesis atau rusak. 11 234 235 Dalam istilah fisiologis, fungsi potensial untuk molekul pendamping di jantung iskemik meliputi: pelipatan protein polipeptida yang baru disintesis penting untuk mempertahankan metabolisme oksidatif setelah kerusakan miosit (L), perlindungan mitokondria dari ROS dan sitokin seperti TNFα 204 236 dan translokasi protein yang baru disintesis selama perbaikan organel (M), perbaikan protein struktural kritis setelah perubahan sitoskeletal yang diinduksi iskemia (N), 237 daur ulang vesikel membran (Hsc70) (O), pengangkutan produk sampingan toksik potensial untuk degradasi oleh proteasom (P), 78 238 239 supresi sitokin proinflamasi seperti pro-interleukin-1β (Q), 204 236 240 supresi NADPH oksidase dan ledakan oksidatif oleh respon kejutan panas (R), 241 perlindungan oleh produksi NO dari sintesis yang dapat diinduksi ekspresi HSP (S), 61 242 243 244 245 246 pencegahan apoptosis baik melalui mitokondria pendamping Hsp60 pengikatan sitokrom C dan/atau pengikatan Hsp70 dari target sitosol (T), perbaikan saluran ion 36.204 (U), sintesis kolagen oleh pendamping Hsp47 untuk fibrosis reparatif (V), 180 dan modulasi cedera iskemik yang dimediasi imun (W). 241

Gambar 2. Skema yang diusulkan untuk siklus reaksi kompleks pendamping Hsc70 dalam pelipatan substrat hipotetis dalam sel. Mulai dari bagian bawah gambar, pendamping Hsc70 (A) terdiri dari domain N-terminal ATPase dan C-terminal untuk mengikat substrat target. Hsp40 (B), homolog eukariotik dari DnaJ, baik mengikat protein yang tidak dilipat (UPs) terlebih dahulu (C) dan kemudian mengikat Hsc70.ADP, atau mengikat ke kompleks Hsc70.ADP.UP (D), yang memiliki konsentrasi rendah pada/ off rate untuk UP. Beberapa nasib yang berbeda untuk kompleks Hsc70.ADP.UP yang dibayangkan, masing-masing tergantung pada penggantian Hsp40 oleh mitra aksesori yang berbeda, khususnya, Hip (Hsc70-interacting protein), Hop (Hsc70/Hsp90-organizing protein), dan Hap (protein aksesori Hsc70). 166 247 248 Setelah Hsp40 dilepaskan, Hip berikatan dengan domain ATPase dari Hsc70 (E), merangsang aktivitasnya, dan kemudian tetap terikat untuk menstabilkan kompleks substrat ADP-Hsc70, menunjukkan bahwa ia mungkin memainkan peran dalam pengangkutan substrat dalam sel (F). 166 Hop berfungsi sebagai penghubung fisik antara Hsc70 dan Hsp90 (G), mungkin untuk memfasilitasi transfer UP antara pendamping ini. Apakah Hop mengubah aktivitas ATPase Hsc70 atau tidak masih kontroversial. 249 Fungsi Hup, yang merangsang pelepasan UPs dari Hsc70 (H) dan mengubah oligomer Hsc70 menjadi monomer (I), masih harus ditetapkan. Energi yang ditransfer dari hidrolisis ATP, langkah pembatas laju dari siklus pendamping eukariotik, digunakan dalam siklus yang berurutan untuk membantu pelipatan dan mencegah agregasi dan degradasi. Untuk tujuan ini, dua protein terkait, BAG-1 (tidak ditampilkan) dan Hap (J), yang mengikat domain Hsc70 ATPase, juga menghambat pengikatan Hsp70 ke substrat protein yang tidak dilipat secara in vitro, menunjukkan bahwa protein ini mungkin berperan dalam mempertahankan kontrol kualitas dengan mengarahkan interaksi nonproduktif menuju degradasi 250 (ilustrasi disediakan oleh LE Hightower, University of Connecticut, Storrs).

Tabel 1. Kelas Utama HSP dalam Biologi Kardiovaskular

mHsp75 menunjukkan mitokondria Hsp75 HIF-1, faktor transkripsi yang diinduksi hipoksia 1 dan MKBP, protein kinase distrofi miotonik.

Dr Benjamin didukung oleh American Foundation for Medical Research, National Institutes of Health, dan Penghargaan Investigator Didirikan dari American Heart Association. Kami berterima kasih kepada R. S. Williams, R. Meidell, A. Davis, P. Thomas, dan R. Sohal atas komentar kritis mereka mengenai naskah kami.


Abstrak—Bagaimana sel merespons stres adalah masalah utama dalam biologi kardiovaskular. Berbagai tekanan fisiologis (misalnya, panas, hemodinamik, protein mutan, dan cedera oksidatif) menghasilkan banyak perubahan dalam sel yang pada akhirnya mempengaruhi struktur dan fungsi protein. Sel-sel dari filum yang berbeda memulai serangkaian peristiwa yang melibatkan protein esensial, molekul pendamping, dalam keputusan untuk memperbaiki atau mendegradasi protein yang rusak sebagai strategi pertahanan untuk memastikan kelangsungan hidup. Bukti akumulatif menunjukkan bahwa pendamping molekuler seperti heat shock family of stress protein (HSPs) secara aktif berpartisipasi dalam serangkaian proses seluler, termasuk sitoprotektif. Fleksibilitas keluarga HSP di mana-mana lebih ditingkatkan oleh jaringan regulasi yang dapat diinduksi stres, baik pada tingkat transkripsi dan pascatranskripsi. Dalam tinjauan ini, kami membahas regulasi dan fungsi pendamping HSP dan signifikansi klinisnya dalam kondisi seperti hipertrofi jantung, cedera dinding pembuluh darah, operasi jantung, prakondisi iskemik, penuaan, dan, mungkin, mutasi pada gen yang mengkode protein kontraktil dan saluran ion. .

Stres fisiologis mulai dari iskemia miokard hingga mutasi genetik menghasilkan keadaan penyakit di mana kerusakan protein dan struktur protein yang salah lipatan merupakan penyebab umum. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Bagaimana respon sel? Beberapa jalur endogen terlibat dalam memulihkan homeostasis seluler, tetapi satu mekanisme yang ditandai dengan baik yang melibatkan pelipatan protein adalah keluarga kejutan panas dari protein stres, atau HSP. 10 11 Pemahaman tentang mekanisme yang mendasari fungsi HSP disediakan oleh 2 bukti utama: (1) pelipatan yang benar dari banyak protein dalam sel membutuhkan mesin pelipat protein, molekul pendamping, 12 13 dan (2) perbaikan pendamping HSP didenaturasi protein atau mempromosikan degradasi mereka setelah kejutan panas. 14 15

Studi genetik memberikan bukti yang meyakinkan dalam filum yang berbeda bahwa ekspresi berlebih dari protein stres adalah cara sitoprotektif yang kuat, bahkan di jantung yang utuh. 10 16 17 18 Demikian pula, studi biokimia telah menunjukkan bahwa pendamping Hsc70 meningkatkan lipatan produktif mutasi F508 umum CFTR. Ini menunjukkan peran fisiologis pendamping HSP dalam penyakit manusia. 19 20 Mekanisme divergen yang menghasilkan protein seluler abnormal atau salah lipatan menyatu menjadi jalur umum, yang mengarah ke peningkatan kadar protein stres sitoprotektif, yang menurunkan atau menetralisir efek merusak dari stres akut atau kronis.

Dalam ulasan ini, kami merangkum pengetahuan saat ini tentang regulasi dan fungsi pendamping individu (misalnya, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27, dan B-crystallin) dalam sistem kardiovaskular. Selain peran mapan mereka dalam kelangsungan hidup sel (nekrosis dan apoptosis), kami akan menekankan bukti yang muncul mengenai fungsi pendamping dalam adaptasi fisiologis selama hipertrofi jantung, prakondisi iskemik, cedera dinding pembuluh darah, stres oksidatif, dan penuaan. Meskipun saat ini kami hanya dapat berspekulasi tentang peran mereka dalam penyakit jantung tertentu, kami akan membahas banyak peluang potensial untuk menetapkan apakah pendamping HSP memberikan efek atau memainkan peran fisiologis langsung dalam riwayat penyakit akibat mutasi alat kontraktil jantung ( misalnya, kardiomiopati hipertrofik) dan saluran ion (misalnya, sindrom long-QT) pada manusia.

Definisi dan Nomenklatur

Apa itu Protein “Heat Shock” Stres?

Istilah protein "kejutan panas" adalah keliru tetapi tetap sebagai warisan penemuan kebetulan Ritossa 21 bahwa sengatan panas menghasilkan embusan kromosom sel kelenjar ludah di Drosophila. Stres panas (≈5° di atas suhu pertumbuhan normal) meningkatkan sintesis cepat dari keluarga protein multigen, awalnya disebut protein kejut panas, 22 yang merupakan hasil dari respons yang sering disebut sebagai respons sengatan panas. 10 21 Stres panas subletal sebelumnya secara sementara meningkatkan kemampuan sel untuk menahan tantangan panas berikutnya yang mematikan. Fenomena ini, atau thermotolerance, memainkan peran kunci dalam meluncurkan banyak penelitian baik dalam model eksperimental in vitro dan in vivo di mana hubungan serupa ditemukan antara respons sengatan panas dan perlindungan terhadap hipoksia atau iskemia yang disimulasikan. Memang, beragam tekanan, termasuk logam berat, analog asam amino, peradangan, dan stres oksidatif/iskemik, menginduksi ekspresi gen HSP. Akibatnya, istilah "protein stres" atau "keluarga kejut panas dari protein stres" lebih disukai, meskipun banyak dari protein ini memiliki fungsi penting selama kondisi tanpa tekanan. 13

Protein stres termasuk dalam keluarga multigen dengan ukuran molekul berkisar dari 10 hingga 150 kDa dan ditemukan di semua kompartemen seluler utama. Konvensinya adalah memberi nama protein stres dengan berbagai ukuran molekul sebagai berikut: Hsp27, Hsp70, dan Hsp90 sedangkan gen protein kejut panas ditetapkan sebagai berikut: hsp27, hsp70, dan hsp90. 23 Perbedaan antara yang diekspresikan secara konstitutif (misalnya, Hsc70 dan Hsp90β) atau anggota serumpun dari keluarga HSP dan isoform yang dapat diinduksi (Hsp70 dan Hsp90α, masing-masing) adalah sewenang-wenang, karena mengumpulkan bukti, dalam sistem in vivo yang relevan secara fisiologis, sekarang menunjukkan bahwa hubungan tersebut bergantung pada ekspresi terbatas sel dan jaringan.

Konsekuensi Seluler dari Panas dan Stres Iskemik Mirip

Seperti iskemia/reperfusi eksperimental, heat shock adalah stres yang mengganggu banyak proses metabolisme dan struktur seluler dan berujung pada kematian sel ketika ambang batas kritis terlampaui. 10 24 25 Stres panas dan iskemia menyebabkan kerusakan yang luas pada sitoskeleton, termasuk runtuhnya jaringan filamen menengah seperti benang menjadi agregat perinuklear yang besar, reorganisasi jaringan sitoplasma, relokalisasi serat yang mengandung aktin di sekitar nukleus, dan gangguan mikrotubulus dan spindel mitosis. 26 27 Pembengkakan mitokondria, hilangnya mitokondria, dan pelepasan fosforilasi oksidatif adalah fitur yang sama dari heat shock dan cedera iskemik reversibel awal. 28 29 30

Secara khas, sintesis protein umum dihambat setelah tantangan panas yang ekstrim sebagai akibat dari fosforilasi faktor inisiasi seperti eIF2α, yang mengganggu perakitan ribosom dan menonaktifkan protein pengikat tutup. 31 32 33 Sebaliknya, gen HSP diekspresikan secara efisien setelah tantangan panas, sebagian, sebagai akibat dari tidak adanya intron dalam beberapa gen yang dapat diinduksi (misalnya, hsp70). Selain itu, perubahan penyambungan mRNA dan stabilisasi mRNA yang diinduksi panas adalah mekanisme adaptif yang digunakan untuk menerjemahkan protein stres secara efisien, yang dapat mencapai 15% hingga 25% dari total protein intraseluler dalam beberapa menit setelah stres fisiologis dalam kondisi ini. 10 34 Secara kebetulan, beberapa pendamping sitosol mentranslokasi ke dalam nukleus, 35 di mana inhibisi perakitan kromatin DNA yang diinduksi panas memperlihatkan konformasi sensitif nuklease, fitur patognomonik dari apoptosis yang diinduksi oleh panas dan iskemia. 36 Perubahan yang kurang dramatis terlihat pada protein membran integral, lapisan ganda lipid, dan morfologi permukaan seluler. Penghentian rangsangan berbahaya diikuti oleh degradasi mRNA Hsp yang cepat dan efisien. 37 38 39

Seperti disebutkan sebelumnya, tekanan panas subletal sebelumnya atau "pengkondisian hipertermik" sangat melemahkan semua perubahan seluler yang diinduksi panas ke tantangan panas parah berikutnya. Selain itu, perlakuan awal dengan panas menghasilkan “toleransi silang” terhadap berbagai jenis stres fisiologis. Misalnya, perlindungan jantung iskemik yang utuh setelah perlakuan awal panas dapat berlangsung selama berjam-jam hingga berhari-hari. 40 41 Wawasan yang diperoleh dari peran fisiologis ekspresi Hsp selama respons sengatan panas telah berkontribusi pada pemikiran terkini tentang fungsi pendamping dalam keadaan patologis yang cenderung menghasilkan pelipatan protein yang abnormal.

Perhatian terutama difokuskan pada induksi pendamping HSP dan mekanisme perbaikan potensial yang terlibat dalam mengurangi cedera iskemia/reperfusi. Gambar 1 secara skematis merangkum banyak dari konsep-konsep ini dan mengilustrasikan beberapa mekanisme yang diketahui dengan baik yang terlibat dalam cedera miokard iskemik, termasuk stres/kerusakan oksidatif, kelebihan kalsium dan protease teraktivasi, pelepasan enzim proteolitik dan lisosom, perubahan sitoskeleton, dan aktivasi komplemen.

Berbagai Tekanan Fisiologis Menginduksi Ekspresi Gen HSP Melalui Mekanisme Umum

Induksi cepat ekspresi protein stres dicapai melalui mekanisme aktivasi transkripsi dan terjemahan preferensial. 10 42 HSF (HSF1 hingga HSF4) mengatur sintesis HSP yang dapat diinduksi selama perkembangan, pertumbuhan, dan adaptasi. 42 43 44 Sedangkan gen salinan tunggal esensial mengkode HSF dalam Saccharomyces cerevisiae dan Drosophila, 45 46 beberapa HSF telah diidentifikasi pada anak ayam, tanaman, tikus, dan manusia. 47 48 49 50 51 Dua HSF (HSF1 dan HSF2, mengkode protein 75 dan 72 kDa, masing-masing) telah diidentifikasi pada tikus. 49 Baik HSF1 maupun HSF2 tidak dapat diinduksi panas, tetapi HSF1 mengalami hiperfosforilasi dalam a rascara yang bergantung pada anggota subfamili MAPK (ERK1, JNK/SAPK, dan protein kinase p38) selama stres fisiologis. 52 53 Selama kondisi tanpa tekanan, baik aktivitas pengikatan DNA maupun aktivitas transkripsi vertebrata HSF1 berada di bawah kontrol negatif yang ketat (ditinjau dalam Referensi 44 44 ). Namun, masih kontroversial apakah represi oleh pendamping Hsp70, sekuestrasi fosforilasi konstitutif pada residu serin, atau regulator penghambat yang tidak diketahui adalah mekanisme utama yang mendasari aktivasi yang dapat diinduksi stres dan penonaktifan cepat HSF1. 43 54 55 56

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa sebagai respons terhadap panas dan iskemia simulasi, mekanisme untuk aktivasi HSF1 serupa, jika tidak identik, dalam sel miogenik 57 dan bahwa penipisan ATP intraseluler memainkan peran penting dalam memicu pengikatan HSF1-DNA. aktivitas. 58 Dalam kondisi penyakit, penginduksi aktivasi HSF1, seperti LDL teroksidasi dan intermediet nitrogen reaktif, diperkirakan meningkatkan kerusakan protein, yang memicu upregulasi ekspresi gen HSP. 59 60 61 Namun, aktivasi transkripsi dari jalur HSF1 tidak memerlukan sintesis protein baru, karena transaktivator yang sudah ada sebelumnya (HSF1) tidak aktif dalam keadaan tidak tertekan. 43 56 57 Stres fisiologis, seperti panas dan iskemia, menginduksi monomer HSF1 untuk dioligomerisasi sebagai homotrimer, yang kemudian mengikat motif spesifik urutan hulu, elemen kejutan panas, dalam promotor semua gen HSP yang diinduksi stres 62 63 (Gambar 1I melalui 1K). Kami baru-baru ini membuat model knockout gen Hsf1 dan menunjukkan dalam studi in vitro persyaratan penting dari jalur pengaturan ini dalam pertahanan seluler dan termotoleransi. 36 Selain itu, ekspresi protein stres telah terlibat dalam mempromosikan kelangsungan hidup sel tumor 64 dan perlindungan jantung iskemik. 16 17 18

Stres Protein Berlebihan Meningkatkan Kecepatan Pemulihan Fisiologis Jantung Iskemik

Literatur substansial menjelaskan induksi Hsp70 oleh iskemia, 57 65 66 peran potensial Hsp70 dalam prakondisi iskemik, 40 67 dan korelasi terbalik antara ekspresi Hsp70 yang diinduksi oleh prakondisi iskemik atau termal dan ukuran infark pada model hewan. 41 68 69 70 Selain itu, ekspresi paksa Hsp70 menyampaikan efek sitoprotektif dalam sel yang dikultur, termasuk miosit jantung yang mengalami iskemia simulasi. 71 72 Secara khusus, ekspresi berlebih dari protein kejut panas 70-kDa utama (Hsp70) pada tikus transgenik meningkatkan fungsi miokard, 16 17 18 mempertahankan pemulihan fungsional metabolik, 18 dan mengurangi ukuran infark 73 setelah iskemia/reperfusi. Selain Hsp70, Hsp27 dan B-crystallin dapat melindungi kardiomiosit primer terhadap kerusakan iskemik. 74 Meskipun mekanisme yang tepat tidak cukup dipahami, protein stres dianggap memediasi cardioprotection melalui fungsi biologis mereka sebagai pendamping molekuler.

Protein Stres Dapat Berfungsi sebagai Molecular Chaperones

Pendamping molekuler, seperti Hsp70 dan B-crystallin, adalah protein yang memfasilitasi pelipatan, perakitan, dan pembongkaran protein lain tetapi bukan merupakan bagian dari produk jadi. 75 Karena banyak protein memerlukan pendamping untuk melipat, protein ini merupakan komponen penting dalam tahap akhir dari dogma sentral biologi molekuler: DNA↔RNA→polipeptida→protein terlipat. 11 75 Pendamping in vitro berfungsi untuk mencegah agregasi protein lain di bawah kondisi stres dan untuk mempromosikan pemulihan aktivitas enzimatik substrat protein terdenaturasi atau enzim (misalnya, sitrat sintase, -galaktosidase, atau luciferase) pada penghapusan stres. 11 13 76

Gambar 2 menunjukkan secara skematis siklus reaksi pendamping Hsc70 dalam kaitannya dengan cochaperone dan substrat molekuler yang baru-baru ini diidentifikasi dalam sel. Misalnya, pendamping Hsp40 memainkan fungsi katalitik utama dalam memuat substrat target ke siklus pengikatan/pelepasan Hsc70. 77 Meskipun mekanisme fungsi-fungsi ini masih muncul, fungsi utama dari molekul pendamping adalah untuk (1) mengikat sementara dan menunda pelipatan rantai polipeptida yang baru lahir sampai sintesis selesai, (2) mempertahankan rantai polipeptida dalam konformasi yang sesuai yang cocok untuk translokasi melintasi membran organel, (3) mencegah agregasi dari interaksi intramolekul atau antarmolekul, (4) secara aktif membongkar vesikel berlapis klatrin, (5) menahan kompleks aporeseptor steroid dalam keadaan kompeten ligan (Hsp90 dan cochaperone), dan (6) membantu dalam mendegradasi racun metabolit dengan mempromosikan ubiquination dan lisis proteasome 78 (Gambar 1L sampai 1P).

Kasus Molecular Chaperones pada Penyakit Jantung

Minat klinis yang luas ke dalam fungsi biologis pendamping molekuler meluas ke berbagai patologi manusia dari kondisi degeneratif seperti penyakit Alzheimer, prion, amiloidosis, pembentukan katarak, penyakit sel sabit, cystic fibrosis, dan berbagai penyakit jantung termasuk iskemia miokard. Peristiwa awal yang membangun kembali aliran tepat waktu dari miokardium iskemik baik melalui trombolitik, angioplasti langsung, atau lisis bekuan spontan sangat penting untuk meningkatkan penyelamatan miokard dan mengurangi morbiditas dan mortalitas. 79 80 Meskipun demikian, iskemia berulang baik dari pecahnya plak yang tidak stabil atau gagal jantung kongestif dapat mempersulit perjalanan klinis infark miokard akut. Pada infark miokard akut tanpa komplikasi, pemulihan fisiologis pada tingkat sel dimulai dalam beberapa menit tetapi dapat berlangsung selama berminggu-minggu hingga berbulan-bulan sebelum perbaikan miokard selesai. Dengan demikian, mekanisme perlindungan endogen memiliki relevansi klinis dalam mengurangi efek penyakit jantung iskemik.

Aktivitas Biokimia Jalur Regulasi HSP dan Pendamping Selama Iskemia Miokard

Dalam pekerjaan sebelumnya yang dilakukan untuk menentukan stimulus terdekat untuk aktivasi HSF, kami mengamati bahwa asidosis intraseluler yang parah (pH 6,7) tidak cukup untuk menginduksi pengikatan DNA HSF1 dalam sel-sel miogenik yang dikultur yang terpapar pada iskemia yang disimulasikan, jika simpanan ATP dipertahankan. 58 Sebaliknya, deplesi ATP yang parah (65%) merangsang pengikatan DNA HSF1, bahkan jika pH dipertahankan dalam kisaran normal. 58 Pada jantung iskemik utuh, iskemia 15 menit, yang menghasilkan cedera reversibel, dikaitkan dengan penurunan serupa (65%) simpanan ATP berenergi tinggi, sedangkan cedera mematikan ditemukan dengan iskemia berkepanjangan (>40 menit) dan >90% deplesi dari kolam berenergi tinggi. 81 KM untuk aktivitas ATPase yang lemah dari Hsc70 sapi adalah 1 hingga 2 mol/L, 3 kali lipat di bawah konsentrasi milimolar dari kumpulan nukleotida adenin intraseluler. 75 Oleh karena itu, aktivasi ATP-dependen dari jalur regulasi HSF1 dan sifat biokimia molekul pendamping tidak mungkin terpengaruh selama periode iskemia transien atau cedera iskemik miokard reversibel.

Bukti prinsip yang menunjukkan efek kardioprotektif Hsp70 pada hewan transgenik yang mengalami iskemia/reperfusi menunjukkan bahwa metode farmakologis atau genetik untuk meningkatkan ekspresi protein stres di miokardium pasien yang berisiko kejadian iskemik akut dapat membatasi cedera iskemik. 82 Namun, pengetahuan dasar tambahan diperlukan mengenai (1) hubungannya dengan jalur endogen lain yang terlibat dalam perlindungan miokard dari stres/kerusakan oksidatif, (2) spesifisitas fungsional di antara anggota pendamping dari keluarga multigen HSP, dan (3) kontribusi ini jalur selama iskemia akut dan keadaan fisiologis lain yang memicu respons kejutan panas, sebelum aplikasi klinis.

Protein Stres dan Jalur Antioksidan untuk Kardioproteksi

Sejak tahun 1970-an, hipotesis bahwa pemulung radikal bebas dapat memperbaiki kerusakan oksidatif selama iskemia/reperfusi telah dikejar oleh dokter dan peneliti. 83 Dalam sistem model mulai dari transgenik Drosophila untuk tikus, overekspresi katalase, superoksida dismutase, atau glutathione peroksidase cenderung protektif terhadap stres oksidatif. 84 85 86 Stres oksidatif, dari iskemia/reperfusi, juga memainkan peran sentral dalam cedera organ vital seperti otak, ginjal, dan jantung. ROS dianggap berkontribusi terhadap disfungsi ventrikel, atau aritmia, atau kerusakan sel progresif atau kematian setelah cedera iskemik (Gambar 1). 87 88 89 90

Hasil yang tidak sesuai telah dilaporkan dari upaya untuk memberikan antioksidan selama dan setelah iskemia/reperfusi miokard. 91 92 Antioksidan eksogen, yang terbatas pada ruang interstisial, mungkin memiliki kemampuan terbatas untuk melindungi protein intraseluler terhadap ROS. Misalnya, radikal bebas hidroksil (·OH), yang diyakini sebagai agen utama kerusakan oksidatif, sangat reaktif dengan substrat tipikal sehingga waktu paruhnya pada 37°C adalah 7×10 10 detik. 93 Dengan demikian, sulit untuk membayangkan bahwa pemberian antioksidan eksogen, pada konsentrasi yang layak secara fisiologis, dapat secara efektif mencegah kerusakan makromolekul yang diinduksi OH. Strategi yang berpotensi lebih efektif mungkin secara fisiologis meminimalkan produksi ·OH. Memang, ekspresi berlebihan dari anggota keluarga HSP dapat memberikan satu jalan seperti itu. Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa selama perlindungan terhadap iskemia miokard, peningkatan regulasi kadar protein stres berkorelasi dengan peningkatan aktivitas enzim katalase, menunjukkan potensi interaksi aditif atau sinergis dari jalur endogen ini terhadap stres oksidatif. 40 94 95 Pertanyaan penting yang belum terjawab adalah apakah fungsi protein stres, sebagai pendamping molekuler, melengkapi fungsi unik enzim antioksidan dalam melindungi terhadap stres/kerusakan oksidatif.

Pendamping Molekuler dari Kompartemen Sitosol/Nuklir

Tabel menunjukkan kelas utama HSP, kompartemen intraseluler, fungsi diduga mereka, dan potensi signifikansi dalam biologi kardiovaskular.

Pendamping Hsp70

Anggota keluarga Hsp70 adalah kelompok yang paling banyak dipelajari dan berlimpah dalam sel eukariotik. 96 Dalam sitosol, Hsp70 berikatan dengan polipeptida yang baru lahir sebelum dilepaskan dari ribosom. 97 Semua anggota kelas pendamping Hsp70 memiliki dua domain berbeda: domain ATPase terminal-N yang sangat terkonservasi dan domain terminal-C yang lebih divergen, yang mengikat peptida hidrofobik pendek dari substrat target (Gambar 2A). Fungsi pendamping Hsp70 membutuhkan domain N-terminal ATPase, yang menarik, secara struktural mirip dengan aktin otot rangka kelinci meskipun sedikit kesamaan urutan. 100

Hubungan struktur/fungsional Hsp70 ini kemungkinan memberikan aktivitas pendamping in vivo dalam perlindungan jantung. Dalam hal ini, hampir tidak ada yang diketahui tentang pendamping Hsc70 konstitutif, yang berbagi homologi urutan >80% dengan Hsp70. Dapat dibayangkan, peningkatan regulasi sederhana dari Hsc70 konstitutif dapat meningkatkan manfaat kardioprotektif yang substansial. Namun, peningkatan regulasi HSP di luar ambang batas kritis mungkin memiliki konsekuensi seluler yang merusak. 101 Fungsi yang berbeda antara anggota Hsp70 dilaporkan baru-baru ini ada di wilayah di luar domain pengikatan peptida, menunjukkan tingkat kerumitan tambahan untuk fungsi pendamping in vivo. 102

Pendamping Hsp90

Gambar 2 menunjukkan bahwa pendamping Hsp90 adalah komponen dari siklus reaksi yang melibatkan kompleks pendamping Hsc70 dan protein yang baru disintesis. Selain itu, anggota keluarga Hsp90, Hsp90α dan Hsp90β, yang merupakan 1% hingga 2% dari total protein sitoplasma terlarut, memiliki karakteristik hubungan fungsional in vivo terbaik dengan protein target, reseptor hormon steroid. 103 Hsp90 dengan mitra pendamping, Hsp70 dan Hsp56, secara langsung mengikat, menstabilkan, dan mempertahankan kompleks aporeceptor dalam konformasi yang tidak aktif. Pengikatan ligan (misalnya, estrogen) ke kompleks aporeceptor memicu hidrolisis ATP oleh Hsp90, yang berdisosiasi dari reseptor "aktif" yang sekarang dapat mengikat motif pengenalan urutan-spesifik dan menginduksi transkripsi gen target. 104 Selain itu, peningkatan kadar ekspresi Hsp90 mengacaukan reseptor estrogen/kompleks elemen responsif estrogen dan menurunkan regulasi ekspresi gen target responsif estrogen, yang menunjukkan loop umpan balik regulasi. 105

Fungsi pendamping Hsp90 dimediasi oleh jalur transduksi sinyal yang melibatkan berbagai protein kinase dari kedua jenis tirosin dan serin-treonin, kasein kinase II, eIF-2α yang diatur heme, dan berbagai protein seluler lainnya, seperti calmodulin, aktin, dan tubulin (diulas dalam Referensi 106 106 ). Akhirnya, pendamping Hsp90 dari Saccharomyces cerevisiae sangat penting untuk bertahan hidup di bawah semua kondisi, mendukung peran fisiologis penting mereka pada eukariota rendah. 107

Pendamping Sitosol dengan Minat Khusus dalam Biologi Jantung dan Pembuluh Darah

Berbeda dengan rekan-rekan Hsp70 dan Hsp90 di mana-mana, anggota spesifik dari HSP MW kecil (HO-1 atau Hsp32, Hsp27, B-crystallin, dan pendamping Hsp20) menunjukkan ekspresi terbatas jaringan, menunjukkan potensi sifat khusus dalam sistem kardiovaskular.

H2O yang dapat diinduksi (Hsp32)

H2O adalah enzim pembatas laju dalam degradasi heme menjadi biliverdin (antioksidan kuat), besi molekuler, dan karbon monoksida. Tiga gen salinan tunggal terkait mengkodekan isoform H O: HO-1, HO-2, dan HO-3. 108 109 110 HO-1 adalah protein stres 32-kDa bonafide (Hsp32) yang diinduksi oleh beragam tekanan fisiologis, termasuk hipoksia, iskemia/reperfusi, hemin, hidrogen peroksida, dan beberapa logam berat (selenium, arsenit, kobalt, kadmium , dan ion stannous). 108 109 110 Inducible Hsp32 (HO-1), isoform yang paling banyak diekspresikan, terdapat dalam sel miokard. 111

Hsp32, seperti bentuk NO sintase yang dapat diinduksi memediasi penghambatan trombosit yang bergantung pada guanylyl cyclase dan vasodilatasi VSMC. 112 113 114 Namun, gaya hemodinamik yang relevan secara fisiologis (tegangan geser dan regangan siklik) menginduksi ekspresi mRNA HO-1 tetapi tidak menginduksi ekspresi NO sintase, menunjukkan kekhususan jalur respons stres ini terhadap sinyal fisiologis. 115 Baik NO yang dilepaskan secara endogen atau yang diberikan secara eksogen menginduksi peningkatan ekspresi gen Hsp32 (HO-1) 3 hingga 6 kali lipat dan produksi CO di VSMCs 116 sama halnya, inhibitor timah protoporfirin-IX mencegah agregasi trombosit melalui induksi gen HO-1 ekspresi dan produksi CO2 di VSMCs aorta. 115 Pada VSMC tikus, pengobatan angiotensin II menurunkan ekspresi mRNA Hsp32 (HO-1) dengan cara yang bergantung pada kalsium. 117 Namun, hipertensi yang diinduksi angiotensin II meningkatkan ekspresi mRNA Hsp32 (HO-1) di aorta tikus, menunjukkan pengaruh utama faktor hemodinamik in vivo. 118

Beberapa jalur regulasi terlibat dalam induksi ekspresi gen Hsp32, terutama jalur HSF1 dan jalur faktor-1 transkripsi yang diinduksi hipoksia. 119 120 121 122 Meskipun bukti langsung dari fungsi pendamping Hsp32 kurang, ekspresi berlebihnya dalam beberapa jenis sel melindungi terhadap stres/kerusakan oksidatif. 123 124 125 Dengan demikian, penelitian untuk menentukan jalur regulasi yang tepat yang dirangsang oleh logam berat, hipoksia, dan stres oksidatif dapat memberikan wawasan baru tentang peran biologis Hsp32 (HO-1) dalam memodulasi stres/kerusakan oksidatif selama iskemia/reperfusi, tonus vaskular (misalnya, hipertensi), dan penghambatan agregasi trombosit dan/atau proliferasi VSMC setelah angioplasti balon.

Hsp25/27 pendamping

Setelah penemuannya sebagai penghambat polimerisasi aktin, 126 pendamping Hsp 25/27 (Hsp25 pada tikus dan Hsp27 pada manusia) telah terbukti memainkan peran utama dalam dinamika filamen aktin dalam beragam jenis sel. Rangsangan fisiologis (stres oksidatif, sitokin, dan faktor pertumbuhan) secara dramatis meningkatkan fosforilasi Hsp27 manusia pada residu Ser15, Ser78, dan Ser83, yang penting untuk toleransi yang didapat. 127 128 129 Fosforilasi Hsp25/27 dikatalisis oleh MAPKs (p38-MAPKs, JNKs, atau SAPKs) dan ERKs. 130 Pada jantung dewasa yang perfusi, p38-MAPK dan JNK/SAPK diaktifkan setelah iskemia/reperfusi. 131 Menanggapi pengobatan ROS, aktivasi p38-MAPK meningkatkan aktivitas MAPKAP kinase 2, yang memfosforilasi Hsp27. 132

Dalam sel endotel manusia, penghambatan aktivasi p38-MAPK yang diinduksi faktor pertumbuhan endotel vaskular menghapus fosforilasi Hsp27, polimerisasi aktin, dan migrasi sel, menunjukkan kemungkinan hubungan antara Hsp27 dan angiogenesis. 133 Bersama-sama, bukti yang tersedia menempatkan p38-MAPK sebagai aktivator hulu fosforilasi Hsp25/27 yang diinduksi stres, dan jalur ini mendasari efek p38-MAPK pada reorganisasi aktin berfilamen, akumulasi serat stres, dan perekrutan vinculin di lokasi adhesi fokal. 134 Selanjutnya akan menjadi penting untuk menentukan apakah Hsp25/27 memberikan tindakan vasoprotektif dalam menanggapi kekuatan hemodinamik atau cedera dinding pembuluh darah. Namun, analisis langsung kemungkinan akan membutuhkan model knockout gen Hsp27.

B-Crystallin Chaperone (Hsp22)

Sedangkan Hsp27 terdeteksi dalam sel endotel, VSMC, dan kardiomiosit, pendamping B-kristalin diekspresikan hanya dalam kardiomiosit. 135 Baik Hsp27 dan B-crystallin secara struktural terkait HSPs bonafid dengan aktivitas pendamping in vitro tetapi, tidak seperti Hsp70, bukan protein pengikat ATP. 136 137 138 139 Meningkatnya minat terhadap regulasi dan fungsi protein B-crystallin (Hsp22), protein struktural utama lensa okular, terkait dengan ekspresi terbatas jaringannya dalam garis keturunan miogenik lurik dengan kapasitas oksidatif tinggi, seperti jantung dan serat otot rangka tipe I. 140 Dalam jaringan nonlenticular, ekspresi postnatal B-crystallin meningkat dan mencapai tingkat tertinggi di jantung orang dewasa (≈1% sampai 3% dari total protein terlarut), diikuti oleh otot rangka dan ginjal. 140 Studi imunohistokimia sebelumnya telah melokalisasi ekspresi B-kristalin tertinggi dalam serat konduksi jantung jantung dewasa. 141 Apakah perubahan ekspresi B-kristalin dapat menyebabkan kelainan sistem konduksi saat ini tidak diketahui tetapi menimbulkan kemungkinan yang menarik.

Meskipun ekspresi B-crystallin telah dilokalisasi ke pita Z dari sitoskeleton, dalam pola yang mirip dengan desmin dan aktin, 142 penelitian terbaru menunjukkan bahwa interaksi ini jauh lebih sementara dan dinamis sehubungan dengan target intraseluler, tergantung pada kondisi fisiologis. Pada miosit jantung yang tidak distimulasi, studi biokimia menunjukkan bahwa B-crystallin sangat larut dan tetap dalam fraksi sitosolik Panas atau iskemia memicu translokasi cepat B-crystallin ke dalam fraksi sitoskeletal/nuklear yang tidak larut, agregasi, dan interaksi spesifik pada pita Z (Referensi 142 142 dan IJ Benjamin, data tidak dipublikasikan, 1998). Signifikansi fisiologis untuk kecenderungan B-crystallin dan Hsp25/27 untuk membentuk kompleks hetero-oligomer besar (500 hingga 800 kDa) baik in vivo maupun in vitro setelah tekanan fisiologis tetap menjadi misteri. 143 144 Meskipun pendamping B-crystallin memberikan sitoproteksi untuk kardiomiosit, 74 mekanisme regulasi modifikasi pascatranslasi seperti fosforilasi, glikasi, dan deasetilasi pada fungsi B-kristalin menunggu analisis langsung dalam sistem kardiovaskular.

Protein Stres dan Pengembangan dan Diferensiasi Otot Lurik

Peningkatan ekspresi pendamping HSP MW kecil telah dijelaskan selama periode yang terkait dengan peningkatan sintesis protein, degradasi protein, dan reorganisasi seluler, seperti diferensiasi miogenik dan embriogenesis. 145 Ekspresi B-crystallin yang dibatasi jaringan selama miogenesis otot rangka mungkin memerlukan keluarga MyoD dari faktor transkripsi helix-loop-helix dasar, yang mengikat penambah E-box penting yang terkandung dalam promotor B-crystallin. 146 147 Kami baru-baru ini melaporkan bahwa ekspresi B-crystallin, tetapi tidak Hsp27, secara langsung terkait dengan peningkatan metabolisme oksidatif di otot rangka setelah stimulasi saraf kronis. 148 Namun, peran fisiologis upregulasi ekspresi Hsp27, yang mendahului diferensiasi awal sel induk embrionik murine, masih harus ditetapkan dalam garis keturunan miogenik. 149

Lebih sedikit yang diketahui tentang mekanisme pengaturan yang terlibat dalam ekspresi terbatas B-kristalin dalam miosit jantung. B-Crystallin banyak diekspresikan dalam perkembangan jantung awal yang dimulai pada hari embrio 8.5, menunjukkan peran baik sebagai protein struktural atau sebagai pendamping molekuler dalam stabilisasi myofiber. 150 Karena faktor Myod-like tidak ada di jantung, studi pengikatan in vitro ekstrak jantung telah melibatkan aktivitas transkripsi dari faktor stimulasi hulu pada elemen E-box dan faktor respons serum pada kotak CArG terbalik di jantung. Promotor B-kristalin. 151 Sejauh ini, survei perkembangan in vivo mengungkapkan bahwa ekspresi B-kristalin tidak terpengaruh pada otot rangka myf5 tikus nol atau jantung tikus nol d-HAND pada hari embrio 9.0 (I.J. Benjamin, data tidak dipublikasikan, 1998). 152 153

Pendamping Sitosol/Nuklir Lainnya

Beberapa HSP lain yang ada di kompartemen sitosol/nuklear berpotensi menarik dalam biologi kardiovaskular. Misalnya, protein 20-kDa sitosol, p20, banyak diekspresikan di jantung, rangka, dan otot polos dan dimurnikan bersama dengan pendamping B-kristalin dan Hsp27. 154 155 Meskipun ekspresi p20 tidak diinduksi oleh panas atau stres kimia, ia mengandung homolog C-terminal " domain-crystallin domain" yang dimiliki bersama oleh semua anggota HSP MW kecil. 138 Dalam VSMCs, p20 adalah substrat untuk protein kinase cAMP dan cGMP, menunjukkan peran pengaturan untuk fungsi yang didalilkan dalam pemeliharaan fisiologis tonus vaskular dan adaptasi terhadap cedera dinding pembuluh darah. 156

Anggota keempat dari HSP kecil (selain Hsp27, B-crystallin, dan p20), asosiasi protein pengikat protein kinase myotonic dan meningkatkan aktivitas protein kinase distrofi dan mencegah denaturasi yang diinduksi panas secara in vitro. 157 Myotonic distrofi protein kinase, tidak seperti Hsp27 atau B-crystallin, diregulasi di otot rangka pasien dengan distrofi miotonik, menunjukkan bahwa protein baru ini mungkin terlibat dalam patogenesis penyakit ini. 157

Anggota keluarga Hsp110 menunjukkan fungsi pendamping dan sitoprotektif, meskipun rincian tentang ekspresi relatif mereka dalam sel miokard dan distribusi regional dalam sistem kardiovaskular menunggu karakterisasi lebih lanjut. 158 Anggota keluarga Hsp110 tambahan termasuk Hsp105, Apg-1, dan Osp94. 159 160 161 Ada minat yang kuat dalam mengidentifikasi homolog mamalia dari ragi Hsp104, yang, alih-alih mencegah agregasi protein, tampaknya melarutkan kembali agregat protein yang tidak larut. 162

Sistem Pendamping Mitokondria Hsp70

Semua organisme memiliki mekanisme yang bergantung pada ATP untuk pelipatan dan perakitan protein di dalam organel. 11 13 Translokasi protein melintasi membran mitokondria membutuhkan pendamping mitokondria Hsp70 dalam matriks, di mana pelipatan ke keadaan asli selesai 13 (lihat Gambar 1).

Sistem Pendamping Mitokondria

Selain pendamping seperti Hsp70, pendamping mitokondria Hsp60 dan Hsp10 merupakan sistem terpisah yang menyediakan lingkungan yang diasingkan untuk melipat subset protein in vivo. 163 Cincin beranggota 7 ini disusun sebagai struktur silinder di mana pelipatan protein yang bergantung pada ATP terjadi di rongga pusatnya. 164 Bukti dari studi in vitro menunjukkan bahwa Hsp70 chaperones dan sistem chaperonin berfungsi secara kooperatif dalam pelipatan dan perakitan protein pada eukariota (ditinjau dalam Referensi 13 13 ).

Sistem Chaperonin Sitosolik

TRiC chaperonin dianggap setara fungsional chaperonin Hsp60/Hsp10 dalam sitosol eukariotik. Kompleks TRIC, yang terdiri dari cincin ganda beranggota 8 atau 9 dari subunit 55 hingga 65 kDa, diperlukan untuk melipat aktin dan tubulin in vivo. 165 Chaperonin TRIC membutuhkan komponen tambahan, seperti Hsp40, yang merangsang Hsc70 ATPase, untuk pelipatan protein dalam sitosol 77166 (lihat Gambar 2). Bukti yang tersedia menunjukkan bahwa chaperonin TRIC berfungsi pada tahap akhir pelipatan selama translasi sejumlah domain polipeptida yang terbatas. 13

Implikasi

Pendamping mitokondria dan pendamping hanya sedikit diinduksi oleh stres fisiologis pada kardiomiosit dan jantung. 167 Namun, lokasi mitokondria Hsp70 pendamping dan pendamping di situs utama produksi ROS dapat berfungsi untuk melengkapi mekanisme pertahanan baik enzimatik dan nonenzimatik untuk mengurangi cedera oksidatif dan meningkatkan tingkat pemulihan fisiologis setelah cedera iskemik. 168 169 Apakah overekspresi baik mitokondria Hsp75 pendamping atau pendamping dapat memberikan perlindungan setara atau unggul terhadap cedera iskemik saat ini tidak diketahui. Pertanyaan penting lainnya menyangkut apakah fungsi yang tumpang tindih dari pendamping Hsp70 dan sistem pendamping Hsp60 atau TRIC/Hsp40 dikoordinasikan untuk pelipatan protein de novo dan sitoproteksi potensial selama patogenesis penyakit jantung.

Pendamping Molekuler di ER

Protein yang Diatur Glukosa

Analisis pendamping ER mungkin kepentingan klinis tertentu, karena fungsi ER untuk mendegradasi atau memperbaiki protein yang rusak setelah iskemia miokard atau setelah protein mutan (misalnya, CFTR atau tiroglobulin) gagal melipat dengan benar. 11 170 171 Anoksia, kelaparan glukosa, dan ionofor kalsium menginduksi anggota kelas protein stres yang diatur glukosa mengikat Ca 2+, Grp170, Grp94, dan Grp78/BiP. 11 172 Perubahan variabel dalam ekspresi protein Grp78 telah dilaporkan setelah iskemia. 173 174 Meskipun "bersalah karena asosiasi" dengan pendamping sitosolik adalah peran yang diduga dari fungsi pendamping Grp dalam pengawasan protein dan kontrol kualitas, lebih banyak studi tentang ekspresi mereka diperlukan dalam keadaan patofisiologis yang terkait dengan ekspresi, glikosilasi pascatranslasi, dan sekresi protein abnormal melalui jalur ER-Golgi.

Hsp47 pendamping

Glikoprotein Hsp47 pengikat kolagen 47-kDa adalah anggota dari superfamili serpin (inhibitor protease serin) dan sangat diinduksi oleh stres panas atau keadaan patofisiologis (misalnya, fibrosis hati) yang terkait dengan peningkatan sintesis kolagen. 175 Hsp47 berada di ER dan berisi sinyal retensi C-terminal Arg-Asp-Glu-Leu ER. 176 Hsp47 mengikat secara sementara ke kolagen tipe I hingga IV dan dengan kuat ke substrat kolagen yang terdenaturasi sehingga perannya dalam pemrosesan dan transportasi prokolagen tampaknya sudah mapan. 177 Studi masa depan sekarang harus membahas kemungkinan relevansi biologis dan klinis dari ekspresi Hsp47 pada permulaan dan perkembangan keadaan patofisiologis, seperti infark miokard, kardiomiopati idiopatik dan hipertrofi, dan hipertensi, di mana fibrosis miokard menonjol. 178

Tantangan Saat Ini dan Arah Masa Depan

Pemulihan fisiologis jantung iskemik dimulai dalam beberapa menit, tetapi tingkat perbaikan iskemik seluler, yang dapat berlangsung selama berhari-hari hingga berminggu-minggu, sangat penting untuk mengurangi morbiditas dan mortalitas kardiovaskular berikutnya. Gagasan bahwa protein stres dapat mempercepat pemulihan fisiologis cedera miokard reversibel didasarkan pada bukti eksperimental yang menunjukkan bahwa beberapa "sinyal" proksimat dapat mengaktifkan respons sengatan panas dan, dengan demikian, membangkitkan mekanisme perlindungan endogen Hsps. Kejadian klinis utama seperti angina tidak stabil, oklusi berulang setelah terapi trombolitik, dan eksaserbasi akut angina kronis merupakan penginduksi fisiologis potensial protein stres sitoprotektif. Langkah logis berikutnya adalah mempertimbangkan kemungkinan bahwa anggota terkait dari keluarga protein stres multigen memberikan manfaat fungsional yang serupa atau tambahan. Karena iskemia dan gangguan fisiologis lainnya mengganggu hubungan struktur-fungsi normal protein intraseluler, penelitian selanjutnya harus menetapkan apakah pendamping molekuler, baik sendiri atau dalam kombinasi, mengurangi kerusakan iskemik dengan mempercepat pemulihan fisiologis sel miokard dalam organisme utuh.

Model Eksperimental untuk Penelitian Protein Stres

Model transgenik dari ekspresi berlebih Hsp70 (keuntungan fungsi) dan hsf1-tikus yang kekurangan (kehilangan fungsi), dan karakterisasi selanjutnya, mulai menjelaskan peran fisiologis mereka in vivo. 16 17 18 36 Salah satu arah yang menarik dari upaya tersebut dapat mengarah pada pendekatan terpadu ke dalam peran fisiologis seluruh sistem atau jaringan regulasi dalam model hewan yang dimodifikasi secara genetik dari penyakit manusia. Namun, kekayaan pengetahuan yang ada tentang studi fisiologis pada hewan yang lebih besar dari tikus tidak boleh diabaikan. Studi untuk menentukan peran ekspresi HSP dalam pemingsanan miokard menggunakan hewan sadar dapat membenarkan pengembangan model tikus dan kelinci transgenik. Keterbatasan potensial dari strategi tersebut mencakup biaya yang jauh lebih besar dari periode kehamilan yang lebih lama, waktu yang lebih lama untuk mencapai kematangan seksual, dan ukuran serasah yang lebih kecil dari spesies yang lebih besar tersebut. Namun, peneliti dengan keahlian dalam biologi molekuler dan fisiologi molekuler yang melakukan proyek kolaboratif meningkatkan peluang keberhasilan, sambil menghindari duplikasi upaya.

Apakah Ekspresi Gen HSP yang Diinduksi Stres Mempengaruhi Ukuran Infark, Aritmogenesis, dan Remodeling Miokard Setelah Infark Miokard Akut?

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa perlakuan awal (24 jam) dengan stres panas melemahkan pelepasan radikal bebas di jantung tikus yang terisolasi95 dan mengurangi jumlah aritmia, ciri fungsional utama dari cedera iskemia/reperfusi (ditinjau dalam Referensi 92 92 ). Bersama-sama, studi ini mengkorelasikan interaksi potensial antara jalur pelindung ini tetapi tidak memadai untuk membangun hubungan sebab dan akibat. Pengembangan model tikus knockout gen HSF1 memberikan pendekatan eksperimental yang kuat untuk menentukan apakah defisiensi sintesis HSP yang diinduksi stres, selama gangguan fisiologis seperti iskemia miokard, memengaruhi hasil cedera pascainfark dan mekanisme perbaikan pada organisme utuh. Hasil studi tersebut dapat membantu membangun kausalitas, menjelaskan mekanisme potensial dimana sintesis HSP berhubungan dengan iskemia miokard, dan mengevaluasi partisipasi protein stres selama prakondisi iskemik awal dan akhir. Karakterisasi tepat waktu dari beberapa model knockout, yang saat ini sedang dikembangkan di laboratorium di seluruh dunia, harus terus mendorong kolaborasi yang bermanfaat di antara para peneliti. 179 Kemajuan lebih lanjut harus mempercepat aliran pengetahuan baru ke bidang terkait seperti fibrosis reaktif dan reparatif pascaiskemik, 180 inflamasi pascareperfusi, 181 dan pemingsanan miokard. 89 182

Ekspresi Protein Stres dan Mekanisme Prakondisi Iskemik

Prakondisi iskemik adalah manuver eksperimental paling kuat yang melindungi jantung secara berulang terhadap tantangan iskemik berikutnya. 183 Namun, ada kontroversi tentang peran yang tepat dari protein stres dalam fenomena yang ditandai dengan baik ini. 184 Beberapa mekanisme yang melibatkan protein kinase C, reseptor adenosin, dan hubungannya dengan jalur transduksi sinyal telah terlibat dalam prakondisi iskemik. 185 Bukti yang cukup menunjukkan kurangnya korelasi antara ekspresi yang diinduksi stres (misalnya, Hsp70) dan pengkondisian awal, yang berumur pendek dan berlangsung antara 1 dan 3 jam, tergantung pada model dan spesiesnya. 186

Apakah Keluarga Pendamping Protein Stres Tidak Mungkin Memiliki Relevansi Fisiologis dalam Prakondisi Dini?

Menurut pendapat kami, penelitian di bidang ini telah mengabaikan atau memberikan perhatian yang tidak memadai terhadap potensi pentingnya Hsps MW kecil, seperti B-crystallin dan Hsp27. Para pendamping ini tampaknya menjadi kandidat untuk "garis pertahanan pertama" melawan stres yang tidak mematikan. Apakah oligomerisasi MW Hsps kecil berkontribusi pada stabilitas mekanik atau peran sitoskeleton dalam perlindungan iskemik miosit jantung saat ini tidak diketahui. 187 188 Kedua model knockout gen B-crystallin dan Hsp27, yang saat ini dalam pengembangan, dapat secara langsung menjawab hipotesis ini.

Demikian pula, penelitian diperlukan untuk mengatasi korelasi antara pengkondisian terlambat dan ekspresi protein stres. Dua puluh empat jam setelah stres iskemik awal, beberapa penelitian telah melaporkan peningkatan sintesis Hsp60 dan Hsp70 pada kelinci, 41 Hsp70 pada babi, 182 dan mangan-SOD pada anjing 189 190 dan toleransi iskemik tertunda atau pengkondisian terlambat. Oleh karena itu, pertanyaan mendasar adalah apakah ada hubungan langsung antara ekspresi protein stres dan pengkondisian akhir. 191 192 193 Penilaian yang lebih rinci tentang peran spesifik Hsp individu dalam perlindungan jantung juga diperlukan. Upaya untuk menentukan mekanisme saluran kalium sensitif ATP kardioprotektif dengan menggunakan inhibitor telah menemukan kurangnya korelasi dengan ekspresi protein stres Hsp70. 194 Namun, pendekatan menggunakan inhibitor spesifik tidak memadai untuk menetapkan spesifisitas, untuk tingkat kepastian apa pun, di luar protein yang sedang diselidiki. 195

Pendamping Molekuler dan Jalur Kematian Sel

Protein stres adalah kandidat ideal untuk memainkan peran pengaturan kunci dalam kelangsungan hidup sel dan jalur kematian yang melibatkan kerusakan DNA dan sintesis, perbaikan, dan degradasi protein. Manuver yang meningkatkan ekspresi Hsp70 setelah kejutan panas, paparan natrium butirat, dan ekspresi berlebih konstitutif atau teregulasi menghambat apoptosis pada berbagai jenis sel. 196 197 198 Proto-onkogen c-myc mempotensiasi apoptosis yang diinduksi kejutan panas 199 200 sebaliknya, ekspresi berlebih Bcl-2 menambah kelangsungan hidup seluler yang diinduksi termotoleransi. 201 Ekspresi spesifik jaringan Hsp70-2 mencegah apoptosis pada sel mitosis tertentu melalui mekanisme yang melibatkan kontrol siklus sel. 202 Fungsi pendamping Hsp70 dalam mengatur apoptosis mungkin pada tingkat transduksi sinyal, seperti yang telah terlibat dalam jalur kinase teraktivasi stres. 203

Studi terbaru di laboratorium kami menggunakan hsf1-sel kultur yang kekurangan telah menetapkan peran Hsps yang diinduksi stres untuk membuat sel termotoleran terhadap apoptosis yang diinduksi panas. 36 Penelitian ini menyediakan model genetik untuk menguji hubungan saling ketergantungan potensial antara Hsps yang diinduksi stres dan mekanisme yang terlibat dalam kelangsungan hidup sel dan/atau jalur kematian sel. Stres panas subletal melindungi mitokondria terhadap stres oksidatif dan mencegah kematian sel melalui apoptosis. 204 Mengingat lokasinya yang strategis di semua organel utama, tergoda untuk berspekulasi bahwa beberapa Hsps dapat memerangi stres/kerusakan oksidatif dengan melipat kembali represor yang rusak dari jalur kematian sel atau mencegah degradasinya. Atau, menekan pelepasan aktivator bunuh diri seperti sitokrom C dapat terjadi melalui interaksi dengan pendamping mitokondria dan pendamping (Gambar 1).

Selain itu, hasil dari beberapa penelitian terbaru telah melibatkan MW Hsp25/27 kecil dalam jalur kelangsungan hidup sel yang melibatkan diferensiasi sel dan stres/kerusakan oksidatif. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa ekspresi berlebih dari Hsp25/27, seperti protein antiapoptosis Bcl-2, meningkatkan kadar glutathione antioksidan dan resistensi terhadap apoptosis yang dimediasi Fas/APO-1, meskipun apakah ini terjadi secara langsung masih belum jelas. 205 Penarikan sel induk embrionik tikus dari siklus sel menginduksi upregulasi mRNA Hsp25/27, yang disertai dengan penurunan fosforilasi dan peningkatan oligomerisasi protein Hsp25/27. 149 Pengurangan antisense Hsp25/27 membalikkan perubahan ini melalui perpanjangan siklus sel, pengurangan kadar glutathione, dan percepatan menuju apoptosis. Bersama-sama, temuan provokatif ini menunjukkan bahwa selama proliferasi dan diferensiasi sel miokard, pendamping Hsp25/27, dan lainnya, dapat mengurangi stres/kerusakan oksidatif dan mencegah apoptosis melalui mekanisme baru yang bergantung pada redoks. 206

Apakah Ekspresi Gen HSP yang Diinduksi Stres Mempengaruhi Sejarah Alami Penyakit Kardiovaskular Kronis, Termasuk Penuaan?

Sejumlah penelitian telah mengkorelasikan induksi ekspresi Hsp dan kelebihan tekanan oleh pita aorta, hipertensi akut, paparan agen vasoaktif atau hipertrofi ventrikel kiri, dan ekspresi faktor pertumbuhan pada beberapa jenis sel. 207 208 209 Penurunan ekspresi gen HSP dan aktivitas pengikatan DNA HSF1 dilaporkan terjadi selama proses penuaan di miokardium hewan pengerat. 210 Ada semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa stres/kerusakan oksidatif mungkin menjadi faktor penyebab utama dalam proses penuaan. 211 Tingkat stres oksidatif dan kerentanan jaringan terhadap stres oksidatif yang diinduksi secara eksperimental tampaknya meningkat selama proses penuaan. Apakah peningkatan jumlah kerusakan oksidatif molekuler, yang diamati selama proses penuaan, secara kausal terkait dengan penurunan aktivitas HSF1 dan, implikasinya, ekspresi gen Hsp saat ini tidak diketahui. Ketersediaan model KO transgenik dan gen akan memungkinkan penelitian di masa depan untuk menetapkan peran ekspresi gen syok panas yang diinduksi stres selama penuaan normal atau adaptasi fisiologis terhadap faktor risiko jantung terkait penyakit.

Molecular Chaperones pada Penyakit Jantung yang Disebabkan oleh Ekspresi Protein Mutan

Peningkatan kadar protein yang salah lipatan atau terdenaturasi, serta injeksi mikro protein abnormal, merupakan penginduksi kuat ekspresi gen HSP. 14 59 Studi terbaru menunjukkan bahwa pendamping Hsc70 berinteraksi secara tidak langsung dengan CFTR yang menyimpan mutasi lipat F508 yang umum mendukung gagasan umum tentang peran biologis mereka dalam penyakit manusia. 20

Dari perspektif biologi pendamping, penyakit jantung yang timbul dari mutasi pada gen yang mengkode komponen aparatus kontraktil atau protein saluran ion pada dasarnya adalah masalah protein abnormal. Beberapa mutasi protein sarkomer telah terlibat dalam patogenesis kardiomiopati hipertrofik familial, termasuk rantai berat dan ringan miosin, subunit troponin I dan T, protein pengikat miosin C, dan tropomiosin (Referensi 6 6 dan ditinjau dalam Referensi 7 7 ). Sementara pendamping Hsp27 berperan dalam polimerisasi aktin dan pendamping TRiC terlibat dalam pelipatan aktin dan tubulin, peran fisiologis sistem pendamping dan pendamping dalam pelipatan dan perakitan struktur sarkomer, dalam kondisi normal atau dalam penyakit, tetap menjadi misteri. Dapat dibayangkan, pendamping dapat mempengaruhi baik perbaikan atau degradasi protein sarkomer mutan, yang, pada akhirnya, mempengaruhi hubungan struktur-fungsi dan fenotipe penyakit. 212 Analisis in vitro pertama-tama diperlukan untuk menentukan apakah fungsi pendamping dapat mempengaruhi pelipatan protein produktif yang disebabkan oleh mutasi yang relevan, yang dapat divalidasi dalam model hewan yang sesuai. 18 213

Pendamping Molekuler dalam Biologi Vaskular

Ada banyak peluang untuk membedah fungsi pendamping selama sintesis dan sekresi peptida dan protein aktif biologis, proliferasi seluler, pensinyalan intraseluler, dan penataan ulang sitoskeletal. Hasil studi tersebut dapat mengidentifikasi target protein HSP spesifik dan spesifisitas di antara berbagai jenis sel dalam mempromosikan efek perlindungan vaskular estrogen. 214 215 Peran penting Hsp90 dan cochaperones dalam biologi reseptor steroid menunjukkan bahwa pendamping HSP memainkan peran klinis yang signifikan dalam efek terapi penggantian hormon pada wanita pascamenopause. 216 217 Studi epidemiologis telah menemukan bahwa manfaat perlindungan terhadap penyakit jantung koroner pada wanita pramenopause dihapuskan pada tahun-tahun pascamenopause. 218 219 220 Potensi tindakan protektif estrogen telah dikaitkan dengan sifat antioksidan dan vasoprotektifnya, menurunkan lipid darah dan lipoprotein, dan efek langsung pada dinding pembuluh darah. 221 Penting untuk menentukan apakah ekspresi Hsp yang diinduksi stres pada tikus yang dimodifikasi secara genetik berperan dalam respons vaskular terhadap cedera pada hewan jantan dan betina. 215

Pendamping Molekuler dan Penyakit Imunologis

Berbeda dengan peran sitoprotektif mereka yang mapan, protein stres tertentu telah terlibat dalam patogenesis penyakit kardiovaskular. Misalnya, peningkatan kadar serum antibodi terhadap homolog bakteri Hsp60 mamalia telah ditunjukkan pada pasien dengan kardiomiopati dan diabetes, pada individu tanpa gejala dengan stenosis karotis, dan pada lesi aterosklerotik pada kelinci dan manusia (diulas dalam Referensi 22222). Satu hipotesis adalah bahwa penyakit autoimun hasil dari reaktivitas silang peptida imunogenik, yang berasal dari pendamping bakteri dan mitokondria dan Hsp60 (chaperonin) dan dikenali oleh limfosit T /δ yang diaktifkan. 223 224 Respon imun humoral dan penanda seropositif terhadap famili Hsp70 (terutama ER Grp78 dan Hsc70) dari parasit protozoa Trypanosoma cruzi telah terlibat dalam patogenesis penyakit Chagas, 224A penyebab paling umum gagal jantung kongestif di Amerika Latin (lihat Tabel). Meskipun studi korelatif ini memiliki keterbatasan yang melekat, penelitian masa depan untuk menetapkan kausalitas dapat membuka jalan untuk mengembangkan vaksin atau terapi baru lainnya untuk pengobatan dan pencegahan.

Aplikasi Terapi Potensial dari Molecular Chaperones

Strategi yang dapat meningkatkan tingkat pemulihan fisiologis setelah pemingsanan pascainfark dan disfungsi ventrikel tetap menjadi tujuan penting dalam pengelolaan pasien dengan infark miokard akut. Karena manuver menggunakan baik jaringan atau hipertermia seluruh tubuh yang rumit dan tidak praktis pada manusia sadar, strategi farmakologis yang meningkatkan ekspresi protein stres untuk perlindungan isotermal memiliki potensi manfaat terhadap kerusakan iskemik pada jantung, ginjal, dan otak. Inhibitor proteasome, yang secara sementara meningkatkan tingkat protein yang tidak dilipat di dalam sel, adalah salah satu pendekatan potensial. 225 Pendekatan alternatif mungkin melibatkan pengembangan molekul kecil dan peptida 226 226A yang meniru aksi in vivo pendamping dengan manfaat terapeutik.

Perspektif

Peran protein stres dalam cardioprotection telah diakui sebagai salah satu arah masa depan yang paling penting dari penelitian penyakit jantung iskemik.227 Karena jumlah individu yang terkena sangat besar, intervensi terapeutik yang berkontribusi pada perubahan kecil dalam morbiditas dan mortalitas pasca-infark miokard, misalnya, dapat memiliki efek dramatis pada hasil klinis secara keseluruhan. Peluang untuk mengatasi peran fisiologis pendamping sitoprotektif pada penyakit jantung perlu diperluas untuk memasukkan kemungkinan peran mereka selama kondisi kronis (aterosklerosis, hipertensi, diabetes, kelainan genetik, dan penyakit jantung katup) yang berkumpul melalui jalur umum, mengakibatkan gagal jantung dan kematian mendadak. Aliansi strategis di antara tim peneliti dapat menempa arah baru dan mempercepat kemajuan di bidang yang menjanjikan ini, yang, pada akhirnya, dapat berhasil mengeksploitasi jalur endogen untuk meningkatkan kesehatan fisiologis dan mengurangi gesekan fisiologis yang terkait dengan penyakit kardiovaskular.

Singkatan dan Akronim yang Dipilih

CFTR=regulator konduktansi transmembran fibrosis kistik
ER=retikulum endoplasma
ERK=kinase responsif ekstraseluler
grp=protein terkait glukosa
HO=heme oksigenase
Hsc=serumpun sengatan panas
HSF=faktor transkripsi kejutan panas
HSP=keluarga kejut panas dari protein stres
Hsp=protein kejut panas
JNK=c-Jun N-terminal kinase
MAPK=protein kinase yang diaktifkan oleh mitogen
MAPKAP=Protein kinase yang diaktifkan MAPK
MW=berat molekul
ROS=spesies oksigen reaktif
SAPK=protein kinase yang diaktifkan oleh stres
TRIC=Kompleks cincin TCP-1
VSMC=sel otot polos pembuluh darah

Gambar 1. Ringkasan sinyal patofisiologis utama yang mengaktifkan sintesis HSP (kiri garis solid vertikal) dan fungsi potensial HSP (kanan garis solid vertikal). Cedera seluler dimanifestasikan oleh peningkatan generasi ROS, ketersediaan besi redoks-aktif, peroksidasi lipid membran, dan kerusakan protein, antara lain. 92 Sumber ekstraseluler ROS (A) dapat berupa sel endotel, VSMC, dan bahkan miosit di jaringan sekitar mitokondria, transpor elektron molekul oksigen (B) dapat menjadi sumber intraseluler utama untuk pembentukan ROS. Kalsium bebas intraseluler (C), yang meningkat 10 kali lipat dalam 10 menit reperfusi, 228 229 telah terlibat dalam aktivasi protease (D), yang, pada gilirannya, dianggap berkontribusi pada cedera miokard intraseluler. 230 231 232 Kerusakan sitoskeleton (E) adalah kejadian awal cedera iskemik, yang menyebabkan disfungsi ventrikel atau "kejutan miokard" ketika cedera reversibel. 87 Cedera miokard juga dapat terjadi dari perekrutan leukosit polimorfonuklear (PMNs) melalui berbagai mekanisme ke dalam wilayah iskemik dan dengan pelepasan radikal bebas yang diturunkan oksigen (A), enzim lisosom sitotoksik (F), protease ekstraseluler (G), dan komplemen. aktivasi (H) (ditinjau dalam Referensi 233). Sinyal fisiologis yang beragam diperkirakan mengaktifkan HSF1 (I) yang dapat diinduksi stres, yang mengikat elemen kejutan panas spesifik urutan (HSE) (J), yang terkandung dalam promotor semua HSP (K). Meskipun mekanisme yang tepat dari perlindungan iskemik yang dimediasi Hsp70 kurang dipahami, ini secara luas dikaitkan dengan sifat biologis "pendamping molekuler," yang diusulkan untuk membantu dalam perakitan atau perbaikan protein yang baru disintesis atau rusak. 11 234 235 Dalam istilah fisiologis, fungsi potensial untuk molekul pendamping di jantung iskemik meliputi: pelipatan protein polipeptida yang baru disintesis penting untuk mempertahankan metabolisme oksidatif setelah kerusakan miosit (L), perlindungan mitokondria dari ROS dan sitokin seperti TNFα 204 236 dan translokasi protein yang baru disintesis selama perbaikan organel (M), perbaikan protein struktural kritis setelah perubahan sitoskeletal yang diinduksi iskemia (N), 237 daur ulang vesikel membran (Hsc70) (O), pengangkutan produk sampingan toksik potensial untuk degradasi oleh proteasom (P), 78 238 239 supresi sitokin proinflamasi seperti pro-interleukin-1β (Q), 204 236 240 supresi NADPH oksidase dan ledakan oksidatif oleh respon kejutan panas (R), 241 perlindungan oleh produksi NO dari sintesis yang dapat diinduksi ekspresi HSP (S), 61 242 243 244 245 246 pencegahan apoptosis baik melalui mitokondria pendamping Hsp60 pengikatan sitokrom C dan/atau pengikatan Hsp70 dari target sitosol (T), perbaikan saluran ion 36.204 (U), sintesis kolagen oleh pendamping Hsp47 untuk fibrosis reparatif (V), 180 dan modulasi cedera iskemik yang dimediasi imun (W). 241

Gambar 2. Skema yang diusulkan untuk siklus reaksi kompleks pendamping Hsc70 dalam pelipatan substrat hipotetis dalam sel. Mulai dari bagian bawah gambar, pendamping Hsc70 (A) terdiri dari domain N-terminal ATPase dan C-terminal untuk mengikat substrat target. Hsp40 (B), homolog eukariotik dari DnaJ, baik mengikat protein yang tidak dilipat (UPs) terlebih dahulu (C) dan kemudian mengikat Hsc70.ADP, atau mengikat ke kompleks Hsc70.ADP.UP (D), yang memiliki konsentrasi rendah pada/ off rate untuk UP. Beberapa nasib yang berbeda untuk kompleks Hsc70.ADP.UP yang dibayangkan, masing-masing tergantung pada penggantian Hsp40 oleh mitra aksesori yang berbeda, khususnya, Hip (Hsc70-interacting protein), Hop (Hsc70/Hsp90-organizing protein), dan Hap (protein aksesori Hsc70). 166 247 248 Setelah Hsp40 dilepaskan, Hip berikatan dengan domain ATPase dari Hsc70 (E), merangsang aktivitasnya, dan kemudian tetap terikat untuk menstabilkan kompleks substrat ADP-Hsc70, menunjukkan bahwa ia mungkin memainkan peran dalam pengangkutan substrat dalam sel (F). 166 Hop berfungsi sebagai penghubung fisik antara Hsc70 dan Hsp90 (G), mungkin untuk memfasilitasi transfer UP antara pendamping ini. Apakah Hop mengubah aktivitas ATPase Hsc70 atau tidak masih kontroversial. 249 Fungsi Hup, yang merangsang pelepasan UPs dari Hsc70 (H) dan mengubah oligomer Hsc70 menjadi monomer (I), masih harus ditetapkan. Energi yang ditransfer dari hidrolisis ATP, langkah pembatas laju dari siklus pendamping eukariotik, digunakan dalam siklus yang berurutan untuk membantu pelipatan dan mencegah agregasi dan degradasi. Untuk tujuan ini, dua protein terkait, BAG-1 (tidak ditampilkan) dan Hap (J), yang mengikat domain Hsc70 ATPase, juga menghambat pengikatan Hsp70 ke substrat protein yang tidak dilipat secara in vitro, menunjukkan bahwa protein ini mungkin berperan dalam mempertahankan kontrol kualitas dengan mengarahkan interaksi nonproduktif menuju degradasi 250 (ilustrasi disediakan oleh LE Hightower, University of Connecticut, Storrs).

Tabel 1. Kelas Utama HSP dalam Biologi Kardiovaskular

mHsp75 menunjukkan mitokondria Hsp75 HIF-1, faktor transkripsi yang diinduksi hipoksia 1 dan MKBP, protein kinase distrofi miotonik.

Dr Benjamin didukung oleh American Foundation for Medical Research, National Institutes of Health, dan Penghargaan Investigator Didirikan dari American Heart Association. Kami berterima kasih kepada R. S. Williams, R. Meidell, A. Davis, P. Thomas, dan R. Sohal atas komentar kritis mereka mengenai naskah kami.


Publikasi

Beberapa tahun terakhir telah melihat peningkatan dramatis dalam metodologi desain protein. Namun demikian, sebagian besar metode menuntut intervensi ahli, membatasi penerapannya secara luas. Sebaliknya, algoritma PROSS untuk meningkatkan stabilitas protein dan tingkat ekspresi heterolog telah berhasil diterapkan pada berbagai enzim yang menantang dan protein pengikat. Di sini, kami membandingkan penerapan PROSS sebagai alat yang berdiri sendiri untuk ilmuwan protein tanpa atau pengalaman terbatas dalam pemodelan. Dua belas laboratorium dari Protein Production and Purification Partnership di Eropa (P4EU) menantang algoritma PROSS dengan 14 target protein yang tidak terkait tanpa dukungan dari pengembang PROSS. Untuk setiap target, hingga enam desain dievaluasi untuk tingkat ekspresi dan dalam beberapa kasus, untuk stabilitas dan aktivitas termal. Dalam sembilan target, desain menunjukkan peningkatan level ekspresi heterolog baik dalam sistem ekspresi prokariotik dan/atau eukariotik dalam kondisi eksperimental yang disesuaikan untuk setiap protein target. Selanjutnya, kami mengamati peningkatan stabilitas termal di sembilan dari sepuluh target yang diuji. Dalam dua contoh utama, Human Stem Cell Factor (hSCF) dan Human Cadherin-Like Domain (CLD12) dari reseptor RET, protein tipe liar tidak dapat diekspresikan sebagai protein larut dalam E. coli, namun desain PROSS menunjukkan tingkat ekspresi yang tinggi dalam sel E. coli dan HEK293, masing-masing, dan meningkatkan stabilitas termal. Kami menyimpulkan bahwa PROSS dapat meningkatkan stabilitas dan ekspresibilitas dalam berbagai kasus, dan peningkatan itu biasanya memerlukan kondisi ekspresi spesifik target. Studi ini menunjukkan kekuatan dari upaya masyarakat luas untuk menyelidiki sifat umum metode baru dan merekomendasikan area untuk penelitian masa depan untuk memajukan algoritma praktis yang berguna untuk ilmu protein.

Situs fungsional dari banyak keluarga protein didominasi oleh beragam daerah tulang punggung yang tidak memiliki struktur sekunder (loop) tetapi terlipat secara stabil ke keadaan kompeten secara fungsional. Namun demikian, desain daerah loop terstruktur dari awal, terutama di situs fungsional, telah menemui kesulitan besar. Oleh karena itu kami mengembangkan pendekatan, yang disebut AbDesign, untuk mengeksploitasi modularitas alami dari banyak keluarga protein dan secara komputasi merakit sejumlah besar tulang punggung baru dengan menggabungkan fragmen modular yang terjadi secara alami. Strategi ini menghasilkan protein yang besar, akurat secara atom, dan sangat efisien, termasuk antibodi dan enzim yang menunjukkan lusinan mutasi dari protein alami apa pun. Ruang konformasi tulang punggung kombinatorial yang dapat diakses oleh AbDesign bahkan untuk keluarga homolog berukuran sedang dapat melebihi keragaman di seluruh PDB, memberikan tingkat kontrol sub-ngstrom atas pemosisian grup situs aktif yang diperlukan untuk memperoleh protein yang sangat aktif. Naskah ini menjelaskan cara mengimplementasikan pipeline menggunakan kode yang tersedia secara gratis di https://github.com/Fleishman-Lab/AbDesign_for_enzymes .

Kemampuan kita untuk merancang aktivitas biomolekuler baru atau yang lebih baik bergantung pada pemahaman hubungan urutan-fungsi dalam protein. Namun, ukuran besar dan kompleksitas lipatan sebagian besar protein mengaburkan hubungan ini, dan metode pengoptimalan protein terus bergantung pada iterasi eksperimental yang melelahkan. Baru-baru ini, pemahaman yang lebih dalam tentang peran efek ambang stabilitas dan epistasis biomolekuler dalam protein telah mengarah pada pengembangan metode hibrida yang menggabungkan analisis filogenetik dengan perhitungan desain atomistik. Metode ini memungkinkan optimasi yang andal dan bahkan satu langkah dari stabilitas protein, ekspresibilitas, dan aktivitas dalam protein yang dianggap di luar cakupan desain komputasi. Selanjutnya, rekonstruksi urutan leluhur menghasilkan wawasan tentang mata rantai yang hilang dalam evolusi enzim dan pengikat yang dapat digunakan dalam desain protein. Melalui kombinasi perhitungan filogenetik dan atomistik, tujuan lama metode komputasi umum yang dapat diterapkan secara universal untuk mempelajari dan mengoptimalkan protein akhirnya tampak dalam jangkauan.

Banyak patogen manusia menggunakan reseptor permukaan sel inang untuk menempel dan menyerang sel. Seringkali, afinitas interaksi inang-patogen rendah, menghadirkan peluang untuk memblokir invasi menggunakan mimik protein inang yang larut dan afinitas tinggi. Plasmodium falciparum reticulocyte-binding protein homolog 5 (RH5) menyediakan kandidat yang menarik untuk mimikri: protein ini sangat lestari dan afinitasnya yang moderat mengikat basigin reseptor manusia (K
D 1 M) merupakan langkah penting dalam invasi eritrosit oleh parasit malaria ini. Kami menggunakan pemindaian mutasi mendalam dari fragmen basigin manusia yang dapat larut untuk secara sistematis mengkarakterisasi mutasi titik yang meningkatkan afinitas basigin untuk RH5 dan kemudian menggunakan Rosetta untuk merancang varian dalam ruang urutan mutasi yang meningkatkan afinitas. Desain tujuh mutasi yang dihasilkan menunjukkan afinitas 1900 kali lipat lebih tinggi (K
D sekitar 1 nM) untuk RH5 dengan kecepatan pengikatan yang sangat lambat (0,23 jam
1) dan mengurangi konsentrasi penghambat pertumbuhan Plasmodium yang efektif setidaknya 10 kali lipat dibandingkan dengan basigin manusia. Desainnya memberikan titik awal yang menguntungkan untuk rekayasa peningkatan kecepatan yang mungkin penting untuk mencapai penghambatan pertumbuhan yang efektif secara terapeutik.

Stabilisasi glikoprotein amplop metastabil (Env) HIV-1 dihipotesiskan untuk meningkatkan induksi antibodi penetral luas. Kami meningkatkan hasil ekspresi dan stabilitas glikoprotein amplop HIV-1 BG505SOSIP.664 gp140 melalui urutan otomatis yang dijelaskan sebelumnya dan pendekatan termostabilisasi komputasi yang dipandu struktur, PROSS. Ini menggabungkan informasi konservasi urutan dengan penilaian komputasi stabilisasi mutan, sehingga mengambil keuntungan dari variasi urutan alami yang luas yang ada dalam HIV-1 Env. PROSS digunakan untuk merancang tiga varian gp140 dengan 17–45 mutasi relatif terhadap konstruksi induk. Salah satu desain secara eksperimental diamati memiliki peningkatan empat kali lipat dalam hasil dan peningkatan 4 ° C dalam termostabilitas. Selain itu, imunogen yang dirancang memiliki profil antigenisitas yang serupa dengan versi penaut fleksibel asli dari tipe liar, BG505SOSIP.664 gp140 (NFL Wt) ke epitop utama yang ditargetkan oleh antibodi penetral luas. PROSS menghilangkan proses penyaringan banyak varian untuk stabilitas dan fungsionalitas yang melelahkan, memberikan bukti prinsip metode untuk stabilisasi dan peningkatan hasil tanpa mengorbankan antigenisitas untuk kandidat vaksin kompleks generasi berikutnya yang sangat terglikosilasi.

Antibodi yang dikembangkan untuk penelitian dan aplikasi klinis mungkin menunjukkan stabilitas, ekspresi, atau afinitas yang kurang optimal. Strategi pengoptimalan yang ada berfokus pada mutasi permukaan, sedangkan pematangan afinitas alami juga memperkenalkan mutasi pada inti antibodi, yang secara bersamaan meningkatkan stabilitas dan afinitas. Untuk secara sistematis memetakan toleransi mutasi dari fragmen variabel antibodi (Fv), kami melakukan tampilan ragi dan menerapkan pemindaian mutasi dalam ke antibodi anti-lisozim dan menemukan bahwa banyak mutasi yang meningkatkan afinitas berkerumun di antarmuka rantai ringan-berat variabel, dalam inti antibodi. Desain Rosetta menggabungkan peningkatan mutasi, menghasilkan varian dengan afinitas sepuluh kali lipat lebih tinggi dan stabilitas yang ditingkatkan secara substansial. Untuk membuat pendekatan ini dapat diakses secara luas, kami mengembangkan AbLIFT, server web otomatis yang merancang mutasi inti multipoint untuk meningkatkan kontak antara rantai ringan dan berat Fv tertentu (http://AbLIFT.weizmann.ac.il). Kami menerapkan AbLIFT ke dua antibodi yang tidak terkait yang menargetkan antigen manusia VEGF dan QSOX1. Menariknya, desain meningkatkan stabilitas, afinitas, dan hasil ekspresi. Hasilnya memberikan bukti prinsip untuk melewati siklus rekayasa antibodi yang melelahkan melalui desain afinitas dan stabilitas komputasi otomatis.

Desain membran-protein adalah area penelitian yang menarik dan semakin sukses yang telah menghasilkan landmark termasuk desain protein integral-membran yang stabil dan akurat berdasarkan motif gulungan-gulungan. Desain protein yang lebih kompleks secara topologi, seperti kebanyakan reseptor, saluran, dan transporter, bagaimanapun, menuntut fungsi energi yang menyeimbangkan kontribusi dari kontak intra-protein dan interaksi protein-membran. Kemajuan terbaru dalam fungsi energi semua atom yang larut dalam air telah meningkatkan akurasi dalam tolok ukur prediksi struktur. Membran plasma, bagaimanapun, memaksakan kendala fisik yang berbeda pada solvasi protein. Untuk memahami kendala ini, kami baru-baru ini mengembangkan layar eksperimental throughput tinggi, yang disebut dsTβL, dan menyimpulkan energi penyisipan nyata untuk setiap asam amino pada lusinan posisi melintasi membran plasma bakteri. Di sini, kami mengekspresikan profil ini sebagai istilah energi lipofilisitas di Rosetta dan menunjukkan bahwa fungsi energi baru mengungguli yang sebelumnya dalam pemodelan dan tolok ukur desain. Simulasi Rosetta ab initio mulai dari rantai yang diperpanjang merekapitulasi dua pertiga dari struktur yang ditentukan secara eksperimental dari homo-oligomer yang membentang membran dengan <2.5Å root-mean-square deviasi dalam lima model yang diprediksi teratas (tersedia online: http:// tmhop.weizmann.ac.il). Selanjutnya, dalam dua tolok ukur desain urutan, fungsi energi meningkatkan diskriminasi mutasi titik stabilisasi dan merekapitulasi urutan protein membran alami dari struktur yang diketahui, sehingga merekomendasikan fungsi energi baru ini untuk pemodelan dan desain protein membran.

Metode untuk prediksi struktur antibodi bergantung pada urutan homologi untuk struktur yang ditentukan secara eksperimental. Model yang dihasilkan mungkin akurat tetapi sering kali tegang secara stereokimia, membatasi kegunaannya dalam pemodelan dan alur kerja desain. Kami menyajikan server web AbPredict 2, yang alih-alih menggunakan homologi urutan, melakukan pencarian berbasis Monte Carlo untuk kombinasi energi rendah dari konformasi tulang punggung untuk menghasilkan struktur antibodi yang akurat dan tidak tegang.

Melipat protein ke konformasi fungsionalnya sangat penting untuk kehidupan. Meskipun 75% dari proteom terdiri dari protein multi-domain, pengetahuan kita tentang pelipatan didasarkan terutama pada penelitian yang dilakukan pada protein domain tunggal dan protein pelipatan cepat. Meskipun demikian, kompleksitas lanskap lipat yang ditunjukkan oleh protein multi-domain telah mendapat sorotan yang meningkat dalam beberapa tahun terakhir. Kami mempelajari tiga domain protein adenilat kinase dari E. coli (AK), yang telah terbukti melipat melalui serangkaian jalur yang melibatkan beberapa keadaan perantara. Kami menggunakan metode desain protein untuk memanipulasi lanskap pelipatan AK, dan spektroskopi FRET molekul tunggal untuk mempelajari efek pada proses pelipatan. Mutasi yang diperkenalkan dalam domain pengikatan NMP (NMPbind) dari protein ditemukan memiliki efek tak terduga pada lanskap lipat. Jadi, sementara menstabilkan mutasi pada inti domain NMPbind mempertahankan jalur lipat utama AK tipe liar, mutasi yang tidak stabil pada antarmuka antara NMPbind dan domain CORE menyebabkan partisi ulang yang signifikan dari fluks antara jalur lipat. Hasil kami menunjukkan plastisitas luar biasa dari lanskap lipat AK, dan mengungkapkan bagaimana mutasi spesifik dalam struktur utama diterjemahkan ke dalam perubahan dinamika lipat. Kombinasi metodologi yang diperkenalkan dalam karya ini harus terbukti berguna untuk memperdalam pemahaman kita tentang proses pelipatan protein multi-domain.

Karakterisasi protein yang diekspresikan secara berlebihan sangat penting untuk menilai kualitasnya, dan memberikan masukan untuk desain ulang dan optimasi berulang. Proses ini biasanya dilakukan mengikuti prosedur pemurnian yang membutuhkan biaya waktu dan tenaga yang nyata. Oleh karena itu, penilaian kualitas protein rekombinan tanpa pemurnian sebelumnya menawarkan keuntungan besar.Di sini, kami melaporkan metode spektrometri massa asli yang memungkinkan karakterisasi protein yang diproduksi berlebihan langsung dari media kultur. Sifat-sifat seperti kelarutan, berat molekul, pelipatan, keadaan perakitan, struktur keseluruhan, modifikasi pasca-translasi dan pengikatan pada biomolekul yang relevan segera terungkap. Kami menunjukkan penerapan metode untuk karakterisasi mendalam dari protein rekombinan yang disekresikan dari sistem eukariotik seperti ragi, serangga, dan sel manusia. Metode ini, yang dapat dengan mudah diperluas ke analisis throughput tinggi, sangat mempersingkat kesenjangan waktu antara produksi dan karakterisasi protein, dan sangat cocok untuk mengkarakterisasi protein yang direkayasa dan bermutasi, dan mengoptimalkan hasil dan kualitas protein yang diekspresikan secara berlebihan.

Jaringan protein di semua organisme terdiri dari pasangan homolog yang berinteraksi. Dalam jaringan ini, beberapa protein bersifat spesifik, berinteraksi dengan satu atau beberapa mitra pengikat, sedangkan yang lain bersifat multispesifik dan mengikat berbagai target. Kami menjelaskan algoritma yang dimulai dari pasangan yang berinteraksi dan mendesain lusinan pasangan baru dengan konformasi tulang punggung yang beragam di situs pengikatan serta orientasi dan urutan pengikatan baru. Diterapkan pada pasangan bakteri afinitas tinggi, algoritme menghasilkan 18 bakteri baru, dengan afinitas serumpun dari pico- ke mikromolar. Tiga pasang menunjukkan 3-5 kali lipat dalam spesifisitas relatif terhadap tipe liar, sedangkan yang lain multispesifik, secara kolektif membentuk jaringan interaksi protein. Analisis kristalografi menegaskan akurasi desain, termasuk tulang punggung baru dan interaksi kutub. Jaringan interaksi kutub yang telah diatur sebelumnya bertanggung jawab atas spesifisitas tinggi, sehingga menentukan prinsip-prinsip desain yang dapat diterapkan untuk memprogram jaringan interaksi seluler sintetis dengan afinitas dan spesifisitas yang diinginkan.

Fotorespirasi mendaur ulang produk oksigenasi ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase ( Rubisco), 2-fosfoglikolat, kembali ke Siklus Calvin. Namun, fotorespirasi alami membatasi produktivitas pertanian dengan membuang energi dan melepaskan CO2. Beberapa bypass fotorespirasi sebelumnya telah disarankan tetapi terbatas pada enzim dan jalur yang ada yang melepaskan CO2. Di sini, kami memanfaatkan kekuatan enzim dan rekayasa metabolisme untuk menetapkan rute sintetis yang melewati fotorespirasi tanpa pelepasan CO2. Dengan mendefinisikan aturan reaksi spesifik, kami secara sistematis mengidentifikasi rute menjanjikan yang mengasimilasi 2-fosfoglikolat ke dalam Siklus Calvin tanpa kehilangan karbon. Kami selanjutnya mengembangkan model kinetik-stoikiometrik yang menunjukkan bahwa shunt sintetis yang diidentifikasi berpotensi meningkatkan laju fiksasi karbon di seluruh rentang fisiologis iradiasi dan CO2, bahkan jika sebagian besar enzim mereka beroperasi pada sepersepuluh dari aktivitas karboksilasi maksimal Rubisco. Reduksi glikolat menjadi glikolaldehida penting untuk beberapa pirau sintetik tetapi tidak diketahui terjadi secara alami. Oleh karena itu, kami menggunakan desain komputasi dan mengarahkan evolusi untuk menetapkan aktivitas ini dalam dua reaksi berurutan. Sebuah sintetase asetil-KoA direkayasa untuk stabilitas yang lebih tinggi dan sintesis glikol-KoA. Sebuah reduktase propionil-KoA direkayasa untuk selektivitas yang lebih tinggi untuk glikol-KoA dan untuk penggunaan NADPH di atas NAD(+), sehingga mendukung reduksi daripada oksidasi. Modul reduksi glikolat yang direkayasa kemudian digabungkan dengan kondensasi hilir dan asimilasi glikolaldehida menjadi ribulosa 1,5-bifosfat, sehingga memberikan bukti prinsip untuk jalur fotorespirasi konservasi karbon.

Peningkatan substansial dalam aktivitas enzim menuntut banyak mutasi pada posisi proksimal spasial di situs aktif. Mutasi semacam itu, bagaimanapun, sering menunjukkan efek epistatik (non-aditif) yang tidak terduga pada aktivitas. Di sini kami menjelaskan FuncLib, metode otomatis untuk merancang mutasi multititik di situs aktif enzim menggunakan analisis filogenetik dan perhitungan desain Rosetta. Kami menerapkan FuncLib ke dua enzim yang tidak terkait, fosfotriesterase dan asetil-KoA sintetase. Semua desain aktif, dan sebagian besar menunjukkan profil aktivitas yang berbeda secara signifikan dari tipe liar dan satu sama lain. Beberapa lusin desain dengan hanya 3–6 mutasi situs aktif menunjukkan efisiensi 10 hingga 4.000 kali lipat lebih tinggi dengan berbagai substrat alternatif, termasuk hidrolisis agen saraf organofosfat toksik soman dan siklosarin dan sintesis butiril-KoA. FuncLib diimplementasikan sebagai server web (http://FuncLib.weizmann.ac.il) yang menghindari layar eksperimental dengan throughput tinggi yang berulang dan membuka jalan untuk merancang repertoar katalitik yang sangat efisien dan beragam.

Metode yang ampuh untuk menentukan penggabungan energik antara asam amino adalah analisis siklus mutan ganda. Dalam metode ini, dua residu dimutasi secara terpisah dan dalam kombinasi dan efek energik dari mutasi ditentukan. Penyimpangan efek mutasi ganda dari jumlah efek mutasi tunggal menunjukkan bahwa kedua residu berinteraksi secara langsung atau tidak langsung. Di sini, kami menunjukkan bahwa analisis siklus mutan ganda dengan spektrometri massa asli dapat dilakukan untuk interaksi dalam ekstrak sel Escherichia coli mentah, sehingga meniadakan kebutuhan untuk pemurnian protein dan menghasilkan isoterm pengikatan. Hasil kami menunjukkan bahwa kekuatan ikatan hidrogen antarmolekul tidak terpengaruh oleh kondisi yang lebih padat dalam lisat sel.

Antibodi monoklonal anti-karbohidrat (mAbs) sangat menjanjikan sebagai terapi dan diagnostik kanker. Namun, spesifisitas mereka dapat dicampur, dan karakterisasi rinci bermasalah, karena kompleks antibodi-glikan menantang untuk mengkristal. Di sini, kami mengembangkan pendekatan yang dapat digeneralisasikan menggunakan teknik throughput tinggi untuk mengkarakterisasi struktur dan spesifisitas mAbs tersebut, dan menerapkannya pada mAb TKH2 yang dikembangkan melawan antigen karbohidrat terkait tumor sialyl-Tn (STn). Spesifisitas mAb ditentukan oleh nilai KD yang jelas ditentukan oleh skrining microarray glikan kuantitatif. Residu kunci di situs penggabungan antibodi diidentifikasi oleh mutagenesis yang diarahkan ke situs, dan permukaan kontak antigen-glikan ditentukan menggunakan perbedaan transfer saturasi NMR (STD-NMR). Fitur-fitur ini kemudian digunakan sebagai metrik untuk memilih model 3D optimal dari kompleks antibodi-glikan, dari ribuan opsi yang masuk akal yang dihasilkan oleh docking otomatis dan simulasi dinamika molekul. Spesifisitas STn selanjutnya divalidasi dengan penyaringan komputasi model 3D antibodi yang dipilih terhadap sialyl-Tn-glikom manusia. Pendekatan eksperimental-komputasi ini akan memungkinkan desain rasional antibodi kuat yang menargetkan karbohidrat.

Desain otomatis enzim dengan sifat katalitik seperti tipe liar telah menjadi tujuan lama tetapi sulit dipahami. Di sini, kami menyajikan metode umum dan otomatis untuk desain enzim melalui perakitan tulang punggung kombinatorial. Mulai dari satu set struktur enzim yang homolog namun beragam secara struktural, metode ini mengumpulkan kombinasi tulang punggung baru dan menggunakan Rosetta untuk mengoptimalkan urutan asam amino, sambil melestarikan residu katalitik utama. Kami menerapkan metode ini ke dua keluarga enzim yang tidak terkait dengan lipatan barel TIM, glikosida hidrolase 10 (GH10) xilanase dan laktonase seperti fosfotriesterase (PLL), masing-masing merancang 43 dan 34 protein. Dua puluh satu desain GH10 dan tujuh PLL aktif, termasuk desain yang berasal dari template dengan <25% identitas urutan. Selain itu, empat desain sama aktifnya dengan enzim alami dalam keluarga ini. Akurasi atom dalam desain GH10 aktivitas tinggi dikonfirmasi lebih lanjut oleh analisis kristalografi. Dengan demikian, perakitan dan desain tulang punggung kombinatorial dapat digunakan untuk menghasilkan enzim yang stabil, aktif, dan beragam secara struktural dengan selektivitas atau aktivitas yang berubah.

Protein semakin banyak digunakan dalam penelitian biomedis dasar dan terapan. Banyak protein, bagaimanapun, hanya sedikit stabil dan dapat diekspresikan dalam jumlah terbatas, sehingga menghambat penelitian dan aplikasi. Penelitian telah mengungkapkan prinsip dan mekanisme termodinamika, seluler, dan evolusi yang mendasari stabilitas marginal. Dengan pemahaman yang berkembang ini, metode desain stabilitas komputasi telah berkembang selama dua dekade terakhir mulai dari metode yang secara selektif hanya membahas beberapa aspek stabilitas marjinal. Metode saat ini lebih umum dan, dengan menggabungkan analisis filogenetik dengan desain atomistik, telah menunjukkan peningkatan drastis dalam kelarutan, stabilitas termal, dan ketahanan agregasi sambil mempertahankan aktivitas molekul utama protein. Desain stabilitas membuka jalan menuju rekayasa rasional dari peningkatan enzim, terapi, dan vaksin serta penerapan metodologi desain protein pada protein besar dan aktivitas molekuler yang telah terbukti menantang di masa lalu.

Sistem pendamping GroE di Escherichia coli terdiri dari GroEL dan GroES dan memfasilitasi pelipatan protein yang bergantung pada ATP in vivo dan in vitro Protein dengan urutan dan struktur yang sangat mirip dapat berbeda dalam ketergantungannya pada GroEL untuk pelipatan yang efisien. Salah satu sumber ketergantungan GroEL yang potensial tetapi belum diverifikasi adalah frustrasi, di mana tidak semua interaksi dalam keadaan asli dioptimalkan dengan penuh semangat, sehingga mempotensiasi pelipatan dan kesalahan pelipatan yang lambat. Di sini, kami memilih protein fluoresen hijau yang ditingkatkan sebagai sistem model dan menjadikannya mutagenesis acak, diikuti dengan penyaringan untuk varian yang tampilan lipat in vivonya meningkatkan atau menurunkan ketergantungan GroEL. Kami mengkonfirmasi ketergantungan GroEL yang berubah dari varian ini dengan uji pelipatan in vitro. Yang mengejutkan, mutasi pada posisi yang diprediksi sangat frustrasi ditemukan berkorelasi dengan penurunan ketergantungan GroEL. Sebaliknya, mutasi pada posisi dengan frustrasi rendah ditemukan berkorelasi dengan peningkatan ketergantungan GroEL. Dukungan lebih lanjut untuk temuan ini diperoleh dengan menunjukkan bahwa melipat varian protein fluoresen hijau yang ditingkatkan yang dirancang secara komputasi untuk mengurangi frustrasi memang kurang bergantung pada GroEL. Hasil kami menunjukkan bahwa perubahan frustrasi lokal juga memengaruhi partisi in vivo antara pelipatan spontan dan yang dimediasi pendamping. Oleh karena itu, desain sekuens frustrasi minimal dapat mengurangi ketergantungan chaperonin dan meningkatkan tingkat ekspresi protein.

Protein alami harus melipat menjadi konformasi yang stabil dan menjalankan fungsi molekulernya. Sampai saat ini, desain komputasi telah berhasil menghasilkan protein yang stabil dan akurat secara atom dengan menggunakan apa yang disebut lipatan "ideal" yang kaya akan struktur sekunder reguler dan hampir tanpa loop dan elemen destabilisasi, seperti rongga. Namun, fungsi molekuler, seperti pengikatan dan katalisis, seringkali menuntut fitur yang tidak ideal, termasuk loop besar dan tidak beraturan serta jaringan interaksi kutub yang terkubur, yang tetap menantang untuk desain lipatan. Melalui lima siklus desain/eksperimen, kami mempelajari prinsip-prinsip untuk merancang fragmen variabel antibodi (Fvs) yang stabil dan fungsional. Secara khusus, kami (i) menggunakan batasan desain urutan yang berasal dari penyelarasan beberapa urutan antibodi, dan (ii) selama desain tulang punggung, mempertahankan interaksi stabilisasi yang diamati dalam antibodi alami antara kerangka kerja dan loop daerah penentu komplementaritas (CDR) 1 dan 2 Fvs yang dirancang mengikat ligan mereka dengan afinitas midnanomolar dan stabil seperti antibodi alami, meskipun memiliki >30 mutasi dari germline antibodi mamalia. Selanjutnya, analisis kristalografi menunjukkan akurasi atom di seluruh kerangka dan di empat dari enam CDR dalam satu desain dan akurasi atom di seluruh Fv di desain lain. Prinsip-prinsip yang kami pelajari bersifat umum, dan dapat diterapkan untuk merancang lipatan nonideal lainnya, menghasilkan antibodi dan enzim yang stabil, spesifik, dan tepat.

Sementara antibodi monoklonal yang kuat terhadap risin diperkenalkan selama bertahun-tahun, pertanyaan apakah peningkatan afinitas antibodi memungkinkan netralisasi toksin yang lebih baik belum sepenuhnya dibahas. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi kontribusi afinitas antibodi terhadap potensi netralisasi risin dari antibodi. Antibodi monoklonal cHD23 yang menargetkan subunit toksin B dan mengganggu ikatannya dengan reseptor membran, diisolasi. Untuk membuat klon antibodi dengan afinitas yang lebih baik terhadap risin, perpustakaan tampilan fag scFv yang berisi versi mutasi dari daerah variabel cHD23 dibangun dan klon dengan pengikatan risin yang lebih baik diisolasi. Pemodelan struktural mutan ini menunjukkan bahwa mutasi yang dimasukkan dapat meningkatkan fleksibilitas konformasi antibodi sehingga meningkatkan kemampuannya untuk mengikat risin. Sementara ditemukan bahwa klon terpilih menunjukkan peningkatan netralisasi risin, korelasi antara nilai K-D dan potensi hanya kecil (r = 0,55). Namun, ada korelasi positif (r = 0,84) antara nilai-nilai off-rate (k(off)) dari klon matang afinitas dan kemampuan mereka untuk menetralkan risin. Karena membran sel menampilkan sejumlah besar situs pengikatan permukaan potensial untuk risin, disarankan bahwa antibodi dengan nilai off-rate yang ditingkatkan memblokir kemampuan toksin untuk mengikat reseptor target, dengan cara yang sangat efisien. Saat ini, terapi berbasis antibodi adalah pengobatan yang paling efektif untuk keracunan risin dan diharapkan bahwa temuan penelitian ini akan memberikan informasi yang berguna dan strategi yang mungkin untuk merancang terapi berbasis antibodi yang lebih baik untuk toksin.

Regulasi alosterik mendasari kemampuan sel hidup untuk merasakan perubahan dalam nutrisi dan konsentrasi molekul pemberi sinyal, tetapi kemampuan untuk merancang regulasi alosterik secara komputasi menjadi protein non-alosterik telah sulit dipahami. Desain situs alosterik diperumit oleh persyaratan untuk mengkodekan stabilitas relatif konformasi aktif dan tidak aktif dari protein yang sama di hadapan dan tidak adanya ligan dan efektor. Untuk mengatasi tantangan ini, kami menggunakan Rosetta untuk merancang tulang punggung dari wilayah 3 penentu komplementaritas rantai berat yang fleksibel (HCDR3), dan menggunakan pencocokan geometris dan pengoptimalan urutan untuk menempatkan situs koordinasi Zn2+ dalam antibodi pengikat fluorescein. Kami memperkirakan bahwa karena fleksibilitas HCDR3, kantong pengikat fluorescein akan dikonfigurasi dengan benar hanya pada aplikasi Zn2+. Kami menemukan bahwa regulasi oleh Zn2+ bersifat reversibel dan sensitif terhadap identitas ion divalen, dan mengakibatkan penurunan stabilitas antibodi dan afinitas pengikatan fluorescein. Fluorescein terikat pada urutan besarnya afinitas yang lebih tinggi dengan adanya Zn2+ daripada tanpa kehadirannya, dan peningkatan afinitas fluorescein hampir seluruhnya disebabkan oleh kecepatan fluorescein yang lebih cepat, menunjukkan bahwa Zn2+ mengatur antibodi untuk pengikatan fluorescein. Analisis mutasi menunjukkan sensitivitas ekstrim regulasi Zn2+ pada detail atom di dalam dan di sekitar lokasi koordinasi logam. Antibodi yang dirancang dapat berfungsi untuk mempelajari bagaimana regulasi alosterik berevolusi dari protein pengikat non-alosterik, dan menyarankan cara untuk merancang sensor molekuler untuk target lingkungan dan biomedis.

Meningkatkan efisiensi katalitik awalnya rendah enzim dengan substrat target baru dengan urutan besarnya atau dua mungkin hanya memerlukan beberapa putaran mutagenesis dan penyaringan atau seleksi. Namun, putaran optimasi berikutnya cenderung menghasilkan tingkat peningkatan yang menurun (pengembalian yang berkurang) yang pada akhirnya mengarah ke dataran optimasi. Kami bertujuan untuk mengoptimalkan efisiensi katalitik bakteri fosfotriesterase (PTE) terhadap agen saraf tipe-V. Sebelumnya, kami meningkatkan efisiensi katalitik PTE tipe liar terhadap agen saraf VX sebanyak 500 kali lipat, menjadi efisiensi katalitik (k(kucing)/KM) 5 x 10(6)M(-1) min(-1 ). Namun, detoksifikasi in vivo yang efektif membutuhkan enzim dengan efisiensi katalitik > 10(7) M-1 min(-1). Di sini, setelah delapan putaran tambahan evolusi terarah dan desain komputasi dari varian yang distabilkan, kami mengembangkan varian PTE yang mendetoksifikasi VX dengan ak(cat)/KM >= 5 x 10(7)M(-1) min(-1) dan VX Rusia (RVX) dengan ak(cat)/KM >= 10(7) M-1 mnt(-1). Perbaikan 10 kali lipat terakhir ini adalah yang paling memakan waktu dan melelahkan, karena sebagian besar perpustakaan menghasilkan perbaikan kecil atau tidak sama sekali. Menstabilkan enzim yang berkembang, dan menghindari kompromi dalam aktivitas dengan substrat yang berbeda, memungkinkan kami memperoleh peningkatan lebih lanjut di luar dataran optimalisasi dan mengembangkan varian PTE yang secara keseluruhan ditingkatkan sebesar > 5000 kali lipat dengan VX dan sebesar > 17.000 kali lipat dengan RVX. Varian yang dihasilkan juga menghidrolisis agen saraf tipe G dengan efisiensi tinggi (GA, GB pada k(cat)/KM > 5 x 10(7) M-1 min(-1)) dan dengan demikian dapat berfungsi sebagai kandidat untuk saraf spektrum luas. profilaksis agen dan terapi pasca pajanan menggunakan dosis enzim rendah.

Pengemasan ulang inti protein adalah tes standar perangkat lunak pemodelan protein. Sebuah studi baru-baru ini dari enam paket perangkat lunak pemodelan yang berbeda menunjukkan bahwa mereka lebih berhasil dalam memprediksi konformasi rantai samping inti dibandingkan dengan residu permukaan. Semua perangkat lunak pemodelan yang diuji memiliki fungsi energi multikomponen, biasanya termasuk kontribusi dari solvasi, elektrostatika, ikatan hidrogen, dan interaksi Lennard-Jones selain istilah statistik berdasarkan struktur protein yang diamati. Kami menyelidiki sejauh mana fungsi energi yang disederhanakan yang hanya mencakup batasan stereokimia dan interaksi hard-sphere yang menjijikkan dapat mengemas kembali inti protein dengan benar. Untuk residu tunggal dan pengemasan ulang kolektif, model hard-sphere secara akurat merekapitulasi konformasi rantai samping yang diamati untuk Ile, Leu, Phe, Thr, Trp, Tyr dan Val. Hasil ini menunjukkan bahwa tidak ada alternatif, konformasi rantai samping residu inti yang diizinkan secara sterik. Analisis set inti protein yang sama menggunakan rangkaian perangkat lunak Rosetta mengungkapkan bahwa model hard-sphere dan Rosetta berkinerja sama baiknya di Ile, Leu, Phe, Thr dan Val model hard-sphere berkinerja lebih baik di Trp dan Tyr dan Rosetta berkinerja lebih baik di Ser. Kami menyimpulkan bahwa akurasi prediksi tinggi dalam inti protein yang diperoleh oleh perangkat lunak pemodelan protein dan pendekatan hard-sphere kami yang disederhanakan mencerminkan kepadatan tinggi inti protein dan dominasi tolakan sterik.

Banyak kandidat vaksin yang menjanjikan dari virus, bakteri, dan parasit patogen tidak stabil dan tidak dapat diproduksi dengan murah untuk penggunaan klinis. Misalnya, Plasmodium falciparum reticulocyte-binding protein homolog 5 (PfRH5) sangat penting untuk invasi eritrosit, sangat terkonservasi di antara isolat lapangan, dan memunculkan antibodi yang menetralkan in vitro dan melindungi pada model hewan, menjadikannya kandidat vaksin malaria terkemuka.Namun, RH5 fungsional hanya dapat diekspresikan dalam sistem eukariotik dan menunjukkan toleransi suhu sedang, membatasi kegunaannya di negara-negara panas dan berpenghasilan rendah di mana malaria merajalela. Pendekatan saat ini untuk stabilisasi imunogen melibatkan aplikasi berulang dari desain rasional atau semirasional, mutagenesis acak, dan karakterisasi biokimia. Biasanya, setiap putaran optimasi menghasilkan sedikit peningkatan stabilitas, dan beberapa putaran diperlukan. Sebaliknya, kami mengembangkan strategi desain satu langkah menggunakan analisis filogenetik dan perhitungan atomistik Rosetta untuk merancang varian PfRH5 dengan pengemasan dan polaritas permukaan yang ditingkatkan. Untuk mendemonstrasikan kekokohan pendekatan ini, kami menguji tiga desain PfRH5, yang semuanya menunjukkan peningkatan stabilitas relatif terhadap tipe liar. Yang terbaik, memiliki 18 mutasi relatif terhadap PfRH5, diekspresikan dalam bentuk terlipat pada bakteri pada >1 mg protein per L kultur, dan memiliki toleransi termal 10-15 derajat C lebih tinggi daripada tipe liar, sementara juga mempertahankan pengikatan ligan dan sifat imunogenik yang tidak dapat dibedakan dari jenis liar, membuktikan nilainya sebagai imunogen untuk generasi vaksin masa depan terhadap stadium darah malaria. Kami membayangkan bahwa metodologi desain stabilitas komputasi yang efisien ini juga akan digunakan untuk meningkatkan sifat biofisik kandidat vaksin bandel lainnya dari patogen yang muncul.

Metode saat ini untuk prediksi struktur antibodi bergantung pada urutan homologi untuk struktur yang diketahui. Meskipun strategi ini sering menghasilkan prediksi yang akurat, model dapat tegang secara stereo-kimia. Di sini, kami menyajikan algoritme yang sepenuhnya otomatis, yang disebut AbPredict, yang mengabaikan homologi urutan, dan sebagai gantinya menggunakan pencarian Monte Carlo untuk konformasi energi rendah yang dibangun dari segmen tulang punggung dan orientasi tubuh kaku yang muncul dalam struktur molekul antibodi. Kami menemukan kasus di mana AbPredict memilih templat loop akurat dengan identitas urutan serendah 10%, sedangkan templat identitas urutan tertinggi berbeda secara substansial dari konformasi kueri. Oleh karena itu, dalam beberapa kasus yang dilaporkan dalam benchmark Penilaian Pemodelan Antibodi baru-baru ini, model AbPredict lebih akurat daripada model dari peserta mana pun, dan kualitas stereo-kimia model secara konsisten tinggi. Lebih lanjut, dalam dua kasus buta yang diberikan kepada kami oleh ahli kristalografi sebelum penentuan struktur, metode ini mencapai <1,5 ngstrom akurasi tulang punggung keseluruhan. Pemodelan yang akurat dari struktur antibodi yang tidak diregangkan akan memungkinkan desain dan rekayasa pengikat yang ditingkatkan untuk penelitian biomedis langsung dari urutan.

Energi interaksi membran-protein menentukan topologi dan struktur protein: hidrofobisitas mendorong penyisipan segmen heliks ke dalam membran, dan muatan positif mengarahkan protein terhadap bidang membran sesuai dengan aturan positif-dalam. Sampai saat ini, bagaimanapun, mengukur kontribusi ini menemui kesulitan, menghalangi analisis sistematis dari dasar energik untuk topologi membran-protein. Kami baru-baru ini mengembangkan metode dsT beta L, yang menggunakan sekuensing dalam dan seleksi in vitro segmen yang dimasukkan ke dalam membran plasma bakteri untuk menyimpulkan profil energi penyisipan untuk setiap residu asam amino melintasi membran, dan menghitung kontribusi penyisipan dari hidrofobisitas dan positif -aturan dalam. Di sini, kami menyajikan algoritma prediksi topologi yang disebut TopGraph, yang didasarkan pada pencarian urutan untuk energi penyisipan dsT beta L minimum. Sedangkan energi penyisipan rata-rata yang diberikan oleh skala eksperimental sebelumnya adalah positif (tidak menguntungkan), rata-rata yang diberikan oleh TopGraph dalam set yang tidak berlebihan adalah -6,9 kkal/mol. Dengan mengukur kontribusi dari hidrofobisitas dan aturan positif-dalam, kami selanjutnya menemukan bahwa di sekitar setengah dari protein membran besar, segmen kutub dimasukkan ke dalam membran untuk memposisikan lebih banyak muatan positif di sitoplasma, menunjukkan interaksi antara dua kontribusi energi ini. Karena residu polar yang tertanam di membran sangat penting untuk pengikatan substrat dan perubahan konformasi, hasilnya melibatkan aturan positif-dalam dalam menentukan arsitektur situs fungsional protein-membran. Wawasan ini dapat membantu prediksi struktur, rekayasa, dan desain protein membran. TopGraph tersedia online (topgraph.weizmann.ac.il).

Kami para insinyur protein bersikap ambivalen tentang evolusi: di satu sisi, evolusi mengilhami kami dengan banyak sekali contoh pengikat biomolekuler, sensor, dan katalis di sisi lain, contoh-contoh ini jarang disesuaikan dengan baik untuk tugas-tugas rekayasa yang kami pikirkan. Oleh karena itu, insinyur protein telah memodifikasi protein alami dengan substitusi titik dan pertukaran fragmen dalam upaya untuk menghasilkan fungsi baru. Sebuah tandingan upaya desain tersebut, yang sedang dikejar sekarang dengan keberhasilan yang lebih besar, adalah untuk sepenuhnya menghindari bahan awal yang disediakan oleh alam dan untuk merancang fungsi protein baru dari awal dengan menggunakan pemodelan dan desain molekul de novo. Sementara kemajuan penting telah dibuat di kedua arah, beberapa bidang desain protein masih di luar jangkauan. Untuk tujuan ini, kami menganjurkan sintesis dari dua strategi ini: dengan menggunakan perhitungan desain untuk menggabungkan kembali dan mengoptimalkan fragmen dari protein alami, kami dapat membangun struktur yang stabil dan belum disampel, sehingga memberikan akses ke repertoar konformasi yang diperluas dan fungsi yang diinginkan. Kami mengusulkan bahwa metode masa depan yang menggabungkan analisis filogenetik, struktur dan bioinformatika urutan, dan pemodelan atomistik mungkin berhasil di mana salah satu dari pendekatan ini gagal dengan sendirinya.

Pada overekspresi heterolog, banyak protein salah lipatan atau agregat, sehingga menghasilkan hasil fungsional yang rendah. Human acetylcholinesterase (hAChE), suatu enzim yang memediasi transmisi sinaptik, adalah kasus khas dari protein manusia yang memerlukan sistem mamalia untuk mendapatkan ekspresi fungsional. Kami mengembangkan strategi komputasi dan merancang varian AChE dengan 51 mutasi yang meningkatkan pengemasan inti, polaritas permukaan, dan kekakuan tulang punggung. Varian ini diekspresikan pada tingkat yang mirip dengan 2.000 kali lipat lebih tinggi pada E. coli dibandingkan dengan hAChE tipe liar dan menunjukkan termostabilitas 20 derajat C lebih tinggi tanpa perubahan dalam sifat enzimatik atau dalam konfigurasi situs aktif sebagaimana ditentukan oleh kristalografi. Untuk menunjukkan kegunaan yang luas, kami juga merancang empat protein manusia dan bakteri lainnya. Pengujian paling banyak tiga desain per protein, kami memperoleh peningkatan stabilitas dan/atau hasil yang lebih tinggi dari protein larut dan aktif dalam E. coli. Algoritme kami hanya memerlukan struktur 3D dan beberapa lusin urutan homolog yang terjadi secara alami, dan tersedia di http://pross.weizmann.ac.il.

Selama dekade terakhir, para ilmuwan telah membuat kemajuan yang menarik dalam merancang lipatan protein seluruhnya di komputer dan kemudian berhasil mensintesisnya di laboratorium (1-5). Protein perancang ini memiliki struktur yang sama dalam percobaan seperti dalam model dan sangat stabil namun, mereka tidak memiliki fitur struktural penting yang terlihat pada antarmuka protein dan situs aktif enzim. Dalam dua laporan pada halaman 680 dan 687 edisi ini, Boyken et al. (6) dan Jacobs et al. (7) menggunakan perangkat lunak pemodelan biomolekuler Rosetta untuk merancang protein yang mencakup beberapa fitur ini. Eksperimen menunjukkan bahwa desain baru ini mempertahankan presisi dan stabilitas struktural yang tinggi.

Penyisipan segmen pembentuk heliks ke dalam membran dan asosiasinya menentukan struktur, fungsi, dan tingkat ekspresi semua protein membran plasma. Namun, kuantifikasi energi protein membran yang sistematis dan andal telah menjadi tantangan. Kami mengembangkan metode pemindaian mutasi dalam untuk memantau efek ratusan mutasi titik pada penyisipan heliks dan asosiasi diri di dalam membran dalam bakteri. Pengujian mengukur energi penyisipan untuk semua asam amino alami pada 27 posisi melintasi membran, mengungkapkan bahwa hidrofobisitas membran biologis secara signifikan lebih tinggi daripada yang dihargai. Kami selanjutnya menghitung kontribusi penyisipan protein-membran dari residu bermuatan positif pada antarmuka sitoplasma-membran dan mengungkapkan perbedaan besar dan tak terduga di antara residu ini. Akhirnya, kami memperoleh lanskap mutasi komprehensif dalam domain membran Glycophorin A dan onkogen ErbB2, dan menemukan bahwa penyisipan dan asosiasi-diri sangat digabungkan dalam homodimer reseptor.

Katalis disulfida yang disekresikan Quiescin sulfhydryl oxidase-1 (QSOX1) mempengaruhi organisasi matriks ekstraseluler dan diekspresikan secara berlebihan dalam berbagai adenokarsinoma dan stroma terkait. Penghambatan QSOX1 manusia ekstraseluler oleh antibodi monoklonal menurunkan migrasi sel tumor dalam model kultur sel dan karenanya mungkin memiliki potensi terapeutik. Namun, spesifisitas spesies antibodi monoklonal QSOX1 telah menjadi kemunduran dalam menilai kegunaannya sebagai agen anti-metastasis in vivo, masalah umum dalam industri terapi antibodi. Oleh karena itu kami menggunakan rekayasa yang dipandu secara struktural untuk memperluas spesifisitas spesies antibodi, meningkatkan afinitasnya terhadap QSOX1 tikus setidaknya empat kali lipat. Struktur kristal dari varian yang direkayasa ulang, dikomplekskan dengan antigen tikusnya, mengungkapkan bahwa antibodi menyelesaikan penargetan spesies ganda melalui kontak yang diubah antara rantai berat dan ringannya, ditambah penggantian aromatik besar dengan rantai samping fleksibel dan kutub yang dijembatani air serbaguna interaksi. Secara paralel, kami menghasilkan antibodi pengganti yang menargetkan tikus QSOX1 yang menunjukkan mode penghambatan QSOX1 baru. Set tiga antibodi penghambat QSOX1 ini kompatibel dengan berbagai model tikus untuk uji pra-klinis dan aplikasi bioteknologi. Dalam penelitian ini, kami memberikan wawasan tentang blok struktural untuk reaktivitas silang dan menyiapkan pedoman untuk desain dan rekayasa ulang antibodi yang sukses.

Desain komputasi fungsi protein telah membuat kemajuan substansial, menghasilkan enzim baru, pengikat, inhibitor, dan bahan nano yang sebelumnya tidak terlihat di alam. Namun, kemampuan untuk merancang tulang punggung protein baru untuk fungsi penting untuk melakukan kontrol atas semua derajat kebebasan polipeptida tetap menjadi tantangan kritis. Sebagian besar upaya sebelumnya untuk merancang tulang punggung baru menghitung rantai utama dari awal. Di sini, sebagai gantinya, kami menjelaskan tulang punggung kombinatorial dan algoritma pengoptimalan urutan yang disebut AbDesign, yang memanfaatkan sejumlah besar urutan dan struktur molekul antibodi yang ditentukan secara eksperimental untuk membangun model antibodi baru, menempelkannya pada permukaan target dan mengoptimalkan urutan dan konformasi tulang punggung untuk tinggi stabilitas dan afinitas pengikatan. Kami menggunakan algoritme untuk menghasilkan desain antibodi yang menargetkan permukaan molekul yang sama dengan sembilan antibodi afinitas tinggi alami dalam lima kasus, identitas urutan antarmuka di atas 30%, dan dalam empat di antaranya, konformasi tulang punggung pada inti permukaan pengikat antibodi adalah dalam 1 angstrom root-mean square deviasi dari antibodi alami. Desain merekapitulasi jaringan interaksi kutub yang diamati dalam kompleks alami, dan kekakuan rantai samping asam amino pada permukaan pengikatan yang dirancang, yang kemungkinan penting untuk afinitas dan spesifisitas, tinggi dibandingkan dengan studi desain sebelumnya. Dalam antibodi anti-lisozim yang dirancang, daerah penentu komplementaritas (CDR) di pinggiran antarmuka, seperti L1 dan H2, menunjukkan keragaman konformasi tulang punggung yang lebih besar daripada CDR pada inti antarmuka, dan meningkatkan luas permukaan pengikatan dibandingkan dengan antibodi alami, berpotensi meningkatkan afinitas dan spesifisitas.

Latar Belakang: Selulosomal cohesin-dockerin tipe terbalik di Bacteroides cellulosolvens. Hasil: Gabungan pendekatan kristalografi dan komputasi dari kohesin tunggal menghasilkan model struktural kompleks kohesin-dockerin yang diverifikasi secara eksperimental. Kesimpulan: Mode pengikatan ganda dockerin tidak eksklusif untuk integrasi enzim ke dalam selulosom, tetapi juga mencirikan perlekatan permukaan sel. Signifikansi: Pendekatan gabungan ini menyediakan platform untuk menghasilkan hipotesis yang dapat diuji dari interaksi kohesin-dockerin afinitas tinggi. Interaksi kohesin-dockerin mengatur perakitan salah satu kompleks multienzim alam yang paling rumit, selulosa. Selulosom diproduksi secara eksklusif oleh mikroba anaerobik dan memediasi hidrolisis polisakarida struktural tanaman yang sangat efisien, seperti selulosa dan hemiselulosa. Dalam model kanonik perakitan selulosa, modul dockerin tipe I dari enzim berikatan dengan modul kohesin tipe I yang diulang dari perancah primer. Setiap dockerin tipe I mengandung dua situs pengikatan kohesin yang sangat terkonservasi, yang memberikan fleksibilitas kuaterner ke kompleks multienzim. Scaffoldin juga mengandung dockerin tipe II yang mengikat seluruh kompleks ke permukaan sel dengan mengikat kohesin tipe II dari scaffoldin penahan. Dalam selulosolven Bacteroides, bagaimanapun, organisasi tipe kohesin-dockerin dibalik, dimana pasangan kohesin-dockerin tipe II mengintegrasikan enzim ke dalam perancah utama, dan modul tipe I memediasi perlekatan selulosa ke perancah penahan. Di sini, kami melaporkan struktur kristal kohesin tipe I dari B. cellulosolvens penahan scaffoldin ScaB ke resolusi 1,84-angstrom. Strukturnya menyerupai kohesin tipe I lainnya, dan situs pengikatan dockerin diduga, yang berpusat di -untai 3, 5, dan 6, kemungkinan akan dilestarikan di kohesin B. cellulosolven tipe I lainnya. Gabungan pemodelan komputasi, mutagenesis, dan studi pengikatan berbasis afinitas mengungkapkan jaringan ikatan hidrogen yang serupa antara residu pengenalan Ser/Asp yang diduga dalam dockerin pada posisi 11/12 dan 45/46, menunjukkan bahwa mode pengikatan ganda tidak eksklusif untuk integrasi enzim ke dalam selulosom primer tetapi juga dapat mengkarakterisasi perakitan poliselulosa dan perlekatan permukaan sel. Pendekatan umum ini dapat memberikan informasi struktural yang berharga dari antarmuka cohesin-dockerin, sebagai pengganti struktur kristal definitif.

Gen regulator autoimun (AIRE) sangat penting untuk membangun toleransi imunologis sentral dan mencegah autoimunitas. Mutasi pada AIRE menyebabkan penyakit resesif autosomal yang langka, sindrom poliendokrin autoimun tipe 1 (APS-1), dibedakan dengan autoimunitas multi-organ. Kami telah mengidentifikasi banyak kasus dan keluarga dengan mutasi mono-alel pada jari seng homeodomain tanaman pertama (PHD1) AIRE yang mengikuti pewarisan dominan, biasanya ditandai dengan onset yang lebih lambat, fenotipe yang lebih ringan, dan penetrasi yang berkurang dibandingkan dengan APS-1 klasik. Mutasi PHD1 missense ini menekan ekspresi gen yang didorong oleh AIRE tipe liar secara dominan-negatif, tidak seperti CARD atau mutan AIRE terpotong yang tidak memiliki kapasitas dominan seperti itu. Analisis array Exome mengungkapkan bahwa mutan dominan PHD1 ditemukan dengan frekuensi yang relatif tinggi (& gt0,0008) dalam populasi campuran. Hasil kami memberikan wawasan tentang aksi molekuler AIRE dan menunjukkan bahwa mutasi penyebab penyakit di lokus AIRE lebih umum daripada yang diperkirakan sebelumnya dan menyebabkan fenotipe autoimun yang lebih bervariasi.

Untuk melakukan aktivitasnya, makromolekul biologis menyeimbangkan sifat fisik yang berbeda, seperti stabilitas, afinitas interaksi, dan selektivitas. Seberapa sering sifat-sifat yang berlawanan seperti itu dikodekan dalam sistem makromolekul sangat penting untuk pemahaman kita tentang proses evolusi dan kemampuan untuk merancang molekul baru dengan fungsi yang diinginkan. Kami menyajikan kerangka kerja untuk membatasi simulasi desain untuk menyeimbangkan karakteristik fisik yang berbeda. Setiap sifat diwakili oleh hunian fraksional keseimbangan dari keadaan yang diinginkan relatif terhadap alternatifnya, mulai dari tidak ada hingga hunian penuh, dan sifat-sifat yang berbeda digabungkan menggunakan operator Boolean untuk menghasilkan bahasa logika "kabur" untuk mengkodekan kombinasi sifat apa pun. Dalam makalah lain, kami menyajikan algoritma desain tulang punggung kombinatorial baru AbDesign di mana kerangka logika fuzzy digunakan untuk mengoptimalkan tulang punggung dan urutan protein untuk stabilitas dan afinitas pengikatan dalam simulasi desain antibodi. Kami sekarang memperluas kerangka kerja ini dan menemukan bahwa simulasi desain logika fuzzy mereproduksi urutan dan prinsip desain struktur yang terlihat di alam untuk mendasari spesifisitas yang sangat baik di satu sisi dan multispesifisitas di sisi lain. Bahasa logika fuzzy dapat diterapkan secara luas dan dapat membantu menentukan ruang mutasi yang dapat ditoleransi dan menguntungkan dalam sistem biomolekuler alami dan merancang molekul buatan yang mengkodekan karakteristik kompleks. (C) Laboratorium Biologi Molekuler MRC 2014. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.


Referensi

Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R. & Farokhzad, O. C. Pengobatan nano kanker: kemajuan, tantangan, dan peluang. Nat. Pdt. Kanker 17, 20 (2016).

Chen, H., Zhang, W., Zhu, G., Xie, J. & amp Chen, X. Memikirkan kembali nanotheranostics kanker. Nat. Pdt. 2, 17024 (2017).

Douglas, S. M., Bachelet, I. & Church, G. M. Sebuah nanorobot berpintu logika untuk pengangkutan muatan molekul yang ditargetkan. Sains 335, 831–834 (2012).

Anselmo, A. C. & Mitragotri, S. Nanopartikel di klinik: pembaruan. Bioeng. terjemahan Med. 4, e10143 (2019).

Zhao, Z., Ukidve, A., Kim, J. & amp Mitragotri, S. Strategi penargetan untuk pengiriman obat spesifik jaringan. Sel 181, 151–167 (2020).

Cheng, Z., Al Zaki, A., Hui, J. Z., Muzykantov, V. R. & amp Tsourkas, A. Nanopartikel multifungsi: biaya versus manfaat penambahan kemampuan penargetan dan pencitraan. Sains 338, 903 (2012).

Datta, L. P., Manchineella, S. & amp Govindaraju, T. Biomolekul yang diturunkan biomaterial. Biomaterial 230, 119633 (2020).

Liu, K., Jiang, X. & Hunziker, sistem pengiriman nano amfifilik berbasis P. Karbohidrat untuk terapi kanker. skala nano 8, 16091–16156 (2016).

Habibi, N., Kamaly, N., Memic, A. & Shafiee, H. Struktur nano berbasis peptida yang dirakit sendiri: bahan nano cerdas menuju pengiriman obat yang ditargetkan. Nano Hari Ini 11, 41–60 (2016).

Kakkar, A., Traverso, G., Farokhzad, O. C., Weissleder, R. & amp Langer, R. Evolusi kompleksitas makromolekul dalam sistem pengiriman obat. Nat. Pdt. 1, 63 (2017).

Seeman, N.C. & Sleiman, H.F. DNA nanoteknologi. Nat. Pdt. 3, 17068 (2018).

Lammers, T. et al. Pengobatan nano kanker: apakah menargetkan target kita? Nat. Pdt. 1, 16069 (2016).

Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J. & Corrie, S. R. Obat-obatan berbasis nanopartikel: tinjauan bahan yang disetujui FDA dan uji klinis hingga saat ini. Farmasi. Res. 33, 2373–2387 (2016).

Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Ciri-ciri kanker: generasi berikutnya. Sel 144, 646–674 (2011).

Valkenburg, K. C., de Groot, A. E. & Pienta, K. J. Menargetkan stroma tumor untuk meningkatkan terapi kanker. Nat. Pdt. Klin. Onkol. 15, 366–381 (2018).

Ji, T.et al.Nanocarrier peptida yang dapat diubah untuk pelepasan obat yang cepat dan terapi kanker yang efektif melalui aktivasi fibroblas terkait kanker. Angew. Kimia Int. Ed. 55, 1050–1055 (2016).

Han, X. dkk. Pembalikan desmoplasia pankreas dengan mendidik kembali sel-sel bintang dengan sistem nano yang diaktifkan lingkungan mikro tumor. Nat. komuni. 9, 3390 (2018).

Li, S. dkk. Kombinasi terapi tumor-infark dan kemoterapi melalui co-pengiriman doxorubicin dan trombin dikemas dalam nanopartikel tumor-target. Nat. Bioma. Ind. 4, 732–742 (2020).

Metselaar, J. M. & Lammers, T. Tantangan dalam terjemahan klinis nanomedicine. Pengiriman Obat terjemahan Res. 10, 721–725 (2020).

Nel, A.E. dkk. Memahami interaksi biofisikokimia pada antarmuka nano-bio. Nat. ibu. 8, 543–557 (2009).

Cai, R. & Chen, C. Mahkota dan tongkat kerajaan: peran korona protein dalam pengobatan nano. Adv. ibu. 31, 1805740 (2019).

Banerjee, I., Pangule, R. C. & Kane, R. S. Pelapis antifouling: perkembangan terbaru dalam desain permukaan yang mencegah pengotoran oleh protein, bakteri, dan organisme laut. Adv. ibu. 23, 690–718 (2011).

Chelmowski, R. dkk. SAM berbasis peptida yang menolak adsorpsi protein. Selai. Kimia Soc. 130, 14952–14953 (2008).

Tonigold, M.et al. Pra-adsorpsi antibodi memungkinkan penargetan nanocarrier meskipun ada korona biomolekuler. Nat. nanoteknologi. 13, 862–869 (2018).

Hamad-Schifferli, K. Memanfaatkan sifat baru korona protein: aplikasi yang muncul dalam pengobatan nano. pengobatan nano 10, 1663–1674 (2015).

Setten, R. L., Rossi, J. J. & Han, S.-P. Keadaan saat ini dan arah masa depan dari terapi berbasis RNAi. Nat. Pdt. Drug Discov. 18, 421–446 (2019).

Zhang, Z.et al. Pengiriman obat yang ditargetkan ke otak dengan memanipulasi fungsi protein korona. Nat. komuni. 10, 3561 (2019).

Mirshafiee, V., Kim, R., Park, S., Mahmoudi, M. & Kraft, M. L. Dampak pra-pelapisan protein pada komposisi korona protein dan serapan seluler nanopartikel. Biomaterial 75, 295–304 (2016).

Owens, D. E. & Peppas, N. A. Opsonisasi, biodistribusi, dan farmakokinetik nanopartikel polimer. Int. J. Farmasi. 307, 93–102 (2006).

Zhang, P., Sun, F., Liu, S. & Jiang, S. Anti-PEG antibodi di klinik: masalah saat ini dan di luar PEGylation. J. Kontrol. Rel. 244, 184–193 (2016).

Hu, C.-M. J. dkk. Nanopartikel polimer berkamuflase membran eritrosit sebagai platform pengiriman biomimetik. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 108, 10980 (2011).

Rodriguez, P. L. et al. Peptida 'diri' minimal yang menghambat pembersihan fagositik dan meningkatkan pengiriman nanopartikel. Sains 339, 971 (2013).

Kim, J.et al. Co-coating nanocarrier obat bertarget reseptor dengan bagian anti-fagosit meningkatkan serapan jaringan spesifik versus pembersihan fagositik non-spesifik. Biomaterial 147, 14–25 (2017).

Kang, T.et al. Nanopartikel yang dilapisi dengan membran neutrofil dapat secara efektif mengobati metastasis kanker. ACS Nano 11, 1397–1411 (2017).

Cheng, Q. dkk. Nanopartikel penargetan organ selektif (SORT) untuk pengiriman mRNA spesifik jaringan dan pengeditan gen CRISPR-Cas Nat. nanoteknologi. 15, 313–320 (2020).

Blanco, E., Shen, H. & Ferrari, M. Prinsip desain nanopartikel untuk mengatasi hambatan biologis untuk pengiriman obat. Nat. Bioteknologi. 33, 941 (2015).

Nichols, J. W. & Bae, Y. H. EPR: bukti dan kekeliruan. J. Kontrol. Rel. 190, 451–464 (2014).

Nakamura, H., Jun, F. & Maeda, H. Pengembangan obat makromolekul generasi berikutnya berdasarkan efek EPR: tantangan dan perangkap. Pendapat Ahli. Pengiriman Obat 12, 53–64 (2015).

Wilhelm, S.et al. Analisis pengiriman nanopartikel ke tumor. Nat. Pdt. 1, 16014 (2016).

Li, S. dkk. Penipisan lokal yang dimediasi nanopartikel dari trombosit terkait tumor mengganggu hambatan vaskular dan menambah akumulasi obat pada tumor. Nat. Bioma. Ind. 1, 667–679 (2017).

Miller, M.A. dkk. Memprediksi kemanjuran pengobatan nano terapeutik menggunakan nanopartikel pencitraan resonansi magnetik pendamping. Sci. terjemahan Med. 7, 314ra183 (2015).

Shah, S., Liu, Y., Hu, W. & amp Gao, J. Pemodelan dinamika bentuk-tergantung partikel di nano. J. Nanosci. nanoteknologi. 11, 919–928 (2011).

Liang, Q. dkk. Kelembutan mikropartikel yang diturunkan dari sel tumor mengatur efisiensi pengiriman obatnya. Nat. Bioma. Ind. 3, 729–740 (2019).

Palomba, R.et al. Pembawa biomimetik meniru membran plasma leukosit untuk meningkatkan permeabilitas pembuluh darah tumor. Sci. Reputasi. 6, 34422 (2016).

Sindhwani, S.et al. Masuknya nanopartikel ke dalam tumor padat. Nat. ibu. 19, 566–575 (2020).

Liu, X., Jiang, J. & Meng, H. Transcytosis — strategi penargetan efektif yang melengkapi 'efek EPR' untuk pengiriman obat nano kanker pankreas. Theranostik 9, 8018–8025 (2019).

Pandit, S., Dutta, D. & Nie, S. Transcytosis aktif dan peluang baru untuk pengobatan nano kanker. Nat. ibu. 19, 478–480 (2020).

Guo, Y. dkk. Nanopartikel polimer terbungkus membran eritrosit sebagai vaksin nano untuk induksi kekebalan antitumor terhadap melanoma. ACS Nano 9, 6918–6933 (2015).

Xu, J.et al. Membalikkan batang tumor melalui nanopartikel yang ditargetkan secara oral mencapai pengobatan kanker usus besar yang efisien. Biomaterial 216, 119247 (2019).

Perisai, C. W. et al. Ransel seluler untuk imunoterapi makrofag. Sci. Adv. 6, eaaz6579 (2020).

Ngambenjawong, C., Gustafson, H. H. & Pun, S. H. Kemajuan dalam terapi bertarget tumor terkait makrofag (TAM). Adv. Pengiriman Obat Putaran. 114, 206–221 (2017).

Dowdy, S. F. Mengatasi hambatan seluler untuk terapi RNA. Nat. Bioteknologi. 35, 222–229 (2017).

Thambi, T., Phan, V. H. G. & Lee, D. S. Hidrogel injeksi sensitif-stimuli berdasarkan polisakarida dan aplikasi biomedisnya. Makromol. Komunitas Cepat. 37, 1881–1896 (2016).

Lin, N., Huang, J. & amp Dufresne, A. Persiapan, sifat dan aplikasi nanocrystals polisakarida dalam nanomaterial fungsional canggih: review. skala nano 4, 3274–3294 (2012).

Hu, H. dkk. Nanocrystals kapas selulosa polikation yang responsif terhadap redoks untuk pengobatan kanker yang efektif. Aplikasi ACS ibu. Antarmuka 7, 8942–8951 (2015).

Swierczewska, M., Han, H. S., Kim, K., Park, J. H. & amp Lee, nanopartikel berbasis S. Polisakarida untuk pengobatan nano theranostik. Adv. Pengiriman Obat Putaran. 99, 70–84 (2016).

Butt, A. M. et al. Penyampaian kode doksorubisin dan siRNA melalui polipleks misel campuran responsif pH yang dilapisi kitosan untuk terapi kanker yang ditingkatkan pada tumor yang resistan terhadap banyak obat. mol. Farmasi. 13, 4179–4190 (2016).

Shi, G.-N. dkk. Peningkatan kekebalan antitumor dengan menargetkan sel dendritik dengan vaksin nanopartikel kitosan yang mengandung lisat sel tumor. Biomaterial 113, 191–202 (2017).

Thambi, T.et al. Nanopartikel karboksimetil dekstran bioreduksi untuk pengiriman obat bertarget tumor Adv. Kesehatanc. ibu. 3, 1829–1838 (2014).

Han, H.S. dkk. Nanopartikel asam hialuronat shell-cross-linked bioreduksi untuk pengiriman obat yang ditargetkan tumor Biomakromolekul 16, 447–456 (2015).

Wang, X. dkk. Konjugat karboksimetil kitosan-quercetin amfifilik dengan sifat penghambatan P-gp untuk pengiriman oral paclitaxel. Biomaterial 35, 7654–7665 (2014).

Schmidt, K.T. dkk. Pengukuran NLG207 (sebelumnya CRLX101) yang terikat nanopartikel dan melepaskan camptothecin dalam plasma manusia. J. Farmasi. Bioma. dubur. 181, 113073 (2020).

Choi, K.Y.et al. Nanoplatform interferensi RNA serbaguna untuk pengiriman RNA sistemik. ACS Nano 8, 4559–4570 (2014).

Lallana, E.et al. Nanopartikel kitosan / asam hialuronat: desain rasional ditinjau kembali untuk pengiriman RNA mol. Farmasi. 14, 2422–2436 (2017).

Kim, T.et al. Kapsul kitosan multikompartemen berpola nanopartikel untuk pengiriman oligonukleotida oral. Biometer ACS. Sci. Ind. 4, 4163–4173 (2018).

Wu, L. dkk. Tinjauan tentang perkembangan fucoidan dalam aktivitas antitumor: kemajuan dan tantangan. Karbohidrat. Polim. 154, 96–111 (2016).

Shamay, Y. et al. P-selectin adalah target pengiriman nanoterapi dalam lingkungan mikro tumor. Sci. terjemahan Med. 8, 345ra87 (2016).

Juenet, M.et al. Terapi trombolitik berdasarkan nanopartikel polimer yang difungsikan fucoidan yang menargetkan P-selectin. Biomaterial 156, 204–216 (2018).

Otterlei, M.et al. Induksi produksi sitokin dari monosit manusia dirangsang dengan alginat. J. Kekebalan. 10, 286–291 (1991).

Jani, M. S., Veetil, A. T. & Krishnan, Y. Imunomodulasi presisi dengan teknologi asam nukleat sintetis. Nat. Pdt. 4, 451–458 (2019).

Zhao, Y. dkk. Nanofabrication berdasarkan nanoteknologi DNA. Nano Hari Ini 26, 123–148 (2019).

Seeman, N. C. Sambungan dan kisi asam nukleat. J. Teori. Biol. 99, 237–247 (1982).

Guo, P., Zhang, C., Chen, C., Garver, K. & Trottier, M. Interaksi antar-RNA fag phi29 pRNA untuk membentuk kompleks heksamerik untuk transportasi DNA virus. mol. Sel 2, 149–155 (1998).

Guo, P. Bidang yang muncul dari nanoteknologi RNA. Nat. nanoteknologi. 5, 833–842 (2010).

Xu, C. dkk. Biodistribusi yang menguntungkan, penargetan spesifik, dan pelarian endosomal bersyarat dari nanopartikel RNA dalam terapi kanker. Kanker Lett. 414, 57–70 (2018).

Jasinski, D., Haque, F., Binzel, D. W. & amp Guo, P. Kemajuan bidang nanoteknologi RNA yang muncul. ACS Nano 11, 1142–1164 (2017).

Watts, J. K., Deleavey, G. F. & Damha, M. J. SiRNA yang dimodifikasi secara kimia: alat dan aplikasi. Penemuan Obat Hari ini 13, 842–855 (2008).

Piao, X., Xia, X., Mao, J. & Bong, D. Ligasi peptida dan pembelahan RNA melalui antarmuka template abiotik. Selai. Kimia Soc. 137, 3751–3754 (2015).

Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A. & Seeman, N. C. Merancang dan merakit sendiri kristal DNA dua dimensi. Alam 394, 539–544 (1998).

Rothemund, P. W. Melipat DNA untuk membuat bentuk dan pola berskala nano. Alam 440, 297–302 (2006).

Wei, B., Dai, M. & Yin, P. Bentuk kompleks yang dirakit sendiri dari ubin DNA untai tunggal. Alam 485, 623–626 (2012).

Ali, M.M.et al. Amplifikasi lingkaran bergulir: alat serbaguna untuk biologi kimia, ilmu material, dan kedokteran. Kimia Soc. Putaran. 43, 3324–3341 (2014).

Wang, C., Sun, W., Wright, G., Wang, A. Z. & amp Gu, Z. Imunoterapi kanker yang dipicu oleh peradangan dengan pengiriman terprogram CpG dan antibodi anti-PD1. Adv. ibu. 28, 8912–8920 (2016).

Ramezani, H. & Dietz, H. Membangun mesin dengan molekul DNA. Nat. Pdt. 21, 5–26 (2020).

Wang, P., Ko, S. H., Tian, ​​C., Hao, C. & amp Mao, C. RNA-DNA hybrid origami: melipat untai tunggal RNA panjang menjadi struktur nano kompleks menggunakan untai pembantu DNA pendek. Kimia komuni. 49, 5462–5464 (2013).

Zhou, J. & Rossi, J. Aptamers sebagai terapi yang ditargetkan: potensi dan tantangan saat ini. Nat. Pdt. Drug Discov. 16, 181–202 (2017).

Li, L. dkk. Aptamers asam nukleat untuk diagnostik dan terapi molekuler: kemajuan dan perspektif. Angew. Kimia Int. Ed. https://doi.org/10.1002/anie.202003563 (2020).

Ren, K. dkk. Strategi kunci-dan-kunci ganda DNA untuk pengiriman siRNA spesifik-subtipe sel. Nat. komuni. 7, 13580 (2016).

Ma, W. dkk. Nanorobot DNA cerdas dengan degradasi lisosomal protein yang ditingkatkan secara in vitro dari HER2. Nano Let. 19, 4505–4517 (2019).

Jiang, D.et al. Struktur nano DNA tetrahedral multi-senjata untuk penargetan tumor, modalitas ganda dalam pencitraan in vivo Aplikasi ACS ibu. Antarmuka 8, 4378–4384 (2016).

Lee, H. dkk. Nanopartikel asam nukleat yang dirakit sendiri secara molekuler untuk pengiriman siRNA in vivo yang ditargetkan Nat. nanoteknologi. 7, 389–393 (2012).

Zhang, Q. dkk. Origami DNA sebagai sarana penghantaran obat in vivo untuk terapi kanker. ACS Nano 8, 6633–6643 (2014).

Yang, Y.et al. Polimer koordinasi skala nano berbasis G-quadruplex untuk memodulasi hipoksia tumor dan mencapai pengiriman obat bertarget nuklir untuk terapi fotodinamik yang ditingkatkan. Nano Let. 18, 6867–6875 (2018).

Veetil, A.T. dkk. Nanokapsul DNA yang dapat ditargetkan sel untuk pelepasan spatiotemporal dari molekul kecil bioaktif yang dikurung Nat. nanoteknologi. 12, 1183–1189 (2017).

Bujold, K. E., Hsu, J. C. C. & Sleiman, H. F. Mengoptimalkan DNA 'nanosuitcases' untuk enkapsulasi dan pelepasan siRNA bersyarat. Selai. Kimia Soc. 138, 14030–14038 (2016).

Ranallo, S., Prevost-Tremblay, C., Idili, A., Vallee-Belisle, A. & amp Ricci, F. Pelepasan asam nukleat bertenaga antibodi menggunakan mesin nano berbasis DNA. Nat. komuni. 8, 15150 (2017).

Amir, Y. dkk. Komputasi universal oleh robot origami DNA pada hewan hidup. Nat. nanoteknologi. 9, 353–357 (2014).

Arnon, S.et al. Robot skala nano yang dikendalikan pikiran dalam inang yang hidup. PLoS SATU 11, e0161227 (2016).

Li, S. dkk. Sebuah nanorobot DNA berfungsi sebagai terapi kanker dalam menanggapi pemicu molekuler in vivo. Nat. Bioteknologi. 36, 258–264 (2018).

Ma, P. Q., Huang, Q., Li, H. D., Yin, B. C. & Ye, B. C. Jaringan komunikasi multimesin yang meniru respons imun adaptif. Selai. Kimia Soc. 142, 3851–3861 (2020).

Kobori, S., Nomura, Y. & Yokobayashi, Y. Mesin nano RNA bertenaga sendiri yang digerakkan oleh struktur metastabil. Asam Nukleat Res. 47, 6007–6014 (2019).

Agrahari, V.et al. Mikro-/nanorobot cerdas sebagai perangkat pembawa obat dan sel untuk kemajuan terapeutik biomedis: peluang pengembangan yang menjanjikan dan tantangan translasi. Biomaterial 260, 120163 (2020).

Wu, Z., Chen, Y., Mukasa, D., Pak, O. S. & Gao, W. Mikro/nanorobot medis dalam media kompleks. Kimia Soc. Putaran. 49, 8088–8112 (2020).

Hong, E.et al. Struktur dan komposisi menentukan imunorekognisi nanopartikel asam nukleat. Nano Let. 18, 4309–4321 (2018).

Pardi, N., Hogan, M. J., Porter, F. W. & Weissman, D. vaksin mRNA — era baru dalam vaksinologi. Nat. Pdt. Drug Discov. 17, 261–279 (2018).

Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S. & amp DeRosa, F. Janji vaksin mRNA: perspektif biotek dan industri. Vaksin NPJ 5, 11 (2020).

Jeyanathan, M.et al. Pertimbangan imunologis untuk strategi vaksin COVID-19. Nat. Pdt. Imunol. 20, 615–632 (2020).

Keller, A. & Linko, V. Tantangan dan perspektif struktur nano DNA dalam biomedis. Angew. Kimia Int. Ed. 59, 15818–15833 (2020).

Afonin, K.A. dkk. Memicu interferensi RNA dengan nanopartikel RNA-RNA, RNA-DNA, dan DNA-RNA. ACS Nano 9, 251–259 (2015).

Guo, S. dkk. Ukuran, bentuk, dan imunogenisitas tergantung urutan nanopartikel RNA. mol. Ada. Asam nukleat 9, 399–408 (2017).

Halman, J. R. et al. Nanopartikel pengubah bentuk yang saling bergantung secara fungsional dengan sifat yang dapat dikontrol. Asam Nukleat Res. 45, 2210–2220 (2017).

Guo, S. dkk. Nanopartikel RNA ultra-termostabil untuk pelarutan dan pemuatan paclitaxel hasil tinggi untuk terapi kanker payudara. Nat. komuni. 11, 972 (2020).

Hyde, J. L. et al. Elemen struktural RNA virus mengubah pengenalan inang terhadap RNA nonself. Sains 343, 783–787 (2014).

Rackley, L. dkk. Serat RNA sebagai nanoscaffolds yang dioptimalkan untuk koordinasi siRNA dan pengurangan pengenalan imunologis. Adv. Fungsi. ibu. 28, 1805959 (2018).

Liu, J.et al. Nanoplatform DNA yang disesuaikan untuk RNAi-/kemoterapi sinergis dari tumor yang resistan terhadap banyak obat. Angew. Kimia Int. Ed. 57, 15486–15490 (2018).

Surana, S., Shenoy, A. R. & Krishnan, Y. Merancang perangkat nano DNA untuk kompatibilitas dengan sistem kekebalan organisme yang lebih tinggi. Nat. nanoteknologi. 10, 741–747 (2015).

Johnson, M.B. dkk. Poligon berbasis asam nukleat yang dapat diprogram dengan sifat neuroimunomodulator terkontrol untuk pemodelan QSAR prediktif. Kecil 13, 1701255 (2017).

Yamankurt, G. dkk. Eksplorasi ruang desain pengobatan nano dengan penyaringan throughput tinggi dan pembelajaran mesin. Nat. Bioma. Ind. 3, 318–327 (2019).

Kroll, A.V. dkk. Vaksin nanopartikel biomimetik untuk terapi kanker. Adv. Biosis. 3, 1800219 (2019).

Klinman, D. M. Immunotherapeutic menggunakan CpG oligodeoxynucleotides. Nat. Pdt. Imunol. 4, 249–258 (2004).

Khisamutdinov, E. F. dkk. Meningkatkan imunomodulasi pada imunitas bawaan dengan transisi bentuk di antara nanovehicle segitiga, persegi, dan pentagon RNA. Asam Nukleat Res. 42, 9996–10004 (2014).

Liu, X. dkk. Platform struktur nano DNA untuk perakitan langsung vaksin sintetis. Nano Let. 12, 4254–4259 (2012).

Li, J.et al. Struktur nano DNA multivalen yang dirakit sendiri untuk pengiriman oligonukleotida CpG imunostimulator intraseluler noninvasif. ACS Nano 5, 8783–8789 (2011).

Goldberg, M. S. Meningkatkan imunoterapi kanker melalui nanoteknologi. Nat. Pdt. Kanker 19, 587–602 (2019).

Wang, S. dkk. Vaksinologi rasional dengan asam nukleat bulat. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 116, 10473–10481 (2019).

Umeki, Y.et al. Induksi kekebalan antitumor potensial dengan pelepasan berkelanjutan antigen kationik dari hidrogel berbasis DNA dengan aktivitas adjuvant. Adv. Fungsi. ibu. 25, 5758–5767 (2015).

Zhu, G. dkk. Jalinan nanokapsul DNA-RNA yang sarat dengan neoantigen tumor sebagai vaksin nano sinergis untuk imunoterapi kanker. Nat. komuni. 8, 1482 (2017).

Santulli-Marotto, S., Nair, S. K., Rusconi, C., Sullenger, B. & amp Gilboa, E. Aptamers RNA multivalen yang menghambat CTLA-4 dan meningkatkan kekebalan tumor. Kanker Res. 63, 7483–7489 (2003).

Devaraj, SGT, Rao, LGL, Zu, Y., Chang, J. & amp Iyer, SP DNA aptamer terhadap kematian sel anti-terprogram-1 (anti-PD1-apt) menginduksi aktivitas anti-leukemik yang kuat secara in vitro dan in vivo manusiawi Tikus NSG dengan xenograft leukemia myeloid. Darah 130, 1373 (2017).

Praetorius, F. dkk. Produksi massal bioteknologi origami DNA. Alam 552, 84–87 (2017).

Li, M.et al. Produksi in vivo struktur nano RNA melalui pelipatan terprogram dari RNA untai tunggal Nat. komuni. 9, 2196 (2018).

Bae, W., Kocabey, S. & Liedl, struktur nano T. DNA in vitro, in vivo dan pada membran. Nano Hari Ini 26, 98–107 (2019).

Gerling, T., Kube, M., Kick, B. & Dietz, H. Ikatan kovalen yang dapat diprogram urutan dari rakitan DNA yang dirancang. Sci. Adv. 4, eaau1157 (2018).

Anastassacos, F. M., Zhao, Z., Zeng, Y. & Shih, W. M. Tautan silang glutaraldehida dari oligolisin yang melapisi origami DNA sangat mengurangi kerentanan terhadap degradasi nuklease. Selai. Kimia Soc. 142, 3311–3315 (2020).

Kim, Y. & Yin, P. Meningkatkan stabilitas biokompatibel struktur nano DNA menggunakan oligonukleotida dendritik dan motif bata. Angew. Kimia Int. Ed. 59, 700–703 (2020).

Perrault, S. D. & Shih, W. M. Enkapsulasi membran lipid dari oktahedron nano DNA 3D. Metode Mol. Biol. 1500, 165–184 (2017).

Wiraja, C.et al. Kerangka asam nukleat sebagai pembawa yang dapat diprogram untuk pengiriman obat transdermal. Nat. komuni. 10, 1147 (2019).

Benson, E.et al. Render DNA dari jerat polihedral pada skala nano. Alam 523, 441–444 (2015).

Veneziano, R. dkk. Perakitan DNA skala nano perancang diprogram dari atas ke bawah. Sains 352, 1534 (2016).

De Santis, E. & Ryadnov, perakitan mandiri M. G. Peptida untuk bahan nano: anak baru yang lama di blok. Kimia Soc. Putaran. 44, 8288–8300 (2015).

Qin, H., Ding, Y., Mujeeb, A., Zhao, Y. & amp Nie, G. Penargetan lingkungan mikro tumor dan formulasi nano berbasis peptida responsif untuk terapi tumor yang ditingkatkan. mol. Farmasi. 92, 219–231 (2017).

Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I. & Stephenson, R. J. Kemajuan terbaru dalam peptida rakitan sendiri: implikasi untuk pengiriman obat yang ditargetkan dan rekayasa vaksin. Adv. Pengiriman Obat Putaran. 110-111, 169–187 (2017).

Qi, G.-B., Gao, Y.-J., Wang, L. & amp Wang, H. merakit sendiri bahan nano berbasis peptida untuk pencitraan biomedis dan terapi. Adv. ibu. 30, 1703444 (2018).

Liang, C.et al. Pelipatan peptida yang dibantu enzim, perakitan, dan sifat anti-kanker. skala nano 9, 11987–11993 (2017).

Beesley, J. L. et al. Memodifikasi kandang peptida rakitan sendiri untuk mengontrol internalisasi ke dalam sel mamalia. Nano Let. 18, 5933–5937 (2018).

Ueda, M.et al. Nanotube berongga rasio aspek tinggi yang disegel akhir yang mengenkapsulasi obat antikanker: nanokapsul peptidik berbentuk torpedo. ACS Nano 13, 305–312 (2019).

Wyatt, L.C. dkk. Peptida dari keluarga pHLIP untuk pengiriman molekul kargo intraseluler dan ekstraseluler yang ditargetkan ke tumor. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 115, E2811–E2818 (2018).

Zhang, D.et al. Pembentukan nanofibers in situ dari konjugat purpurin18-peptida dan perakitan menginduksi efek retensi di lokasi tumor. Adv. ibu. 27, 6125–6130 (2015).

Dimatteo, R., Darling, N. J. & Segura, T. In situ membentuk hidrogel injeksi untuk pengiriman obat dan perbaikan luka. Adv. ibu. 127, 167–184 (2018).

Li, J.et al. Kekuatan baru dari penghambat anhidrase karbonat yang merakit sendiri: serat nano yang dibangun oleh peptida pendek menginspirasi terapi kanker hipoksia. Sci. Adv. 5, eaax0937 (2019).

Mann, A.P. dkk. Peptida untuk pengiriman pencitraan dan senyawa terapeutik yang ditargetkan dan sistemik ke dalam cedera otak akut. Nat. komuni. 7, 11980 (2016).

Zhang, C.et al. Nanomaterial multifungsi berbasis peptida untuk pencitraan dan terapi tumor. Adv. Fungsi. ibu. 28, 1804492 (2018).

Zhang, G.dkk. Sistem pengiriman yang menargetkan permukaan pembentukan tulang untuk memfasilitasi terapi anabolik berbasis RNAi. Nat. Med. 18, 307–314 (2012).

Field, L. D., Delehanty, J. B., Chen, Y. & amp Medintz, I. L. Peptida untuk secara khusus menargetkan nanopartikel ke organel seluler: quo vadis? acc. Kimia Res. 48, 1380–1390 (2015).

Rudra, J.S. dkk. Memodulasi respons imun adaptif terhadap rakitan mandiri peptida. ACS Nano 6, 1557–1564 (2012).

Lau, J. L. & Dunn, M. K. Peptida terapeutik: perspektif historis, tren perkembangan saat ini, dan arah masa depan. Bioorg. Med. Kimia 26, 2700–2707 (2018).

Zhang, L. dkk. Nanoterapeutik peptida responsif kooperatif yang mengatur aktivitas Tie2 reseptor angiopoietin dalam lingkungan mikro tumor untuk mencegah kekambuhan tumor payudara setelah kemoterapi. ACS Nano 13, 5091–5102 (2019).

Gray, B. P., Li, S. & Brown, K. C. Dari tampilan fag hingga pengiriman nanopartikel: memfungsikan liposom dengan peptida multivalen meningkatkan penargetan ke biomarker kanker. Biokonjugasi. Kimia 24, 85–96 (2013).

Singha, S.et al. Obat nano berbasis peptida-MHC untuk fungsi autoimunitas sebagai perangkat microclustering reseptor sel-T. Nat. nanoteknologi. 12, 701–710 (2017).

Roberts, S.et al. Jaringan suntik yang mengintegrasikan jaringan dari polipeptida rekombinan dengan urutan yang dapat diatur. Nat. ibu. 17, 1154–1163 (2018).

Mason, T.O. dkk. Sintesis polimer peptida supramolekul nonequilibrium pada platform mikofluida. Selai. Kimia Soc. 138, 9589–9596 (2016).

Molino, N. M. & Wang, S. W. Nanopartikel protein terkurung untuk pengiriman obat. Curr. pendapat. Bioteknologi. 28, 75–82 (2014).

Neek, M., Kim, T.I. & Wang, S.-W. Nanopartikel berbasis protein dalam pengembangan vaksin kanker. pengobatan nano 15, 164–174 (2019).

Zhuang, J.et al. Pengiriman nanopartikel agen imunostimulan untuk imunoterapi kanker. Theranostik 9, 7826–7848 (2019).

Edwardson, T. G. W. & Hilvert, D. Fungsi yang diilhami virus dalam kandang protein yang direkayasa. Selai. Kimia Soc. 141, 9432–9443 (2019).

Cannon, K. A., Ochoa, J. M. & Yeates, T. O. Rakitan protein simetri tinggi: pola dan aplikasi yang muncul. Curr. pendapat. Struktur. Biol. 55, 77–84 (2019).

Jain, A., Singh, S. K., Arya, S. K., Kundu, S. C. & amp Kapoor, S. Protein nanopartikel: platform yang menjanjikan untuk aplikasi pengiriman obat. Biometer ACS. Sci. Ind. 4, 3939–3961 (2018).

Yassine, H.M. dkk. Nanopartikel batang hemaglutinin menghasilkan perlindungan influenza heterosubtipe. Nat. Med. 21, 1065–1070 (2015).

Kuan, S. L., Bergamini, F. R. G. & Weil, T. Struktur nano protein fungsional: kotak peralatan kimia. Kimia Soc. Putaran. 47, 9069–9105 (2018).

Dia, J., Fan, K. & Yan, pembawa obat X. Ferritin (FDC) untuk terapi penargetan tumor. J. Kontrol. Rel. 311, 288–300 (2019).

Jiang, B., Fang, L., Wu, K., Yan, X. & Fan, K. Ferritins sebagai nanozymes alami dan buatan untuk theranostics. Theranostik 10, 687–706 (2020).

Kratz, F. Pembaruan klinis penggunaan albumin sebagai pembawa obat — sebuah komentar. J. Kontrol. Rel. 190, 331–336 (2014).

Desai, N., Trieu, V., Damascelli, B. & amp Soon-Shiong, P. Ekspresi SPARC berkorelasi dengan respon tumor terhadap paclitaxel yang terikat albumin pada pasien kanker kepala dan leher. terjemahan Onkol. 2, 59–64 (2009).

Hidalgo, M.et al. Ekspresi SPARC tidak memprediksi kemanjuran nab-paclitaxel plus gemcitabine atau gemcitabine saja untuk kanker pankreas metastatik dalam analisis eksplorasi uji coba fase III MPACT. klinik Kanker Res. 21, 4811–4818 (2015).

Lin, T. dkk. Nanopartikel albumin penembus darah-otak-penghalang untuk pengiriman obat biomimetik melalui jalur protein pengikat albumin untuk terapi antiglioma. ACS Nano 10, 9999–10012 (2016).

Chung, S.W. dkk. Prodrug caspase-cleavable pengikat albumin yang diaktifkan secara selektif pada tumor lokal yang terpapar radiasi. Biomaterial 94, 1–8 (2016).

Sarett, S.M. dkk. SiRNA lipofilik menargetkan albumin in situ dan meningkatkan ketersediaan hayati, penetrasi tumor, dan pembungkaman gen bebas pembawa. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 114, E6490–E6497 (2017).

Choi, S.H. dkk. Nanopartikel albumin rakitan yang dapat dihirup untuk mengobati kanker paru-paru yang resistan terhadap obat. J. Kontrol. Rel. 197, 199–207 (2015).

Zhu, G. dkk. Nanokompleks albumin/vaksin yang berkumpul in vivo untuk imunoterapi kanker kombinasi. Nat. komuni. 8, 1954 (2017).

Gradishar, W. J. Albumin-terikat paclitaxel: taxane generasi berikutnya. Pendapat Ahli. apoteker. 7, 1041–1053 (2006).

Chawla, S.P. dkk. Aldoxorubicin lini pertama vs doxorubicin pada sarkoma jaringan lunak yang tidak dapat direseksi metastasis atau lanjut secara lokal: uji klinis acak fase 2b. JAMA Onkol. 1, 1272–1280 (2015).

Cirstea, D. et al. Penghambatan ganda target akt/mamalia dari jalur rapamycin oleh nanopartikel albumin-bound-rapamycin dan perifosin menginduksi aktivitas antitumor pada multiple myeloma. mol. Kanker Ada. 9, 963–975 (2010).

Huang, X.L. dkk. Nanocage protein hipoksia-tropik untuk modulasi hipoksia terkait tumor dan kemoterapi. ACS Nano 13, 236–247 (2019).

Fan, K.et al. Ferritin nanocarrier melintasi sawar darah otak dan membunuh glioma. ACS Nano 12, 4105–4115 (2018).

Lee, E.J. dkk. Nanocage-terapi fagositosis yang berlaku dan kematian sel imunogenik membangkitkan kekebalan terhadap kanker. Adv. ibu. 30, 11 (2018).

Zhen, Z. dkk. Nanopartikel apoferritin yang dimodifikasi RGD untuk pengiriman obat yang efisien ke tumor ACS Nano 7, 4830–4837 (2013).

Wang, Z. dkk. Sintesis nanocage tembaga sulfida-ferritin yang terinspirasi biomineralisasi sebagai terapi kanker. ACS Nano 10, 3453–3460 (2016).

Matahari, C.et al. Mengontrol perakitan kluster emas berpasangan dalam nanoreaktor apoferritin untuk penargetan ginjal in vivo dan pencitraan biomedis Selai. Kimia Soc. 133, 8617–8624 (2011).

Fan, J.et al. Bukti langsung untuk aktivitas katalase dan peroksidase dari nanopartikel feritin-platinum. Biomaterial 32, 1611–1618 (2011).

Matahari, C.et al. Nanocage h-ferritin yang disempurnakan dengan beberapa kluster emas sebagai nanoprobe penargetan khusus ginjal dekat-inframerah Biokonjugasi. Kimia 26, 193–196 (2015).

Fan, K.et al. In vivo membimbing nanozim karbon yang didoping nitrogen untuk terapi katalitik tumor. Nat. komuni. 9, 1440 (2018).

Shan, W.J. dkk. Nanocage bioengineered dari protein HBc untuk imunoterapi kanker kombinasi. Nano Let. 19, 1719–1727 (2019).

Chowdhury, S. et al. Bakteri yang dapat diprogram menginduksi regresi tumor yang tahan lama dan kekebalan antitumor sistemik. Nat. Med. 25, 1057–1063 (2019).

Tang, L. dkk. Meningkatkan terapi sel T melalui pengiriman obat nanopartikel responsif pensinyalan TCR. Nat. Bioteknologi. 36, 707–716 (2018).

Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G. & Bachmann, M. F. Temuan utama dan kemajuan terbaru dalam vaksin berbasis partikel mirip virus (VLP). mani. kekebalan. 34, 123–132 (2017).

Shukla, S. et al. Vaksin HER2 berbasis nanopartikel virus: respons imun dipengaruhi oleh transportasi diferensial, lokalisasi, dan interaksi seluler pembawa partikulat. Biomaterial 121, 15–27 (2017).

Lizotte, P.H. dkk. Vaksinasi in situ dengan nanopartikel virus mosaik kacang tunggak menekan kanker metastatik Nat. nanoteknologi. 11, 295–303 (2016).

Kemnade, J. O. et al. Virus mosaik tembakau secara efisien menargetkan serapan DC, aktivasi, dan respons sel T spesifik antigen in vivo. Vaksin 32, 4228–4233 (2014).

Goldinger, S. M. et al. Vaksinasi partikel nano yang dikombinasikan dengan ligan TLR-7 dan -9 memicu respons sel T memori dan efektor CD8(+) pada pasien melanoma. Eur. J. Imun. 42, 3049–3061 (2012).

Serradell, M.C. dkk. Vaksinasi oral yang efisien dengan merekayasa partikel mirip virus dengan protein permukaan protozoa. Nat. komuni. 10, 361 (2019).

Molino, N. M., Neek, M., Tucker, J. A., Nelson, E. L. & amp Wang, vaksin nanopartikel protein peniru virus S. W. untuk memunculkan respons anti-tumor. Biomaterial 86, 83–91 (2016).

Neek, M.et al. Pengiriman bersama antigen testis kanker manusia dengan adjuvant dalam nanopartikel protein menginduksi respons imun yang dimediasi sel yang lebih tinggi. Biomaterial 156, 194–203 (2018).

Molino, N. M., Neek, M., Tucker, J. A., Nelson, E. L. & amp Wang, S. W. Tampilan DNA pada nanopartikel untuk menargetkan sel penyaji antigen. Biometer ACS. Sci. Ind. 3, 496–501 (2017).

Molino, N. M., Anderson, A. K., Nelson, E. L. & Wang, S. W. Nanopartikel protein biomimetik memfasilitasi peningkatan aktivasi sel dendritik dan presentasi silang. ACS Nano 7, 9743–9752 (2013).

Han, J.A. dkk. Nanopartikel sangkar protein feritin sebagai nanoplatform pengiriman antigen serbaguna untuk pengembangan vaksin berbasis sel dendritik (DC). pengobatan nano 10, 561–569 (2014).

Specht, H. M. et al. Heat shock protein 70 (Hsp70) peptida diaktifkan sel pembunuh alami (NK) untuk pengobatan pasien dengan kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC) setelah radiokemoterapi (RCTx) — dari studi praklinis ke uji klinis fase II. Depan. kekebalan. 6, 162 (2015).

Derek, C. A. et al. Imunitas spesifik pasien individu terhadap glioma tingkat tinggi setelah vaksinasi dengan peptida turunan tumor autologus yang terikat pada protein pendamping 96 KD. klinik Kanker Res. 19, 205–214 (2013).

Kar, U. K. et al. Vault nanocapsules sebagai adjuvant mendukung respons imun yang dimediasi sel daripada respons imun yang dimediasi antibodi setelah imunisasi tikus. PLoS SATU 7, e38553 (2012).

Schwarz, B. dkk. Dikontrol simetri, presentasi genetik protein bioaktif pada partikel mirip virus P22 menggunakan protein dekorasi eksternal. ACS Nano 9, 9134–9147 (2015).

van den Heuvel, M. G. L. & Dekker, C. Protein motor bekerja untuk nanoteknologi. Sains 317, 333–336 (2007).

Chen, H.B. dkk. Nanomedicine yang tepat untuk terapi cerdas kanker. Sci. Kimia Cina. 61, 1503–1552 (2018).

Kinbara, K. & Aida, T. Menuju mesin molekul cerdas: gerakan terarah molekul dan rakitan biologis dan buatan. Kimia Putaran. 105, 1377–1400 (2005).

Hayer-Hartl, M., Bracher, A. & Hartl, F. U. Mesin pendamping GroEL-GroES: kandang nano untuk pelipatan protein. Tren Biokimia. Sci. 41, 62–76 (2016).

Ishii, D. dkk. Stabilisasi yang dimediasi chaperonin dan pelepasan nanopartikel semikonduktor yang dipicu ATP. Alam 423, 628–632 (2003).

Deaton, J. dkk. Bakteriorhodopsin fungsional dilarutkan secara efisien dan dikirim ke membran oleh pendamping GroEL. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 101, 2281–2286 (2004).

Biswas, S.et al. Robotika biomolekuler untuk pengiriman tamu yang digerakkan secara kimiawi yang didorong oleh ATP intraseluler. Nat. Kimia 5, 613–620 (2013).

Yuan, Y. dkk. Chaperonin-GroEL sebagai penghantaran obat hidrofobik cerdas dan mesin molekuler penargetan tumor untuk terapi tumor. Nano Let. 18, 921–928 (2018).

Kuhlman, B. & Bradley, P. Kemajuan dalam prediksi dan desain struktur protein. Nat. Pdt Mol. Biol Sel. 20, 681–697 (2019).

Frederix, P. W. J. M. et al. Menjelajahi ruang urutan untuk perakitan mandiri (tri-)peptida untuk merancang dan menemukan hidrogel baru. Nat. Kimia 7, 30–37 (2015).

Sacha, G. M. & Varona, P. Kecerdasan buatan dalam nanoteknologi. Nanoteknologi 24, 452002 (2013).

Pietro, M. & Bernhard Aribo, S. Dalam model silico untuk nanomedicine: perkembangan terakhir. Curr. Med. 25, 4192–4207 (2018).

Puzyn, T. dkk. Menggunakan nano-QSAR untuk memprediksi sitotoksisitas nanopartikel oksida logam. Nat. nanoteknologi. 6, 175–178 (2011).

Ahn, J.et al. Mikrofluida dalam pengiriman obat nanopartikel dari sintesis hingga skrining pra-klinis. Adv. Pengiriman Obat Putaran. 128, 29–53 (2018).

Dia, Z., Ranganathan, N. & Li, P. Mengevaluasi nanomedicine dengan mikofluida. Nanoteknologi 29, 492001 (2018).

Carvalho, M. R. et al. Sistem tumor-on-a-chip kolorektal: alat 3D untuk onco-nanomedicine presisi. Sci. Adv. 5, eaaw1317 (2019).

Dana, J., Agnus, V., Ouhmich, F. & amp Gallix, B. Multimodality imaging dan kecerdasan buatan untuk karakterisasi tumor: status saat ini dan perspektif masa depan. mani. inti Med. 50, 541–548 (2020).

Sun, R. dkk. Pendekatan radiomik untuk menilai sel CD8 infiltrasi tumor dan respons terhadap imunoterapi anti-PD-1 atau anti-PD-L1: biomarker pencitraan, studi multikohort retrospektif. Lancet Oncol. 19, 1180–1191 (2018).

Adir, O.et al. Mengintegrasikan kecerdasan buatan dan nanoteknologi untuk pengobatan kanker yang presisi. Adv. ibu. 32, 1901989 (2020).

Hong, M.K.H. dkk. Melacak asal-usul dan pendorong ekspansi metastatik subklonal pada kanker prostat. Nat. komuni. 6, 6605 (2015).

Vignot, S., Besse, B., André, F., Spano, J.-P. & Soria, J.-C. Perbedaan antara tumor primer dan metastasis: tinjauan literatur tentang biomarker yang ditetapkan secara klinis. Kritis. Pdt. Onkol. hematol. 84, 301–313 (2012).

Schroeder, A.et al. Mengobati kanker metastatik dengan nanoteknologi. Nat. Pdt. Kanker 12, 39–50 (2012).

Hu, Q. dkk. Nanovehicle peniru trombosit antikanker Adv. ibu. 27, 7043–7050 (2015).

Liang, M.et al. Nanopartikel doxorubicin H-ferritin-nanocaged secara khusus menargetkan dan membunuh tumor dengan injeksi dosis tunggal. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 111, 14900–14905 (2014).

Ahn, B.et al. Nanocage feritin manusia saluran-nicked empat kali lipat untuk pemuatan obat aktif dan pelepasan obat yang responsif terhadap pH. Angew. Kimia Int. Ed. 57, 2909–2913 (2018).

Khatun, Z., Nurunnabi, M., Reeck, G. R., Cho, K. J. & Lee, Y.-K. Pengiriman oral konjugat heparin-docetaxel terkait asam taurocholic untuk terapi kanker. J. Kontrol. Rel. 170, 74–82 (2013).

Li, J.et al. Perakitan mandiri nanohidrogel DNA dengan ukuran yang dapat dikontrol dan properti yang responsif terhadap rangsangan untuk terapi regulasi gen yang ditargetkan. Selai. Kimia Soc. 137, 1412–1415 (2015).

Cutler, J. I., Auyeung, E. & Mirkin, C. A. Asam nukleat bulat. Selai. Kimia Soc. 134, 1376–1391 (2012).

Jiang, Q. dkk. Origami DNA sebagai pembawa untuk menghindari resistensi obat. Selai. Kimia Soc. 134, 13396–13403 (2012).

Douglas, S.M. dkk. Pembuatan prototipe cepat bentuk origami DNA 3D dengan caDNAno. Asam Nukleat Res. 37, 5001–5006 (2009).

Bindewald, E., Grunewald, C., Boyle, B., O'Connor, M. & amp Shapiro, B. A. Strategi komputasi untuk desain otomatis struktur skala nano RNA dari blok bangunan menggunakan NanoTiler. J. Mol. Grafik. Model. 27, 299–308 (2008).

Donnem, T. dkk. Tumor non-angiogenik dan pengaruhnya terhadap biologi kanker. Nat. Pdt. Kanker 18, 323–336 (2018).

Hida, K., Maishi, N., Torii, C. & amp Hida, Y. Tumor angiogenesis — karakteristik sel endotel tumor. Int. J.klin. Onkol. 21, 206–212 (2016).

Joyce, J. A. & Fearon, pengecualian sel D. T. T, hak kekebalan, dan lingkungan mikro tumor. Sains 348, 74–80 (2015).

Gay, L. J. & amp Felding-Habermann, B. Kontribusi trombosit untuk metastasis tumor. Nat. Pdt. Kanker 11, 123–134 (2011).

Tozer, G. M., Kanthou, C. & Baguley, B. C. Mengganggu pembuluh darah tumor. Nat. Pdt. Kanker 5, 423–435 (2005).

Nam, J.et al. Nanomedicine kanker untuk imunoterapi kanker kombinasi. Nat. Pdt. 4, 398–414 (2019).

Gajewski, T. F., Schreiber, H. & Fu, Y.-X. Sel imun bawaan dan adaptif dalam lingkungan mikro tumor. Nat. kekebalan. 14, 1014–1022 (2013).

Joshi, M. D., Unger, W. J., Storm, G., van Kooyk, Y. & amp Mastrobattista, E. Menargetkan antigen tumor ke sel dendritik menggunakan pembawa partikulat. J. Kontrol. Rel. 161, 25–37 (2012).

Guillerey, C., Huntington, N. D. & Smyth, M. J. Menargetkan sel pembunuh alami dalam imunoterapi kanker. Nat. kekebalan. 17, 1025–1036 (2016).

Ma, Q., Dieterich, L. C. & Detmar, M. Beberapa peran pembuluh limfatik dalam perkembangan tumor. Curr. pendapat. kekebalan. 53, 7–12 (2018).

Garnier, L., Gkountidi, A.-O. & Hugues, S. Fitur pembuluh limfatik terkait tumor dan fungsi imunomodulator. Depan. kekebalan. 10, 720 (2019).

Laakkonen, P., Porkka, K., Hoffman, J. A. & amp Ruoslahti, E. Peptida pelacak tumor dengan spesifisitas penargetan yang terkait dengan pembuluh limfatik. Nat. Med. 8, 751–755 (2002).

Cheng, C. J., Tietjen, G. T., Saucier-Sawyer, J. K. & amp Saltzman, W. M. Pendekatan holistik untuk menargetkan penyakit dengan nanopartikel polimer. Nat. Pdt. Drug Discov. 14, 239 (2015).

Yang, Y.et al. Pengaruh ukuran, muatan permukaan, dan hidrofobisitas dendrimer poli(amidoamine) pada penetrasi kulitnya. Biomakromolekul 13, 2154–2162 (2012).

De Matteis, V. Paparan nanopartikel anorganik: rute masuk, respon imun, biodistribusi dan evaluasi toksisitas in vitro/in vivo. Toksik 5, 29 (2017).


Tantangan dalam pengobatan nano kanker

Nasib sistem nano yang diberikan pada suatu organisme dipengaruhi oleh jaringan besar faktor. Secara khusus, efisiensi struktur nano antitumor dibatasi oleh kesulitan dalam penargetan, perubahan bahan yang dinamis secara in vivo, dan berbagai hambatan biologis. Hambatan yang kompleks dan saling berhubungan ini membutuhkan penanggulangan berlapis-lapis yang hanya dapat dicapai dengan multifungsi.

Perkembangan kanker adalah hasil kolektif dari berbagai peristiwa patologis 14 , yang seringkali tidak spesifik tumor tetapi melibatkan proses fisiologis normal yang terdistorsi oleh penyakit. Selain itu, sel tumor sangat heterogen dan memiliki tingkat mutasi yang tinggi, menghasilkan perbedaan patologis antara berbagai jenis kanker, individu dan daerah intratumoural. Untuk mengatasi heterogenitas ini, terapi kombinatorial atau multi-target berbasis struktur nano sedang dieksplorasi. Misalnya, menggabungkan metode bertarget sel tumor dengan strategi yang memodulasi lingkungan mikro tumor (TME) (Boxਁ) memungkinkan terapi untuk disesuaikan dengan karakteristik tumor yang berbeda. Pada tumor yang sangat fibrotik, kanker terkait fibroblas (CAFs) atau sel stellata dapat menjadi sasaran bersama, selain sel kanker, untuk menghambat sekresi faktor pertumbuhan dan sitokin pro-inflamasi dan untuk mendistribusikan terapi yang diberikan struktur nano di seluruh stroma padat. 15� . Selain itu, kekambuhan tumor setelah oklusi pembuluh darah oleh pengiriman trombin yang ditargetkan dapat sangat dikurangi dengan pengiriman bersama doksorubisin, mungkin karena kemoterapi membantu untuk memberantas daerah tumor yang kurang dihuni oleh pembuluh darah 18 .

Meskipun pengembangan obat spesifik tumor sangat sulit, mengoptimalkan farmakokinetik dan biodistribusi obat yang kurang spesifik dapat secara substansial meningkatkan kemanjurannya. Memang, kapasitas pengiriman tumor yang ditargetkan, baik melalui penargetan pasif berdasarkan efek peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR), penargetan aktif atau pelepasan obat yang responsif terhadap rangsangan, telah dianggap sebagai keuntungan utama pengobatan nano dalam pengobatan kanker 2 . Namun, dibandingkan dengan formulasi obat konvensional, perilaku in vivo dan nasib struktur nano multifungsi lebih kompleks, yang dapat membuat mereka sangat rentan terhadap inkonsistensi di seluruh pasien dan antara model praklinis dan aplikasi klinis 19 .

Sifat-sifat struktur nano langsung terpengaruh ketika memasuki tubuh melalui interaksi pada antarmuka nano𠄻io. Interaksi ini dapat menyebabkan ketidakstabilan, seperti agregasi partikel, dekomposisi, hilangnya unit fungsional atau pelepasan spesies berbahaya, yang sangat mempengaruhi efisiensi pengiriman dan keamanan hayati 20 . Kontak dengan cairan fisiologis juga menyebabkan penyelubungan struktur nano dengan protein serum (protein korona), berpotensi melindungi fungsi permukaan (seperti ligan penargetan) dan mengganggu pelepasan obat 21 . Modifikasi antifouling, seperti pelapisan dengan poli(etilena glikol) (PEG), sering diterapkan untuk mengurangi interaksi protein nanopartikel.Alternatif berdasarkan biomolekul, terutama protein dan peptida, juga telah dilaporkan 22,23 . Selain itu, interferensi korona protein dengan fungsionalitas permukaan tergantung pada teknik fungsionalisasi misalnya, antibodi yang telah diserap sebelumnya ke nanopartikel polimer mempertahankan kemampuan penargetannya lebih baik daripada molekul terkonjugasi secara kimia, mungkin karena cakupan permukaan yang lebih kuat 24 . Dengan menyesuaikan modifikasi nanosurface, komposisi korona protein dapat dimanipulasi dan dieksploitasi untuk meningkatkan sirkulasi, mengurangi toksisitas atau meningkatkan penargetan 21,25 . Misalnya, Onpattro, formulasi RNA pengganggu kecil (siRNA) yang tersedia secara komersial, merekrut protein penargetan hati, apolipoprotein E, ke permukaan nanopartikel lipid yang mengandung kolesterol in vivo 26 . Peptida pendek juga telah digunakan untuk memanipulasi mode pengikatan serum apolipoprotein pada permukaan nanopartikel untuk meningkatkan pengiriman melintasi sawar darah otak 27 . Meskipun interferensi dari adsorpsi non-spesifik perlu dikarakterisasi secara hati-hati 28 , pendekatan ini menyarankan kemungkinan untuk memodulasi protein korona secara lebih tepat dan menggunakannya sebagai fungsionalitas tambahan.

Dalam aliran darah, fagosit siap menempel pada struktur nano protein berlapis korona melalui reseptor spesifik, yang mengarah pada penghapusan struktur nano dari sirkulasi oleh sistem retikuloendotelial (RES) 29 . Dengan demikian, pelapis antifouling, seperti PEG, biasanya digunakan untuk memperpanjang waktu sirkulasi struktur nano. Meskipun demikian, modifikasi PEG hanya sebagian mengurangi imunogenisitas, dan stimulasi antibodi pengikat PEG telah meningkatkan masalah keamanan 30,31 . Strategi antifouling yang lebih aktif termasuk dekorasi permukaan dengan bagian berdasarkan CD47 32,33 , protein ‘self-marker’ yang menghambat fagositosis, atau dengan membran sel darah yang diekstraksi (menampilkan CD47 pada permukaannya) 31,34 , untuk membantu nanomaterial untuk menghindari pembersihan oleh fagosit. Dalam model tikus, metode ini telah menunjukkan sifat siluman yang unggul dibandingkan dengan PEGylation 31,32,34 . Namun, pembersihan yang dimediasi korona juga dapat menguntungkan pengiriman yang ditargetkan oleh makrofag atau RES. Misalnya, dengan mengganti muatan liposom kationik secara tepat, mereka dapat secara selektif diarahkan ke hati dan limpa untuk menghantarkan gen 35 .

Untuk mencapai jaringan tumor, nanosystem pertama-tama perlu melakukan ekstravasasi dari sirkulasi 1,36 , yang telah lama dianggap diaktifkan oleh pembuluh darah tumor yang bocor. Namun, efek EPR sangat bervariasi antara tumor dan bahkan antara daerah yang berbeda dari tumor yang sama, dan signifikansi klinisnya masih kontroversial. Nanopartikel multifungsi dapat secara aktif meningkatkan ekstravasasi intratumoural dengan menciptakan hipertensi lokal, menyebabkan relaksasi pembuluh darah atau menginduksi kerusakan tambahan pada pembuluh darah tumor. Strategi tersebut sebagian dapat mengatasi masalah heterogenitas EPR 38,40, tetapi stratifikasi pasien dan pengobatan pribadi yang dipandu pencitraan akan terbukti penting untuk menyesuaikan strategi terapi berbasis nanomaterial 1,2,41.

Selain itu, efisiensi ekstravasasi dipengaruhi oleh sifat material nano, misalnya, dalam darah yang mengalir, partikel nano berbentuk bola cenderung tetap dekat dengan bagian tengah pembuluh, sedangkan struktur berbentuk batang atau pelat lebih cenderung melayang ke arah dinding pembuluh dan menunjukkan interaksi yang kuat dengan sel endotel, karena area kontak yang lebih besar 36,42 . Kelembutan permukaan vesikel ekstraseluler secara substansial mempengaruhi ekstravasasi dan serapan seluler in vivo 43 . Adhesi endotel, dan dengan demikian ekstravasasi, dapat ditingkatkan dengan melapisi nanopartikel dengan membran sel yang berasal dari leukosit 44 . Ekstravasasi umumnya diperkirakan terjadi oleh kebocoran paraseluler namun mekanisme lain, seperti transpor aktif oleh sel endotel 39,45 , juga berperan, dan mendapat perhatian dalam hal desain dan penargetan sistem nano 46,47 .

Kebanyakan nanoformulasi antikanker dirancang untuk penggunaan intravena. Sebagai catatan, tantangan yang ditimbulkan oleh hambatan biologis selama transportasi nanopartikel terkait dengan rute pemberian misalnya, strategi multifungsi belum mengatasi masalah akumulasi nanomaterial yang disuntikkan secara intravena di hati, yang dapat membantu mengurangi toksisitas obat yang dikirim ke jaringan lain. dan meningkatkan toleransi keseluruhan 12 , tetapi tetap menjadi masalah untuk pengiriman obat yang efisien ke tumor. Rute pemberian menentukan pola biodistribusi obat, dan rute alternatif untuk injeksi intravena dengan strategi penargetan yang sesuai dieksplorasi untuk kanker tertentu (Kotakਂ). Injeksi intradermal dan subkutan, misalnya, mungkin sangat berguna untuk menargetkan sistem limfatik untuk imunisasi tumor 48 , sedangkan nanopartikel yang diberikan secara oral dapat menargetkan kanker usus besar 49 .

Tumor dan TME juga memberikan penghalang untuk pengiriman obat berbasis struktur nano. Tekanan cairan interstisial yang tinggi dan stroma desmoplastik membatasi penetrasi struktur nano 6,36 . Selain itu, daerah tumor yang lebih dalam kurang dihuni oleh pembuluh darah. Selain itu, nanopartikel dapat ditangkap oleh tumor-associated macrophages (TAMs) alih-alih sel tumor setelah ekstravasasi 41 . Komplikasi intratumoural ini telah memotivasi pengembangan strategi penargetan TME (Boxਁ), memanfaatkan target potensial yang lebih mudah diakses daripada sel tumor. Memang, target terkait TME, seperti protein aktivasi fibroblas pada CAFs 16, kompleks fibrin & fibronektin di pembuluh darah tumor 18 atau TAM 50,51, telah diterapkan untuk pengiriman nanopartikel. Untuk terapi yang memerlukan pengiriman intraseluler (misalnya, pengiriman gen dan pengiriman antigen), serapan seluler dan pelepasan endosom diperlukan. Namun, tidak seperti obat kecil hidrofobik, nanopartikel tidak dapat secara pasif berdifusi melintasi membran plasma. Oleh karena itu, ligan bertarget protein-membran, peptida penembus sel atau bahan fusogenik digunakan untuk mempromosikan serapan seluler 5,52 .

Kotak 1 Target lingkungan mikro tumor untuk struktur nano multifungsi

Stroma dan fibroblas

Dalam lingkungan mikro tumor (TME), sel stroma diam menjadi proliferatif dan sangat sekretori, menghasilkan matriks ekstraseluler padat (ECM), yang bertindak sebagai penghalang intratumoural terhadap penetrasi obat. Selain itu, komponen ECM, sitokin, dan kemokin yang disekresikan oleh fibroblas terkait kanker yang diaktifkan dan sel stroma mesenkim meningkatkan proliferasi sel tumor, invasi, dan perolehan resistensi obat 15 . Protein sel stroma (seperti protein aktivasi fibroblas α) dan komponen ECM (terutama enzim ECM) dapat digunakan sebagai target untuk pengiriman atau pelepasan obat selektif 16 . Obat yang menargetkan kelainan stroma dapat digabungkan dengan strategi penargetan TME untuk membalikkan aktivasi sel stroma, menghambat pensinyalan protumoural, atau mengurangi sintesis dan sekresi komponen ECM fibrotik seperti hialuronan dan kolagen 15,17 .

Pembuluh darah

Pada banyak (tetapi tidak semua) 241 tumor padat, angiogenesis bergeser ke arah keadaan pro-angiogenik, yang mengarah ke jaringan pembuluh darah yang berliku-liku dan terputus, yang membatasi perfusi obat. Sel-sel endotel vaskular yang dikondisikan oleh TME secara aktif berpartisipasi dalam eksklusi atau metastasis sel-T, dan keadaan tumor yang pro-koagulasi menyebabkan aktivasi trombosit, yang dapat mendorong invasi tumor 242� . Reseptor endotel dan mikrotrombi terkait tumor dapat ditargetkan untuk melokalisasi struktur nano ke pembuluh darah tumor 40 . Obat-obatan dapat dilepaskan ke TME untuk memodulasi sinyal angiogenik intratumor (misalnya, jalur faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF)) atau untuk menetralkan faktor pro-angiogenik yang berlebihan, yang dihasilkan sebagai respons terhadap terapi sitotoksik 245 .

Sel kekebalan

Kebanyakan nanoterapi bertarget sel imun bertujuan untuk meningkatkan respons sel T sitotoksik antikanker. Perawatan yang secara langsung menargetkan sel T menggunakan inhibitor pos pemeriksaan imun (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) atau protein kematian sel terprogram 1 (PD-1)) telah menunjukkan harapan terhadap tumor panas, di mana sel T aktif mampu untuk menyusup tetapi secara fungsional diblokir oleh sinyal pos pemeriksaan imun 246 . Pada tumor dingin, sel T tidak diaktifkan, karena adanya sel imun imunosupresif, yang dapat ditargetkan untuk meningkatkan perekrutan sel T. Nanovaksin yang mengantarkan antigen tumor dan agen imunostimulator ke sel dendritik dapat meningkatkan pematangan dan presentasi antigennya 247.248 . Pemrograman ulang makrofag protumoural menjadi fenotipe antitumoural dapat menghidupkan kembali aktivitas sitotoksik antitumornya dan meningkatkan respons sel T 50,51 . Sel natural killer (NK) secara spontan menyerang sel kanker tanpa memerlukan sensitisasi antigen. Menargetkan sel NK dengan sitokin (misalnya, IL-15) atau antibodi yang menginduksi stimulasi dan ekspansi memberikan alternatif imunoterapi berbasis sel T 249 .

Pembuluh limfatik

Tumor padat tidak memiliki drainase limfatik yang fungsional. Namun, pembuluh limfatik adalah jalan raya penting untuk metastasis sel kanker. Memang, tingkat limfangiogenesis yang tinggi pada tumor berkorelasi dengan hasil yang buruk 250.251 . Sel endotel limfatik terkait tumor mengekspresikan molekul imunosupresif secara berlebihan, seperti PD-L1, tetapi juga mendorong migrasi sel dendritik ke kelenjar getah bening, terkait dengan infiltrasi tinggi sel T naif 250 . Limfangiogenesis tumor dapat dimodulasi dengan memblokir VEGFR3, reseptor VEGF-C, faktor limfangiogenik yang disekresikan sel tumor 251 . Namun, ligan penargetan untuk pembuluh limfatik tetap terbatas (dengan contoh peptida LyP-12252).

Kotak 2 Rute administrasi untuk struktur nano penargetan kanker

Pemberian intravena ditandai dengan respon terapeutik yang cepat, bioavailabilitas obat yang tinggi dan kontrol administrasi yang tinggi. Sistem nano yang kompleks secara struktural dan tidak stabil secara biologis seringkali tidak cocok untuk penyerapan gastrointestinal atau injeksi intramuskular, dan dengan demikian injeksi intravena sering menjadi metode pilihan. Selain itu, terapi anti-metastasis memerlukan pemberian obat sistemik. Namun, pemberian intravena mengalami klirens obat yang cepat, distribusi dan akumulasi jaringan yang tidak diinginkan, dan efek samping yang merugikan selanjutnya.

Pengiriman lisan manfaat dari kepatuhan pasien yang baik dan dapat memberikan akses mudah untuk penargetan saluran pencernaan. Namun, lingkungan yang keras dan kompleks di saluran pencernaan (variasi pH tinggi, enzim metabolik, pembersihan yang dimediasi lendir) memberikan tantangan bagi struktur nano. Elemen yang menempel pada lendir dan menembus endotel biasanya diperlukan untuk meningkatkan adsorpsi usus dan penetrasi bahan nano.

Inhalasi dan pemberian intranasal memungkinkan akses ke saluran pernapasan (misalnya, untuk pengobatan kanker paru-paru) dan memungkinkan penargetan berkelanjutan dan kurang invasif, dibandingkan dengan injeksi intravena. Struktur nano juga memerlukan fungsi perekat lendir untuk meningkatkan adhesi dan penetrasi lendir (seperti untuk rute mukosa lainnya, seperti persalinan pervaginam) 253 . Namun, obat yang dihirup atau dikirim secara intranasal juga dapat didistribusikan secara sistemik, obat yang diberikan secara intranasal telah ditemukan terakumulasi dalam sistem saraf pusat 253 .

Injeksi dan infus langsung ke dalam jaringan yang berdekatan dengan lokasi tumor adalah pilihan jika tumor mudah diakses. Rute pemberian lokal melewati banyak penghalang biologis (misalnya, obat yang diberikan ke dalam otak melewati sawar darah otak), tetapi penetrasi jaringan masih diperlukan. Pendekatan untuk meningkatkan penetrasi dan retensi bahan nano di dermis dan jaringan subkutan masih terbatas 254 . Partikel kecil yang disuntikkan secara lokal rentan terhadap drainase limfatik yang cepat, dan dengan demikian pemberian subkutan dapat mengirimkan partikel nano ke kelenjar getah bening dan sel kekebalan yang berada dalam sistem limfatik.

Setiap rute pemberian mengarah pada distribusi obat yang berbeda dan pola efek samping yang berbeda. Masalah keselamatan yang terkait dengan rute non-intravena, seperti inhalasi atau kontak kulit, perlu dipertimbangkan 255 . Studi sistematis toksisitas spesifik rute dalam konteks pengobatan nano kanker akan menjadi penting.


Informasi penulis: Gillooly JF 1 , Gomez JP 2,3 , Mavrodiev EV 4 .

Tanggal e-pub: Februari 2017

Abstrak: Perbedaan batas dan jangkauan tingkat aktivitas aerobik antara endoterm dan ektoterm masih kurang dipahami, meskipun perbedaan tersebut membantu menjelaskan perbedaan mendasar dalam gaya hidup spesies (misalnya pola pergerakan, mode makan, dan tingkat interaksi). Kami membandingkan batas dan jangkauan aktivitas aerobik pada hewan endoterm (burung dan mamalia) dan ektoterm (ikan, reptil, dan amfibi) dengan mengevaluasi ketergantungan massa tubuh dari VO2 max, ruang lingkup aerobik, dan massa jantung dalam konteks filogenetik berdasarkan a supertree vertebrata yang baru dibangun. Bertentangan dengan pekerjaan sebelumnya, hasil menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam skala massa tubuh tingkat konsumsi oksigen minimum dan maksimum dengan massa tubuh dalam endotermik atau ektoterm. Untuk massa tubuh tertentu, tingkat istirahat dan tingkat maksimum adalah 24 kali lipat dan 30 kali lipat lebih rendah, masing-masing, pada ektoterm daripada endoterm. Ruang lingkup aerobik faktorial berkisar antara lima sampai delapan pada kedua kelompok, dengan ruang lingkup pada endoterm menunjukkan ketergantungan massa tubuh yang sederhana. Akhirnya, tingkat konsumsi maksimum dan ruang lingkup aerobik berkorelasi positif dengan sisa massa jantung. Bersama-sama, hasil ini mengukur persamaan dan perbedaan potensi aktivitas aerobik antara ektoterm dan endoterm dari lingkungan yang beragam. Mereka memberikan wawasan tentang model dan mekanisme yang mungkin mendasari ketergantungan massa tubuh dari konsumsi oksigen.


Informasi penulis

Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama: Jing Wang, Yiye Li.

Afiliasi

Laboratorium Kunci CAS untuk Efek Biomedis dari Nanomaterials & Nanosafety, CAS Center for Excellence in Nanoscience, National Center for Nanoscience and Technology, China, Beijing, China

Jing Wang, Yiye Li & Guangjun Nie

Pusat Ilmu Material dan Teknik Optoelektronika, Universitas Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok, Beijing, Tiongkok

Jing Wang, Yiye Li & Guangjun Nie

Institut Inovasi Penelitian GBA untuk Nanoteknologi, Guangdong, Cina

Institut Teknologi Canggih Henan, Universitas Zhengzhou, Zhengzhou, Tiongkok